Методические указания МУК 4.1.2855-11 "Определение остаточных количеств Пропиконазола в ягодах земляники и ягодных кустарников методом капиллярной газожидкостной хроматографии" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 31 марта 2011 г.)

Методические указания МУК 4.1.2855-11
"Определение остаточных количеств Пропиконазола в ягодах земляники и ягодных кустарников методом капиллярной газожидкостной хроматографии"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 31 марта 2011 г.)

Дата введения: с момента утверждения

Общие положения и область применения

Свидетельство об аттестации методики от 01.12.2010 N 0060.29.11.10.

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств Пропиконазола в ягодах земляники и ягодных кустарников в диапазоне 0,025-0,25 мг/кг.

Название по ИЮПАК: ()-1-[2-(2,4-дихлорфенил)-4-пропил-1,3-диоксолан-2-метил]-1Н-1,2,4-триаз ол.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 342,2.

Агрегатное состояние: вязкая жидкость.

Цвет, запах: желтоватый.

Давление насыщенного пара мПа (при 25°С), мПа (при 20°С).

Коэффициент распределения в системе октанол/вода: (рН 6,6, 25°С).

Растворимость в воде: 100 (20°С).

При 25°С растворим в большинстве органических растворителей (этанол, ацетон, толуол), в гексане - 47 .

Пропиконазол не существенно гидролизуется в щелочной и кислой средах.

Период полураспада в почве (20-25°С) от 29 до 70 дней. в воде - 6,4 дня.

Краткая токсикологическая характеристика: Пропиконазол относится к веществам малоопасным по острой пероральной ( для крыс - 1 517, для мышей - 1 490 мг/кг) и дермальной токсичности ( крысы > 4 000, кролики > 6 000 мг/кг), но к умеренно опасным по ингаляционной ( для крыс (4 ч) > 5 800 ).

Область применения: Пропиконазол - системный фунгицид широкого спектра действия. Он обладает высокой активностью против возбудителей мучнистой росы, пятнистостей и ржавчины.

Применяется с нормой расхода 0,125 кг д.в./га в посевах зерновых культур, 0,125-0,375 кг д.в./га в маточниках и питомниках смородины черной.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

- ДСД - 0,02 мг/кг массы человека;

- ОДК в почве - 0,2 мг/кг;

- ПДК в воздухе рабочей зоны - 0,5 ;

- ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,01 ;

- ПДК в воде водоема - 0,15 ;

- МДУ (мг/кг): в зерне хлебных злаков и в сахарной свекле - 0,1.

МДУ Пропиконазола (в импортируемой продукции): в ягодах земляники и ягодных кустарников - 0,05 мг/кг.

1. Метрологическая характеристика метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 1

Метрологические параметры дли Пропиконазола

Анализируемый объект	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Показатель точности (граница относительной погрешности), , %, P = 0,95	Стандартное отклонение повторяемости, , %	Предел повторяемости, r, %	Предел воспроизводимости, R, %
Ягоды земляники	0,01-0,1	50	2,54	7,05	8,39
	0,1-1,0	25	2,42	6,73	8,01
Ягоды кустарников	0,01-0,1	50	2,66	7,39	8,80
	0,1-1,0	25	2,94	8,17	9,73

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для Пропиконазола

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20
	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Полнота извлечения, %	Стандартное отклонение, S, %	Доверительный интервал среднего результата, , %
Ягоды земляники	0,025	0,025-0,25	86,02	2,11	0,85
Ягоды кустарников	0,025	0,025-0,25	81,36	2,61	0,99

2. Метод измерения

Метод основан на определении Пропиконазола методом капиллярной газожидкостной хроматографии с использованием детектора по захвату электронов после экстракции его из образцов ацетонитрилом и очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями.

