Приложение 1. Методы микробиологического анализа

Приложение 1

Методы микробиологического анализа

I. Общие положения

Методы микробиологического анализа включают:

I. Общие положения:

1.1. Аппаратура, инвентарь, посуда.

1.2. Растворы, реактивы, индикаторы, компоненты сред и питательные среды.

1.3. Пробы, отбор и подготовка к анализу.

II. Методы микробиологического анализа на различные группы микроорганизмов:

Метод N 1 - "Пищевые продукты. Определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов посевом в агаризованную среду".

Метод N 2 - "Пищевые продукты. Определение количества колиформных бактерий".

Метод N 3 - "Пищевые продукты. Определение количества бактерий Escherichia coli".

Метод N 4 - "Пищевые продукты. Выявление бактерий рода сальмонелл".

Метод N 5 - "Пищевые продукты. Определение количества Staphylococcus aureus".

Метод N 6 - "Пищевые продукты. Определение количества плесневых грибов и дрожжей".

Метод N 7 - "Пищевые продукты. Определение количества сульфитредуцирующих клостридий".

1.1. Аппаратура, инвентарь, посуда

1.1.1. Для проведения анализа применяют:

Автоклав электрический медицинский, обеспечивающий рабочее давление Па (2,5 атм.);

анаэростат и (или) реактивы, обеспечивающие анаэробные условия культивирования посевов;

баню водяную с терморегулятором, обеспечивающим регулирование температуры до 100°С с точностью ;

весы лабораторные аналитические;

весы лабораторные с пределами взвешивания до 500 г;

гомогенизатор лабораторный или размельчитель тканей РТ-1;

дистиллятор электрический;

лупу с пятикратным увеличением;

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение от до с приспособлением для фазовоконтрастного микроскопирования;

прибор для счета колоний;

pH-метр и манометр;

стерилизаторы (сушильный шкаф) с терморегулятором, обеспечивающим нагрев до 190°С;

термостаты на , , , , с относительной влажностью не менее 95%;

холодильник бытовой;

центрифугу;

воронки стеклянные по ГОСТ 8613-75;

колбы стеклянные термостойкие широкогорлые, плоскодонные вместимостью 100, 250, 500 и 1000 ;

петлю бактериологическую;

пипетки пастеровские;

пипетки бактериологические вместимостью 1, 2, 5 и 10 ;

пробоотборники, ножи, ножницы, ложки из нержавеющей стали, пинцеты, скальпели, долота, консервный нож, пробойники;

пробирки бактериологические размером 15х150 мм, 20х200 мм;

пробки резиновые по ГОСТ 7852-76;

спиртовку или газовую горелку;

стекла предметные по ГОСТ 9274-75;

стекла покровные по ГОСТ 6672-75;

ступку фарфоровую с пестиком вместимостью 300-500 ;

чашки бактериологические Петри;

шпатели стеклянные;

штативы для пробирок;

цилиндры стеклянные разной вместимостью;

бумагу оберточную;

бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026-76;

бумажные фильтры;

вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 6556-75;

ерши;

марлю медицинскую по ГОСТ 9412-77;

масло иммерсионное по ТУ 81-05-79-69;

мыло;

порошки стиральные;

щетки.

1.1.2. Посуду, инструменты и материалы, соприкасающиеся с продуктами во время отбора проб и проведения анализа, стерилизуют одним из способов: насыщенным паром в течение 30 мин в автоклаве при температуре или горячим воздухом в стерилизаторе (сушильном шкафу) при температуре от 180°С до 185°С в течение 15 мин, при температуре от 160°С до 165°С - в течение 120 мин, или обработкой путем погружения в этиловый спирт с последующим фламбированием.

1.2. Растворы, реактивы, индикаторы, компоненты сред и питательные среды

1.2.1. Для приготовления растворов реактивов, индикаторов, компонентов сред и питательных сред применяют, если нет специальных указаний, дистиллированную воду и реактивы квалификации "химически чистый" или "чистый для анализа".

1.2.2. Приготовление и применение растворов, реактивов, индикаторов и компонентов сред.

Растворы

1.2.2.1. Раствор натрия гидроокиси с массовой долей 10%

10 г гидроокиси натрия (едкого натрия) переносят, смывая водой, в мерную колбу вместимостью 100 , доводят объем до метки и получают 10%-ный раствор.

Применяют для подщелачивания питательных сред.

1.2.2.2. Раствор кислоты соляной с массовой долей 10%

10 г соляной кислоты по ГОСТ 3118-77 переносят в мерную колбу, доводят водой объем до 100 , растворяют и получают 10% раствор.

Применяют для подкисления питательных сред.

1.2.2.3. Раствор пептонно-солевой

0,85 г хлористого натрия (NaCl) и 1 г пептона растворяют в 100 воды при медленном нагревании, устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации, при 25°С он составлял , разливают в колбы, пробирки и стерилизуют при температуре 30 мин. Раствор хранят при температуре не более 30 дней.

Применяют для приготовления разведений.

1.2.2.4. Раствор физиологический

0,85 г натрия хлористого растворяют в 100 воды, разливают в пробирки (колбы) и стерилизуют при температуре 20 мин. Раствор хранят при температуре не более 1 мес.

1.2.2.5. Растворы для окраски по Граму

а) Классический способ

1.2.2.5.1. Карболовый раствор кристалл(генциан или метил)-фиолетового: 1 г кристалл(генциан или метил)-фиолетового, 10 96% этилового спирта, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 дистиллированной воды.

Раствор хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой при комнатной температуре не более 3 мес.

1.2.2.5.2. Раствор Люголя

2 г йодистого калия растворяют в 5-10 воды, добавляют 1 г кристаллического йода, оставляют на несколько часов до полного растворения йода и после этого доводят водой объем раствора до 300 .

Раствор хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой при комнатной температуре не более 3 мес.

1.2.2.5.3. Фуксин Циля

1 г основного фуксина, 10 96% этилового спирта, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 дистиллированной воды.

Раствор хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой при комнатной температуре не более 3 мес.

Перед использованием фуксин Циля разводят в дистиллированной воде в соотношении 1:9.

б) Модификация по Хукеру (ГОСТ 10444.1-84)

1.2.2.5.4. Основной красящий раствор по Хукеру

2 г кристалл-виолета с массовой долей сухих веществ 80-90% растворяют в 20 спирта, 0,8 аммония щавелевокислого растворяют в 80 воды, растворы смешивают и выдерживают в течение 24 ч при комнатной температуре перед употреблением.

1.2.2.5.5. Йодный раствор по Бурке

2 г йодистого калия растворяют в 5-10 воды в мерной колбе вместимостью 100 , добавляют 1 г кристаллического йода, оставляют на несколько часов до полного растворения йода и после этого доводят водой объем раствора до метки.

1.2.2.5.6. Контрастный красящий раствор

0,25 г сафранина растворяют в 10 спирта и полученный раствор смешивают со 100 воды.

1.2.2.5.7. Допускается использовать: в качестве основного красящего раствора - водный раствор кристалл(генциан)-виолета с массовой концентрацией 10 ; в качестве контрастного красящего вещества - водный раствор сафранина T с массовой концентрацией 5 или спиртовой раствор основного фуксина с массовой концентрацией 5 .

1.2.2.5.8. Для удаления закрепленного основного красящего вещества используют этиловый спирт (при окраске кристалл-виолетом с щавелевокислым аммонием) или ацетон (при окраске водным раствором кристалл-виолета).

1.2.2.6. Растворы для окраски дрожжей

1.2.2.6.1. Раствор метиленовой сини спиртово-водный

8-9 г метиленовой сини растворяют в 100 96% этилового спирта и 1 этого раствора добавляют в 30 воды. Раствор перемешивают и хранят в темной посуде при температуре не более 1 мес.

1.2.2.6.2. Раствор метиленовой сини по Леффлеру

30 спиртово-водного раствора метиленовой сини (п. 1.2.2.6.1), профильтрованного через бумажный фильтр, и 1 1% водного раствора гидроокиси натрия прибавляют к 100 воды. Растворяют и хранят при температуре не более 1 мес.

1.2.2.7. Растворы для окраски бактериальных спор

1.2.2.7.1. Растворы малахитового зеленого 5%-ный и 10%-ный готовят путем растворения соответственно 5 г или 10 г малахитового зеленого в 100 воды.

1.2.2.7.2. Раствор сафранина 5%-ный готовят путем растворения 5 г сафранина в 100 воды.

1.2.2.7.3. Водный раствор карболового фуксина 0,1%-ный

1 г фуксина основного растворяют в фарфоровой ступе с 10 96% этилового спирта. К смеси добавляют 100 5% водного раствора фенола и оставляют на 24 ч при комнатной температуре, фильтруют через бумажный фильтр и добавляют 900 воды.

1.2.2.8. Раствор бенгальской красной

0,15 г бенгальской красной растворяют в 100 воды и стерилизуют при температуре 15 мин. Раствор хранят в герметично закрытом сосуде при температуре не более 14 дней.

Применяют в питательные среды для плесневых грибов и дрожжей.

1.2.2.9. Растворы для определения сульфитредуцирующей способности клостридий

Натрий сернистокислый ( - сульфит) - 1%-ный водный раствор. Железо сернокислое ( - сульфат) - 0,4%-ный водный раствор. Оба раствора стерилизуют раздельно при температуре 30 мин или готовят без стерилизации на стерильной дистиллированной воде сразу же перед использованием.

Реактивы

1.2.2.10. Реактив Кларка

0,1 г метилового красного растворяют в 300 96% этилового спирта и добавляют 200 воды. Реактив хранят в посуде из темного стекла при температуре не более 1 мес.

Применяют в средах для определения интенсивности ферментации углеводов.

1.2.2.11. Реактив Эрлиха

4 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 320 96% этилового спирта и прибавляют 80 концентрированной соляной кислоты. Реактив хранят в посуде из темного стекла при температуре не более 1 мес.

Применяют в средах для определения индола.

1.2.2.12. Реактивы для определения ацетилметилкарбинола

1.2.2.12.1. Раствор альфа-нафтола 5%-ный

5 г альфа-нафтола растворяют в 100 абсолютного этилового спирта. Раствор применяют свежеприготовленным.

1.2.2.12.2. Раствор гидроокиси калия 40%-ный

40 г гидроокиси калия (едкого калия) переносят, смывая водой, в мерную колбу вместимостью 100 , доводят объем до метки и получают 40%-ный раствор. Реактив хранят в посуде из темного стекла при температуре не более дней.

1.2.2.13. Реактив для определения каталазы

К 100 стерильной дистиллированной воды прибавляют пероксид до получения 3%-го раствора. Реактив хранят в посуде из темного стекла при температуре не более 7 дней.

Индикаторы

1.2.2.14. Индикатор Андреде

0,5 г фуксина кислого растворяют в 16,4 1 н раствора гидроокиси натрия и прибавляют 100 воды. Раствор настаивают при температуре 24 ч и стерилизуют при температуре 100°С 5 мин. Индикатор хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой при температуре не более 1 мес.

Индикатор имеет соломенный или соломенно-желтый цвет, а при смещении pH в кислую сторону приобретает ярко-малиновую окраску.

Применяют в средах для определения сбраживания углеводов и маннита.

1.2.2.15. Индикатор бриллиантовый зеленый

0,5 бриллиантового зеленого растворяют в 100 воды. Хранят в посуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

Применяют в питательные среды для колиформных бактерий.

1.2.2.16. Индикаторная бумага для обнаружения индола

3-5 г парадиметиламинобензальдегида, 10 концентрированной фосфорной кислоты и 50 96%-го этилового спирта тщательно перемешивают в ступке. В полученном растворе смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и нарезают узкими лентами. Цвет сухой бумаги - желтый. Индикаторные бумаги хранят в сухом темном месте не более 1 мес.

1.2.2.17. Индикаторная бумага на обнаружение сероводорода 20 г уксуснокислого свинца , 1 г натрия двууглекислого и 100 воды тщательно перемешивают в ступке. В полученном растворе смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают, нарезают узкими лентами. Цвет сухой бумаги - белый. Хранят в сухом темном месте не более 1 мес.

1.2.2.18. Индикатор кристалл(генциан)-фиолетовый

1 г кристалл-виолета или генциан-виолета (метилового красного) растворяют в 80 подогретой до 60°С воды при постоянном встряхивании в мерном сосуде с притертой пробкой. После охлаждения раствора до (40-45)°С объем доводят до 100 . Из этого основного раствора готовят 0,1%-ный раствор путем разведения водой в соотношении 1:9.

Раствор хранят в темном закрытом флаконе при комнатной температуре не более 3 мес.

Применяют в питательные среды для колиформных бактерий, эшерихий коли.

1.2.2.19. Индикатор нейтральный красный

1 г кристаллического нейтрального красного растворяют при постоянном встряхивании в 100 96%-го этилового спирта. Раствор хранят в закрытом темном сосуде при комнатной температуре не более 3 мес.

Применяют в питательные среды для колиформных бактерий.

1.2.2.20. Индикатор феноловый красный

0,4 г кристаллического фенолового красного растворяют в 100 воды. Хранят в темном закрытом сосуде при комнатной температуре не более 3 мес.

Применяют в дифференциальных средах для сальмонелл.

1.2.2.21. Индикатор бромкрезоловый пурпуровый

0,1 г бромкрезолового пурпурового растирают в ступке с 37 1/20 н раствора гидроокиси (едкого) натра, смывают водой в мерную колбу вместимостью 250 , доводя объем до метки.

Хранят в темном сосуде с притертой пробкой при температуре не более 3 мес.

Применяют для определения кислотообразующей способности микроорганизмов.

Компоненты сред

1.2.2.22. Агар водный (холодный)

1,5-2,0 г агара растворяют в 100 воды. Стерилизуют при температуре 20 мин. Хранят при температуре не более 14 дней.

Применяют для наслаивания на поверхность плотных и жидких сред.

1.2.2.23. Масло вазелиновое

Масло разливают в колбы, пробирки и стерилизуют при 20 мин.

Применяют для наслаивания на жидкие питательные среды.

1.2.2.24. Молоко обезжиренное

Молоко доводят до кипения, оставляют на сутки в холодильнике, освобождают от сливок, вторично доводят до кипения, вновь оставляют на 1 день в холодильнике и вторично снимают верхний слой. Обезжиренное молоко может быть приготовлено путем сепарирования. Обезжиренное молоко фасуют в стерильную посуду и стерилизуют при температуре 100°С в течение трех дней по 30 мин или однократно при температуре в течение 20 мин. После стерилизации молоко должно принимать коричневый оттенок.

Молоко обезжиренное применяют в качестве компонента питательных сред.

1.2.2.25. Мясо (кусочки, фарш, мясная вода, отвар)

Освобожденное от костей, жира, сухожилий говяжье или конское мясо для приготовления мясного отвара режут на мелкие кусочки или для приготовления мясной воды пропускают через мясорубку, заливают из расчета 1 л воды на 500 г мяса и оставляют на ночь в холодильнике. На следующий день смесь мяса с водой медленно нагревают до кипения и кипятят до готовности, периодически помешивая и доливая воду до первоначального объема. Небольшое количество (до 5 л) можно кипятить на открытом огне, часто помешивая, чтобы не произошло пригорания частичек мяса.

Большое количество лучше кипятить в котлах с паровой рубашкой. Для определения готовности смеси, фильтруют сначала небольшое количество ее в пробирку через бумажный фильтр, если жидкость прозрачна, кипение прекращают. Смесь вновь оставляют до следующего дня в холодильнике. pH охлажденной смеси доводят до 7,0-7,2, фильтруют через ткань, отжимая из кусочков мяса или фарша всю жидкость. Мясную воду или мясной отвар и кусочки мяса или фарша стерилизуют при температуре 20 мин. 1 мясной воды или мясного отвара соответствует 3-5 г мясного экстракта.

Применяют в качестве компонентов питательных сред.

1.2.2.26. Экстракт дрожжей (20%-ный раствор)

100 г пекарских прессованных дрожжей нарезают небольшими кусочками и заливают 500 воды, подобрав посуду для приготовления экстракта с учетом того, чтобы смесь занимала 1/5 емкости. Смесь ставят в термостат (сушильный шкаф) при температуре от 58°С до 60°С на 2 дня и встряхивают 1-2 раза в сутки. Конец автолиза устанавливают по полному разжижению дрожжей. Экстракт должен иметь коричневый оттенок и приятный запах. 5 20%-го экстракта равноценны 1 г дрожжевого экстракта в порошке.

Добавляют в питательные среды как источник веществ, способствующих регенерации поврежденных микроорганизмов.

1.2.2.27. Яично-желточная взвесь и яично-желточная эмульсия

Из протертого с поверхности 96%-ным спиртом яйца асептически извлекают желток и смешивают его со 100 физиологического раствора. Желточную эмульсию приготавливают аналогично, но берут два желтка и смешивают их с 10 физиологического раствора.

Добавляют к питательным средам для определения лецитиназной активности микроорганизмов.

Питательные среды

1. Мясопептонный агар с глюкозой (МПА с глюкозой)

Состав:

Мясной экстракт сухой	3 г
или мясная вода п. 1.2.2.25	1000
пептон	10 г
хлорид натрия	5 г
глюкоза	10 г
агар	15-20 г

Приготовление: компоненты смешивают с водой, подогревают до кипения, периодически перемешивая, кипятят до полного растворения ингредиентов, охлаждают до (45-55)°С, устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25°С , разливают во флаконы и стерилизуют при температуре 15 мин. Среду хранят при температуре не более 14 дней.

Применяют для подсчета мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

2. Среда из сухого питательного агара с глюкозой (СПА с глюкозой)

Состав:

гидролизат рыбы (порошок)	17,9 г
агар	11,2 г
хлорид натрия	5,9 г
глюкоза	10,0 г

Приготовление: готовят согласно прописи на этикетке. После расплавления добавляют 10 г глюкозы, устанавливают pH, стерилизуют и хранят как МПА с глюкозой.

Применяют для подсчета мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

3. Сухая среда для определения общего количества микроорганизмов. Готовят согласно прописи на этикетке.

4. Среда Кесслер-Свенартон (модифицированная)

Состав:

пептон	10,0 г
лактоза	2,5 г
сухая желчь	5,0 г
или стерилизованная бычья желчь	50,0
натрий углекислый	0,06 г
натрий фосфорнокислый двузамещенный	0,5 г
кристалл(генциан)виолет, 1%-ный раствор (п. 1.2.2.18)	2,0
или порошок кристалл(генциан)виолет	0,02

Приготовление: компоненты тщательно перемешивают, кипятят 20-30 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25°С , разливают в пробирки, в которые кладут трубки Дархема (поплавки) дном вверх и стерилизуют 20 мин при температуре . Если в трубках остался воздух, среду не используют. Среду хранят при температуре не более 14 дней.

Применяют для посевов на колиформные бактерии.

5. Бульон (агар) лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью (БЛБЗЖ)

Состав:

пептон	10,0 г
лактоза	10,0 г
сухая желчь	20,0 г
раствор бриллиантового зеленого (п. 1.2.2.15)	2,66
агар (если необходимо)	15,0-20,0 г

Приготовление: смесь нагревают до полного расплавления всех компонентов, охлаждают до (45-55)°С, устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25°С . (Бульон двойной концентрации - количество всех компонентов, кроме дистиллированной воды, удваивается). Во все пробирки кладут трубки Дархема дном вверх, стерилизуют при температуре 15 мин. Среду хранят при температуре не более 14 дней.

Применяют для посевов на колиформные бактерии.

6. Среда КОДА, сухая

Состав:

пептон	15,0 г
хлорид натрия	5,0 г
	1,0 г
лактоза	10,0 г
алкилбензолсульфонат	12,0 г
бромкрезол пурпуровый	0,03 г
метиловый спирт	0,003 г

Приготовление: готовят согласно указаниям на этикетке.

Применяют для посевов на колиформные бактерии.

7. Среда Эндо (модифицированная), сухая

Состав:

гидролизат рыбы (порошок)	11,5 г
дрожжевой экстракт	0,86 г
лактоза	12,9 г
хлорид натрия	3,6 г
натрий фосфорнокислый двузамещенный	0,48 г
сульфат натрия	0,83 г
карбонат натрия	0,01 г
фуксин щелочной	0,22 г
агар	9,6 г

Приготовление: готовят согласно указаниям на этикетке.

Применяют для посевов и подтверждения колиформных бактерий.

8. Среда Кесслер (модифицированная), сухая

Состав:

пептон	10,0 г
глюкоза	2,5 г
желчь сухая	3,0 г
натрий углекислый безводный	0,06 г
натрий фосфорнокислый двузамещенный	0,5 г
кристаллический фиолетовый	0,02 г

Приготовление, установление pH и стерилизацию проводят согласно прописи на этикетке.

Применяют для посевов на E. coli.

9. Среда Кесслер (модифицированная)

10 г пептона и 50 мл стерильной бычьей желчи (или 5 г сухой желчи) смешивают с 1000 воды, кипятят 20-30 мин на водяной бане и фильтруют через вату. Добавляют 2,5 г глюкозы и доводят объем до 1000 , устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25°С , добавляют 2 1%-го раствора кристалл(генциан)фиолетового (п. 1.2.2.18), разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют при 10 мин. Среду хранят при температуре не более 14 дней.

Применяют для посевов на E. coli.

