Приложение В (обязательное). Состав и приготовление питательных сред и реактивов

Приложение В
(обязательное)

Состав и приготовление питательных сред и реактивов

B.1 Забуференная пептонная вода

B.1.1 Состав:

- пептон - 10,0 г;

- хлористый натрий - 5,0 г;

- двузамещенный фосфорнокислый натрий 12-водный - 9,0 г;

- однозамещенный фосфорнокислый калий - 1,5 г;

- вода -1000 .

B.1.2 Приготовление

При нагревании компоненты растворяют в воде. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°C. Среду разливают во флаконы подходящей вместимости с учетом добавления необходимой навески продукта. Если навеска равна 25 г, то забуференную пептонную воду разливают по 225 . Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре °C.

B.2 Среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон)

B.2.1 Раствор А

B.2.1.1 Состав:

- ферментативный гидролизат сои - 5,0 г;

- хлористый натрий - 8,0 г;

- фосфорнокислый однозамещенный калий -1,4 г;

- фосфорнокислый двузамещенный калий - 0,2 г;

- вода - .

B.2.1.2 Приготовление

Компоненты растворяют в воде при нагревании до температуры около 70°C. Раствор готовят за день до приготовления RVS-бульона.

B.2.2 Раствор B

B.2.2.1 Состав:

- хлористый магний 6-водный - 400 г;

- вода -1000 .

B.2.2.2 Приготовление

Хлористый магний растворяют в воде. Поскольку эта соль очень гигроскопична, рекомендуется из новой открытой упаковки растворять ее по определенной схеме. Например, к 250 г хлористого магния 6-водного добавляют 625 воды, получая раствор объемом 788 массовой концентрации 31,7 г/100 . Состав раствора соответствует В.2.2.1. Раствор переносят в бутылку из темного стекла с притертой пробкой и хранят при комнатной температуре не более двух лет.

B.2.3 Раствор С

B.2.3.1 Состав:

- малахитовый зеленый оксалат - 0,4 г;

- вода -100 .

B.2.3.2 Приготовление

Малахитовый зеленый оксалат переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 и доводят водой до метки. Раствор переносят в бутылку из темного стекла, хранят при комнатной температуре не более 8 мес.

B.2.4 Готовая среда

B.2.4.1 Состав:

- раствор А (см. В.2.1) -1000 ;

- раствор В (см. В.2.2) - 100 ;

- раствор С (см. В.2.3) - 10 .

B.2.4.2 Приготовление

Прибавляют к 1000 раствора А 100 раствора В и 10 раствора С. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял . Перед использованием среду разливают по пробиркам по 10 . Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре °C. Рекомендуется использовать среду в день приготовления. При необходимости допускается готовую среду хранить по ГОСТ 10444.1.

Следует учитывать, что на этой среде не растет S. Typhi.

Примечание - Конечный состав среды: ферментативный гидролизат сои - 4,5 ; хлористый натрий - 7,2 ; фосфорнокислый однозамещенный калий - 1,26 , фосфорнокислый двузамещенный калий - 0,18 ; хлористый магний безводный - 13,4 или хлористый магний 6-водный - 28,6 ; малахитовый зеленый оксалат - 0,036 .

B.3 Селенитовая среда

Селенитовую среду готовят из двух растворов.

B.3.1 Раствор 1

B.3.1.1 Состав:

- пептон- 5,0 г;

- двузамещенный фосфорнокислый натрий безводный - 7,0 г;

- однозамещенный фосфорнокислый натрий - 3,0 г;

- лактоза - 4,0 г;

- вода-1000.

B.3.1.2 Приготовление

При нагревании растворяют компоненты в воде. Путем изменения соотношения фосфатных солей устанавливают рН . Среду разливают по 100 в колбы или флаконы и стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение двух дней или при температуре °C в течение 30 мин.

B.3.2 Раствор 2

В.3.2.1 Состав:

- кислый селенистокислый натрий - 10,0 г;

- вода-100.

Кислый селенистокислый натрий растворяют с соблюдением правил асептики в стерильной дистиллированной воде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

B.3.3 Готовая среда

B.3.3.1 Состав:

раствор 1-100 ;

раствор 2-4 .

B.3.3.2 Приготовление среды

К раствору 1 прибавляют раствор 2, среду разливают по 10 в пробирки.

Стерилизация приготовленной среды не допускается, так как при этом происходит редукция кислого селенистокислого натрия, выпадает осадок красного цвета и среда становится непригодной для использования. Селенитовую среду выпускают в сухом виде и готовят по инструкции, указанной на этикетке.

B.4 Тетратионатный бульон Мюллер-Кауфман

B.4.1 Основа среды

B.4.1.1 Состав:

- мясо-пептонный бульон - 100 ;

- углекислый кальций - 4,5 г.

B.4.1.2 Приготовление среды

В мясо-пептонный бульон, приготовленный по ГОСТ 10444.1, помещают стерильный углекислый кальций. Углекислый кальций стерилизуют по ГОСТ 10444.1.

Приготовленную основу стерилизуют в автоклаве при температуре °C в течение 20 мин.

B.4.2 Раствор 1

B.4.2.1 Состав:

- гипосульфит натрия - 50 г;

- вода - до 100 .

B.4.2.2 Приготовление

Гипосульфит натрия помещают в колбу вместимостью 100 , растворяют в дистиллированной воде и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор переливают в колбу или флакон и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин или при температуре °С в течение 20 мин. Раствор хранят не более 1 мес при температуре °C.

B.4.3 Раствор 2

B.4.3.1 Состав:

- йодистый калий - 25 г;

- йод кристаллический - 20 г;

- вода - до 100 .

B.4.3.2 Приготовление

Йодистый калий помещают в колбу вместимостью 100 , растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, прибавляют кристаллический йод, растворяют его. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят при комнатной температуре в плотно закрытом сосуде из темного стекла.

B.4.4 Раствор 3

В.4.4.1 Состав:

- бриллиантовый зеленый - 0,5 г;

- вода - 100.

B.4.4.2 Приготовление

Бриллиантовый зеленый переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

B.4.5 Раствор 4

B.4.5.1 Состав:

- сухая бычья желчь - 10 г

- вода -до 100 .

B.4.5.2 Приготовление

Сухую желчь растворяют в 100 дистиллированной воды или используют 100 натуральной желчи. Раствор желчи или натуральную желчь стерилизуют при температуре °C в течение 20 мин. Раствор хранят не более 1 мес при температуре °C.

B.4.6 Готовая среда

B.4.6.1 Состав:

- основа среды по В.4.1-100 ;

- раствор 1-10 ;

- раствор 2-2 ;

- раствор 3-0,2 ;

- раствор 4-5 .

B.4.6.2 Приготовление

Указанные растворы прибавляют к основе среды в приведенном выше порядке, перемешивая смесь после каждого прибавления, среду разливают по 10 в пробирки.

Среду используют в день приготовления.

Для повышения селективности среды допускается добавлять к среде раствор новобиоцина натриевой соли из расчета 0,5 раствора новобиоцина натриевой соли на 100 основы среды.

B.4.7 Раствор новобиоцина

B.4.7.1 Состав:

- новобиоцин натриевая соль - 0,04 г;

- вода -5 .

B.4.7.2 Приготовление

Новобиоцин натриевую соль растворяют в дистиллированной воде. Раствор стерилизуют фильтрацией по ГОСТ 26670 через мембранный фильтр размером пор 0,22 мкм, хранят при температуре °C в течение четырех недель.

В.5 Ксилоза-лизин-деоксихолатный агар (XLD-aгap)

B.5.1 Основа среды

B.5.1.1 Состав:

- дрожжевой экстракт (порошок) - 3,0 г;

- хлористый натрий (NaCI) - 5,0 г;

- ксилоза - 3,75 г;

- лактоза - 7,5 г;

- сахароза - 7,5 г;

- L-лизин гидрохлорид - 5,0 г;

- тиосульфат натрия - 6,8 г;

- железо III аммоний цитрат - 0,8 г;

- феноловый красный - 0,08 г (или 20 раствора, приготовленного по 5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);

- деоксихолат натрия - 1,0 г;

- агар - от 9 до 18 г*;

- вода - 1000 .