Идентификация проводится по времени удерживания двух характерных пиков, а количественное определение - методом абсолютной калибровки по сумме двух характерных пиков.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Весы аналитические "OHAUS", ЕР 114 с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0,0001 г, класс точности по ГОСТ 24104-2001 - специальный (I)
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности г "ACCULAB" V600, соответствуют классу точности по ГОСТ 24104-2001 - средний (III)
Колбы мерные на 10, 25, 50, 100, 500 и 1 000	ГОСТ 1770-74
Микрошприц для газовой хроматографии "Hamilton, 1700", объем 10 , фирма "SUPELCO", кат. N 20972
Пипетки мерные на 1,0, 2,0, 5,0 рН-метр/милливольтметр pH-150 0...14 рН; мВ, номер госрегистрации 10663	ГОСТ 29227-91
Хроматограф газовый НР6890 Series GC System с детектором по захвату электронов (ЭЗД), регистрационный номер в государственном реестре средств измерения 201/978
Цилиндры мерные на 10, 25 и 50	ГОСТ 1770-74

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Пропиконазол, аналитический стандарт с
содержанием действующего вещества не менее 96,4%, чист, ГСО 7717
Азот, осч	ГОСТ 9293-74
Ацетон, осч	ТУ 6-09-3513-86
Ацетонитрил, осч, УФ-200 нм	ТУ 6-09-2167-84
Вода дистиллированная и (или)	ГОСТ 6709-72
бидистиллированная (вода дистиллированная, перегнанная повторно в стеклянной емкости)
Гелий очищенный, марки "А"	ТУ-51-940-80
Калий марганцово-кислый, ч.д.а.	ГОСТ 20490-75
Кальций хлористый, ч	ТУ 6-09-4711-81
Кислота соляная, хч	ГОСТ 857-95
Натрий серно-кислый, безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Натрий хлористый, хч	ГОСТ 4233-77
Натрия гидроокись, хч	ГОСТ 4328-77
Хлороформ, хч	ТУ 2631-001-29483781-04

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Аппарат для встряхивания проб "SKLO UNION TYP LT1"
Банки с крышками для экстракции на 250 , полипропилен, кат. N 3120-0250, фирма "NALGENE"
Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная	ГОСТ 5556-81
Виалы с тефлоновыми прокладками емкостью 40 , кат. N Z 27,702-9, фирма "Aldrich"
Воронки делительные на 250	ГОСТ 25336-82
Воронки лабораторные, стеклянные	ГОСТ 25336-82
Испаритель ротационный Rota vapor R110
Buchi с водяной баней В-480, фирма "Buchi"
Колбы конические плоскодонные на 100, 250 и 1 000	ГОСТ 25336-82
Колбы круглодонные со шлифом (концентраторы) на 100, 250 и 4 000 ТС	ТУ 92-891.029-91
Колонка хроматографическая, капиллярная кварцевая (100% диметилполисилоксана), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирма "Restek"
Насос диафрагменный FT.19, фирма "KNF Neu Laboport"
Стаканы стеклянные, термостойкие объемом 100-2 000	ГОСТ 25336-82
Установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4 000 и приемной конической колбой объемом 1 000 см
Фильтры бумажные, "красная лента"	ТУ-6-09-1678-86

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха , относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 . Выдерживают его над осушителем в течение 5-6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5°С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5°С, отбрасывают.

7.1.2. Очистка ацетона

Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцово-кислый калий из расчета 1 .

Ацетон перегоняют при температуре 56,2°С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2°С, отбрасывают.

7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцово-кислый калий из расчета 1 и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0°С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0°С, отбрасывают.

7.2. Приготовление растворов для проведения анализа

7.2.1. Приготовление рабочих растворов

7.2.1.1. Приготовление 50%-го водного раствора гидроокиси натрия.

50 г гидроокиси натрия переносят в мерную колбу на 100 , добавляют 50-60 дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.1.2. Приготовление 0,1 М раствора соляной кислоты

Мерным цилиндром отбирают 8,2 концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 1 000 , куда предварительно наливают около 400 дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов

7.2.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией Пропиконазола 1 .

Взвешивают 50 мг Пропиконазола в мерной колбе объемом 50 . Навеску растворяют в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике не более 120 суток.

7.2.2.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией Пропиконазола 10,0 .

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 , помещают в мерную колбу объемом 100 и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике не более 60 суток.

7.2.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией Пропиконазола 1,0 .

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 , помещают в мерную колбу объемом 10 и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 3 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике не более 60 суток.

7.2.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией Пропиконазола 0,5 .

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 , помещают в мерную колбу объемом 10 и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией Пропиконазола 0,2 .

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 2 , помещают в мерную колбу объемом 10 и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией Пропиконазола 0,1 .

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 1 , помещают в мерную колбу объемом 10 и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.7. Стандартный раствор N 7 с концентрацией Пропиконазола 0,05 .

Из стандартного раствора N 4 отбирают пипеткой 1 , помещают в мерную колбу объемом 10 и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 7 используется для установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость суммы площадей (высоты) двух характерных пиков от концентрации Пропиконазола в растворе , устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 .

В испаритель хроматографа вводят по 1 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости суммы площадей хроматографических пиков изомеров Пропиконазола в Hz от концентрации Пропиконазола в растворе в .

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" от 21.08.1979 N 2051-79, а также с ГОСТ 6828-89 "Земляника свежая. Требования при заготовках, поставках и реализации", ГОСТ 6829-89 "Смородина черная свежая. Требования при заготовках, поставках и реализации. ТУ".

Пробы ягод хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре от 0 до 4°С не более суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре - 18°С до 2 лет.

9. Подготовка проб и выполнение измерений

9.1. Ягоды земляники и кустарников

9.1.1. Экстракция

Образец измельчённых ягод массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 , добавляют 50 ацетонитрила и помещают на 30 мин на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 30 ацетонитрила и помещая каждый раз на 30 мин на аппарат для встряхивания проб. Экстракты объединяют в концентраторе объемом 250 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30°С.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмеишвающихся растворителей

Сухой остаток, полученный в п. 9.1.1, растворяют в 50 0,1 М раствора соляной кислоты и переносят в делительную воронку объемом 250 , доводят рН раствора при помощи 50%-го раствора гидроокиси натрия до значения 8-9. Пропиконазол экстрагируют тремя порциями хлороформа по 30 , каждый раз интенсивно встряхивая смесь в течение 2 мин. После разделения слоев нижний слой (хлороформ) собирают в концентратор объемом 250 , пропуская через слой безводного сульфата натрия. Объединённый экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30°С.

Сухой остаток растворяют в 5 ацетона и 1 пробы вводят в хроматограф.

9.2. Условия хроматографирования

Хроматограф газовый НР6890 Series GC System с детектором по захвату электронов (ЭЗД) в модификации с электронным управлением пневмонической системы (ЭУПС).

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая Rtx-1, (100% диметилполисилоксана), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура детектора - 300°С, поток обдува анода (азот) - 6,0 , поток поддува- 58,6 .

Температура испарителя - 260°С, тип газа гелий, режим Split, давление 24,89 psi, деление потока 20:1, split поток 28,5 .

Программированный нагрев колонки с 200°С (выдержка 1 мин) по 2 град./мин до 230°С и с 230°С (выдержка 1 мин) по 10 град./мин до 260°С (выдержка 5 мин), режим постоянное давление, поток колонки 1,4 , средняя скорость 39 см/с.

Абсолютное время удерживания характерных пиков Пропиконазола: Пропиконазол 1 - 10,200 мин ; Пропиконазол 2 - 10,500 мин .

Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,05-0,5 нг.

10. Обработка результатов анализа

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа HP GC ChemStation Rev. A.06.03RUS.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Пропиконазола рассчитывают по формуле:

, где

Х - содержание Пропиконазола в пробе, мг/кг;

- высота (площадь) пика стандарта, мВ;

- высота (площадь) пика образца, мВ;

А - концентрация стандартного раствора, ;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, ;

m - масса анализируемого образца, г;

Р - содержание Пропиконазола в аналитическом стандарте, %.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

, где

, - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

, где

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,025 мг/кг"*,

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

, где

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

, где

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

, где

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

, где

, , - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

, где (3)

, - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

14. Разработчики

Калинин В.А., профессор, канд. с-х. наук., Калинина Т.С, ст. н. сотр., канд. с.-х. наук, Довгилевич А.В., ст. н. сотр., канд. хим. наук, Рыбакова О.И., науч. сотр., канд. с-х. наук.

Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов". 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 53/1. Телефон: (495) 976-37-68, факс: (495) 976-43-26.

Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации N 0060.29.11.10 от 01.12.2010 и внесена в Федеральный реестр (ФР.1.31.2011.09736).

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

_____________________________

* - 0,025 мг/кг - предел обнаружения.