10. Среда Козера (модифицированная)

Состав:

фосфорнокислый натрий-аммоний двузамещенный, 4-водный	1,5 г
фосфорнокислый однозамещенный калий	1,0 г
сернокислый магний	0,2 г
лимоннокислый натрий	3,0 г
бромтимоловый синий, 1,5%-ный спиртовый раствор	1,0
вода дистиллированная	1000,0

Приготовление: компоненты, кроме бромтимолового синего, смешивают с водой, устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25°С , и стерилизуют при температуре 15 мин. После стерилизации добавляют раствор бромтимолового синего. Среду хранят при температуре не более 7 дней.

Применяют для идентификации E. coli.

11. Мясопептонный бульон с триптофаном

0,03 г триптофана растворяют в 100 стерильного мясопептонного бульона при медленном нагревании. Разливают в пробирки и стерилизуют при 20 мин. Среду хранят при температуре не более 7 дней.

Применяют для определения индола.

12. Среда магниевая

Состав:

I раствор
пептон	8,4 г
дрожжевой экстракт или диализат жидкий	40,0
или сухой	4,0 г
хлорид натрия	14,3 г
калий фосфорнокислый однозамещенный	2,85 г
вода дистиллированная	1780,0
II раствор
магний хлористый	7,14 г
вода дистиллированная	180,0
III раствор
0,5%-ный водный раствор бриллиантового зеленого	1,8

Приготовление: после растворения всех ингредиентов растворы соединяют, разливают в пробирки, колбы и стерилизуют при 30 мин. Среду хранят при температуре не более 7 дней.

Применяют для выявления сальмонелл.

13. Среда тетратионатная (Кауфмана, Мюллера)

Состав:

мясопептонный бульон стерильный	900,0
мел стерильный	45,0 г
50%-ный водный стерильный раствор серноватистокислого натрия	100,0
раствор Люголя	20,0
желчь стерильная	50,0
или сухая	5,0 г
0,1%-ный водный раствор бриллиантового зеленого	10,0

Приготовление: в стерильную колбу помещают стерильный мел, затем добавляют все стерильные компоненты, перемешивают и разливают по 10 в пробирки (колбы). Среду готовят в асептических условиях. Готовую среду можно хранить при температуре 7 дней.

Приготовление раствора серноватистокислого натрия (гипосульфита): 50 г химически чистого серноватистокислого натрия растворяют в 100 дистиллированной воды, стерилизуют при температуре 30 мин.

Приготовление раствора Люголя: 25 г йодистого калия растворяют в 50-60 г дистиллированной воды, прибавляют 20 г кристаллического йода, ставят в термостат при температуре до полного растворения йода, доводят объем до 100 дистиллированной водой. Раствор фильтруют и хранят при температуре в плотно укупоренном непрозрачном сосуде.

Применяют для выявления сальмонелл.

14. Среда Плоскирева (сухая)

Состав:

гидролизат рыбы	16,00 г
агар	8,75 г
лактоза	7,59 г
натриевые соли желчных кислот	8,10 г
натрий гидроцитрат 2-х замещенный	8,80 г
натрий фосфорнокислый 2-х замещенный	2,25 г
натрий тиосульфат	6,86 г
йод	0,12 г
нейтральный красный	0,04 г
бриллиантовый зеленый	0,02 г
натрия карбонат	1,42 г

Приготовление, установление pH и стерилизацию проводят согласно прописи на этикетке.

Применяют для выявления и подтверждения роста сальмонелл.

15. Висмут-сульфитный агар (Вильсон-Блера, сухая среда)

Состав:

гидролизат рыбы	12,7 г
агар	10,0 г
агароид	20,0 г
глюкоза	3,9 г
висмут-цитрат	2,38 г
натрия сульфит	4,79 г
соль Мора	0,97 г
натрий фосфорнокислый 2-х замещенный	3,68 г
бриллиантовый зеленый	0,028 г
натрия карбонат	0,65 г

Приготовление, установление pH и стерилизацию проводят согласно прописи на этикетке.

Применяют для выявления и подтверждения роста сальмонелл.

16. Среда трехсахарный агар с мочевиной

Состав:

сухой питательный агар	2,5 г
лактоза	1,0 г
сахароза	1,0 г
глюкоза	0,1 г
мочевина	1,5 г
железо сернокислое	0,02 г
фенолрот, 0,4%-ный водный раствор	0,04
натрий серноватистокислый (гипосульфит - )	0,03 г
вода дистиллированная	100,0

Приготовление: все компоненты смешивают, устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25°С , разливают в пробирки и стерилизуют при температуре 10 мин. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет. Среду после стерилизации смешивают так, чтобы остался столбик не менее 2-3 см.

Применяют для дифференциации сальмонелл.

17. Среда трехсахарный агар Олькеницкого

Состав:

сухой препарат с индикатором ВР и лактозой	45,0 г
сухой питательный агар	5,0 г
сахароза	10,0 г
глюкоза	1,1 г
мочевина	10,0 г
тиосульфат натрия	1,5 г
соль Мора	0,2 г
вода дистиллированная	1000,0

Приготовление: в 1 л воды растворяют 45 г лактозы ВР и СПА, доводят до кипения, все остальные компоненты растворяют в полученной смеси, доводят pH до 7,2-7,4, разливают в стерильные пробирки по 5 мл и стерилизуют текучим паром или при 112°С 20 мин. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет. После стерилизации среду смешивают так, чтобы остался столбик не менее 2-3 см.

Применяют для дифференциации сальмонелл.

18. Среды Гисса цветные с углеводами или спиртами и индикатором Андреде

Состав:

пептон	10,0 г
хлорид натрия	5,0 г
углевод (глюкоза или лактоза, или сахароза) или маннит	10,0 г

Приготовление: пептон и хлорид натрия растворяют в воде при нагревании, фильтруют через бумажный фильтр, прибавляют углевод (или спирт) и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25°С , добавляют индикатор Андреде, разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют при 12-15 мин. Среда должна быть бесцветной или соломенно-желтого цвета без розового оттенка. Среду хранят при температуре не более 7 дней.

Применяют для дифференциации сальмонелл.

19. Среда молочно-солевой агар

Состав:

мясопептонный бульон	1000,0
хлорид натрия	65,0 г
молоко обезжиренное	100,0
агар	20,0 г

Приготовление: хлорид натрия и агар добавляют в мясопептонный бульон и кипятят на слабом огне до полного расплавления агара, периодически помешивая. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25°С . Стерилизуют при температуре 20 мин. К охлажденной до среде добавляют обезжиренное стерилизованное молоко. Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри по . Среду в чашках хранят при температуре не более 7 дней.

Применяют для выделения и подтверждения стафилококков.

20. Среда яично-солевой агар

Состав:

мясопептонный агар, пропись N 1 (без глюкозы)	1000,0
NaCl	95,0 г
яично-желточная взвесь (п. 1.2.2.27)	100

Приготовление: 1000 мясопептонного агара расплавляют, растворяют в нем 95 г хлористого натрия, охлаждают до 45°С и добавляют 100 яично-желточной взвеси. Смесь тщательно перемешивают и хранят в холодильнике не более 5 суток.

Применяют для выделения и подтверждения Staphylococcus aureus.

21. Среда агар яично-желточный азид

Состав:

мясная вода (п. 1.2.2.25)	1000,0
пептон	10,0 г
NaCl	3,0 г
	0,2 г
агар	15,0 г
	0,15 г
яично-желточная взвесь (п. 1.2.2.28)	150,0

Приготовление: все ингредиенты, кроме азида натрия и яично-желточной взвеси, растворяют в 1000 мясной воды при нагревании, устанавливают pH 7,6, стерилизуют при температуре 120°С 30 мин. Охлаждают до 50-60°С, добавляют 0,15 г азида натрия и снова стерилизуют при 120°С 30 мин. Охлаждают до 50°С и добавляют 150 стерильной яично-желточной взвеси. Хорошо смешивают и сразу разливают по 15 в чашки Петри.

Применяют для выделения и подтверждения Staphylococcus aureus.

22. Солевой (или сахарный) бульон

Состав:

мясопептонный бульон по ГОСТ 10444.1-84	100,0
хлорид натрия	6,0 г
или глюкозы	1,0 г

Приготовление: хлорид натрия или глюкозу растворяют в мясопептонном бульоне, устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25°С , разливают в пробирки и стерилизуют при температуре 15 мин.

Среду хранят при температуре не более 14 дней.

Применяют для выявления стафилококков.

23. Среда с ДНК

Состав:

ДНК	0,3 г
хлорид кальция	0,001 г
хлорид натрия	10,0 г
1%-ный водный раствор толуидина синего "С"	9,2
трисаминометан	6,1 г
агар	10,0-12,0 г
вода дистиллированная	1000,0

Приготовление: растворяют в воде трисаминометан и доводят pH раствора до 9,0 добавлением 10%-ного раствора NaOH или 10%-ного раствора HCl. Добавляют остальные ингредиенты, кроме толуидина синего, и растворяют нагреванием в кипящей водяной бане до полного расплавления агара. К охлажденной до среде добавляют толуидин синий, тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри для непосредственного употребления или оставляют в колбе и хранят при температуре не более 7 дней.

Применяют для идентификации Staphylococcus aureus или обнаружения термодезоксинуклеазы Staphylococcus aureus в продуктах питания.

24. Среда с антибиотиком левомицетином (хлорамфениколом)

Состав:

агар	20,0 г
дрожжевой экстракт жидкий (п. 1.2.2.26)	25
или сухой	5,0 г
глюкоза	20,0 г
левомицетин 0,4%-ный раствор	25
или хлоргидрат тетрациклин 0,1%-ный раствор	100,0

Приготовление: к 1000 воды прибавляют агар, дрожжевой экстракт и глюкозу, нагревают, периодически помешивая, до расплавления составных частей, охлаждают до , устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25°С , стерилизуют при температуре 15 мин, охлаждают до 45-47°С и добавляют левомицетин или хлоргидрат тетрациклин, приготовленные на стерильной дистиллированной воде (допускается левомицетин или тетрациклин стерилизовать вместе со средой при температуре 15 мин).

Среда без антибиотика может храниться при температуре не более 14 дней.

Среда с антибиотиком хранению не подлежит.

Применяют для определения плесневых грибов и дрожжей.

25. Среда с антибиотиком и красной бенгальской

Состав:

среда с левомицетином	990,0
0,15%-ный раствор красной бенгальской (п. 1.2.2.8)	10,0

Приготовление: к стерильной расплавленной и охлажденной среде с антибиотиком добавляют стерильный раствор красной бенгальской, перемешивают и разливают в чашки Петри.

Применяют для выделения плесневых грибов и дрожжей и подавления роста воздушного мицелия плесневых грибов.

26. Сусловый агар

Состав:

сусло солодовое (неохмеленное) или виноградное	1000,0
лимонной кислоты 20%-ный водный раствор (п. 1.2.2.2)	2-3
агар	20,0 г

Приготовление: к суслу плотностью 1,04-1,05 или 8-10° Blg прибавляют агар, расплавляют на водяной бане и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фильтрат разливают в стерильную посуду и стерилизуют при температуре 30 мин. Перед использованием к среде добавляют 2-3 20%-ного стерильного водного раствора лимонной кислоты до pH .

Среду без лимонной кислоты хранят при температуре не более 7 дней.

Применяют для выделения плесневых грибов и дрожжей.

27. Среда сульфитжелезная полужидкая

Состав:

мясопептонный бульон	100,0
дрожжевой экстракт сухой	1,0 г
или жидкий (п. 1.2.2.26)	5,0
агар	0,15-0,18 г
сульфит натрия 5%-ный водный раствор*	1,0
железо лимоннокислое (цитрат) 5%-ный водный раствор	1,0

______________________________

* Допускается заменять сульфит натрия на гипосульфит натрия в качестве 1 г на 1000 среды; цитрат железа на хлорное железо . В тех же концентрациях. Рекомендуется добавлять в среду полимиксин B-сульфат в количестве 200 ед. на 1 среды.

Приготовление: к мясопептонному бульону добавляют дрожжевой экстракт и агар, устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации его показатель составлял при 25°С и стерилизуют при температуре 15 мин. После стерилизации и регенерации добавляют горячие (70-80)°С растворы сульфита натрия и лимоннокислого железа стерилизованные или приготовленные без стерилизации на стерильной дистиллированной воде. Среду перемешивают, разливают в пробирки по 10-12 и используют для посева.

Применяют для выявления сульфитредуцирующих клостридий.

28. Дифференциальная улучшенная клостридиальная среда (D.R.C.M.)

Состав:

мясная вода (п. 1.2.2.25)	800,0
пептон	10,0 г
дрожжевой экстракт сухой	1,5 г
или жидкий (п. 1.2.2.26)	7,5
натрий уксуснокислый	5,0 г
0,5%-ный раствор крахмала растворимого	200,0
глюкоза	1,0 г
цистеина-L-гидрохлорид	0,5 г
агар	2,0-20,0 г
4%-ный раствор сульфита натрия	4,0
7%-ный раствор цитрата железа	4,0

Приготовление: в 800 воды растворяют дрожжевой экстракт, пептон, уксуснокислый натрий. Отдельно 1 г растворимого крахмала вносят в небольшое количество воды и при непрерывном помешивании переносят в кипящую воду, доводя объем до 200 , и получают крахмальный клейстер, который добавляют в 800 раствора, кипятят 30 мин, добавляют глюкозу, цистеин-L-гидрохлорид, устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25°С . Горячий раствор фильтруют через бумажный фильтр, добавляют нужное количество агара и стерилизуют при температуре 15 мин.

Растворы 4%-ного водного сульфита натрия и 7%-ного водного раствора цитрата железа (последний при приготовлении нагревают 5 мин) стерилизуют или готовят на стерильной дистиллированной воде и хранят при температуре не более 14 дней. Перед использованием основную среду регенерируют, охлаждают до и вводят в нее смесь растворов сульфита натрия и цитрата железа, разливают в пробирки по 10-12 .

Применяют для выявления сульфитредуцирующих клостридий.

29. Среда с растворами для определения сульфитредуцирующей способности клостридий.

К 100 любой охлажденной регенерированной питательной среды для клостридий добавляют непосредственно перед посевом по 5 0,4%-ного раствора сернокислого железа и 1%-ного раствора сернокислого натрия, приготовленных согласно п. 1.2.2.9, разливают в колбы или пробирки, укупоривают пробками, стерилизуют при температуре в течение 30 мин.

Среду хранят при температуре не более 7 дней.

Применяют для определения сульфитредуцирующей активности клостридий.

1.3. Пробы, отбор и подготовка к анализу

Отбор проб и подготовку их к анализу проводят в соответствии с ГОСТ 26668-85 и ГОСТ 26669-85, кроме подготовки к анализу проб поверхностно контаминированных и пюреобразных продуктов.

Для анализа поверхностно контаминированных кусочков плодов, ягод, овощей и овощных полуфабрикатов готовят суспензии.

Для приготовления суспензий из трех единиц тары или фасовки раздельно в стерильную посуду с соблюдением правил асептики отбирают навеску массой по г.

Массу навески уточняют по разности массы посуды с продуктом и массой посуды.

К навескам добавляют 0,1%-ный пептонно-солевой раствор в количестве, равном массе навески. Для приготовления суспензий содержимое встряхивают 25-кратным круговым движением с радиусом 30 см.

Для анализа пюре или плодов дробленых отбирают навески массой г раздельно из трех единиц фасовки.

При анализе поверхностно контаминированных продуктов количество микроорганизмов в 1 г продукта соответствует их содержанию в 1 суспензии. Серию десятикратных разведений готовят по ГОСТ 26669-85.

При анализе пюре или дробленых плодов количество микроорганизмов определяют непосредственно высевом продукта и (или) его разведений. Масса навески, предназначенной для приготовления серии разведений, должна быть не менее г , а для непосредственного высева в питательные среды - не менее 1 г .

Примечание: 1. Сухую плазму кроликов можно приобрести по адресу: БССР, г. Минск, ул. Ногина, 3. Предприятие по производству бактерийных препаратов Белорусского НИИ эпидемиологии и микробиологии.

2. Среды, в названии которых указано "Сухая", выпускаются Дагестанским НИИ питательных сред, Ставропольским филиалом ВНИИМС, Литовским филиалом ВНИИМС.

II. Методы
микробиологического анализа на различные группы микроорганизмов

Метод N 1. Пищевые продукты. Определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов посевом в агаризованную среду

Настоящий метод распространяется на пищевые продукты, содержащие в 1 г более 30 микроорганизмов и устанавливает порядок определения жизнеспособных мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

1. Сущность метода

Метод основан на высеве определенного количества продукта или его разведения в агаризованную питательную среду, культивировании посевов в аэробных условиях при в течение ч, подсчете всех выросших видимых колоний мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов и пересчете их количества на 1 г продукта.

2. Пробы

2.1. Пробы отбирают и подготавливают к анализу согласно п. 1.3 приложения 1.

3. Аппаратура, инвентарь и посуда

Для проведения анализа применяют аппаратуру, инвентарь и посуду согласно п. 1.1 приложения 1.

4. Растворы, реактивы, индикаторы, компоненты сред, питательные среды

Для проведения анализа применяют:

4.1. Растворы по пп. 1.2.2.1, 1.2.2.3, 1.2.2.4 приложения 1.

4.2. Компоненты сред по п. 1.2.2.23 приложения 1.

4.3. Питательные среды N 1 или N 2, или N 3 приложения 1.

5. Проведение исследований

Мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы в 1 г продукта определяют по ГОСТ 26670-85 п. 4.1 путем высева параллельно в две чашки Петри по 1 суспензии продукта или их разведений в одну из питательных сред (N 1, N 2, N 3 приложения 1).

Если ожидают наличие роста микроорганизмов, образующих налеты на поверхности среды (ползучий рост), то в чашки Петри с посевным материалом наливают питательной среды и после застывания на нее наливают без перемешивания еще этой же разогретой и охлажденной питательной среды или стерильного водного агара (п. 1.2.2.22 приложения 1). Этот второй слой также оставляют для застывания.

После застывания агаризованной среды посевы инкубируют, поставив чашки вверх дном, при в течение ч.

6. Оценка результатов исследований

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно в соответствии с ГОСТ 26670-85.

Метод N 2. Пищевые продукты. Определение количества колиформных бактерий посевом в жидкие среды

Настоящий метод распространяется на пищевые продукты и устанавливает порядок определения наиболее вероятного числа (НВЧ) жизнеспособных колиформных бактерий в 1 г продукта.

1. Сущность метода

Метод основан на высеве определенного количества суспензии с продукта или (и) его разведений в ряд пробирок с жидкой селективно-диагностической лактозной средой, культивировании при в течение 24-48 ч, учете положительных пробирок и определении наиболее вероятного числа в 1 г продукта колиформных бактерий, ферментирующих лактозу с образованием газа и кислоты.

2. Пробы

Пробы отбирают и подготавливают к анализу согласно п. 1.3 приложения 1.

3. Аппаратура, инвентарь, посуда

Для проведения анализа применяют аппаратуру, инвентарь и посуду согласно п. 1.1 приложения 1 и дополнительно трубки Дархема (поплавки).

4. Растворы, реактивы, индикаторы, компоненты сред, питательные среды

Для проведения анализа применяют:

4.1. Растворы по пп. 1.2.2.1, 1.2.2.3, 1.2.2.4, 1.2.2.5.

4.2. Индикаторы по пп. 1.2.2.16, 1.2.2.19, 1.2.2.18.

4.3. Компоненты по п. 1.2.2.26.

4.4. Питательные жидкие среды N 4 или N 5, или N 6 и плотные N 7 приложения 1.

5. Проведение исследований

5.1. Из навески продукта или суспензии готовят ряд десятикратных разведений до такой степени, чтобы окончательное разведение давало отрицательный результат (см. ГОСТ 26670-85).

5.2. По 1 разведений и (если необходимо) неразведенного продукта или суспензии высеивают параллельно в три пробирки с трубками Дархема (поплавками), содержащие по 9 селективно-диагностической лактозной среды N 4 или N 5, или N 6 *.

5.3. Посевы инкубируют при в течение ч. Посевы просматривают через ч и регистрируют положительные пробирки. Окончательный учет проводят через ч.

5.4. Положительными считают такие пробирки, в которых через 48 ч имели место интенсивный рост микроорганизмов, проявляющийся в сильном помутнении среды, образование любого количества газа, изменение цвета среды и др. признаки.

5.5. Из каждой положительной пробирки делают петлей пересевы на плотные среды Эндо. Одну чашку среды можно использовать для высева одновременно из двух-трех пробирок, разделив дно чашки на секторы. Посевы на средах ЭНДО делают штрихами так, чтобы получить рост изолированных колоний. Посевы термостатируют при температуре в течение 24 ч.

5.6. Через 24 ч выдержки посевов на плотной среде их просматривают и отмечают рост колоний, характерных для колиформных бактерий: на среде Эндо - плоские или слегка выпуклые или с валиком, красные, с различной интенсивностью окраски, с металлическим или без металлического блеска.

5.7. Не менее чем из пяти подозрительных колоний делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для этого на обезжиренное предметное стекло наносят петлю стерильной дистиллированной воды и в ней растирают материал, взятый петлей из изучаемой колонии. При окраске бульонной культуры на предметное стекло наносят каплю этой культуры.

Мазок на предметном стекле фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки. На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор кристалл(генциан или метил)фиолетового (п. 1.2.2.5.1) на 0,5-1,0 мин, снимают бумагу, наливают раствор Люголя (п. 1.2.2.5.2) на 0,5-1,0 мин, сливают раствор Люголя и стекло прополаскивают в этиловом спирте в течение 0,5-1,0 мин, пока не перестанет отходить краситель. Затем препарат тщательно промывают водой и докрашивают разведенным фуксином Циля (п. 1.2.2.5.3).

После промывки водой и просушивания на воздухе или фильтровальной бумагой мазок микроскопируют.

Можно проводить окраску мазков по Граму в модификации Хукера (ГОСТ 10444.3-85).

Для этого на фиксированный мазок через полоску фильтровальной бумаги наносят раствор кристаллического фиолетового с щавелевокислым аммонием (п. 1.2.2.5.4). Через 0,5-1,0 мин удаляют бумагу и остаток красителя, мазок промывают проточной водой, наносят на него йодный раствор Бурке (п. 1.2.2.5.5). Спустя 0,5-1,0 мин мазок промывают 96%-ным этиловым спиртом, погружая его последовательно в несколько порций спирта до тех пор, пока с мазка перестанут стекать окрашенные струйки. Затем мазок тщательно промывают водой и окрашивают контрастным красящим раствором (п. 1.2.2.5.6), выдерживая 2-3 мин в растворе сафранина, затем промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Допускается окрашивать мазок 1%-ным водным раствором кристалл(генциан)-виолета (п. 1.2.2.5.7) и после закрепления краски йодным раствором Бурке промывать препарат вместо спирта ацетоном (п. 1.2.2.5.8) и докрашивать 0,5%-ным водным раствором сафранина (п. 1.2.2.5.7) или спиртовым раствором фуксина.

Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в сине-фиолетовый цвет основного красителя. Грамотрицательные микроорганизмы приобретают красный цвет дополнительного красящего раствора.

Колиформные бактерии являются грамотрицательными палочками.

5.8. Если после просмотра препаратов не менее чем из пяти колоний разного типа на плотной среде не будут обнаружены грамотрицательные палочки, дают заключение об отсутствии колиформных бактерий в анализируемом продукте. Если хотя бы в одной из типичных колоний будут обнаружены грамотрицательные палочки, считают, что в соответствующем разведении продукта присутствуют колиформные бактерии. Производят определение их наиболее вероятного числа в 1 г продукта.

6. Оценка результатов исследований

6.1. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

6.2. Определение количества колиформных бактерий в 1 г продукта проводят с помощью таблицы наиболее вероятных чисел (НВЧ) микроорганизмов следующим образом:

6.2.1. Из ряда засеянных по три пробирки разведений выбирают наибольшее разведение, в котором все три пробирки дали положительный результат, т.е. в них обнаружены колиформные бактерии, и два следующих за ним разведения, в каждом из которых отмечают число положительных пробирок.

6.2.2. По количеству учтенных положительных пробирок в трех последовательных разведениях составляют трехзначное число, по которому, пользуясь таблицей, находят НВЧ колиформных бактерий в 1 г. Например, из трех засеянных разведений , и три положительные пробирки были в разведении, две - в и одна в разведении. Записывают число положительных пробирок в каждом разведении, оно равняется 3, 2 и 1. Этому трехзначному числу в таблице НВЧ графе 2 соответствует цифра 150. Следовательно, наиболее вероятное число колиформных бактерий в 1 г продукта в нашем примере равно 150. Действительное же число колиформных бактерий в 1 г в данном случае находится в интервале от 35 до 380 клеток с вероятностью 95%. Если бы наименьшим разведением, давшим положительный результат, было не , а или и т.д., то для определения числа колиформных бактерий на 1 г цифру в графе 2 таблицы НВЧ необходимо было бы умножить соответственно на 10, 100 и т.д. И наоборот, если бы положительные результаты были в пробирках, засеянных 10 г, 1 г и разведением, то для определения наиболее вероятного числа колиформных бактерий в 1 г продукта цифру в графе 2 таблицы НВЧ необходимо было бы разделить соответственно на 100, 10 и т.д.

6.2.3. Если ни одно разведение не дало три положительные пробирки, то выбирают наибольшие разведения, в которых есть положительные пробирки. Например, если в посевах из разведений , , число положительных пробирок было соответственно 2, 1 и 1, результат записывают трехзначным числом 211 (, , ). Далее определение наиболее вероятного числа колиформных бактерий в 1 г продукта проводят в соответствии с п. 6.2.2.

6.2.4. Если посевы таковы, что в каждом засеянном разведении три пробирки положительные, результат записывают трехзначным числом 333. Далее определение наиболее вероятного числа колиформных бактерий проводят в соответствии с п. 6.2.2. В этом случае НВЧ колиформных бактерий в 1 г будет "выше 1100". Для определения конечного числа колиформных бактерий в данном случае анализ повторяют с большими разведениями продукта.

6.2.5. Результат записывают в виде числа .

Например: 1500 кл/г записывают как кл/г.

______________________________

* В качестве арбитражной используют N 5

Приложение

Таблица
для определения наиболее вероятного числа микроорганизмов

Количество положительных пробирок для разведения продукта			Наиболее вероятное число НВЧ в 1 г	Действительное число микроорганизмов с вероятностью 95%
			Наиболее вероятное число НВЧ в 1 г	от	до
1	2	3	4	5	6
0	0	0	< 3	-	-
0	0	1*	3	0,1	9,5
0	1	0	3	0,1	10,0
0	2	0	6	1,2	17,0
1	0	0	4	0,2	17,0
1	0	1	7	1,2	17,0
1	1	0	7	1,3	20,0
1	1	1	11	3,5	35,0
1	2	0	11	3,6	35,0
2	0	0	9	1,5	35,0
2	0	1	14	3,6	35,0
2	0	0	15	3,7	38,0
2	1	1	20	4,5	38,0
2	2	0	21	4,5	40,0
2	2	1*	28	8,7	94,0
2	3	0*	29	8,7	94,0
3	0	0	23	4,6	94,0
3	0	1	38	8,8	104,0
3	0	2*	60	16,0	181,0
3	1	0	40	9,1	181,0
3	1	1	70	17,0	199,0
3	1	2*	120	35,0	360,0
3	2	0	90	18,0	360,0
3	2	1	150	35,6	380,0
3	2	2	210	35,0	400,0
3	2	3*	290	90,0	990,0
3	3	0	200	36,0	990,0
3	3	1	500	91,0	1980,0
3	3	2	1100	182,0	4050,0
3	3	3	> 1100	-	-

Примечание: 1. Таблица составлена на основе (ISO)/4702 E, 1982 г. (таблица De Man).

2. Таблица включает наиболее вероятные пробирочные композиции трехзначного числа первой категории, которые могут быть получены в 95% случаев при анализе пяти проб продукта.

3. "*" - наименее вероятные пробирочные комбинации, которые могут быть получены в 4% случаев при анализе пяти проб продукта.

4. Если при анализе получают пробирочные комбинации, не входящие в таблицу, то это указывает либо на ошибки при выполнении анализа, либо на присутствие в продукте бактериостатических веществ.

Метод N 3. Пищевые продукты. Определение количества Escherichia coli

Настоящий метод распространяется на пищевые продукты и устанавливает порядок определения наиболее вероятного числа (НВЧ) жизнеспособных клеток E. coli в 1 г продукта.

1. Сущность метода

Метод основан на высеве определенного количества продукта, суспензии или их разведении в ряд пробирок с жидкой селективно-диагностической средой с глюкозой, культивировании при в течение 48 ч, учете положительных пробирок и определении наиболее вероятного числа в 1 г продукта, грамотрицательных не образующих спор палочек, сбраживающих глюкозу и лактозу с образованием кислоты и газа и дающих характерные биохимические реакции на индол ("И"), метилрот ("М"), ацетилметилкарбинол ("А") и цитрат ("Ц").

2. Пробы

Пробы отбирают и подготавливают к анализу согласно п. 1.3 приложения 1.

3. Аппаратура, инвентарь, посуда

4. Растворы, реактивы, индикаторы, компоненты сред, питательные среды

Для проведения анализа применяют:

4.1. Растворы по пп. 1.2.2.1, 1.2.2.3, 1.2.2.4, 1.2.2.5.

4.2. Реактивы по пп. 1.2.2.10, 1.2.2.11, 1.2.2.12.

4.3. Индикаторы по пп. 1.2.2.15, 1.2.2.16, 1.2.2.18.

4.4. Питательные среды: для выделения N 5 или N 8, или N 9; для подтверждения - N 7, N 10, N 11 приложения 1.

5. Проведение исследований

5.1. Из навески продукта или суспензии готовят ряд десятикратных разведений до такой степени, чтобы последнее разведение давало отрицательный результат (см. ГОСТ 26670-85).

5.2. По 1 разведений и, если необходимо, неразведенного продукта или суспензии высеивают параллельно в три пробирки, содержащие по 9 одной из сред выделения (N 5, N 8, N 9) с поплавками.

5.4. Положительными считаются такие пробирки, в которых имеет место интенсивный рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды, образовании газа, изменении цвета среды и в других признаках.

5.5. Из каждой положительной пробирки делают петлей пересевы на среду Эндо (N 7). Одну чашку среды Эндо можно использовать для высева одновременно из двух-трех пробирок, разделив дно чашки на секторы. Посевы на среду Эндо делают штрихами так, чтобы получить рост изолированных колоний. Посевы термостатируют при температуре в течение ч.

5.6. Через 24 ч термостатирования посевов на среде Эндо их просматривают и отмечают рост типичных колоний: плоских или слегка выпуклых, или с валиком, красных, нередко с металлическим блеском, розовых, бледно-розовых. При наличии типичных колоний для бактерий Escherichia coli проводят их изучение.

5.7. Не менее чем из пяти подозрительных колоний делают препараты, окрашивают по Граму (п. 5.7 Метода N 2) и микроскопируют. Бактерии E. coli являются грамотрицательными палочками. Если после просмотра препарата не менее чем из трех колоний разного типа на среде Эндо не будут обнаружены грамотрицательные палочки, дают заключение об отсутствии бактерий E. coli в анализируемом продукте. Если хотя бы в одной из типичных колоний будут обнаружены грамотрицательные палочки, предположительно считают, что в анализируемом продукте присутствуют бактерии E. coli. Эти колонии подвергают изучению.

5.8. Из пяти однотипных колоний грамотрицательных палочек п. 5.7 делают пересевы в пять пробирок со скошенным мясопептонным агаром. Посевы термостатируют при в течение ч.

5.9. Культуры, выросшие на скошенном агаре, изучают по следующим биохимическим тестам*.

5.9.1. Продукция индола:

Культуры по п. 5.8 высеивают в пробирки с 5 мясопептонного бульона с триптофаном (N 11). Под пробку помещают полоску индикаторной бумаги на индол (п. 1.2.2.16). Посевы термостатируют при температуре в течение 24 ч. Через 24 ч, если в среде накапливается индол, желтый цвет индикаторной бумажки меняется от сиренево-розового до интенсивного малинового. Образование индола можно проверить и с помощью реактива Эрлиха (п. 1.2.2.11). Для этого в 5 24-часовой культуры, выросшей на МПБ с триптофаном, добавляют 10 капель (0,6 ) реактива Эрлиха. При наличии в среде индола в пограничном слое в течение 5 мин появится красное окрашивание среды. Бактерии, как правило, образуют индол.

