Инструкция по определению бактерицидных свойств новых дезинфицирующих средств (утв. Министерством здравоохранения СССР 6 мая 1968 г. N 739-68) (не действует)

Инструкция по определению бактерицидных свойств новых дезинфицирующих средств
(утв. Министерством здравоохранения СССР 6 мая 1968 г. N 739-68)

ГАРАНТ:

Настоящая Инструкция не действует

Взамен настоящей Инструкции введено Руководство Р 4.2.2643-10 "Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности", утвержденное Роспотребнадзором, Главным государственным санитарным врачом РФ 1 июня 2010 г.

I. Общие положения

1. Химические вещества, применяемые для целей дезинфекции, должны отвечать следующим требованиям: обладать хорошей растворимостью в воде, вызывать гибель микроорганизмов в короткие сроки, не снижать свою активность в присутствии органических веществ, быть нетоксичными или малотоксичными для людей и животных, не иметь резкого неприятного запаха, не обладать маркостью и не портить обеззараживаемые предметы. Препараты не должны терять свои бактерицидные свойства при хранении как в сухом виде, так и в виде растворов, быть дешевыми и удобными для транспортировки.

2. При изучении нового дезинфицирующего средства необходимо иметь подробную химическую характеристику препарата, с указанием физико-химических свойств, нейтрализующих веществ и условий хранения.

3. Определение бактерицидности испытуемых дезинфицирующих средств состоит из следующих этапов:

1) Подбор культур микроорганизмов для определения бактерицидной активности дезинфицирующих средств.

2) Изучение бактерицидной активности дезинфицирующих средств в опытах с тест-объектами из батистовой ткани, зараженными тест-культурами.

3) Изучение бактерицидной активности дезинфицирующих средств при обеззараживании поверхностей.

4) Изучение бактерицидной активности дезинфицирующих средств при обеззараживании белья.

5) Изучение бактерицидной активности дезинфицирующих средств при обеззараживании посуды.

6) Изучение бактерицидной активности дезинфицирующих средств при обеззараживании выделений человека (кал, моча, мокрота и др.).

II. Подбор культур микроорганизмов для определения бактерицидной активности новых дезинфицирующих средств

1. Микроорганизмы, используемые в качестве тест-культур и требования, предъявляемые к ним

4. Для определения бактерицидной активности нового дезинфицирующего средства используют следующие виды микроорганизмов:

а) кишечную палочку В. Coli, как наиболее устойчивый вид из кишечной группы бактерий;

б) золотистый стафилококк Staph aureus, наиболее устойчивый вид из кокковой группы микробов;

в) антракоид Вас. anthracoides в споровой форме.

5. При выборе штаммов культур обращают внимание на наличие у них типичных морфологических, биохимических и культуральных свойств, а также на их устойчивость к действию фенола и хлорамина; споровую культуру антракоида проверяют на устойчивость к пару и хлорамину.

6. Рабочие штаммы должны иметь следующую устойчивость:

кишечная палочка:
к фенолу	1:90	не менее	15-20 минут
к хлорамину	0,1%	не менее	10 минут
золотистый стафилококк:
к фенолу	1:70	не менее	20-25 минут
к хлорамину	0,2%	не менее	10 минут
споры антракоида:
к текучему пару
с т-poй 100°С			6-7 минут
к хлорамину 10%		не менее	6 часов

Устойчивость рабочих штаммов проверяют не реже 1 раза в месяц.

7. Музейные культуры хранят при Т°+4°С в виде сухой культуры в ампулах (после лиофильной сушки) не более 2-х лет; в виде посевов на мясопептонном агаре (посев уколом) под слоем стерильного вазелинового масла (толщина слоя 1,5-3 мм) не более 6 месяцев.

8. При отсутствии резистентных культур их выделяют из внешней среды. Для выделения кишечной палочки готовят 20 мл взвеси путем смешивания 2-3 образцов фекалий с водопроводной водой (соотношение фекалий и воды 1:2). Затем взвесь смешивают с 10 мл фенола, разведенного 1:90 и через 5-минутные интервалы делают посев (по 2 петли взвеси на поверхность среды Эндо). Через сутки типичные колонии кишечной палочки пересевают на поверхность MПА. Культуру, выросшую на МПА, идентифицируют по морфологическим, биохимическим и культуральным свойствам, затем проверяют ее устойчивость к фенолу и хлорамину.

Выделение штаммов золотистого стафилококка производят по такой же методике, только посев производят на МПА и материалом для выделения золотистого стафилококка служит смесь из 2-3 проб гнойного отделяемого ран, смешанных с фенолом в разведении 1:70.

I. Приготовление бактериальной или споровой взвеси и батистовых тест-объектов

9. Суточную культуру рабочего штамма кишечной палочки или золотистого стафилококка засевают на поверхность мясопептойного агара и выращивают в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 часов.

10. Для получения споровой формы бактерий суточную бульонную культуру антраконда засевают на косой агар в пробирках (рецепт среды смотри в приложении 1). Пробирки в течение 48 часов (2 суток) держат в термостате при 37°, а затем 5-7 дней при комнатной температуре 10-18°С, в темноте. По истечении указанных сроков культуру проверяют на спорообразование под микроскопом. Для приготовления мазка культуру забирают петлей с верхнего, среднего и нижнего участка агара; все три пробы растирают вместе на одном предметном стекле, распределяя тонким слоем. Мазок окрашивают фуксином. Под микроскопом рассматривают не менее 10 полей зрения; количество спор в поле зрения должно быть не менее 90%.

11. Для приготовления бактериальной взвеси культуру смывают стерильной водопроводной водой. Полученную взвесь микробов фильтруют через стерильный ватно-марлевый фильтр и разводят до концентрации, соответствующей по мутности бактериальному стандарту 2 миллиарда микробных тел в 1 мл.

Культуру антракоида снимают с агара и растирают о стенки пробирки со стерильной водопроводной водой.

12. При приготовлении батистовых тест-объектов кусок батиста погружают на 24 часа в холодную водопроводную воду для удаления аплитуры. Затем его тщательно стирают с мылом, кипятят, сушат и гладят горячим утюгом. С помощью иглы в приготовленном куске ткани выдергивают нитки в продольном направлении на расстоянии 11 мм друг от друга, а в поперечном - на расстоянии 6 мм. По этим линиям батист разрезают ножницами на тест-объекты и по 50 штук раскладывают в чашки Петри, последние завертывают в бумагу и стерилизуют в автоклаве 30 минут при 126° (0,5 ати).

13. Для заражения стерильные батистовые тест-объекты (в количестве 50-100 штук) в чашке Петри заливают 10-20 мл бактериальной или споровой взвесью, равномерно смачивая все тест-объекты. Чашку Петри закрывают крышкой и оставляют тесты в бактериальной или опоровой взвеси в течение 20 минут. Затем в асептических условиях батистовые тест-объекты, пропитанные культурой, переносят на поверхность стерильной фильтровальной бумаги (2 слоя на дне чашки Петри, покрывают их сверху стерильной бумагой и закрывают чашку Петри крышкой. Через 10 минут после удаления избытка жидкости для фиксации микроорганизмов на батистовых тест-объектах, последние переносят на поверхность сухой стерильной фильтровальной бумаги в чашке Петри и сверху прикрывают стерильным листом фильтровальной бумаги, подсушивают в термостате при 37°С в течение 20 минут с приоткрытыми крышками.

14. Хранят зараженные тест-объекты в чашках Петри в рефрижераторе при температуре +4°С.

Срок хранения тест-объектов, зараженных культурой кишечной палочки, 1 сутки, культурой золотистого стафилококка - 4 суток, спорами антракоида - 7 суток.

II. Определение устойчивости тест-культур

15. Определение устойчивости тест-культур проводят при воздействии дезинфицирующих растворов на тест-культуру, фиксированную на батистовых тест-объектах.

2. Определение устойчивости культур к действию фенола

16. Для определения устойчивости культур к фенолу используют чистый, кристаллический фенол, перегнанный при температуре 180°. Хранят кристаллический фенол в герметичной стеклянной таре, помещенной в эксикатор над обожженным хлористым кальцием.

17. Рабочие растворы фенола готовят на стерильной водопроводной воде в день опыта; концентрацию раствора берут в зависимости от вида культуры (устойчивость золотистого стафилококка испытывают при разведении фенола 1:70, а устойчивость кишечной палочки 1:90).

18. При постановке опытов в стеклянную колбу пипеткой наливают требуемый объем соответствующего раствора фенола (из расчета на каждый тест-объект по 0,5 мл). Отсчитав в чашке Петри зараженные тест-объекты (по 2 на каждую экспозицию), захватывают их пинцетом все сразу и после обжигания горлышка колбы, опускают в раствор фенола, не касаясь краев. Легкими покачиваниями колбы достигают смачивания всех тест-объектов дезинфицирующим раствором. Колбу помещают в водяную баню с температурой 19-20° и держат ее в этих условиях в течение всего опыта. Момент смачивания всех тест-объектов считают началом опыта. Через каждые пять минут в течение часа стерильным охлажденным пинцетом или платиновой петлей извлекают по 2 тест-объекта из раствора фенола и опускают в пробирку с 5 мл стерильной водопроводной воды. Через 5 минут тест-объекты переносят во вторую пробирку также с 5 мл стерильной водопроводной воды. Затем через 5 минут из второй пробирки каждый тест-объект помещают в пробирку с 5 мл жидкой питательной среды (мясопептонный бульон или казеиновый бульон).

19. Контролем служат два тест-объекта, не подвергавшиеся действию фенола, но погруженные в пробирки со стерильной водопроводной водой на срок, равный действию фенола. Перед посевом на питательную среду контрольные тест-обьекты также промываются в двух водах.

Посевы ставят в термостат при 37°С. Результаты учитывают через 24-48 часов и окончательно через 7 суток. Опыты повторяют не менее трех раз.

3. Определение устойчивости к хлорамину

20. До проверки устойчивости культур к хлорамину йодометрическим способом определяют количество активного хлора в сухом веществе. В опытах используют хлорамин, содержащий 26-28% активного хлора.

21. Определение устойчивости рабочих штаммов к хлорамину проводят по методике, аналогичной определению устойчивости к фенолу. Только первую промывку производят не в воде, а в 0,5% растворе гипосульфита натрия, который необходим для нейтрализации хлора, фиксированного на ткани.

22. При определении устойчивости культуры кишечной палочки используют 0,1% раствор хлорамина, для золотистого стафилококка - 0,2%, для спор антракоида - 10%.

23. Контролем в опытах при определении устойчивости к хлорамину служат два тест-объекта, погруженные в воду на максимальный срок экспозиции, после чего промытые в 0,5% растворе гипосульфита натрия и в воде. Другим контролем служит контроль нейтрализации, который заключается в следующем. Тест-объекты погружают в растворы хлорамина на максимальную экспозицию, затем они последовательно отмываются в гипосульфите натрия и в воде, после чего засевают на МПБ, куда подсевают разведение тест-культуры, содержащее 10-20 клеток.

24. Посевы ставят в термостат при температуре 37°С, проверяют через 24-48 часов, окончательно учитывают результаты через 7 дней.

4. Определение устойчивости спор к пару

25. Устойчивость споровой формы культуры антракоида проверяют в аппарате Ойль-Мюллера следующим образом: в колбу аппарата наливают воду и нагревают до кипения. При достижении температуры до 100°С на термометре, находящимся под действием текучего пара, на предварительно обожженную сетку помещают два зараженных тест-объекта. Сетку с тест-объектами вносят в зону действия текучего пара. По истечении 1 мин действия пара тесты извлекают и засевают на две пробирки с бульоном. На обожженную сетку вновь вносят два теста на экспозицию 2 мин и так повторяют, увеличивая экспозицию на 1 мин до 5-7 мин. Посевы инкубируют при 37°С в течение 7 дней. Предварительный учет результатов проводят через 48 часов, окончательный - на 7 сутки.

Аппарат Ойль-Мюллера может быть заменен колбой емкостью 1-2 литра с широким удлиненным горлом. Корковую пробку колбы на 1/3 срезают для выхода пара из колбы. Через пробирку пропускают проволоку, имеющую на конце металлическую сеточку диаметром 3-3,5 см, на которую помещают тест-объекты. Сеточка с тестами должна находиться над уровнем воды на расстоянии 5-6 см.

IV. Изучение бактерицидных свойств дезинфицирующих средств

1. Определение бактерицидных и спорицидных свойств новых дезинфицирующих средств

26. Для определения наличия бактерицидных или спорицидных свойств дезинфицирующих средств готовят 1-5% растворы испытуемого дезинфицирующего препарата на дистилированной воде из расчета 0,5 мл раствора на каждый тест-объект.

27. В рабочие растворы дезинфицирующего средства погружают батистовые тест-объекты, зараженные культурой кишечной палочки, стафилококка или спорами антракоида, как описано выше.

28. Начиная от момента погружения тест-объектов в дезинфицирующий раствор, в течение часа и более через каждые 5 минут вынимают петлей из раствора по 2 тест-объекта и после 2-х кратной промывки в воде или в нейтрализаторе и воде делают посев их в жидкую питательную среду (казеиновый или мясопептонный бульон).

29. Посевы помещают в термостат при температуре 37°С. Учет результатов проводят ежедневно для вегетативных форм в течение 6-7 дней, для споровых форм - в течение 14 дней. Окончательное суждение о наличии у испытуемого вещества бактерицидных и спорицидных свойств делают после обобщения результатов 3-х повторных опытов.

2. Определение бактериостатических свойств дезинфицирующих средств

30. При оценке бактерицидного действия нового дезинфекционного средства разграничивают бактерицидное действие препарата от бактериостаза.

Если для изучаемого вещества известен нейтрализатор, то промывка пересеваемого материала в растворе нейтрализатора, достаточна для устранения бактериостатических свойств дезинфицирующего вещества.

31. Бактериостатические свойства препарата устанавливают также путем добавки в питательные среды веществ, адсорбирующих дезинфицирующие средства (10% инактивированной сыворотки и др.).

32. В тех случаях, когда нейтрализатор не известен, при изучении нового дезинфектанта применяют отмывание микроорганизмов от остатков исследуемого вещества путем центрифугирования. Для этого 3 мл смеси бактериальной культуры и исследуемого раствора, в соотношении 1:9, после определенной экспозиции помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при 3000 об/мин. Удаляют надосадочную жидкость, остаток ресуспендируют в 3 мл физиологического раствора и вновь центрифугируют в течение 5 минут.

Последнюю процедуру повторяют трижды. Остаток засевают на питательные среды.

33. Кроме культуральных методов исследования бактериостатическое действие устанавливают при использовании биологической пробы на животных.

Биологическую пробу для определения бактериостатических свойств используют только в опытах с патогенными культурами, кишечной группы В. tiphi, В. typhimurium предварительно оттитровав вирулентность штаммов.

Бактериальную культуру, подвергнутую воздействию исследуемого препарата, освобождают от последнего путем центрифугирования, как описано выше, и вводят восприимчивому животному. Количество вводимых микробных тел должно соответствовать вирулентной дозе.

34. Все эксперименты повторяют не менее 3 раз.

Особенно строго учитывают температуру исследуемого раствора 20°С. Небольшие колебания температуры растворов, дают значительную разницу в результатах.

Во всех опытах используют питательные среды, приготовленные только по одному рецепту.

3. Изучение эффективности дезинфицирующих средств в зависимости от различных факторов

35. После установления наличия бактерицидных свойств у нового дезинфицирующего вещества изучают зависимость его эффективности от концентрации действующего начала времени воздействия, температуры, реакции среды, наличия белковой защиты.

36. Изучение зависимости эффективности от перечисленных факторов проводят путем воздействия дезинфицирующих растворов на бактерии, фиксированные на батистовых тест-объектах.

37. При изучении влияния различных факторов на эффективность обеззараживания в опытах с батистовыми тест-объектами, заражение последних проводятся по методике, описанной в пункте 14, а порядок проведения опытов такой же, как при изучении устойчивости.

38. Для изучения бактерицидной активности нового дезинфицирующего средства в присутствии белка батистовые тесты заражают 18-24-часовой бульонной культурой кишечной палочки или стафилококка или во взвесь бактерий добавляют в качестве белковой защиты 20% инактивированной сыворотки или дефибрированной крови.

Суточную бульонную культуру перед использованием встряхивают; бульонная культура содержит 1 миллиард микробных тел в 1 мл. (При посеве 0,1 мл 24 час, бульонной культуры в 10 мл бульона).

Инактивацию нормальной сыворотки крупного рогатого скота проводят дробным трех-кратным прогревом на водяной бане при Т° 59-60°С в течение 30 минут.

Испытание бактерицидной активности препарата в присутствии белка проводят с теми концентрациями, которые оказались эффективными при обеззараживании тест-объектов, зараженных опытными культурами без белковой защиты.

Если активность препарата не снижается в присутствии белка, концентрацию последнего увеличивают до 40%. При отсутствии снижения активности препарата и при добавлении 40% белка считают, что данный препарат не реагирует с белком.

39. Влияние температуры на активность исследуемого дезинфицирующего средства изучают при обеззараживании инфицированных батистовых тест-объектов. Для этого колбу с исследуемым раствором помещают в водяную баню.

Доводят температуру исследуемого раствора до желаемого уровня и опускают заражение тест-объекты.

Далее порядок проведения опыта такой, как при изучении устойчивости тест-культур.

40. Влияние рН среды на активность исследуемого средства изучают также при обеззараживании инфицированных батистовых тест-объектов. Готовят ряд разведений исследуемого вещества с различным рН. Для подкисления используют децинормальный раствор соляной или другой кислоты, а для подщелачивания децинормальный раствор щелочи.

Порядок проведения опыта такой, как и при изучении устойчивости тест-культур.

IV. Изучение бактерицидных свойств испытуемых дезинфицирующих средств при обеззараживании различных объектов

1. Изучение бактерицидной активности средств при обеззараживании поверхностей

41. Изучение бактерицидной активности дезинфицирующих средств при обеззараживании поверхностей проводятся с целью разработки режима обеззараживания их в зависимости от концентрации раствора, кратности обработки, расхода жидкости на 1  поверхности, экспозиции, температуры, вида поверхности.

42. В качестве тест-объектов используют поверхности размером 10х10  из различных материалов: деревянные, оштукатуренные, поверхности окрашенные масляной или клееной краской, оклеенные обоями, а также поверхности из линолеума и др.

43. Перед заражением культурой поверхности подвергают механической очистке - моют водой с мылом и щеткой, за исключением поверхностей, оклеенных обоями и окрашенных клеевой краской. Последние протирают несколько раз стерильной салфеткой, увлажненной стерильной водопроводной водой. После подсыхания поверхности располагают горизонтально и на них пипеткой наносят рабочий штамм из расчета 0,5 мл 2 миллиардной взвеси на площадь в 100 кв. см. Культуру равномерно распределяют по поверхности стеклянным шпателем. Поверхности подсушивают при комнатных условиях (температура 18-20°С и относительная влажность воздуха 50-60%). Заражение поверхностей проводят накануне постановки опыта.

44. При обеззараживании инфицированных поверхностей оштукатуренные, окрашенные клеевой краской, оклеенные обоями и тест-объекты из кафеля располагают вертикально и проводят обработку их в этом положении, остальные поверхности обрабатывают как в горизонтальном, так и в вертикальном положениях. Дезинфицирующий раствор наносят на поверхность путем орошения из пульверизатора, точно следя за количеством израсходованной жидкости. Норма расхода 300-500 мл раствора на кв. м обрабатываемой площади. После орошения поверхности оставляют до полного высыхания. Обычно на это затрачивается 45-60 мин.

45. Контроль эффективности обеззараживания осуществляют следующим образом: забор проб производят путем тщательного протирания орошенных поверхностей стерильным, слегка увлажненным ватным тампоном или стерильной марлевой салфеткой.

После протирания на поверхности не должно оставаться излишней влаги. Ватный тампон или марлевую салфетку (5х5 ) отмывают в 10 мл нейтрализатора или в стерильной водопроводной воде. Время отмыва по 10 минут, при встряхивании с бусами. Отмывную жидкость вносят в чашки Петри (обычно в 2-3 чашки по 0,5-1 мл в каждую) и заливают растопленным и остуженным до 40-50° с агаром. Для равномерного распределения микроорганизмов в агаре, последний перемешивают круговыми движениями до застывания питательной среды.

46. В контрольных опытах аналогично зараженные поверхности орошают стерильной водопроводной водой из того же расчета (300-500 поверхности), что и опытные. Жидкость, в которую помещают тампоны после взятия проб с контрольных поверхностей, перед посевом разводят в 100 раз. После выдерживания посевов в термостате подсчитывают количество выросших колоний на чашках Петри, рассчитывают плотность заражения на 100  и % обеззараживания, принимая количество бактерий, снятых с контрольных тест-объектов за 100%.

Например:

с 100  контрольной поверхности снято 148000 микробных тел, а с аналогичного вида опытной поверхности - 20 микробных тел.

Отсюда следует, что процент обеззараживания опытной поверхности составляет 99,987%. Окончательную оценку обеззараживания поверхностей делают на основании трех опытов с совпадающими результатами.

Эффективным считают такое дезсредство, которое при обеззараживании поверхностей обеспечивает 100% гибель рабочего штамма на опытных поверхностях.

47. При работе с гладкими поверхностями кроме смывов забор проб после обеззараживания производят методом отпечатков, который заключается в следующем. На дне чашек Петри помещают равного диаметра с ней марлевый кружочек. С двух сторон по краю марлевого кружочка при выкраивании оставляют "стебельки", полоски марли, размером 2-3 см, которые выступают за края. Для того, чтобы марля при стерилизации не свертывалась на нее помещают листок фильтровальной бумаги. Чашки стерилизуют вместе с марлей и фильтровальной бумагой. После стерилизации из чашек стерильным пинцетом вынимают фильтровальную бумагу, а в чашки на марлю выливают расплавленный и остуженный до 40-50° мясопептонный или казеиновый агар или агар Эндо. После подсыхания питательной среды без нарушения целостности и стерильности агаровой пластинки ее вынимают за "стебельки" и накладывают на исследуемую поверхность для получения отпечатков. Затем агар за "стебельки" помещают обратно в ту же чашку Петри и ставят в термостат. Таких отпечатков делают с одной и той же поверхности не менее трех.

2. Изучение бактерицидных свойств новых дезинфицирующих средств при обеззараживании белья

48. Изучение эффективности новых дезинфицирующих средств при обеззараживании белья проводят с целью разработки эффективных режимов обеззараживания в зависимости от концентрации действующего начала, времени обработки.

При этом учитывают норму расхода на 1 кг белья, температуру раствора, степень и характер загрязнения белья, влияние дезинфицирующего раствора на прочность и окраску белья.

49. Контроль эффективности обеззараживания белья новыми дезинфицирующими средствами проводят с помощью тест-объектов, представляющих собой кусочки бязи размером 2x2 см. Бязь предварительно обрабатывают так же как батист (см. раздел 3).

50. Заражение стерильных тест-объектов из бязи производят 2-х млд суспензией рабочих культур из расчета 20 мл на 10 тест-объектов.

Зараженные и подсушенные в термостате тест-объекты закладывают в бязевые мешочки размером 5х8 см по 2 шт. в каждый. Мешочки закрывают в виде конверта, к углу его пришивают нитку длиной около 0,5 м.

51. Дезинфицирующий раствор готовят перед опытом из расчета четырех литров раствора на один кг белья при работе с вегетативными формами микроорганизмов и 5 литров - в опытах со споровыми формами.

52. Белье погружают в бак с раствором последовательно, одну вещь за другой, следя за тем, чтобы между вещами не образовалось воздушных прослоек, препятствующих процессу дезинфекции. Одновременно между слоями белья распределяют (сверху, в середине и внизу) мешочки с зараженными тест-объектами. Через определенные промежутки времени (например 15-30 мин и 1 час) мешочки с тест-объектами извлекают одновременно из трех слоев. Тест-объект вынимают стерильным пинцетом из мешочка, нейтрализуют или промывают в стерильной водопроводной воде, после чего помещают в питательный бульон. В контрольных опытах белье погружают в водопроводную воду. Мешочки с тестами закладывают так же, как и в основном опыте.

53. При получении положительных данных (100% гибель рабочих штаммов) в опытах по обеззараживанию белья, зараженного чистыми культурами золотистого стафилококка или кишечной палочки, переходят к опытам, по обеззараживанию загрязненного белья. С этой целью к 6 мл 2-х млрд суточной культуры золотистого стафилококка прибавляют 4 мл инактивированной сыворотки, смешивают и заливают тест-объекты из расчета 20 мл на 10 тест-объектов. При работе с культурой кишечной палочки к 6 мл млрд культуры добавляют 4 мл 40% эмульсии кала (8 г кала растирают в ступе с 20 мл воды). Подсушивают тест-объекты при 37° 20-25 мин.

54. Посевы выращивают при 37° 7 суток, при наличии роста производят высев на твердые питательные среды и идентифицируют культуру.

55. Эффективными считают средство, обеспечивающее 100% гибель рабочих культур в обеззараживаемом белье.

3. Изучение бактерицидных свойств новых дезинфицирующих средств при обеззараживании посуды

56. Изучение эффективности дезсредств при обеззараживании посуды проводят с целью разработки эффективных режимов обеззараживания ее в зависимости от наличия и отсутствия остатков пищи на ней, температуры растворов, времени обработки, концентрации действующего начала.

57. Для обеззараживания посуды в качестве тест-объектов используют тарелки, стаканы, эмалированные кружки, ножи, вилки, ложки. Вначале чистую посуду (тарелки, стаканы), заражают 2 млд суточной культурой, путем нанесения последней из пипетки, как при заражении поверхностей. Вилки, ложки и ножи погружают в бактериальную суспензию на 1-2 минуты, оставляя незараженными их ручки. Зараженную посуду подсушивают при комнатных условиях. Подготовленную таким образом посуду после полного высыхания погружают в испытуемый раствор так, чтобы между предметами находился дезинфицирующий раствор. Дезинфицирующий раствор должен полностью и с избытком покрыть всю посуду. Через определенные интервалы времени (например, 15, 30, 60 минут) извлекают из дезинфицирующего раствора по одному предмету (тарелки, стакан, нож и т.д.) и ватным тампоном или марлевой салфеткой тщательно протирают зараженную часть каждого предмета. Отмыв тампона или салфетки проводят в широкогорлых пробирках в 10 мл стерильной водопроводной воды с бусами путем встряхивания в течение 10 минут. После отмыва ватный тампон или марлевую салфетку засевают на жидкие питательные среды. Отмывную жидкость в количестве 0,5-1 мл засевают на питательные среды для подсчета колоний.

58. Контролем служит аналогично загрязненная посуда, погруженная на самую длительную экспозицию в водопроводную воду.

59. При получении 100% гибели рабочего штамма при обеззараживании чистой посуды, искусственно инфицированной тест-культурой, переходят к обеззараживанию посуды, загрязненной остатками пищи. Для этого перед нанесением на посуду культуры, последнюю смешивают с небольшим количеством овсяной, манной или какой-либо другой каши, сваренной на молоке со сливочным маслом (на 10  каши берут 1 мл 2-х млд культуры). Методика обеззараживания посуды, забор проб и высев на питательные среды указана выше.

60. Эффективным считают средство, обеспечивающее 100% гибель микроорганизмов.

4. Изучение бактерицидной активности дезинфицирующих средств при обеззараживании мочи

При изучении бактерицидной активности дезинфицирующих средств, в опытах с мочей учитывают соотношение дезрастворов и мочи, концентрацию действующего начала, время обработки, температуру.

61. Опыты по обеззараживанию мочи проводят следующим образом: берут несколько колб или пробирок, наливают в них по 8 мл мочи, прибавляют по 1 мл 2-миллиардной суспензии тест-микробов и 1 мл инактивированной сыворотки. Растворы испытуемого дезинфицирующего средства готовят в концентрациях, которые обеспечивают бактерицидный эффект при испытании на тест-объектах с белковой защитой после 10-15 минут воздействия. Растворы дезинфицирующего средства добавляют к моче в равном или двойном с ней количестве. Отмечают время контакта и через интервалы (например, 15, 30, 60 минут) пипеткой берут указанную смесь в количестве 1 мл и переносят в пробирки с 5 мл питательной среды. После тщательного смешивания 1 мл жидкости из первой пробирки с бульоном переносят во вторую и затем засевают по 0,1 мл на твердые питательные среды как из первой, так из второй.

При заражении мочи кишечной палочкой, высев делают на среду Эндо, а стафилококком - на твердые питательные среды. Чашки Петри ставят в термостат, через сутки проводят ориентировочный учет результатов, а через 7 суток - окончательный.

62. Контролем служат аналогично поставленные опыты только с добавлением к моче не дезинфицирующего раствора, а воды. Результаты опытов учитывают по отношению к контролю, который принят за 100%. Окончательное суждение об эффективности действия дезинфицирующего средства делают на основании не менее трех опытов с совпадающими результатами.

63. Эффективными считают средство, обеспечивающее 100% гибель рабочих культур.

5. Изучение бактерицидных свойств дезинфицирующего средства при обеззараживании кала

64. При разработке режимов обеззараживания кала учитывают отношение дезинфицирующего средства к обеззараживаемой массе, время обработки, температуру, консистенцию обеззараживаемых выделений, степень гомогенизации в процессе обеззараживания.

65. Опыты проводят следующим образом: 20 г кала растирают в ступке и добавляют 80 мл воды; полученную эмульсию фильтруют через двойной слой марли, разливают пипеткой в пробирки по 9 мл и добавляют по 1 мл 2-миллиардной суспензии культуры кишечной палочки. Опыты начинают ставить с концентрацией, вызывающей гибель кишечной палочки в моче с белком через 30 мин.

66. Приготовленную эмульсию фекалий заливают равным и двойным количеством дезинфицирующего раствора и в дальнейшем производят высевы так же, как и при обеззараживании мочи. Результаты учитывают через двое суток.

67. При положительных результатах проводят опыты с большим количеством оформленных фекалий (200-250 г.). Для этого помещают их в сосуд и заливают дезинфицирующим раствором в равном или двойном количестве по отношению к весу фекалий. Затем небольшую часть каловых масс размешивают стеклянной палочкой с жидкостью, а остальную массу оставляют в виде небольших комочков. Через определенные промежутки (например, 30, 60 минут) времени производят раздельные высевы жидкой части и комочков.

68. Жидкую часть фекальных масс набирают пипеткой и посев производят так же, как мочи. Плотные части кала (комочки) забирают петлей, сделанной из проволоки, и опускают в 5 мл питательной среды, растерев их о края пробирки и тщательно перемешав с бульоном; затем переносят из первой пробирки 1 мл смеси во вторую пробирку, также содержавшую 5 мл бульона. Как из первой, так из второй пробирки производят посев на чашку Петри со средой Эндо или Левина. Окончательный результат эффективности обеззараживания учитывать через 48 часов, а ориентировочный - через 24 часа.

69. Контролем служат аналогично поставленные опыты с добавлением вместо дезинфицирующего раствора воды. Результаты опытов учитывают по отношению к контролю, который принимают за 100%. Судят об эффективности исследуемого вещества на основании не менее трех опытов с совпадающими результатами.

70. Эффективным считают средство, обеспечивающее 100% гибель рабочих культур и обеззараживаемом материале.

71. Последующие этапы изучения новых дезинфицирующих веществ с целью внедрения их в практику дезинфекции проводит в соответствии с приказом по Министерству здравоохранения СССР N 883 от 29 ноября 1966 г. (приложение N 3).

Зам. начальника Главного санэпид. управления Министерства здравоохранения СССР

В. Попов