Методические указания по определению эфаля в зерновых культурах методом газожидкостной хроматографии (Дополнение к методическим указаниям N 6132-91) (утв. Министерством здравоохранения СССР 29 июля 1991 г. N 6145-91)

1. Краткая характеристика метода

Эфаль - смесевой препарат:

(I) трис-O-(этилортофосфит)алюминия (аналог альетта):

	М.м. 354.0

(II) фосфит алюминия:

М.м. 106,0

(III) фосфористая кислота:

М.м. 82,02

Эфаль - 66,6% к.э. - вязкая прозрачная жидкость, хорошо растворима в воде. Компоненты препарата I, III в воде растворимы, II - труднорастворимы; в органических растворителях практически не растворимы.

МДУ эфаля в огурцах - 0,5 мг/кг, винограде - 0,8 мг/кг, в воде - 0,3 мг/л.

2. Методика определения эфаля в зерновых культурах (пшеница, рожь) методом газожидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении эфаля из исследуемого объекта водой, концентрировании и последующем определении методом реакционной газожидкостной хроматографии в виде метилпроизводных.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Минимально детектируемое количество:

этилфосфита алюминия - 0,1 нг;

фосфористой кислоты - 0,1 нг.

Предел обнаружения в пробе - 0,2 мг/кг.

Среднее значение определения при n = 5, %, - 73 и 71 соответственно.

Размах варьирования, %, - 70 - 78 и 64 - 76.

Стандартное отклонение, %, - 3,6 и 5,7.

Доверительный интервал среднего при P = 0,95, и .

2.1.3. Избирательность метода

Условия экстракции и последующего газохроматографического определения эфаля (этилфосфита алюминия и фосфористой кислоты) позволяют избирательно определять препарат в присутствии фосфорорганических и пестицидов других групп.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-87.

Метилгликоль (метилцеллозольв), чда, МРТ 6-09-6347-69.

Гидразингидрат, чда.

Кали едкое, ч., ГОСТ 24363-80.

Хлороформ, х.ч., ГОСТ 20015-74.

Кислота уксусная (ледяная), хч., ГОСТ 18270-81.

Кислота серная, хч., ГОСТ 4204-77, 20%-ный раствор.

Метиловый спирт, хч., ГОСТ 6996-77.

Диэтиловый эфир, хч., ГОСТ 6262-79.

Азот в баллоне, особой чистоты, ГОСТ 9293-74.

Водород в баллоне, ГОСТ 3022-88.

Неподвижная фаза - 15% Карбовакс 20 М на хроматоне N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 мм).

Этилфосфит алюминия, хч.

Фосфористая кислота, хч.

Основные стандартные растворы (ОСР) этилфосфита алюминия и фосфористой кислоты с концентрацией по 100 мкг/мл готовят взятием навески каждого вещества 10 мг (0,0100 г) хч и растворением в дистиллированной воде в мерных колбах емкостью 100 мл. Хранить в холодильнике не более 10 дней.

Рабочие стандартные растворы с содержанием 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2 мкг/мл готовят разбавлением ОСР водой. Хранить не более 2 дней.

2.3. Приборы, аппаратура и посуда

Газовый хроматограф серии "Цвет" или аналогичный с пламенно-фотометрическим (фосфорным) детектором (ПФД).

Колонка стеклянная, длина 2 м, диаметр 3,5 мм.

Мельница ручная типа РСТ УССР 1913-82 или электрическая, позволяющая измельчать зерно до 1 - 3 мм.

Ротационный испаритель типа ИР-1М, ТУ 25-11-917-76.

Колбы грушевидные (круглодонные), ГОСТ 25336-82, вместимостью 500 мл, 100 мл, 50 мл ОКШ 500-29/50-14.

Колбы мерные, ГОСТ 1770-74, вместимостью 50, 100 мл.

Пробирки мерные на шлифах, ГОСТ 1770-74, вместимостью 5 мл.

Пипетки, ГОСТ 20292-74, на 0,1; 0,2; 1; 5; 10 мл.

Микрошприц на 10 мкл МШ-10, ТУ SE-2.833.024.

Прибор для получения диазометана (рис. 1):

- колба круглодонная, емкостью 500 мл на шлифах (реакционный сосуд);

- холодильник Либиха на шлифах;

- делительная воронка на шлифе (капельница);

- П-образный переходник на шлифах;

- капилляр.

2.4. Подготовка к определению

2.4.1. Отбор проб

Отбор проб и доставка проб производятся в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденными Минздравом СССР, N 2051-79 от 21.08.79.

2.4.2. Подготовка колонки для ГЖХ

Колонку заполняют стандартной фазой (15% Карбовакс 20 М на хроматоне N-AW-DMCS), подключив ее к вакууму водоструйного насоса. Заполненную колонку кондиционируют в термостате колонок в течение 6 часов без подключения к детектору, продувая азотом (20 - 24 мл/мин.) и постепенно поднимая температуру от 100°C до 150°C. Затем колонку присоединяют к детектору.

2.5. Описание определения

2.5.1. Экстракция

Зерно измельчают и просеивают через сита 1 - 3 мм. Для анализа берут 25 г средней пробы подготовленного зерна. Приливают к зерну 50 мл хлороформа и 50 мл воды. Встряхивают пробу на аппарате для встряхивания 30 минут. Дают 15 минут отстояться. Сливают жидкую фазу, фильтруя под вакуумом на воронке Бюхнера через тройной слой марли. К остатку в колбе прибавляют 25 мл хлороформа и 25 мл воды, энергично встряхивают и фильтруют, как описано выше. Фильтрат переносят в делительную воронку и отбрасывают нижний хлороформный слой. Водную фазу переносят в колбу для отгонки и концентрируют до 10 мл под вакуумом водоструйного насоса при температуре бани не более 45°C. Измеряют точно объем сконцентрированной пробы (), отбирают 0,2 мл, переносят в мерную пробирку и доводят до 2 мл смесью растворителей метилгликоль - ацетонитрил (1:1). Полученную смесь переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 15 минут, после чего отбирают для дальнейшего метилирования 1 мл центрифугата; либо фильтруют через небольшой бумажный фильтр "красная лента" и также отбирают для метилирования точно 1 мл смеси, что соответствует аликвоте 0,1 мл () сконцентрированного () экстракта.

2.5.2. Получение метилпроизводных эфаля (этилфосфита алюминия и фосфористой кислоты)

Подготовленные аликвоты экстрактов () метилируют диазометаном. Одновременно метилируют стандартные растворы этилфосфита алюминия и фосфористой кислоты. Для этого берут 0,1 мл рабочих стандартных растворов (10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2 мкг/мл) и по 0,9 мл смеси растворителей метилгликоль - ацетонитрил (1:1), т.е. подготовленные к метилированию и дальнейшему газохроматографическому анализу стандарты содержат 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,2 мкг/мл этилфосфита алюминия или фосфористой кислоты.

2.5.2.1. Получение диазометана

Вследствие токсичности и раздражающего действия диазометана прибор должен быть установлен в вытяжном шкафу. При работе использовать индивидуальные средства защиты: экран, перчатки, очки.

В реакционную колбу (см. рис. 1) помещают 6 г кали едкого, 3 мл метанола и 3 мл гидразингидрата. Через смесь продувают азот с расходом ~ 100 мл/мин. Из капельницы подают хлороформ со скоростью 1 капля за 1 - 2 с.

2.5.2.2. В подготовленные пробы и стандарты вводят по 5 - 6 мкл ледяной уксусной, 3 - 5 мкл 20-процентной серной кислоты и продувают получаемый в описанном выше приборе диазометан до появления интенсивной желтой окраски раствора пробы или стандарта. Затем немедленно нейтрализуют избыток диазометана в пробе (стандарте) прибавлением нескольких микролитров уксусной кислоты до исчезновения окраски. Пробы и стандарты готовы к газохроматографическому определению.

После окончания метилирования прекращают подачу в реакционную колбу хлороформа, отключают азот, остатки в реакционной колбе заливают водой и тщательно промывают колбу и все части прибора водой.

2.5.3. Хроматографический анализ

Газовый хроматограф серии "Цвет" с пламенно-фотометрическим (фосфорным) детектором (ПФД).

Колонка хроматографическая стеклянная длиной 2 м, внутренним диаметром 3,5 мм.

- Неподвижная фаза 15% Карбовакс 20 М на хроматоне N-AW-DMCS.

- Температура колонки 145 °C.

- Температура испарителя 180 °C.

- Газ-носитель - азот с расходом 50 мл/мин.

- Расход водорода - 65 мл/мин.

- Вводимый объем - 1 - 3 мкл.

- Шкала множителя .

- Скорость диаграммной ленты 240 мм/час.

- Время удерживания:

диметилфосфоната (метилирование фосфористой кислоты): 2,1 мин.;

метилэтилфосфоната (метилирование этилфосфита алюминия): 2,6 мин.

Предел определения:

диметилфосфоната - 0,1 нг;

метилэтилфосфоната - 0,1 нг.

Количественную оценку проводят методом соотношения со стандартом по сравнению со стандартами этилфосфита алюминия и фосфористой кислоты.

Расчет результатов анализа проводят по формуле:

, где

где:

X - содержание этилфосфита алюминия (фосфористой кислоты) в анализируемой пробе, мг/кг;

C - концентрация стандартного раствора для ГЖХ, вводимого в хроматограф, мкг/мл;

- высота пика стандартного раствора, мм;

- высота пика пробы, мм;

- конечный объем сконцентрированного экстракта пробы, мл;

- часть экстракта V , взятая для метилирования, мл;

- объем стандартного раствора, введенного в хроматограф, мкл;

- объем пробы, введенной в хроматограф;

P - масса анализируемой пробы, г.

3. Техника безопасности

Соблюдать все необходимые требования безопасности при работе в химических лабораториях, а также Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях, отделениях, отделах санитарно-эпидемиологических учреждений системы МЗ СССР, N 2455-81 от 20.10.81.

Особое внимание обратить при работе с гидразингидратом и диазометаном. Соблюдать требования безопасности, описанные в методике. Гидразингидрат - токсичная, пожароопасная жидкость (температура воспламенения 59°, самовоспламенения - 267°). При попадании гидразингидрата на окружающие предметы, руки, одежду его немедленно смывают большим количеством воды.

Рис. 1	Прибор для получения диазометана 1. Трехгорлый реактор 2. Капельная воронка 3. Обратный холодильник 4. Трубка для подачи азота 5. Газоотводная трубка