B.5.1.2 Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты основы или дегидратированную основу в воде при частом помешивании. Доводят до кипения, но не кипятят, избегая перегрева.

Устанавливают рН так, чтобы после прогрева он составлял при температуре 25°C. Разливают основу в пробирки или флаконы подходящей вместимости. Затем прогревают на кипящей водяной бане около 5 мин.

B.5.2 Раствор фенолового красного

В.5.2.1 Состав:

- феноловый красный - 0,4 г;

- вода - 100 .

В.5.2.2 Приготовление

Феноловый красный переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре.

В.5.3 Приготовление чашек со средой

Среду после прогрева переносят в водяную баню при температуре от 44°C до 47°C, перемешивают и разливают в чашки, дают затвердеть. Перед использованием среду в чашках предпочтительно с открытой крышкой и поверхностью среды вниз подсушивают в шкафу с температурой от 37°C до 55°C до тех пор, пока поверхность среды не станет сухой. Допускается хранить чашки со средой при температуре °C не более пяти дней.

B.6 Дифференциально-диагностические среды

B.6.1 Висмут-сульфит агар (агар Вильсон-Блера).

B.6.2 Среда Плоскирева.

B.6.3 Среда Эндо.

B.6.4 Среда Левина.

Среды готовят по инструкции, указанной на этикетке.

B.6.5 Бриллиантовый зеленый агар

B.6.5.1 Состав:

- дрожжевой экстракт - 3 г:

- пептон - 10 г;

- хлористый натрий - 5 г;

- лактоза - 10 г;

- сахароза - 10 г;

- феноловый красный -0,08 г (или 20 раствора, приготовленного по В.5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);

- агар - 20 г;

- бриллиантовый зеленый - 0,0125 г (или 2,5 раствора, приготовленного по В.4.4);

- вода - 1000.

B.6.5.2 Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты основы или дегидратированную основу в воде при частом помешивании. Доводят до кипения, кипятят 1 мин.

Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°C. Разливают среду во флаконы подходящей вместимости. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре °C. Охлаждают до температуры от 45°C до 50°C и разливают в чашки Петри.

B.7 Питательный агар

B.7.1 Состав:

- мясной экстракт - 3 г;

- пептон - 5 г;

- агар -от 9 до 18 г;

- вода -1000 .

B.7.2 Приготовление

Компоненты растворяют в воде при нагревании. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°C. Переносят питательную среду в пробирки или флаконы, стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре °C.

B.7.3 Приготовление чашек с питательным агаром

Переносят приблизительно 15 расплавленной среды в стерильные чашки Петри и поступают по В.5.3.

B.8 Мясо-пептонный агар

Мясо-пептонный агар готовят по ГОСТ 10444.1 или используют ГРМ-агар.

ГРМ-агар готовят по инструкции, указанной на этикетке.

B.9 Мясо-пептонный бульон с глюкозой

Мясо-пептонный бульон с глюкозой готовят по ГОСТ 10444.1. Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6-7 .

B.10 Среды с углеводами (среды Гисса)

Среды с углеводами (среды Гисса) готовят по ГОСТ 10444.1 или используют сухие среды с углеводами, которые готовят по инструкции, указанной на этикетке.

B.11 Трехсахарный железистый агар (TSI-arap)

В.11.1 Состав:

- мясной экстракт -3,0 г;

- дрожжевой экстракт - 3,0 г;

- пептон - 20,0 г;

- хлористый натрий (NaCI) - 5,0 г;

- лактоза - 10,0 г;

- сахароза - 10,0 г;

- глюкоза - 1,0 г;

- железо (III) цитрат - 0,3 г;

- тиосульфат натрия - 0,3 г;

- феноловый красный - 0,024 г (или 6 раствора, приготовленного по B.5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);

- агар - от 9 до 18 г;

- вода - 1000 .

В.11.2 Приготовление

При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°C. Переносят среду в пробирки по 7-8 . Стерилизуют 15 мин в автоклаве при °C. Затем пробирки оставляют в наклонном положении так, чтобы высота столбика среды составляла около 2,5 см, а скошенная поверхность над ним - 5 см.

Допускается использование агара Клиглера или среды Олькеницкого. Среды готовят по инструкциям, указанным на этикетках.

B.12 Агар с мочевиной (агар Кристенсена)

B.12.1 Основа среды

B.12.1.1 Состав:

- пептон - 1,0 г;

- глюкоза - 1,0 г;

- хлористый натрий (NaCI) - 5,0 г;

- однозамещенный фосфорнокислый калий - 2,0 г;

- феноловый красный - 0,012 г (или 3 раствора, приготовленного по В.5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);

- агар - от 9 до 18 г;

- вода - 1000 .

B.12.1.2 Приготовление

При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°C. Основу среды в определенных объемах разливают в колбы или флаконы и стерилизуют в автоклаве при температуре °C в течение 15 мин.

B.12.2 Раствор мочевины

B.12.2.1 Состав:

- мочевина - 40 г;

- вода до конечного объема -100 .

B.12.2.2 Приготовление

Мочевину помещают в колбу вместимостью 100 , растворяют в воде, объем раствора доводят водой до метки. Раствор мочевины стерилизуют фильтрацией по ГОСТ 26670 через фильтры с размером пор 0,22 мкм или текучим паром в течение 30 мин.

B.12.3 Раствор фенолового красного

В.12.3.1 Состав и приготовление - по В.5.2.

B.12.4 Готовая среда

B.12.4.1 Состав:

- основа (см. В.12.1) - 950 ;

- раствор мочевины (см. В.12.2) - 50 .

B.12.4.2 Приготовление

Прибавляют с соблюдением правил асептики раствор мочевины к основе, предварительно расплавленной и охлажденной до температуры от 44°C до 47°C. Разливают готовую среду в стерильные пробирки 7-8 . После стерилизации среду скашивают по В.11.2.

B.13 L-лизиндекарбоксилазная среда

B.13.1 Состав:

- L-лизин моногидрохлорид - 5,0 г;

- дрожжевой экстракт - 3,0 г;

- глюкоза - 1,0 г;

- бромкрезоловый пурпуровый - 0,015 г (или 5 раствора, приготовленного по В.13.3);

- вода - 1000 .

B.13.2 Приготовление

Компоненты растворяют в воде при нагревании.

Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°C.

Переносят среду в пробирки по 2-5 .

Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре °C.

В.13.3 Раствор бромкрезолового пурпурового

B.13.3.1 Состав:

- бромкрезоловый пурпуровый - 0,3 г;

- вода - 100 .

B.13.3.2 Приготовление

Бромкрезоловый пурпуровый переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 и доводят водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

B.14 Бета-галактозидазный реактив

B.14.1 Буферный раствор

B.14.1.1 Состав:

- фосфорнокислый однозамещенный натрий - 6,9 г;

- гидроксид натрия (NaOH) концентрации 10 - около 3 ;

- вода до конечного объема - 50 .

B.14.1.2 Приготовление

Растворяют фосфорнокислый однозамещенный натрий приблизительно в 45 воды в мерном флаконе. Устанавливают рН с помощью раствора гидроксида натрия при температуре 25°C. Добавляют воду до объема 50 .

B.14.2 ONPG-раствор

B.14.2.1 Состав:

- о-нитрофенил -D-галактопиранозид (ONPG) - 0,08 г;

- вода -15 .

B.14.2.2 Приготовление

Растворяют ONPG в воде температурой около 50°C. Раствор охлаждают.

B.14.3 Готовый реактив

B.14.3.1 Состав:

- буферный раствор (см. В.14.1) - 5 ;

- ONPG-раствор (см. В.14.2)- 15 .

B.14.3.2 Приготовление

Готовят свежий раствор, прибавляя буферный раствор к ONPG-раствору.

B.15 Среда и реактивы для реакции Фогес-Проскауера (VP)

B.15.1 VP-среда

B.15.1.1 Состав:

- пептон - 7 г;

- глюкоза - 5 г;

- фосфорнокислый двузамещенный калий - 5 г;

- вода - 1000 .

B.15.1.2 Приготовление

Компоненты растворяют в воде при нагревании. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°C. Среду разливают в пробирки по 3 . Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре °C.

B.15.2 Раствор креатина (N-амидиносаркозина)

B.15.2.1 Состав:

- креатин моногидрат - 0,5 г;

- вода - 100 .

B.15.2.2 Приготовление

Креатин моногидрат растворяют в воде.

B.15.3 1-нафтол, спиртовой раствор

B.15.3.1 Состав:

- 1-нафтол-6 г;

- спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья объемной долей 96% - 100 .

B.15.3.2 Приготовление

Растворяют 1-нафтол в этаноле.

B.15.4 Раствор гидроксида калия

B.15.4.1 Состав:

- гидроксид калия (КOН) - 40 г;

- вода - 100 .

B.15.4.2 Приготовление

Гидроксид калия растворяют в воде.

B.16 Реактивы для индольной реакции

B.16.1 Реактив Ковача

B.16.1.1 Состав:

- 4-диметиламинобензальдегид - 5 г;

- соляная кислота плотностью 1,19 - 25 ;

- 2-метилбутан-2-ол (изобутиловый спирт) - 75 .

B.16.1.2 Приготовление

Компоненты перемешивают.

B.16.2 Реактив Эрлиха

B.16.2.1 Состав:

- парадиметиламинобензальдегид - 1 г;

- этиловый спирт объемной долей 96% - 95 ;

- соляная кислота плотностью 1,19 - 80 .

B.16.2.2 Приготовление

Компоненты перемешивают.

B.17 Триптон/триптофановая среда

B.17.1 Состав:

- триптон - 10 г;

- хлористый натрий (NaCl) - 5 г;

- DL-триптофан - 1 г;

- вода - 1000 .

B.17.2 Приготовление

Компоненты растворяют в горячей воде. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°C. Разливают среду по 5 в пробирки. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре °C.

B.18 Бульон Хоттингера

Бульон Хоттингера готовят по ГОСТ 10444.1. Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6-7 .

B.19 Мясо-пептонный бульон с 0,05% L-триптофана

B.19.1 Состав:

- L-триптофан - 0,05 г;

- мясо-пептонный бульон - 100 .

B.19.2 Приготовление

L-триптофан растворяют в мясо-пептонном бульоне, приготовленном по ГОСТ 10444.1, разливают в пробирки по 6-7 и стерилизуют при температуре °C в течение 20 мин.

B.20 Полужидкий питательный агар

B.20.1 Состав:

- мясной экстракт -3,0 г;

- пептон - 5,0 г;

- агар - от 4 до 9 г*;

- вода - 1000 .

B.20.2 Приготовление

Компоненты растворяют в воде при нагревании. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°C. Разливают среду во флаконы подходящей вместимости. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре °C.

B.20.3 Приготовление пробирок с агаром

В стерильные пробирки наливают по 6-7 свежеприготовленного агара.

B.21 Полужидкий мясо-пептонный агар

Готовят по ГОСТ 10444.1 также, как мясо-пептонный агар, но при приготовлении добавляют 4,0-9,0 г агара на 1 мясо-пептонного бульона, перед стерилизацией среду разливают по 6-7 в пробирки.

B.22 Физиологический раствор

B.22.1 Состав:

- хлористый натрий (NaCl) - 8,5 г;

- вода - 1000 .

B.22.2 Приготовление

Хлористый натрий растворяют в воде. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°C. Разливают во флаконы подходящей вместимости, стерилизуют в автоклаве при температуре °C в течение 15 мин.

Допускается использование готовых и дегидратированных, в том числе хромогенных, питательных сред аналогичного состава и зарегистрированных на территории государств, принявших стандарт.