5.9.2. Интенсивность ферментации углеводов с образованием кислот.

Культуры п. 5.8 высеивают в пробирки с мясопептонным бульоном с 1% глюкозы. Посевы термостатируют при в течение 5 суток. К 5 пятисуточной бульонной культуры добавляют 5 капель реактива Кларка (п. 1.2.2.10). Появление в течение 1 мин красного цвета среды указывает на положительную реакцию. Бактерии E. coli дают положительную реакцию.

5.9.3. Продукция ацетилметилкарбинола (ацетоина).

Культуры п. 5.8 высеивают в пробирки с мясопептонным бульоном с 1% глюкозы и термостатируют при температуре 48 ч. К 1 48-часовой бульонной культуре добавляют 0,6 5%-ного спиртового раствора альфа-нафтола (п. 1.2.2.12.1) и 0,2 40%-ного раствора гидрата окиси калия (п. 1.2.2.12.2). Посевы перемешивают и выдерживают при температуре в течение 24 ч. Появление в течение 2-24 ч розового окрашивания среды указывает на наличие ацетилметилкарбинола (ацетоина), т.е. положительная реакция. Бактерии E. coli дают отрицательную реакцию.

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

5.4.9. Утилизация цитрата.

Культуру п. 5.8 высеивают в пробирки со средой Козера (N 10). Посевы термостатируют при температуре 18-24 ч. Изменение оливково-зеленого цвета среды Козера на васильковый указывает на положительную реакцию. Бактерии E. coli дают отрицательную реакцию.

6. Оценка результатов исследований

6.1. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

6.2. В результате идентификации учитывают все разновидности бактерий E. coli, грамотрицательных палочек, образующих индол, дающих положительный метилроттест, не образующих ацетилметилкарбинол и не утилизирующих цитрат.

6.3. Вычисление наиболее вероятного числа бактерий E. coli в одном грамме продукта проводят с помощью таблицы наиболее вероятного числа бактерий в соответствии с методом N 2.

6.4. Результаты записывают в виде числа .

Например, 1100 клеток в 1 г записывают как кл/г.

______________________________

* В приложении к методу N 3 дана таблица некоторых дифференциальных тестов наиболее близких родов кишечных палочек

Приложение

Таблица
некоторых дифференциальных тестов наиболее близких родов бактерий кишечных палочек*

Наименование тестов	Escherichia	Citrobacter	Euterobacter	Klebsi
Сбраживание углеводов при температуре (Т)	+	-	-	-
Образование индола (И)	+			-
Интенсивность ферментации углеводов с образованием кислоты (М)	+		-	-
Образование ацетилметилкарбинола (ацетоина) (А)	-	-	+	+
Утилизация цитрата (Ц)	-	+	+	+

______________________________

* Тесты даны согласно Берги, 1974 г.

Обозначения:

+ - положительная реакция

- - отрицательная реакция

- чаще положительная реакция

- чаще отрицательная реакция.

Метод N 4. Пищевые продукты. Выявление бактерий рода сальмонелл

Настоящий метод распространяется на пищевые продукты и устанавливает порядок выявления в них жизнеспособных клеток бактерий рода сальмонелл.

1. Сущность метода

Метод основан на высеве определенного количества продукта или суспензии или эквивалентного разведения этого количества в жидкую среду для накопления и последующего выявления в посевах бактерий, способных развиваться в селективных средах при температурах и в течение 24-48 ч, образующих биохимические и серологические характеристики, описанные в настоящем методе.

2. Пробы

2.1. Пробы отбирают и подготавливают к анализу согласно п. 1.3 приложения 1.

2.2. Масса (объем) навески для непосредственного высева в питательные среды должна быть не менее г или эквивалентного разведения этого количества продукта.

3. Аппаратура, инвентарь, посуда

Для проведения анализа применяют аппаратуру, инвентарь и посуду согласно п. 1.1 приложения 1.

4. Растворы, реактивы, индикаторы, компоненты сред, питательные среды

Для проведения анализа применяют:

4.1. Растворы по пп. 1.2.2.1, 1.2.2.4, 1.2.2.5.

4.2. Реактивы по пп. 1.2.2.11, 1.2.2.12, сыворотки сальмонеллезные поли-моновалентные "О" и "Н" по ГОСТ 16445-70.

4.3. Индикаторы по пп. 1.2.2.14, 1.2.2.16, 1.2.2.17, 1.2.2.20.

4.4. Компоненты по п. 1.2.2.26.

4.5. Питательные среды N 12, N 13, N 14, N 15, N 16, N 17, N 18 приложения 1.

5. Проведение исследований

5.1. К каждой навеске продукта или суспензии массой г прибавляют 220 магниевой среды (среда N 12). Продукт или суспензию тщательно перемешивают или взбалтывают. Посевы инкубируют при температуре в течение 48 ч.

5.2. Культуры по п. 5.1 по 1 пересеивают в пробирки, содержащие по 9-10 жидкой селективной тетратионатной среды (среда N 13). Посевы инкубируют в течение 48 ч при температуре .

5.3. Дифференция культур на плотных средах.

5.3.1. Культуры по п. 5.1 и п. 5.2 пересевают на три плотные среды: Плоскирева, Эндо и висмут-сульфитный агар. Можно использовать по одной чашке каждой плотной среды для высева одновременно из 2-х селективных сред. Для этого дно чашки делят на два-три сектора. На каждом секторе пишут номер пробы продукта и название селективной среды, из которой делают пересев. Посевы на секторах делают штрихами так, чтобы получить рост изолированных колоний. Посевы инкубируют при температуре в течение 24 ч на средах Плоскирева и Эндо и 48 ч на висмут-сульфитном агаре.

5.3.2. Через 24 и 48 ч просматривают посевы на плотных средах п. 5.3.1 и отмечают рост характерных для сальмонелл колоний: на среде Эндо - круглые, бесцветные или слегка розоватые, прозрачные, нежные колонии; на висмут-сульфитном агаре - черные с характерным металлическим блеском, а также зеленоватые с темно-зеленым ободком с пигментированием среды под колониями; на среде Плоскирева - бесцветные, прозрачные, но более плотные, чем на Эндо.

Не менее чем из 5-ти подозрительных колоний делают препараты, окрашивают по Граму (п. 5.7 метода N 2) и микроскопируют. Бактерии рода сальмонелл являются грамотрицательными палочками с закругленными концами.

5.3.3. Если через 48 ч ни на одной из плотных сред не обнаружено роста типичных для сальмонелл колоний дают заключение об их отсутствии в анализируемом продукте.

5.4. Биохимическое изучение культур.

5.4.1. Пять типичных для сальмонелл колоний грамотрицательных палочек с каждой плотной среды, на которой они обнаружены, пересевают в пробирки с трехсахарным агаром с мочевиной (среды N 16 или N 17). Посевы делают сначала штрихами по скошенной поверхности, а затем вглубь столбика. Посевы на этих средах инкубируют при температуре 24-48 ч.

5.4.2. Через 24-48 ч производят идентификацию культур по ферментации глюкозы, лактозы, сахарозы и мочевины.

Культуры, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не расщепляющие мочевину, ферментирующие глюкозу с образованием кислоты и с образованием или без образования газа (столбик сред прокрашивается в желтый или желто-бурый цвет и внутри столбика есть или нет пузырьков, трещин, поверхность скошенного агара слегка розовая или без изменения цвета), подлежат дальнейшему изучению.

5.4.3. Культуры, выросшие на средах п. 5.4.2, изучают по следующим тестам:

5.4.3.1. Сбраживание маннита

Культуры по п. 5.4.2 петлей пересевают в среду Гисса с маннитом (среда N 18). Посевы инкубируют при температуре 24 ч. При росте культур в среде Гисса с маннитом и индикатором Андреде цвет среды становится ярко-красным и в поплавках накапливается газ, т.е. реакция положительная.

Бактерии рода сальмонелл дают положительную реакцию.

5.4.3.2. Образование индола

Культуры по п. 5.4.2 петлей пересевают в пробирки с бульоном Хоттингера или мясопептонным бульоном с триптофаном (среда N 11). Под пробки в пробирки с посевами помещают полоску индикаторной бумажки на индол (п. 1.2.2.16). Посевы инкубируют при температуре 48 ч. При росте культур, образующих индол, цвет индикаторной бумажки меняется от сиренево-розового до интенсивно-малинового, т.е. реакция положительная.

Бактерии рода сальмонелл дают отрицательную реакцию.

Образование индола можно проверить с реактивами Эрлиха (п. 1.2.2.11) на мясопептонном бульоне с триптофаном согласно методу N 3.

5.4.3.3. Образование сероводорода

Культуры по п. 5.4.2 петлей пересевают в пробирки с бульоном Хоттингера. Под пробки в пробирки с посевами помещают полоску индикаторной бумажки на сероводород (п. 1.2.2.17). Посевы инкубируют при температуре 24-48 ч.

При росте культур, образующих сероводород, цвет индикаторной бумажки становится черным, т.е. реакция положительная.

Бактерии рода сальмонелл дают положительную реакцию

5.4.3.4. Продукция ацетилметилкарбинола (ацетоина).

Культуры п. 5.4.2 петлей пересевают в пробирки с мясопептонным бульоном с 1% глюкозы. Посевы инкубируют при температуре 48 ч. Затем к 1 48-часовой культуры добавляют 0,6 5% спиртового раствора альфа-нафтола (п. 1.2.2.12.1) 0,2 40% водного раствора едкого калия (п. 1.2.2.12.2). Посевы перемешивают и выдерживают при температуре в течение 24 ч. Появление в течение 2-24 ч розового или вишневого окрашивания среды указывает на наличие ацетилметилкарбинола (ацетоина), т.е. реакция положительная.

Бактерии рода сальмонелл дают отрицательную реакцию.

5.3.4.5. Определение подвижности

Культуры п. 5.4.2 петлей пересевают в пробирки с полужидким агаром. Посевы инкубируют при температуре 24 ч. При росте в полужидком агаре подвижных культур будет диффузный рост по всему столбику агара, при росте неподвижных культур рост будет только по месту посева (укола). Подвижность культуры можно определить при анализе по п. 5.4.2 под фазово-контрастным микроскопом.

Бактерии рода сальмонелл подвижны.

5.4.4. Интерпретация результатов биохимической дифференциации культур.

Грамотрицательные подвижные палочки, сбраживающие с образованием или без образования газа глюкозу и маннит, не сбраживающие лактозу и сахарозу, не расщепляющие мочевину, не образующие индол и ацетилметилкарбинол и образующие сероводород, предположительно относят к бактериям рода сальмонелл. Для окончательного заключения выделенные культуры должны быть изучены серологически.

5.5. Серологическое изучение культур предположительно рода сальмонелл.

5.5.1. Реакцию агглютинации с сальмонеллезными поли-моновалентными "О" сыворотками проводят с целью определения групповой принадлежности, а с "Н" сыворотками I и II фаз - видовой принадлежности изучаемых культур к роду сальмонелл.

5.5.2. Реакцию агглютинации выполняют следующим образом:

На профламбированном предметном стекле или на стерильной внутренней поверхности чашки Петри с обратной стороны намечают два квадрата размером 1х1 см. В один квадрат помещают каплю физиологического раствора, а в другой - каплю сальмонеллезной сыворотки (поли-моно "О" или "Н" I и II фазы). В обе капли вносят бактериологической петлей культуры п. 5.4.4 *, размешивают до получения однородной взвеси микробных тел.

5.5.3. Чтение результатов реакции агглютинации с "О" и "Н" сыворотками.

Положительная реакция - в квадрате с сывороткой наблюдается образование хлопьев и выпадение их в осадок, суспензия становится прозрачной.

В квадрате с физиологическим раствором наблюдается равномерная взвесь культур.

Отрицательная реакция - в обоих квадратах равномерная взвесь культуры.

Неспецифическая реакция - в обоих квадратах образовался осадок, суспензия прозрачная. Культуры, давшие неспецифические серологические реакции, должны быть изучены дополнительно по биохимическим тестам**.

6. Оценка результатов анализа

6.1. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

6.2. Культуры, давшие типичные биохимические реакции (п. 5.4) и положительные серологические реакции (п. 5.5.3), относят к сальмонеллам.

6.3. Культуры, давшие типичные биохимические реакции (п. 5.4), но не давшие положительных серологических реакций (п. 5.5.3) или давшие неспецифические реакции (п. 5.5.3), а также культуры, не давшие типичные биохимические реакции (п. 5.4), но давшие положительные серологические реакции (п. 5.5.3), предположительно относят к сальмонеллам. Все эти культуры должны быть отосланы для дальнейшего изучения в специализированные лаборатории.

6.4. Культуры, давшие нетипичные биохимические реакции (п. 5.4) и отрицательные серологические реакции (п. 5.5.3), не относят к сальмонеллам.

6.5. При выявлении в анализируемой пробе культур п. 6.2 и 6.3 дают заключение о присутствии бактерий рода сальмонелл в анализируемом продукте.

______________________________

* Ориентировочную реакцию агглютинации можно проводить с культурами из типичных для сальмонелл колоний, выросших на плотных средах п. 5.3.1

** В приложении к методу N 4 дана таблица биохимических свойств наиболее часто встречающихся типов сальмонелл

Приложение

Таблица
биохимических свойств наиболее часто встречающихся серологических типов сальмонелл*

	Газ в глюкозе	Инозит	Арабиноза	Рамноза	Ксилоза	Глицерин	Цитрат Кристексела			Трегалоза
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Группа А
S. paratyphi A	+ (положительная)	- (отрицательная)	+	+	-	-	-	-	х (вариабельная)
Группа В
S. paratyphi B	+	х	+	х	+	х	+	-	+
S. java	+	х	+	х	+	х	+	+	+
S. abony	+	+	+	+	+	+	+	+	+
S. stanley	+	-	-	+	+	х	+	+	+
S. derby	+	+	+	+	+	+	+	+	+
S. agona	+	+	+	+	+	+	+	+	+
S. typhiwurium	х	х	х	х	х	х	х	х	+
S. reading	+	х	+	х	+	х	+	+	+
S. heidelberg	+	х	+	+	+	+	+	+	+
S. stanley	+	х	+	+	+	х	+	+	+
S. haifa	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Группа
S. paratyphi C	+	-	х	+	+	-	+	+	+
S. cholerae-suis	+	-	-	+	+	-	+	+	+
S. typhi-suis	+	-	+	+	+	-	-	-	-
S. mentevicer	+	х	+	+	+	+	+	+	+
S. cholerae-suis	+	-	-	+	+	-	+	+	+
v. kunsendorf
S. thompson	+	+	+	+	+	+	+	+	+
S. mission	+	-	+	+	+	+	+	+	+
S. isangi	+	+	+	+	+	+	+	+	+
S. virchow	+	+	+	+	+	+	+	+	+
S. infantis	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Группа
S. munchen	+	+	+	+	+	+	+	+	+
S. newport	+	-		+	+	+	+	х	+
S. bovis-morbificcius	+	х	+	+	+	+	+	+	+
S. kottbus	+	+	+	+	+	+	+	+	+
S. tshiongwe	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Группа Д
S. typhi	-	-	х	-	х	-	х	+	х
S. enteritiais	+	-	+	+	+	+	х	х	+
v. jena
S. enteritidis	+	-	х	+	+	-	х	х	+
v. ratin
S. dublin	+	-	х	х	х	х	+	+	+
S. panama	+	-	+	+	+	+	+	х	+
S. gallinarum-pullorum	х	-	+	+	х	-	х	х	х
S. rostock	+	-	+	-	+	-	+	+	+
Группа Е
S. anatum	+	-	+	+	+	+	+	+	+
S. london	+	+	+	+	+	+	+	+	+
S. give	+	+	+	+	+	+	+	х	+
S. newington	+	-	+	+	+	+	+	+	+
S. senftenberg	+	-	+	+	+	х	+	+	х

______________________________

* Биохимические свойства даны согласно Берги, 1974.

Метод N 5. Пищевые продукты. Определение количества Staphylococcus aureus

Настоящий метод распространяется на пищевые продукты, содержащие в 1 г жизнеспособные клетки Staphylococcus aureus, и устанавливает порядок определения их количества.

1. Сущность метода

Метод основан на высеве определенного количества суспензии с продукта, продукта и (или) его разведений в жидкую селективно-диагностическую среду (N 22), культивировании посевов в аэробных условиях при в течение 24-48 ч, учете положительных пробирок и определении НВЧ в 1 г продукта после идентификации роста грамположительных, каталазоположительных кокков, способных коагулировать плазму крови кролика или человека, а также ферментировать маннит в анаэробных условиях и образовывать термостабильную ДНКазу.

2. Пробы

Пробы отбирают и подготавливают к анализу согласно п. 1.3 приложения 1.

3. Аппаратура, инвентарь, посуда

Для проведения анализа применяют аппаратуру, инвентарь и посуду согласно п. 1.1 приложения 1.

4. Растворы, реактивы, индикаторы, компоненты сред, питательные среды

Для проведения анализа применяют:

4.1. Растворы по пп. 1.2.2.1, 1.2.2.3, 1.2.2.4, 1.2.2.5.

4.2. Реактивы по п. 1.2.2.13.

4.3. Индикаторы по п. 1.2.2.14.

4.4. Компоненты по пп. 1.2.2.22, 1.2.2.23, 1.2.2.24, 1.2.2.26, 1.2.2.27.

4.5. Питательные среды N 19, N 20, N 21, N 22, N 23 приложения 1.

5. Проведение исследований

5.2. По 1 разведений и, если необходимо, неразведенного продукта или суспензии высевают параллельно в три пробирки, содержащие по 9 среды N 22.

5.3. Посевы инкубируют в течение 24 ч при температуре и регистрируют положительные пробирки (с признаками микробиологического роста).

5.4. Для идентификации роста из каждой положительной пробирки делают пересев 0,1 культуральной жидкости на поверхность одной из твердых питательных сред (NN 19 или 20, или 21); растирают шпателем Дригальского культуру по поверхности агара и инкубируют чашки при температуре в течение ч.

5.5. После термостатирования посевов на агаризованных питательных средах их просматривают и отмечают рост типичных колоний St. aureus: окрашенных от белого до оранжевого цвета; на молочно-солевом агаре слегка выпуклых, имеющих форму правильных дисков от 2 до 4 мм в диаметре; на яично-желточно-азидном агаре и на яично-желточно-солевом агаре окруженных зоной лецетиназной активности.

5.6. Не менее чем из 5 подозрительных колоний делают препараты, окрашивают по Граму (п. 5.7 метода 2) и микроскопируют. St. aureus окрашивается положительно, имеет шарообразную форму и располагается скоплениями.

5.7. Из одних и тех же колоний (п. 5.4) грамположительных кокков делают пересевы в пробирки со скошенным мясопептонным агаром с 1% глюкозы. Посевы инкубируют при температуре 18-24 ч.

5.8. Культуры, выросшие на скошенном агаре, изучают по следующим тестам*.

5.8.1. Образование каталазы.

Каждую культуру (п. 5.6) испытывают в реакции с 3% раствором (п. 1.2.2.13). На чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю культуры (п. 5.6), к ней добавляют каплю раствора пероксида , перемешивают и смесь покрывают покрывным стеклом.

Культуры, образующие каталазу, вызывают бурное образование пузырьков газа, т.е. реакция положительная.

Стафилококки дают положительную реакцию.

Если ни одна из пяти культур, выросших на скошенном агаре, не образовывает каталазу, дают заключение об отсутствии St. aureus в анализируемом продукте.

5.8.2. Коагулирование плазмы крови.

Для проведения реакции используют сухую плазму крови кролика, которую готовят согласно указаниям на этикетке, или свежую плазму крови кролика, которую готовят следующим образом:

Свежеполученную кровь кролика тщательно смешивают в соотношении 4:1 со стерильным 5-процентным раствором лимоннокислого натрия. Полученную смесь центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об./мин или отстаивают на холоде 18-20 ч, затем плазму отделяют пипеткой и разводят физиологическим раствором в соотношении 1:4.

В пробирки с 0,5 разведенной плазмы прибавляют 0,1 2-3 ч бульонной культуры или петлю суточной агаровой культуры (п. 5.6), которую тщательно растирают в плазме. Пробирки помещают в термостат на .

Учет результатов производят через 1-2-24 ч. Реакцию оценивают положительно на 2 плюса (образован небольшой сгусток), на 3 плюса (образован большой компактный сгусток) и на 4 плюса (свернулась вся плазма и сгусток не меняет своего положения при перевертывании пробирки).

Staphylococcus aureus дает реакцию на 4, 3, 2 плюса.

5.8.3. Сбраживание маннита в анаэробных условиях определяют методом "а" или "б"**.

а) В пробирки со средой Гисса с маннитом (среда N 18), прогретые в кипящей бане в течение 20 мин и охлажденные до , высевают петлей культуры (п. 5.7), наслаивают голодный агар (п. 1.2.2.22) высотой 2-2,5 см или масло вазелиновое (п. 1.2.2.23) высотой 1-1,5 см. Посевы термостатируют при температуре в течение 5 суток.

При сбраживании маннита цвет среды изменяется в розовый, т.е. реакция положительная.

б) Используют среду, приготовленную из сухого агара с индикатором ВР, содержащую маннит.

Среду разливают в пробирку по 4,0 мл и стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. По мере надобности пробирки регенерируют и добавляют по 2,0 стерильного вазелинового масла. Когда среда остынет, уколом (до дна) производят посев испытуемой культуры. Пробирки помещают в термостат при 37°С на 5 суток. В случае разложения маннита среда приобретает синий цвет по всему столбику агара, т.е. реакция положительная.

Staph. aureus дает положительную реакцию.

5.8.4. Образование термостабильной ДНКазы.

Среду с ДНК (среда N 23) расплавляют и разливают по чашкам Петри или на предметное стекло тонким слоем (не более 2-2,5 мм).

В застывшей среде вырезают колодцы диаметром каждого отверстия не более 4 мм, расстояние между стенками колодцев должно быть не менее 7-8 мм. Суточные бульонные культуры прогревают в кипящей водяной бане в течение 15 мин, охлаждают до и вносят 1-2 капли в колодцы пастеровской пипеткой. После чего чашки помещают в термостат при . Результаты учитывают через 1-2-5 ч. При наличии в бульонной культуре или в исходном разведении продукта или суспензии ДНКазы появляется ярко-розовая зона вокруг колодца в радиусе не менее 1 мм на синем фоне среды.

Staph. aureus образует термостабильную ДНКазу.

6. Оценка результатов исследований

6.1. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

6.2. Вычисление наиболее вероятного числа Staph. aureus в 1 г продукта проводят при помощи таблицы НВЧ в соответствии с методом N 2.

6.3. Результаты записывают в виде числа .

Например: 250 клеток в 1 г записывают как кл/г.

______________________________

* В приложении к методу дана таблица некоторых дифференциальных биохимических тестов бактерии семейства Micrococcaceae.

** Тест определяют только в особых случаях (при нечеткой реакции плазмокоагуляции, выявлении токсичности продукта и др.).

Приложение

Таблица

Таблица некоторых дифференциальных биохимических тестов бактерий семейства Micrococcaceae*

Наименование теста	Стафилококки			Микрококки
Наименование теста	S. aureus	S. epidermides	S. saprafiticus	Микрококки
Образование каталазы	+	+	+	+
Коагулирование плазмы крови на 4, 3 и 2 плюса	+	-	-	-
Сбраживание маннита в анаэробных условиях	+	-	-	-
Образование термостабильной ДНКазы	+	-	-	-

______________________________

* Тесты даны согласно Берги, 1974 г.

Обозначение: "+" - реакция положительная

"-" - реакция отрицательная.

Метод N 6. Пищевые продукты. Определение количества плесневых грибов и дрожжей

Настоящий метод распространяется на пищевые продукты, содержащие в 1 г более 3 плесневых грибов или дрожжей и устанавливает порядок определения их количества.

1. Сущность метода

Метод основан на высеве определенного количества продукта или суспензии, или их разведений в селективную агаризованную среду, культивировании посевов при в течение 6 дней, подсчете всех видимых колоний плесневых грибов и дрожжей, типичных по макро- и (или) микроскопической морфологии, и пересчете их количества на 1 г продукта.

2. Пробы

Пробы отбирают и подготавливают к анализу согласно п. 1.3 приложения 1.

3. Аппаратура, инвентарь, посуда

Для проведения анализа применяют аппаратуру, инвентарь и посуду согласно п. 1.1 приложения 1.

4. Растворы, реактивы, индикаторы, компоненты сред, питательные среды

Для проведения анализа применяют:

4.1. Растворы по пп. 1.2.2.1, 1.2.2.2, 1.2.2.3, 1.2.2.4, 1.2.2.6, 1.2.2.8.

4.2. Компоненты по п. 1.2.2.26.

4.3. Питательные среды N 24, N 25, N 26.

5. Проведение исследований

5.1. Из навески продукта или суспензии готовят серию десятикратных разведений согласно п. 1.3 приложения 1.

5.2. По 1 продукта или суспензии, или их соответствующих разведений высевают параллельно в две стерильные чашки Петри. В каждую чашку Петри, содержащую инокулум, добавляют не позднее чем через 15 мин расплавленной и охлажденной до агаризованной среды (N 24 или N 26)*. В случае необходимости для инкубирования развития воздушного мицелия плесневых грибов посевы проводят в среду с бенгальской красной (среда N 26). Среду немедленно тщательно перемешивают с инокулумом и оставляют для застывания.

5.3. После застывания сред посевы инкубируют крышкой вниз при температуре в течение 5 суток. Через 3 суток инкубирования проводят предварительный учет типичных колоний, а через 5 суток - окончательный.

5.4. Через 5 суток просматривают посевы и отбирают чашки, на которых выросло 5-50 типичных колоний плесневых грибов и (или) 5-150 колоний дрожжей.

5.4.1. Плесени образуют на поверхности агара пушистый войлочный бархатистый или порошкообразный, часто окрашенный налет.

5.4.2. Дрожжи на поверхности среды образуют белые или красные колонии с ровными краями и выраженным центром.

Под агаром - это мелкие, средних размеров белые колонии; в глубине агара - это чечевицеобразные колонии чаще кремового цвета с выступающим иногда над поверхностью агара ростом.

5.5. Из не менее чем 5-ти типичных колоний дрожжей готовят препараты и окрашивают метиленовой синью (п. 1.2.2.6) в течение 3-5 мин, а затем промывают водопроводной водой, подсушивают и микроскопируют. Метиленовая синь окрашивает фон препарата значительно слабее, чем дрожжевые клетки. Дрожжевые клетки значительно крупнее бактериальных. Диаметр их достигает 8-10 мкг. Форма их разнообразная - яйцевидная, эллептическая, цилиндрическая, лимоновидная, шаровидная. Часто видно под микроскопом почкование у дрожжей в виде бугорков на поверхности клеток.

6. Оценка результатов исследований

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно в соответствии с ГОСТ 26670-85.

Метод N 7. Пищевые продукты. Определение количества спор мезофильных сульфитредуцирующих клостридий

Настоящий метод распространяется на пищевые продукты, содержащие на 1 г менее 1000 мезофильных сульфитредуцирующих клостридий**, и устанавливает порядок определения их количества.

1. Сущность метода

Метод основан на высеве определенного количества продукта или суспензии, или их разведений в ряд пробирок с полужидкой селективно-диагностической средой, культивировании посевов в анаэробных условиях при в течение 24-43 ч, учете положительных пробирок и определении наиболее вероятного числа в 1 г продукта грамположительных, каталазоотрицательных подвижных палочек, образующих яйцевидные или шарообразные центральные, субтерминальные или терминальные споры и редуцирующие сульфит.

2. Пробы

Пробы отбирают и подготавливают к анализу согласно п. 1.3 приложения 1.

3. Аппаратура, инвентарь, посуда

Для проведения анализа применяют аппаратуру, инвентарь и посуду согласно п. 1.1 приложения 1.

4. Растворы, реактивы, индикаторы, компоненты сред, питательные среды

Для проведения анализа применяют:

4.1. Растворы по пп. 1.2.2.1, 1.2.2.3, 1.2.2.4, 1.2.2.5, 1.2.2.9.

4.2. Реактивы по п. 1.2.2.13.

4.3. Компоненты сред по пп. 1.2.2.22, 1.2.2.23.

4.4. Питательные среды N 27, N 28, N 29.

5. Проведение исследований

5.1. Из навески продукта или суспензии готовят серию десятикратных разведений до такой степени, чтобы последнее разведение давало отрицательный результат (согласно п. 1.3 приложения 1).

5.2. По 1 разведений и (или), если необходимо, неразведенного продукта или суспензии высевают параллельно в три пробирки, содержащие по 10-12 полужидкого сульфитжелезного агара (среда N 27) или улучшенной клостридиальной среды (среда N 28).

Среды в пробирках перед посевом регенерируют, прогревая их в кипящей водяной бане 10-12 мин и быстро охлаждают до температуры 42-45°С.

При выполнении анализа на определение в исследуемом материале количества спор сульфитредуцирующих клостридий посев проводят в пробирки с селективно-диагностической средой, нагретой до 80°С, и затем посевы выдерживают в течение 20 мин в водяной бане с температурой 80°С. Через 20 мин пробирки с посевами извлекают из водяной бани, быстро охлаждают в проточной воде до температуры 42-45°С.

5.3. Посевы инкубируют при температуре 43-72 ч. Посевы просматривают через ч и регистрируют положительные пробирки. Окончательный учет проводят через ч.

5.4. Положительными считаются такие пробирки, в которых имеется рост колоний черного или серо-черного цвета на глубине не менее 1 см от поверхности среды или диффузное почернение среды.

5.5. Из каждой положительной пробирки делают препараты, окрашивают по Граму (п. 5.7 метода N 2) и микроскопируют.

Сульфитредуцирующие клостридии представляют собой грамположительные короткие палочки, в большинстве случаев имеющие центральную, субтерминальную или терминальную споры.

5.6. Определение каталазной активности.

Культуры из положительных пробирок п. 5.4 изучают в реакции с 3%-ным раствором пероксида (п. 1.2.2.13). Реакцию выполняют согласно методу N 5 (п. 5.6.1).

Сульфитредуцирующие клостридии являются каталазоотрицательными.

5.7. Определение редукции сульфита.

Культуру из каждой положительной пробирки (п. 5.4) - грамположительных каталазоотрицательных палочек - пересевают в две пробирки, одна из которых содержит 10-12 , а другая 5-7 среды для определения сульфитредуцирующей способности клостридий (среда N 29).

Посевы инкубируют при температуре в течение ч в анаэробных и аэробных условиях.

Для создания анаэробных условий на посевы в пробирки с высоким столбиком наслаивают водный агар (п. 1.2.2.22) или вазелиновое масло (п. 1.2.2.23) высотой 1,5-2,0 см.

Клостридии в процессе роста восстанавливают сульфит натрия в сульфид натрия , который, соединяясь с хлорным (или цитратным) железом, образует черный осадок сернистого железа (FeS).

Сульфитредуцирующие клостридии вызывают почернение среды в пробирках с высоким столбиком в анаэробных условиях и не дают почернения в пробирках с низким столбиком в аэробных условиях.

6. Оценка результатов исследований

6.1. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

6.2. В результате идентификации учитывают все виды клостридий - грамположительных, каталазоотрицательных палочек с центральными, субтерминальными и терминальными спорами и без спор, вызывающие редукцию сульфита при температуре .

6.3. Вычисление наиболее вероятного числа мезофильных сульфитредуцирующих клостридий в 1 г продукта проводят с помощью таблицы наиболее вероятного числа микроорганизмов в соответствии с методом N 2.

6.4. Результаты записывают в виде числа .

Например, 1100 клеток в 1 г записывают как кл/г.

______________________________

* В качестве арбитражной используют среду N 24

** При анализе продуктов, содержащих в 1 г более 1000 сульфитредуцирующих клостридий, используют посев на агарированные среды N 27 или N 28 с 2% агара.

Согласовано

Государственная инспекция
по заготовкам и качеству
продукции Госагропрома
СССР

А.Я. Козелькин

24 июня 1986 г.

<< Назад
	Содержание Инструкция по микробиологическому контролю быстрозамороженной плодоовощной продукции (утв. Госагропромом СССР 24 июня 1986...

Приложение 1. Методы микробиологического анализа

ГАРАНТ:

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас