Методические указания МУК 4.1.2864-11 "Методика измерений остаточных количеств Тиабендазола в семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 31 марта 2011 г.)

Методические указания МУК 4.1.2864-11
"Методика измерений остаточных количеств Тиабендазола в семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 31 марта 2011 г.)

Дата введения: с момента утверждения

Общие положения и область применения

Свидетельство об аттестации методики от 23.11.2010 N 01.5.04.693.

Настоящие методические указания устанавливают метод измерения массовой концентрации Тиабендазола в семенах и масле рапса в диапазоне концентраций 0,01-0,1 мг/кг.

1. Краткая характеристика препарата

Действующее вещество: Тиабендазол.

Структурная формула:

Название действующего вещества по ИЮПАК: 2-(1,3-тиазол-4-ил)бензимидазол.

2-(4-тиазолил)-1Н-бензимидазол (С.А.).

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 201,3.

Белое кристаллическое вещество. Температура плавления: 297-298°С. Давление паров при 25°С: мПа. Коэффициент распределения н-октанол-вода: log P = 2,39 (рН 7).

Растворимость (г/л) при 20°С: н-гептан - <0,01, ксилол - 0,13, ацетон - 2,43, 1,2-дихлорэтан - 0,81, метанол - 8,28, этилацетат - 1,49, н-октанол - 3,91, вода - 10,0 (рН 2), 0,16 (рН 4), 0,03 (рН 7-10). Устойчив к гидролизу. Водный фотолиз (20°С, рН 5, 29 ч); = 4,73; = 12,00.

Краткая токсикологическая характеристика: Острая пероральная токсичность () для мышей - 3 600 мг/кг, крыс - 3 100 мг/кг, кроликов - 3 800 мг/кг, птиц - более 2 250 мг/кг; острая дермальная токсичность () для кроликов - более 2 000 мг/кг, не ирритант; ингаляционная токсичность () для крыс - более 0,5 мг/кг. Не токсичен для пчел. для рыб 0,55 мг/л при экспозиции 96 ч. Класс токсичности по ВОЗ - III.

Область применения: Тиабендазол - системный фунгицид защитного и лечебного действия. Тиабендазол образует защитный слой на обработанной поверхности, используется на овощных, плодовых и зерновых культурах. Не совместим с купратами и окисляющими агентами, такими как хлораты и нитраты.

Гигиенические нормативы для Тиабендазола в семенах и масле рапса в России не установлены.

2. Методика определения Тиабендазола в семенах и масле рапса методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении Тиабендазола методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем с последующей очисткой на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Диапазон измерений, массовая концентрация, мг/кг	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), , %	Показатель промежуточной прецизионности (относительное среднеквадратическое отклонение в условиях вариации факторов "время", "оператор" в одной лаборатории), , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), , %	Показатель точности* (границы относительной погрешности при вероятности Р = 0,95), , %
Семена рапса от 0,01 до 0,10 вкл.	5	12	14	24
Масло рапса от 0,01 до 0,10 вкл.	6	7	8	16
* Соответствует расширенной неопределенности при коэффициенте охвата k = 2.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Объект анализа	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, S; %	Доверительный интервал среднего результата,
Семена рапса	0,01	0,01-0,1	89,4	2,7	5,3
Масло рапса	0,01	0,01-0,1	89,8	1,1	2,3

2.1.3. Избирательность метода

Избирательность метода определения Тиабендазола достигается сочетанием условий подготовки проб и хроматографического анализа.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, осч	ТУ 6-09-3513-86
Ацетонитрил для ВЭЖХ, сорт 1 или хч	ТУ 6-09-3534-87
Бумажные фильтры "красная лента"	ТУ 2642-001-42624157-98
Вода бидистиллированная, деионизированная	ГОСТ 6709-79
н-Гексан, хч, свежеперегнанный	ТУ 2631-003-05807999-98
Изопропиловый спирт	ТУ 2632-015-11291058-95
Калий углекислый, хч	ГОСТ 4221-76
Калия перманганат	ГОСТ 20490-75
Кальция хлорид, хч	ГОСТ 4161-77
Кислота ортофосфорная, хч, 0,005 М водный раствор	ГОСТ 6552-80
Кислота серная, хч	ГОСТ 4204-77
Натрий двууглекислый	ГОСТ 83-79
Натрий сернокислый безводный, ч, свежепрокаленный	ГОСТ 4166-76
Натрий хлористый, чда	ГОСТ 4233-77
Натрия гидроксид, хч	ГОСТ 4328-77
Подвижная фаза для ВЭЖХ: ацетонитрил:0,005 М раствор (40:60, по объему)
Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040-0,063 mm) ("Merck", Германия)
Стекловата
Тиабендазол, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,8% (Cheminova)
Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-ацетон (80:20, по объему)
Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-ацетон (15:85, по объему)

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором
(Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный
Колонка Spherisorb Phenyl () мм, 3 мкм (Waters, USA) или аналогичная
Ванна ультразвуковая УЗВ-1,3, или аналогичная	ГОСТ Р МЭК 60335-2-15-98
Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные	ГОСТ 24104-2001
Мельница лабораторная зерновая ЛМЗ	ТУ 1-01-0593-79
Гомогенизатор	МРТУ 42-1505-63
Ротационный испаритель вакуумный
Buchi R-205 или аналогичный
Бидистиллятор
рН-метр универсальный ЭВ-74	ГОСТ 22261-76
Насос водоструйный	МРТУ 42 861-64
Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС	ГОСТ 10384-72
Колбы круглодонные на шлифах КШ10 и КШ250 29-32 ТС	ГОСТ 10384-72
Воронки лабораторные В-75-110	ГОСТ 25 336-82
Воронки делительные ВД-3-250 и 500	ГОСТ 8613-75
Цилиндры мерные на 50, 100, 500 и 1 000	ГОСТ 1774-74
Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1 000	ГОСТ 1770-74
Пипетки на 1, 2, 5, 10	ГОСТ 22292-74
Колонки стеклянные ( ) см

Допускается использование приборов и посуды с метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2.4. Отбор проб

Отбор проб семян рапса производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0-4°С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 2 месяцев.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Перед началом работы проверяют чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40°С до объёма 1,0 и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Spherisorb Phenyl) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 ) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 ч.

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты 0,5 г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 , растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объёму, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1 000 мл смешивают 800 мл н-гексана и 200 мл ацетона. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1 000 мл смешивают 150 мл н-гексана и 850 мл ацетона.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску Тиабендазола (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 ).

Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы [смесь ацетонитрил - 0,005 М (40:60, по объему)]. Стандартный и градуировочные растворы можно хранить в холодильнике при температуре 0-4°С в течение 1 месяца.

Для внесения в контрольный образец при определении полноты извлечения используют стандартный раствор, разбавленный ацетонитрилом до нужного уровня концентраций методом последовательного разбавления. Растворы для внесения в масло готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 методом последовательного разбавления по объему изопропиловым спиртом.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация Тиабендазола в растворе) в хроматограф вводят по 20 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации Тиабендазола в градуировочном растворе ().

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента:

, где

- норматив контроля градуировочного коэффициента, %. = 10% при Р = 0,95).

2.5.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 смеси гексан-ацетон (80:20, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 30 элюента N 2 и 30 элюента N 1 со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения Тиабендазола на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 отбирают 0,1 стандартного раствора Тиабендазола с концентрацией 10 . Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40°С), остаток растворяют в 5 элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 50 элюента N 1, которые отбрасывают, затем 100 элюента N 2 со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание Тиабендазола (п. 2.6.3).

Фракции, содержащие Тиабендазол, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют (п. 2.6.3). Рассчитывают содержание Тиабендазола в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания Тиабендазола и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.7. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Извлечение Тиабендазола из проб семян и масла рапса

Навеску измельченных семян массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 100 мл и экстрагируют Тиабендазол 40 ацетонитрила на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды порциями по 30 .

Навеску масла массой 20 г помещают в делительную воронку емкостью 250 и экстрагируют Тиабендазол трижды ацетонитрилом порциями по 30 , встряхивая смесь каждый раз в течение 2-3 мин и собирая нижний органический слой.

Объединенные экстракты семян или масла промывают гексаном в делительных воронках дважды по 25 , встряхивая смесь каждый раз в течение 1-2 мин и собирая нижний органический слой.

После этого экстракты выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С. Дальнейшую очистку экстрактов проводят на колонке с силикагелем по п. 2.6.2.

Внимание! Отделение ацетонитрильного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

2.6.2. Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.1 экстрактов растительных материалов, количественно переносят двумя порциями смеси гексан-ацетон (80:20, по объему) по 5 каждая в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 50 элюента N 1, который отбрасывают. Тиабендазол элюируют 80 элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 . Раствор упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40°С. Сухой остаток растворяют в 2 подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2 487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Колонка Spherisorb Phenyl (150х4.6) мм, 3 мкм (Waters, USA).

Температура колонки °С.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: ацетонитрил: 0,005 М раствор (40:60, по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 300 нм.

Объем вводимой пробы 20 .

Линейный диапазон детектирования 0,1-2,00 мкг/мл.

2.6.4. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание Тиабендазола в образцах семян или масла (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

, где

- площадь пика Тиабендазола в стандартном растворе, ();

- площадь пика Тиабендазола в анализируемой пробе, ();

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, ;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация стандартного раствора Тиабендазола, ;

Содержание остаточных количеств Тиабендазола в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор Тиабендазола 2 , разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

3. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

, где (1)

, - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (г = ).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

4. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

, где

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг*, где * - 0,01 мг/кг - предел обнаружения Тиабендазола в рапсе).

5. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

5.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

, где

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

, где

Д - граница абсолютной погрешности, мг/кг: где

, где

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

, где

, X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры () с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

5.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

, где (3)

, - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

6. Требования безопасности

6.1. При работе необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 1.2.2701-10 и ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

7. Требования к квалификации оператора

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 5.

8. Разработчики

Цибульская И.А., Черменская Т.Д., Ковров Н.Г. (ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Россельхозакадемии, г. Санкт-Петербург).

Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации N 01.5.04.686) и внесена в Федеральный реестр (ФР.1.31.2011.09107).

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко