Методические указания МУК 4.1.2862-11 "Определение остаточных количеств пестицидов в пищевых продуктах, сельскохозяйственном сырье и объектах окружающей среды" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 31 марта 2011 г.)

Методические указания МУК 4.1.2862-11
"Определение остаточных количеств пестицидов в пищевых продуктах, сельскохозяйственном сырье и объектах окружающей среды"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 31 марта 2011 г.)

Дата введения: 31 марта 2011 г.

Общие положения и область применения

Свидетельство об аттестации методики от 23.11.2010 N 01.5.04.692. Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в семенах рапса массовой концентрации Гимексазола в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг и в масле рапса в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг.

Структурная формула:

Название действующего вещества по номенклатуре ICO: Гимексазол.

Название по ИЮПАК: 5-метилизоксазол-3-ол.

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 99,08.

Химически чистое вещество: бесцветные игольчатые кристаллы с температурой плавления 86 - 87°С и давлением паров 182 мПа. 5.92 (20°С).

Растворимость при 20°С (г/л): в воде - 58.2 (pH 3), 67,8 (pH 9), в гексане - 12,2, в метаноле - 968, ацетоне - 730, дихлорметане - 602, этилацетате - 437, толуоле - 176, диэтиловом эфире - 300 г/л.

В обычных условиях Гимексазол стабилен в щелочной среде и относительно стабилен в кислой среде. В растениях деградирует до О- и N-гликозидов, в почве превращается в 5-метил-2-(3Р)-оксазолон с периодом полураспада 2 - 25 дней.

Краткая токсикологическая характеристика: для крыс 3903 - 4678 мг/кг, острая дермальная токсичность для крыс более 10 000 мг/кг. Не обладает мутагенной, канцерогенной и тератогенной активностью.

Область применения: Гимексазол - системный фунгицид, подавляющий возбудителей заболеваний растений, инфекционное начало которых находится в почве и на семенах.

Гигиенические нормативы: ПДК в воде водоемов - 0,002 , ПДК в почве - 0,03 мг/кг, в воздухе рабочей зоны - 1,0 . МДУ в семенах и масле рапса не установлен.

1. Метрологическая характеристика метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и её составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р=0,95 не превышает значений (табл. 1) для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Диапазон измерений, массовая концентрация, мг/кг	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), , %	Показатель промежуточной прецизионности (относительное среднеквадратическое отклонение в условиях вариации факторов "время", "оператор" в одной лаборатории), , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости) , %	Показатель точности* (границы относительной погрешности при вероятности Р=0,95), , %
Семена рапса от 0,01 до 0,1 вкл.	6	11	12	22
Масло рапса от 0,01 до 0,2 вкл.	5	8	9	17
______________________________ * Соответствует расширенной неопределенности , при коэффициенте охвата k=2.

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для Гимексазола (n=20, Р=0,95)

Объект анализа	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, S, %	Доверительный интервал среднего результата, , %
Семена рапса	0,01	0,01-0,1	86,7	5,2	7,8
Масло рапса	0,02	0,02-0,2	82,4	5,3	8,3

2. Метод измерения

Метод основан на определении Гимексазола методом газожидкостной хроматографии с термоионным детектором после его экстракции из проб органическим растворителем и очистке экстракта путем перераспределения между водной и органической фазами и дериватизации с помощью диэтилхлортиофосфата. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерения, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерения

Газовый хроматограф с термоионным детектором и стеклянной хроматографической колонкой длиной 1 м, внутренним диаметром 3 мм с неподвижной фазой OV-17 (5 %) на хроматоне N-cynep (0,125-0,160 мм).
Весы аналитические типа ВЛА-200	ГОСТ 24104-2001
Весы лабораторные типа ВЛКТ-500	ГОСТ 24104-2001
Колбы мерные со шлифом объемом 25, 50, 100	ГОСТ 23932-90
Микрошприц МШ-10	ТУ 2-833-106
Микрошприц на 50 , Hamilton
Пипетки градуированные объемом 1, 2, 5 и 10	ГОСТ 29221-91
Пробирки мерные со шлифом объемом 5,0	ГОСТ 23932-90
Цилиндры мерные объемом 25 и 250	ГОСТ 23932-90

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Аналитический стандарт Гимексазола с содержанием основного компонета 98,4 %
Азот газообразный высокой чистоты	ТУ 301-07-25-89
Ацетон, осч	ТУ 2633-004-11291058-94
Вода дистиллированная	ГОСТ 7602-72
Дихлорметан, хч	ТУ 6-09-2662-77
н-Гексан, ч., свежеперегнанный	ТУ 6-09-3375-78
Диэтилхлортиофосфат, 97%, Aldrich Chemical Co., Inc.; 0,4% раствор в ацетоне
Калий углекислый, хч, 25%-й водный раствор	ГОСТ 4221-76
Натрий двууглекислый, чда	ГОСТ 4201-79
Натрий сернокислый безводный, чда свежепрокаленный	ГОСТ 4166-76
Натрий хлористый, хч	ГОСТ 4233-77
Полиэтиленгликоль 400, Merck
Соляная кислота, ч, 2N водный раствор	ГОСТ 3118-77
Эфир диэтиловый, чда	ТУ 2600-001-43852015-05

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

3.3. Вспомогательные устройства, посуда и материалы

Ванна ультразвуковая УЗВ/100 ТН
Водяная баня	ТУ 46-22-603-75
Воронка Бюхнера	ГОСТ 25336
Воронки делительные объемом 250 и 500	ГОСТ 25336-82
Воронки химические конусные	ГОСТ 25336-82
Индикаторная бумага универсальная	ТУ 6-09-1181-76
Колбы-концентраторы объемом 300	ГОСТ 25336-82
Колбы плоскодонные объемом 250 и 300	ГОСТ 25336-82
Мельница электрическая лабораторная	ТУ 46-22-236-79
Насос водоструйный	ГОСТ 10696-75
Ротационный вакуумный испаритель
Buchi R-200/205 (Швейцария)
Стаканы химические объемом 100,200 и 500	ГОСТ 25336-82
Установка для упаривания растворителей в токе азота
Фильтры бумажные, "красная лента"	ТУ 2642-001-42624157-98
Электроплитка	ГОСТ 14919-83

Допускается использование другого вспомогательного оборудования, посуды и материалов с техническими характеристиками не ниже указанных.

4. Требования безопасности

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать правила техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.019 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности (ГОСТ 12.1.004) и иметь средства пожаротушения (ГОСТ 12.4.009). Содержание вредных веществ в воздухе лабораторного помещения не должно превышать норм, установленных ГН 1.2.2701-10 и ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

5. Требования к квалификации операторов

Измерения может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации газового хроматографа, освоивший данный метод и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерения

При выполнении измерения выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха лабораторного помещения ()°С и относительной влажности воздуха не более 80%;

- выполнение измерения на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Отбор проб и хранение

Отбор проб для анализа проводят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" от 21.08.1979 N 2051-79, а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приёмки и методы отбора проб".

Для исследовательских целей допускается получение в лаборатории масла из проб измельчённых семян методом экстракции органическим растворителем при температуре не выше 40°С. Пробы масла хранят в холодильнике при 4°С в закрытой стеклянной таре не более 30 суток.

8. Подготовка к определению

8.1. Кондиционирование колонки

Хроматографическую колонку устанавливают в газовый хроматограф и перед анализом кондиционируют при температуре 280°С до установления нулевой линии.

8.2. Подготовка н очистка растворителей

Перед началом работы проверяют чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40°С до объёма 1,0 и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

8.3. Приготовление растворов

8.3.1. Приготовление 2N раствора соляной кислоты

В мерную колбу объемом 1 с 200 - 300 дистиллированной воды вносят 164 концентрированной соляной кислоты, перемешивают, доводят до метки дистиллированной водой и снова перемешивают.

8.3.2. Приготовление 0,4%-гораствора диэтилхлортиофосфата

В мерную колбу объемом 100 помещают 0,4 г диэтилхлортиофосфата, растворяют в 20 - 30 ацетона, перемешивают и доводят до метки ацетоном.

8.3.3. Приготовление 25% раствора углекислого калия

В мерную колбу объемом 100 вносят 25 г углекислого калия и растворяют в 50 - 70 дистиллированной воды, перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой.

8.3.4. Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Основной раствор гимексазола с содержанием 1 готовят растворением в ацетоне 50 мг аналитического стандарта Гимексазола в мерной колбе объемом 50 . Методом последовательного разбавления готовят раствор в ацетоне с концентрацией 10 .

Для построения градуировочного графика 1 стандартного раствора с концентрацией 10 отбирают в мерную пробирку объемом 5 с притертой пробкой, добавляют 50 25%-го водного раствора углекислого калия, 2 0,4%-го раствора диэтилхлортиофосфата в ацетоне, 1 ацетона. Пробирку плотно закрывают пробкой и выдерживают в течение 30 мин на водяной бане при 45°С*).

По окончании дериватизации пробирку охлаждают до комнатной температуры. Из полученного раствора деривата методом последовательного разбавления готовят градуировочные растворы с концентрациями 0,25, 0,1, 0,05 и 0,025 .

8.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика деривата - концентрация гимексазола в растворе) в хроматограф вводят по 1 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют высоты или площади пиков и строят график зависимости среднего значения высоты (площади) пика от концентрации гимексазола в градуировочном растворе ().

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

, где

С - аттестованное значение массовой концентрации Гимексазола в градуировочном растворе.

- результат контрольного измерения массовой концентрации Гимексазола в градуировочном растворе.

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при Р = 0,95).

9. Проведение определения

9.1. Определение Гимексазола в семенах рапса

Аналитическую пробу измельченных семян рапса массой () г помещают в коническую колбу с притертой пробкой объемом 250 , добавляют 20 дистиллированной воды, помещают на 10 мин в ультразвуковую ванну и затем выдерживают 2 ч при комнатной температуре для набухания семян. После выдержки в колбу добавляют 80 ацетона и экстрагируют Гимексазол в течение 10 мин в ультразвуковой ванне. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера с помощью водоструйного насоса через двойной бумажный фильтр "красная лента". Осадок на фильтре возвращают в колбу и экстракцию повторяют 50 смеси ацетон-вода (80 :20, по объему). Объединенный фильтрат переносят в делительную воронку, обмывая колбу 20 ацетона. Объединенный фильтрат трижды промывают гексаном порциями по 15-20 , воронку встряхивают в течение 2 мин и после разделения гексановый слой отбрасывают. Водно-ацетоновый экстракт переносят в колбу-концентратор объемом 300 , добавляют 0,5 25%-го водного раствора углекислого калия и удаляют ацетон при температуре не выше 30°С на роторном испарителе.

Полученный после упаривания водный остаток переносят в делительную воронку объемом 250 , обмывая колбу-концентратор двумя порциями воды по 30 . К объединенному водному остатку добавляют 1 г двууглекислого, натрия, 7 г хлористого натрия и промывают дважды порциями 50 дихлорметана и дважды 50 диэтилового эфира. Органические слои отбрасывают. Водной остаток подкисляют 2N раствором соляной кислоты до pH 2-3 и экстрагируют Гимексазол дважды порциями 50 диэтилового эфира. Объединенный диэтиловый экстракт пропускают через 50 г безводного сульфата натрия в концентратор объемом 300 . В концентратор добавляют 1 раствора полиэтиленгликоля в ацетоне и упаривают при температуре не выше 30°С до объема 0,5 - 1 . Остатки диэтилового эфира удаляют при комнатной температуре в токе азота.

Остаток из концентратора переносят в мерную пробирку с притертой пробкой объемом 5 , обмывая концентратор трижды порциями ацетона по 1 . В пробирку добавляют 1 0,4%-го раствора диэтилхлортиофосфата в ацетоне и 50 25%-го водного раствора углекислого калия.

Пробирку плотно закрывают притертой пробкой и выдерживают смесь при 45°С в течение 30 мин на водяной бане, затем охлаждают при комнатной температуре. В хроматограф вводят 1 полученного раствора.

9.2. Определение Гимексазола в масле рапса

Аналитическую пробу масла рапса массой (100,1) г помешают в плоскодонную колбу с притертой пробкой объемом 100 , добавляют 50 смеси гексан:ацетон (2:1) и экстрагируют Гимексазол в течение 10 мин в ультразвуковой ванне. Экстракт переносят в делительную воронку на 250 и добавляют 20 дистиллированной воды. После встряхивания и разделения слоев водно-ацетоновый слой собирают, а в воронку последовательно добавляют 30 ацетона, встряхивают, а затем 20 дистиллированной воды. Воронку встряхивают в течение 2 мин и после разделения водно-ацетоновый слой собирают. Объединенный водно-ацетоновый экстракт переносят в концентратор объемом 100 , добавляют 0,5 мл 25%-го водного раствора углекислого калия и удаляют ацетон при температуре не выше 30°С на роторном испарителе.

Полученный после упаривания водный остаток переносят в делительную воронку объемом 250 , обмывая колбу-концентратор двумя порциями воды по 30 . К объединенному водному остатку добавляют 1 г двууглекислого натрия, 7 г хлористого натрия и промывают дважды порциями 50 дихлорметана и дважды 50 диэтилового эфира. Органические слои отбрасывают. Водной остаток подкисляют 2N раствором соляной кислоты до pH 2-3 и экстрагируют Гимексазол дважды порциями 50 диэтилового эфира. Объединенный диэтиловый экстракт пропускают через 50 г безводного сульфата натрия в концентратор объемом 300 . В концентратор добавляют 1 раствора полиэтиленгликоля в ацетоне и упаривают при температуре не выше 30°С. Остатки диэтилового эфира удаляют при комнатной температуре в токе азота.

Остаток из концентратора переносят в мерную пробирку с притертой пробкой объемом 5 , обмывая концентратор трижды порциями ацетона 1 . В пробирку добавляют 1 0,4%-го раствора диэтилхлортиофосфата в ацетоне, 50 25%-го водного раствора углекислого калия.

Пробирку плотно закрывают притертой пробкой и выдерживают смесь при 45°С в течение 45 мин на водяной бане, затем охлаждают при комнатной температуре. В хроматограф вводят 1 полученного раствора.

9.3. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф "Цвет 550М" с ТИД.

Колонка стеклянная длиной 1 м, диаметром 3 мм, заполненная хроматоном N-supper (0,125-0,160) с 5% OV-17. Температура колонки 150°С, испарителя 220°С, детектора 320°С.

Расход газа-носителя (азот) - 26,5 , водорода - 22,4 .

Воздуха 200 . Хроматографируемый объем 1 ,

Время удерживания производного Гимексазола () мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание Гимексазола в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

, где

- высота (площадь) пика Гимексазола в стандартном растворе, мм;

- высота (площадь) пика Гимексазола в анализируемой пробе, мм;

V - объём экстракта, подготовленного для хроматографирования, ;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация Гимексазола в стандартном растворе, .

Содержание остаточных количеств Гимексазола в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор Гимексазола 0,25 , разбавляют ацетоном.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

, где

(1)

, - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости ().

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

() мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

, где

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,01*, где * - 0,01 мг/кг - предел обнаружения Гимексазола в семенах рапса).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

, где

() - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

, где

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

, где

X', X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры () с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

,

(2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условии (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

, где

(3)

, - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

14. Разработчики

Долженко В.И., Цибульская И.А., Карпова Л.М. (ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Россельхозакадемии, г. Санкт-Петербург).

Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации N 01.5.04.685 от 25.06.2010) и внесена в Федеральный реестр (ФР.1.31.2011.09105).

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач РФ

Г.Г. Онищенко

______________________________

* Внимание: вещество очень летуче - следить за герметичностью посуды.