Методические рекомендации "Экспресс-метод оценки общетоксического и кожно-раздражающего действия парфюмерно-косметической продукции in vitro (на культуре подвижных клеток)" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ от 29 января 2002 г. N 29ФЦ/394) (документ не действует)

1.2. Гигиена, токсикология, санитария

Методические рекомендации
"Экспресс-метод оценки общетоксического и кожно-раздражающего действия парфюмерно-косметической продукции in vitro (на культуре подвижных клеток)"
(утв. Заместителем главного государственного санитарного врача РФ от 29 января 2002 г. N 29ФЦ/394)

1. Область применения

Методические рекомендации содержат описание метода тестирования парфюмерно-косметической (ПК) продукции с применением кратковременной суспензионной культуры подвижных клеток (сперматозоидов быка) и определяют порядок проведения испытаний следующих видов ПК-продукции: жидкие моющие средства, дезодоранты и депилятории в аэрозольной упаковке, туалетная и парфюмированная вода, духи, одеколон, спиртосодержащие лосьоны.

Методические рекомендации предназначены для скрининговой оценки вновь разрабатываемой и серийно выпускаемой ПК-продукции с учетом общетоксического и кожно-раздражающего действия.

Методика может быть применена в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами.

Методические рекомендации предназначены для учреждений научно-исследовательского и практического профиля, осуществляющих разработку новых видов ПК-продукции и контроль ее качества.

2. Описание метода

В качестве тест-объекта используется сперма крупного рогатого скота, замороженная в парах жидкого азота. Гранулы замороженной бычьей спермы получают на станциях искусственного осеменения и хранят в сосудах Дьюара, наполненных жидким азотом.

Критерием токсического действия является изменение двигательной активности сперматозоидов под воздействием химических соединений, содержащихся в экстрактах ИК-продукции, по сравнению с таковой для пробы с раствором, не содержащей токсических веществ. Изменение двигательной активности измеряется показателем подвижности "m" и регистрируется автоматически анализатором токсичности по изменению интенсивности светового потока при движении сперматозоидов через оптический зонд.

,

где d - постоянный коэффициент,

Сn - концентрация подвижных клеток,

- средний модуль скорости клеток.

Количественная оценка параметра тест-реакции выражается индексом токсичности "", представляющего собой отношение суммарной двигательной активности сперматозоидов опытной и контрольной проб, выраженное в процентах. Величина индекса токсичности, гарантирующая безопасность ПК-изделий, находится в интервале от 70 до 120% Сравнительная оценка результатов исследования общей токсичности и кожно-раздражающего действия ПК-изделий в эксперименте на лабораторных животных и их различных разведений на культуре сперматозоидов послужила основанием для выбора эталонных разведений перечисленных ранее групп ПК-изделий с учетом допустимого интервала индекса токсичности.

3. Оборудование, химическая посуда и реактивы

3.1. Анализатор токсичности АТ-4.

3.2. Сосуд Дьюара типа СДС, объемом не менее 25 л и диаметром горла не менее 50 мм.

3.3. Термостат типа ТС-80М-2 (25-80°С).

3.4. Весы аналитические с погрешностью взвешивания не более 1 мг, ГОСТ 24104-88.

3.5. Пробирки с притертыми пробками объемом 3-5 мл - 10 шт., ГОСТ 1770-74.

3.6. Дозаторы пипеточные на объемы 0,5 мл, 0,2 мл и 0,1 мл, ТУ 2Т2.993.053.

3.7. Мерные колбы с притертыми пробками объемом 50 мл - 2 шт., ГОСТ 1770-74.

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

3.6. Пинцет анатомический длиной 250 мм.

3.7. Глюкоза ч., ГОСТ 6038-74.

3.8. Цитрат натрия трехзамещенный ч., ГОСТ 22280-76.

3.9. Сперма быка, замороженная в жидком азоте, ГОСТ 26030-83.

ГАРАНТ:

Приказом Росстандарта от 5 июня 2015 г. N 556-ст взамен ГОСТ 26030-83 с 1 июля 2016 г. введен в действие ГОСТ 26030-2015 "Средства воспроизводства. Сперма быков замороженная. Технические условия" для добровольного применения в РФ

3.10. Фильтры АФА-ВП-10. ТУ 95-743-80.

4. Проведение испытаний

4.1. Приготовление экстрактов из образцов ПК-продукции.

4.1.1. Экстракты из испытуемых образцов готовят путем настаивания в дистиллированной воде. Соотношения веса образца и объема модельной среды (дистиллированной воды), а также продолжительность экстракции приведены в таблице 1. Навески ПК-продукции взвешивают в сухой чистой колбе, куда затем добавляют требуемый объем модельной среды. В другую колбу наливают модельную среду и обе колбы помещают в термостат на 24 часа при температуре +37°С. После окончания экстракции растворы охлаждают до комнатной температуры.

Таблица 1

Условия приготовления экстрактов

Вид ПК-продукции	Масса образца, г	Объем модельной среды, мл	Степень разведения образца	Продолжительность экстракции, час
Шампуни для волос и тела	0,1	250	1:2500	24
Жидкое туалетное мыло	0,1	250	1:2500	24
Пена для ванн, гель для душа	0,1	250	1:2500	24
Дезодоранты и депилятории в аэрозольной упаковке	1,0	300	1:300	1
Туалетная и парфюмированная вода, духи, одеколон, спиртосодержащие лосьоны	1,0	700	1:700	1

4.1.2. После завершения экстракции экстракт подвергают фильтрации через бумажный фильтр с целью удаления взвешенных частиц. Фильтрованию подвергают также и модельную среду.

4.1.3. В качестве фильтра используют бумажный фильтр АФА-ВП-10 диаметром 9 см. Бумажные фильтры должны быть заранее промыты и просушены. Для этого предварительно до эксперимента 10 бумажных фильтров опускают в большой стакан, заполненный 1,5 л дистиллированной воды. Стакан накрывают стеклянной пластинкой и ставят в термостат на 24 часа при температуре +37°С. Затем дистиллированную воду выливают, а стакан с мокрыми фильтрами ставят обратно в термостат с целью высушивания фильтров до постоянной массы. Достижение постоянной массы контролируют взвешиванием каждого фильтра на аналитических весах.

4.1.4. После фильтрования из модельной среды и экстрактов готовят изотонические растворы, добавляя в них сухие реактивы глюкозы и цитрата натрия (глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, фильтрат- 100 мл).

4.2. Проведение измерений.

Для определения индекса токсичности изотонического фильтрата экстракта, далее опытного раствора, необходимо сравнить его с изотоническим фильтратом модельной среды.

4.2.1. Контрольный и опытный изотонические экстракты не менее, чем за час до начала эксперимента по 0,4 мл помещают в пробирки с притертыми пробками и ставят в водяную баню при температуре °С.

4.2.2. Приготовление раствора спермы. Оттаивают замороженную сперму в разбавителе. Состав разбавителя: глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, дистиллированная вода - 100 мл. В чистую сухую пробирку наливают 0,4 мл разбавителя и ставят в водный термостат при температуре °С. Охлажденным до температуры жидкого азота анатомическим пинцетом извлекают из сосуда Дьюара гранулу спермы и быстро опускают в нагретый раствор.

4.2.3. Приготовление тест-системы. В каждую пробирку с модельной средой и опытным экстрактом из ПК-изделия приливают по 0,1 мл раствора спермы. Полученную смесь экстрактов спермы из каждой пробирки переносят в капилляры (минимум по 5 на один образец) и устанавливают в каретку прибора. Проводят измерения согласно инструкции к прибору.

4.3. Математическая обработка результатов измерений.

Обработку экспериментальных данных осуществляют вручную или с помощью компьютера по прилагаемой к анализатору токсичности программе

Для каждого образца вычисляют суммарную двигательную активность S.

,

где - значение показателя подвижности.

Для контрольной и опытной выборок образцов вычисляют среднее арифметическое значение и среднеквадратичное отклонение, по которым в свою очередь вычисляют для каждой выборки коэффициент вариации С:

,

где - среднеквадратичное отклонение,

- среднее арифметическое значение.

В случае получения значения коэффициента вариации более 15% хотя бы для одной из выборок, эксперимент повторяют, начиная с 4.1. Если значения коэффициентов вариации для каждой из выборок меньше или равно 15%, то результаты считают пригодными для статистической обработки. Затем вычисляют величину индекса токсичности :

где и - величины суммарной двигательной активности сперматозоидов, усредненные по нескольким соответственно опытным и контрольным образцам.

5. Оценка результатов испытаний

Оценка результатов испытаний осуществляется путем сравнения полученных значений индексов токсичности для исследованных образцов и допустимого интервала индекса токсичности. Индекс токсичности от 70% до 120% указывает на то, что испытуемый образец относится к 4 классу малоопасных соединений согласно классификации ГОСТ 12.1.007-76, и не обладает кожно-раздражающим действием при соблюдении условий применения согласно этикетке. Образец направляется на проведение клинических испытаний на людях-добровольцах.

Во всех остальных случаях результаты свидетельствуют о несоответствии требованиям безопасности, предъявляемым к ПК-продукции. В этой ситуации испытанный образец может быть подвергнут расширенным санитарно-химическим и токсикологическим исследованиям.

Заместитель главного государственного санитарного врача Российской Федерации

Е.Н. Беляев