Руководство Р 4.2.2643-10 "Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 1 июня 2010 г.) (с изменениями и дополнениями)

Руководство Р 4.2.2643-10
"Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 1 июня 2010 г.)

Введены в действие с 1 июня 2010 г.

Введены взамен "Методических рекомендаций по определению вирулицидной активности препаратов" (N 1119-73 от 06.09.1973 г.), "Инструкции по определению бактерицидных свойств новых дезинфицирующих средств (N 739-68 от 6 мая 1968 г.), Методических указаний "Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности", 1998 г.

3.5. Дезинфектология

1. Область применения

1.1 Настоящее руководство (далее - руководство) устанавливает единые методы лабораторных исследований и испытаний для оценки их антимикробной, инсектицидной, акарицидной, репеллентной и родентицидной активности, эффективности и безопасности при применении в быту, в лечебно-профилактических организациях и на других объектах для обеспечения безопасности жизни и здоровья людей, животных и неповреждения объектов внешней среды.

1.2. Настоящее руководство предназначено для организаций, учреждений, предприятий, аккредитованных испытательных центров (лабораторий), органов по сертификации дезинфекционных средств, аккредитованных в системе аккредитации ГОСТ Р, специалистов, осуществляющих исследования дезинфицирующих, стерилизующих, дезинсекционных, дератизационных средств, а также их субстанций (действующих веществ) в процессе их разработки, производства, применения, регистрационных и сертификационных испытаний, производственного контроля и надзора [4, 5].

1.3. Руководство разработано на основе Федерального закона от 31.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" [1], Федерального закона от 10.01.2002 г. N 23001 "Об охране окружающей среды" [2], "Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан" от 22.07.1993 г. N 5487-I [3], Постановления Правительства от 04.04.2001 г. N 262 "О государственной регистрации отдельных видов продукции, представляющих потенциальную опасность для человека, а также отдельных видов продукции, впервые ввозимых на территорию Российской Федерации" [7], а также "Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании", утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 г. N 554 [6], и других нормативных и методических показателей, приведенных в разделе 2 "Нормативные ссылки".

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Дату Федерального закона N 52-ФЗ следует читать как "от 30.03.1999 г."

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Номер Федерального закона "Об охране окружающей среды" следует читать как "N 7-ФЗ"

2. Нормативные ссылки

1. Федеральный закон от 31.03.1999 г., N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" (Собрание законодательства Российской Федерации, 1999, 314, ст. 1650; 2002, N 1 (ч. 1), ст. 2; 2003, N 2, ст. 167; N 27 (ч. 1), ст. 2007; 2004, N 35, ст. 3607; 2005, N 19, ст. 1752; 2006, N 1, ст. 10; 2007, N 1, ст. 29; N 27, ст. 3213; N 46, ст. 5554; N 49, ст. 6070.

2. Федеральный закон от 10.01.2002 г., N 23001 "Об охране окружающей среды".

3. "Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан" от 22 июля 1993 г. N 5487-I (с изменениями от 2 марта 1998 г., 20 декабря 1999 г., 2 декабря 2000 г., 10 января, 27 февраля, 30 июня 2003 г., 29 июня,июня, 22 августа, 1, 29 декабря 2004 г., 7 марта, 21, 31 декабря 2005 г., 2 февраля 2006 г.).

4. Федеральный закон от 16.09.1998 г. N 158-ФЗ "О лицензировании отдельных видов деятельности".

5. Федеральный закон от 10.06.1993 г. N 5151-I "О сертификации продукции и услуг".

6. "Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании", утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 г. N 554 (Собрание законодательства Российской Федерации, 2000, N 31, ст. 3295).

7. Постановление Правительства от 04.04.2001 г. N 262 "О государственной регистрации отдельных видов продукции, представляющих потенциальную опасность для человека, а также отдельных видов продукции, впервые ввозимых на территорию Российской Федерации".

8. Приказ Минздрава СССР от 30.12.1983 г. N 1509 "О дальнейших мерах по совершенствованию порядка оформления разрешения к медицинскому применению и передачи для промышленного производства новых лекарственных средств".

9. Приказ Минздрава России от 20.07.1998 г. N 217 "О гигиенической оценке производства, поставки и реализации продукции и товаров".

10. Приказ Минздрава России от 10.11.2002 г. N 344 "О государственной регистрации дезинфицирующих, дезинсекционных и дератизационных средств для применения в быту, в лечебно-профилактических учреждениях и на других объектах для обеспечения безопасности и здоровья людей".

11. Постановление Госстандарта России от 30.07.2002 г. N 64 "Номенклатура продукции, в отношении которой законодательными актами Российской Федерации предусмотрена обязательная сертификация".

12. СП 3.1/3.2.558-96 "Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных заболеваний".

13. СП 3.5.3.1129-02 "Санитарно-эпидемиологические требования к проведению дератизации".

14. СП 3.5.1378-03 "Санитарно-эпидемиологические требования к организации и осуществлению дезинфекционной деятельности".

15. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

16. СП 3.1.1275-03 "Профилактика инфекционных заболеваний при эндоскопических манипуляциях".

17. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней" с дополнениями и изменениями (СП 1.3.2518-09).

18. СанПиН 1.2.681-97 "Гигиенические требования к производству и безопасности парфюмерно-косметической продукции".

19. СанПиН 2.1.7.728-99 "Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений".

20. СанПиН 2.1.4.1175-02 "Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников".

21. Нормативные показатели безопасности и эффективности дезинфекционных средств, подлежащих контролю при проведении обязательной сертификации N 01-12/75-97, 1998 г.

22. СанПиН 2.1.2.1188-03 "Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества".

23. Нормативные показатели эффективности и безопасности дезинфекционных средств, утвержденные 08.03.2004 г.

24. ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности: ГОСТ 12.1.007-76.

25. ГОСТ 22567.8-77 "Средства моющие синтетические. Методы определения силиката натрия".

26. ГОСТ 8728-77 "Диметилфталат. Технические условия".

27. ГОСТ 13081-77 "Фосфид цинка. Технические условия".

28. ГОСТ 27283-87 "Средства индивидуальные химические для обеззараживания воды от бактериологических средств".

29. ГОСТ 177-88 "Водорода перекись. Технические условия".

30. ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны: ГОСТ 12.1.005-88.

31. ГОСТ 29188.0-91 "Изделия парфюмерно-косметические. Правила приемки, отбор проб, методы органолептических исследований".

32. ГОСТ 29188.6-91 "Изделия парфюмерно-косметические. Газохроматографический метод определения этилового спирта".

33. ГОСТ Р 50550-93 "Товары бытовой химии. Метод определения показателя активности водородных ионов (рН)".

34. ГОСТ 22567.5-93 "Средства моющие синтетические и вещества поверхностно-активные. Методы определения концентрации водородных ионов (рН)".

35. ГОСТ Р 50551-93 "Товары бытовой химии. Метод определения активного хлора".

36. ГОСТ 18995.1-73 "Продукты химические жидкие. Методы определения плотности".

37. ГОСТ 18995.2-73 "Продукты химические жидкие. Методы определения показателя преломления".

38. ГОСТ 18995.4-73 "Продукты химические органические. Методы определения интервала температуры плавления".

39. ГОСТ Р 51022-97 "Методы определения анионного поверхностно-активного вещества".

40. ГОСТ Р 51018-97 "Методы определения неионогенного поверхностно-активного вещества".

41. Ратиндан. Фармакопейная статья ФС 42-330-79.

42. Определение температуры плавления. Государственная Фармакопея XI издания, выпуск 1, С.16.

43. Определение плотности. Государственная Фармакопея XI издания, выпуск 1, С.24.

44. Определение показателя преломления (рефрактометрия). Государственная Фармакопея XI издания, выпуск 1, С.29.

45. Определение вязкости жидкостей. Государственная Фармакопея XI издания, выпуск 1, С.87.

46. Определение рН. Государственная Фармакопея СССР XI издания, выпуск 1, С.113.

47. ОСТ 42-21-2-85 "Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства, режимы". М., 1985 г.

48. Стандарт Европейского Комитета по стандартизации NEN-EN 14476.

49. Государственная фармакопея СССР. XI изд. М., 1987 г., Вып. 1. с. 183-186.

50. ГОСТ Р 51021-97 "Методы определения смываемости с посуды". 1997 г.

ГАРАНТ:

Приказом Росстандарта от 22 ноября 2013 г. N 1909-ст ГОСТ Р 51021-97 отменен с 1 января 2016 г. в связи с введением в действие ГОСТ 32443-2013 "Товары бытовой химии. Метод определения смываемости с посуды"

51. Инструкция по определению бактерицидных свойств новых дезинфицирующих средств. Утв. МЗ СССР 6 мая 1968 г., N 739-68.

52. Методические указания по оценке дезинфицирующих средств, предназначенных для обеззараживания различных объектов и санитарной обработки людей. Утв. МЗ СССР 20 августа 1970 г., N 859-70.

53. Методические указания по определению эффективности препаратов для борьбы с молью, утв. МЗ СССР 12.06.1977 г.

54. Методические указания по гигиенической оценке одежды и обуви из полимерных материалов, Москва, 1977 г., 47 с.

55. Методические указания по изучению токсичности препаратов санитарно-гигиенического и бытового назначения в аэрозольных баллонах. М., 1980 г.

56. Методические указания к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны: МУ 2163-80 М., 1980 г.

57. Методические указания по первичному отбору новых акарицидов и сравнительному изучению их активности против саркоподобных клещей от 23.07.1982 г., утв. ВАСХНИЛ.

58. Методические указания по определению устойчивости культур микроорганизмов, контаминирующих изделия медицинского назначения в условиях производства и эксплуатации, к стерилизующим агентам. Утв. МЗ СССР 29 марта 1985 г., N 28-6/7.

59. Методические указания "Токсикологическая оценка педикулицидов" от 20.06.1985 N 26-6/6.

60. Временные методические указания по обоснованию предельно допустимых концентраций (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест. От 15.06.1988 г., N 4681-88.

61. Методические указания по использованию культуры диплоидных клеток человека, рекомендуемых для токсиколого-гигиенических исследований. Утверждены МЗ СССР 18.09.1991 г., 20 с.

62. Методические указания по оценке активности хемостерилянтов и регуляторов развития насекомых. МУ N 01-19/06-11 от 03.02.1995 г.

63. Гигиеническая оценка условий труда при применении пестицидов, Методические указания N 01-19/140-17 от 20.11.1995 г.

64. Методические указания по лабораторной оценке воздействия соединений на синантропных тараканов. Утв. ГКСЭН РФ N 01-19/17-11 от 09.02.1995 г.

65. Требования к постановке экспериментальных исследований по обоснованию предельно допустимых концентраций промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы: МУ 1.1.578-96. М., 1997 г.

66. Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности. Утв. МЗ РФ, 1998 г.

67. "Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих - переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций". МУ 3.1.1027-01.

68. Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения. МУ 287-113 от 30.12.1998 г.

69. Оценка токсичности и опасности дезинфицирующих средств, МУ 1.2.1105-02, Утв. МЗ России, 10.02.2002 г.

70. Методические указания по лабораторной оценке антимикробной активности текстильных материалов, содержащих антимикробные препараты. МУ от 18.11.83 N 28-6/32.

71. Методические указания "Отлов, учет и прогноз численности мелких млекопитающих и птиц в природных очагах инфекций" МУ 3.1.1029-01, М., 2002.

72. Методические указания "Методы определения эффективности инсектицидов, акарицидов, регуляторов развития и репеллентов, используемых в медицинской дезинсекции" МУ 3.5.2.1759-03.

73. Методические указания "Очистка, дезинфекция и стерилизация эндоскопов и инструментов к ним" МУ 3.5.1937-04.

74. Методические указания "Методы изучения и оценки спороцидной активности дезинфицирующих и стерилизующих средств" МУ 3.5.2435-09.

75. "Методические указания по изучению и оценке вирулицидной активности дезинфицирующих средств" МУ 3.5.24-31-08.

76. Сборник руководящих методических материалов по токсиколого-гигиеническим исследованиям полимерных материалов и изделий на их основе медицинского назначения, утв. МЗ СССР 1987 г. с. 85.

77. Методические указания "Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно допустимых уровней загрязнения кожи" от 01.11.1979 г. N 2102-79.

78. ГОСТ 9.055-75 "Ткани шерстяные. Методы лабораторных испытаний на устойчивость к повреждению молью" М. 1975.

79. Приказ Минздрава СССР от 06.04.1973 г. "Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)".

80. Приказ Минздрава СССР от 10.10.1983 г. "Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения СССР".

81. Методические указания "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды" МУК 4.2.10.18-01 Минздрав России. М. 2001 г.

82. Санитарно-эпидемиологические правила "Профилактика клещевого вирусного энцефалита" СП 3.1.3.2.52-08.

83. Методические рекомендации по отбору и изучению биологической активности и токсичности репеллентов//М. 1987.

84. Руководство Р1.1.003-96 "Общие требования к построению, изложению и оформлению нормативных и методических документов системы государственного санитарно-эпидемиологического нормирования".

85. Методические указания по определению зоокумарина в тканях и крови животных, в приманках и препарате (пенокумарин) хроматографическими и спектрофотометрическими методами N 1550-76.

3. Общие положения

Одним из важнейших элементов санитарно-эпидемиологического благополучия населения страны, составляющих ее национальную безопасность, является организация и неуклонное проведение комплексных мер по неспецифической профилактике и борьбе с возникновением и распространением случаев инфекционных, в том числе внутрибольничных инфекций, а также паразитарных болезней с помощью дезинфектологических средств прерывания путей передачи возбудителей инфекций через объекты внешней среды.

В комплексы профилактических и противоэпидемических мер по борьбе с упомянутыми инфекциями входят дезинфектологические технологии, включающие дезинфицирующие, стерилизующие, дезинсекционные и дератизационные средства.

Дезинфектологические средства обеспечивают гибель, устранение или инактивацию на/в объектах внешней среды возбудителей болезней и их переносчиков (членистоногих и грызунов), т.е. являются биоцидными агентами и поэтому могут являться потенциально-опасными также для людей, животных, обрабатываемых объектов и окружающей среды.

Безопасность для людей в связи с проведением дезинфекционных мероприятий требует, прежде всего, обеспечения высокой эффективности соответствующей целевой технологии. Именно этим может и должно быть гарантировано предупреждение возможного неблагоприятного побочного эффекта - токсического воздействия самих дезинфекционных средств на людей и животных, повреждения обрабатываемых объектов и загрязнения окружающей среды.

В настоящее время при разработке, производстве, проведении регистрационных и сертификационных испытаний разрешается применение, хранение дезинфекционных средств, использование максимально безопасных химико-аналитических, микробиологических, энтомологических, родентологических методов, регламентированных официальными обязательными нормативно-методическими документами.

Унификация методов исследований и критериев оценки эффективности и безопасности дезинфицирующих, стерилизующих, инсектицидных, акарицидных, родентицидных, репеллентных средств необходима для обеспечения единства требований и сравнимости результатов оценки дезинфекционных средств различного состава, данных экспертизы при их государственной регистрации, сертификации средств разных производителей, а также при контроле качества дезинфекционных средств в системе Роспотребнадзора Российской Федерации.

На основе анализа, обобщения и унификации отечественных методов исследований и критериев оценки эффективности и безопасности дезинфекционных и стерилизационных средств, а также гармонизации их с зарубежными стандартами подготовлено Руководство "Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности".

Данное руководство оформлено в соответствии с требованиями Руководства "Общие требования к построению, изложению и оформлению нормативных и методических документов системы государственного санитарно-эпидемиологического нормирования" Р.1.1.1001.-Р.1.1.1005. 96 г. [84] и на основе принятого в нашей стране порядка изучения дезинфекционных средств в целях государственной регистрации и сертификации. Оно состоит из восьми разделов:

1. Область применения;

2. Нормативные ссылки;

3. Общие положения;

4. Химико-аналитические методы исследований дезинфекционных средств;

5. Микробиологические методы исследований и критерии оценки эффективности дезинфицирующих и стерилизующих средств;

6. Энтомологические методы исследований и критерии оценки эффективности дезинсекционных средств;

7. Родентологические методы исследований и критерии оценки эффективности дератизационных средств;

8. Методы исследований и критерии оценки токсичности и безопасности дезинфекционных средств.

4. Химико-аналитические методы исследований дезинфекционных средств

4.1. Общие положения

Химические исследования являются важнейшей составляющей исследований и испытаний при создании, государственной регистрации, производстве, применении и сертификации дезинфекционных средств.

При создании дезинфекционных средств химические исследования включают:

- синтез действующего вещества;

- разработку рецептуры средства;

- разработку методов анализа действующих веществ и средств;

- установление срока годности действующих веществ и средств.

При государственной регистрации дезинфекционных средств проводят химико-аналитические исследования с целью:

- установления соответствия представляемых на регистрацию образцов дезинфекционных средств требованиям нормативной документации;

- определения количеств средства в воздухе и на обрабатываемых изделиях (санитарно-химические исследования) в случае использования в средствах летучих и плохо смываемых компонентов, представляющих потенциальную опасность при их использовании.

При производстве и применении дезинфекционных средств осуществляют контроль их качества согласно требованиям нормативной документации с использованием методов химико-аналитических исследований. При использовании дезинфицирующих средств в пищевой промышленности для обработки оборудования, кроме контроля качества самих дезинфицирующих средств химическими методами контролируют также рабочие растворы средств и смывные воды с обрабатываемого оборудования.

При сертификационных испытаниях дезинфекционных средств химико-аналитические испытания являются основным способом подтверждения соответствия выпускаемого средства требованиям нормативной документации, т.е. соответствия выпускаемого средства зарегистрированному.

Дезинфекционные средства представляют собой составы в различных агрегатных состояниях: жидком, твердом и газообразном, а также в виде разных форм применения.

В состав дезинфекционных средств входят действующие вещества из разных классов химических соединений. Часто эти средства наряду с действующими веществами содержат функциональные добавки (моющие компоненты, синергисты, антикоррозионные добавки, растворители, регуляторы рН, красители, отдушки и пр.), придающие им дополнительные полезные свойства.

Поэтому для оценки качества дезинфекционных средств помимо обязательного количественного определения действующих веществ необходимо оценивать также косвенные интегральные физико-химические показатели качества, характеризующие многокомпонентные дезинфекционные средства в целом. Особенно характерно и обоснованно определение физико-химических показателей для дезинфицирующих средств. Эти показатели в совокупности в определенном приближении могут служить для дополнительной идентификации каждого конкретного дезинфицирующего средства.

Порядок определения показателей качества дезинфекционных средств следующий: сначала оценивают физико-химические показатели, и только после полного соответствия этих показателей требованиям нормативной документации, переходят к количественному анализу действующих веществ.

Такой порядок проведения химико-аналитических исследований дезинфекционных средств обусловлен тем, что при нем осуществляется переход от менее сложных и трудоемких в исполнении измерений, каковыми является определение физико-химических параметров, к более сложным процедурам количественного определения действующих веществ. Это позволяет обнаружить несоответствие средства требованиям нормативной документации уже на этапе измерений физико-химических параметров без проведения длительных исследований по количественному определению действующих веществ.

Контроль качества дезинфекционных средств химическими методами проводится с целью оценки соответствия средства требованиям нормативной документации и, следовательно, рецептуре средства. Вследствие этого, учитывая важную контролирующую функцию химических испытаний дезинфекционных средств, необходимо иметь методическую базу, позволяющую получать достоверные результаты при их аналитических исследованиях.

4.1.1. Методы определения физико-химических показателей дезинфекционных средств

К числу определяемых общих для всех средств показателей относятся внешний вид, включающий агрегатное состояние и цвет, а также запах. Эти показатели определяют органолептически.

Кроме того, для характеристики жидких дезинфекционных средств используют такие физико-химические показатели, как водородный показатель, называемый также показателем активности, или показателем концентрации водородных ионов (рН) самого средства или его водных растворов; плотность при 20°С; показатель преломления при 20°С; относительную или удельную вязкость. Для порошкообразных индивидуальных веществ (субстанций) определяют температуру плавления и рН их водных растворов. Таблетированные формы дезинфицирующих средств испытывают на распадаемость и (или) растворимость.

При этом если указанные выше показатели качества (кроме водородного показателя) являются всего лишь интегральными характеристиками многокомпонентных рецептур, величина водородного показателя (рН) очень существенна для характеристики дезинфекционных средств, так как активность некоторых действующих веществ в значительной мере зависит от величины этого показателя. В то же самое время следует иметь в виду, что величиной рН не следует характеризовать средства с высоким содержанием органических растворителей, в частности, для рецептур с высоким содержанием спиртов величина рН является условной, и ее не измеряют.

В связи с вышеизложенным, перечень тестируемых физико-химических параметров определяется конкретно для каждого средства с учетом его агрегатного состояния и состава.

Органолептическую оценку, включающую визуальное определение внешнего вида и определение запаха обонянием можно проводить в соответствии с ГОСТ 27025-86 [31]. В случае избрания других условий оценки внешнего вида и запаха, эти условия (посуда и освещение - при определении внешнего вида и особые условия определения запаха) должны быть указаны в нормативной документации.

Распадаемость и растворимость таблетированных форм дезинфицирующих средств определяют по времени распадения и растворения их в определенном объеме воды. Условия определения указанных показателей обычно устанавливают разработчики средств, при этом желательно, чтобы они были приближены к условиям применения этих средств.

Измерение физико-химических параметров - водородного показателя, плотности, показателя преломления, относительной или удельной вязкости, температуры плавления проводят в соответствии с действующими ГОСТами на методы определений и Государственной Фармакопеей СССР ХI издания. В частности, водородный показатель определяют потенциометрически [33, 34, 46], плотность при 20°С измеряют с помощью ареометра или пикнометра [36, 43], показатель преломления при 20°С - рефрактометрически [37, 42], температуру плавления - термометрически [42, 44], вязкость - вискозиметрически [45].

4.1.2. Методы количественного определения действующих веществ в дезинфекционных средствах

Без контроля качества выпускаемой продукции - приемосдаточных и сертификационных испытаний на соответствие нормативной документации не может быть использовано ни одно дезинфекционное средство. При этом обязательным условием оценки качества дезинфекционных средств является количественное определение действующих веществ, обуславливающих их активность и токсичность.

Вследствие этого, нормативная документация на дезинфекционные средства (технические условия на отечественную и спецификации на зарубежную продукцию) должна в обязательном порядке включать нормы на содержание действующих веществ. Кроме того, представляемые зарубежными фирмами спецификации должны сопровождаться описаниями методик анализа действующих веществ.

Поскольку в качестве действующих веществ в дезинфекционных средствах применяются вещества из разных классов химических соединений, для количественного определения действующих веществ используются разнообразные методы химического анализа: гравиметрические, титриметрические, фотоколориметрические, спектрофотометрические, методы газовой - газо-адсорбционной и газо-жидкостной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии и др.

Методы и конкретные методики, которые могут быть использованы для количественного определения действующих веществ в средствах указанного назначения, многочисленны. Все они разные и потому не всегда поддаются унификации. В связи с этим ниже приводим систематизированный и обобщенный материал по методам анализа действующих веществ из различных классов химических соединений с описанием некоторых методик, наиболее применяемых для анализа дезинфекционных средств. Приведенные методики могут оказаться неприменимыми для многокомпонентных рецептур, содержащих неиндифферентные к конкретным методам ингредиенты. В таких случаях следует путем химических исследований выяснить причины искажающего действия компонентов на результаты анализов и устранить их в рамках существующих методик или разработать новые методы анализа.

Для анализа действующих веществ в дезинфекционных средствах могут быть использованы также другие, не приведенные ниже методики анализа, обеспечивающие достаточную точность, воспроизводимость и сходимость результатов.

В нижеследующих главах приведено описание методов анализа действующих веществ в дезинфицирующих, стерилизующих средствах, средствах для предстерилизационной очистки, дезинсекционных (инсектицидных, акарицидных, инсектоакарицидных и репеллентных) и дератизационных средствах.

Приводимые ниже методы - это наиболее часто применяемые для контроля качества дезинфекционных средств методы анализа, описанные в химико-аналитических разделах Инструкций по их применению.

4.2. Методы количественного определения действующих веществ в дезинфицирующих, стерилизующих средствах и средствах для предстерилизационной очистки

В дезинфицирующих и стерилизующих средствах действующими веществами, в основном, являются:

- галоидактивные (хлор-, бром- и йодактивные соединения);

- кислородактивные соединения (перекись водорода, ее комплексы с солями, надуксусная кислота, озон);

- альдегиды (глутаровый альдегид, глиоксаль, формальдегид, янтарный альдегид, ортофталевый альдегид);

- четвертичные аммониевые соли (алкилдиметилбензиламмоний хлорид, дидецилдиметиламмоний хлорид и др. из ряда катионных ПАВ);

- производные гуанидина (соли полигексаметиленгуанидина, полигексаметиленбигуанидина и хлоргексидин биглюконат);

- третичный алкиламин - N,N-бис(3-аминопропил)додециламин;

- низшие жирные спирты (этиловый, изопропиловый и н-пропиловый);

- фенольные соединения [2-бифенилол, 2-бензил-4-хлорфенол, 5-хлор-2-гидроксидифенилметан, 5-хлор-2-(2,4-дихлорфенокси)фенол и др.];

- кислоты (органические и неорганические),

- щелочи,

- метасиликат натрия и др.

В состав средств для предстерилизационной очистки входят моющие компоненты, содержание которых в ряде случаев также контролируется. Это вещества из класса анионных, неионогенных и катионных ПАВ, щелочи, соли щелочных металлов (в частности, метасиликат натрия), ферменты и др.

Для количественного определения действующих веществ, входящих в состав дезинфицирующих, стерилизующих средств и средств для предстерилизационной очистки в настоящее время наиболее часто применяют описанные ниже методы анализа.

4.2.1. Методы определения галоидактивных соединений (хлорактивных, бромактивных и йодактивных)

Анализ галоидактивных соединений (хлорактивных, бромактивных и йодактивных) основан на определении активных галоидов (активного хлора, активного брома и активного йода соответственно).

Из этого класса в качестве действующих веществ дезинфицирующих средств, в основном, используют хлорактивные и йодактивные соединения.

Определение хлорактивных соединений. Анализ хлорактивных соединений проводят с количественным определением активного хлора методом йодометрического титрования.

Сущность метода заключается в титровании серноватистокислым натрием (тиосульфатом натрия) свободного йода, выделяющегося при взаимодействии содержащих активный хлор соединений с йодистоводородной кислотой, образующейся из йодистого калия в кислой среде [35].

Выполнение анализа. К навеске средства или аликвоте раствора навески средства, содержащим около 35 мг активного хлора, прибавляют 10  10% раствора йодистого калия, 10  10% раствора серной кислоты, перемешивая после добавления каждого реактива, закрывают колбу пробкой и выдерживают в темном месте 3 мин.

Выделившийся йод титруют 0,1 н. раствором тиосульфата натрия до светло-желтой окраски, прибавляют 1-2  0,5% раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения синей окраски раствора.

Обработка результатов. Массовую долю активного хлора (Х) в процентах вычисляют по формуле:

,

где V - объем раствора тиосульфата натрия концентрации точно с   (0,1 н.), израсходованный на титрование, ;

0,003545 - масса активного хлора, соответствующая 1  раствора тиосульфата натрия концентрации точно с   (0,1 н.), ;

m - масса анализируемой пробы, г.

Определение бромактивных соединений. Анализ бромактивных соединений проводят с количественным определением активного брома методом йодометрического титрования.

Выполнение анализа. По описанной для хлорактивных соединений методике анализируют навеску или аликвоту раствора навески, содержащие около 80 мг активного брома.

Обработка результатов. Массовую долю активного брома (Х) в процентах вычисляют по формуле:

,

где V - объем раствора тиосульфата натрия концентрации точно с   (0,1 н.), израсходованный на титрование, ;

0,00799 - масса активного брома, соответствующая 1  раствора тиосульфата натрия концентрации точно с   (0,1 н.), ;

m - масса анализируемой пробы, г.

Определение йодактивных соединений. Для анализа йодактивных соединений также используют метод йодометрического титрования. Сущность метода заключается в титровании активного йода раствором тиосульфата натрия.

Выполнение анализа. Навеску средства, содержащую около 130 мг активного йода, вносят в титровальную колбу и доводят объем дистиллированной водой до 30 . Полученный раствор йодофора титруют 0,1 н. раствором тиосульфата натрия в присутствии индикатора - 2  (0,5% раствора крахмала), добавляемого при переходе окраски в светло-желтый цвет. Иногда титрование йодактивных соединений ведут в отсутствии крахмала до обесцвечивания раствора.

Обработка результатов. Массовую долю активного йода (Х) в процентах вычисляют по формуле:

,

где V - объем раствора тиосульфата натрия концентрации точно с   (0,1 н.), израсходованный на титрование, ;

0,01269 - масса активного йода, соответствующая 1  раствора тиосульфата натрия концентрации точно с   (0,1 н.), ;

m - масса анализируемой пробы, г.

4.2.2. Методы определения перекисных соединений (перекиси водорода, ее комплексов с солями, надуксусной кислоты и озона)

Определение активного кислорода. Часто перекисные соединения анализируются на содержание активного кислорода.

Для количественного определения активного кислорода используют метод йодометрического титрования [35].

Сущность метода заключается в титровании раствором тиосульфата натрия свободного йода, выделяющегося при взаимодействии содержащих активный кислород соединений с йодистоводородной кислотой, образующейся из йодистого калия в кислой среде.

Выполнение анализа. Навеску средства, содержащую около 8 мг активного кислорода, титруют в условиях, описанных в п. 2.1. для йодометрического титрования хлорактивных соединений [35].

Обработка результатов. Массовую долю активного кислорода (Х) в процентах вычисляют по формуле:

,

где V - объем раствора тиосульфата натрия концентрации точно с   (0,1 н.), израсходованный на титрование, ;

0,0008 - масса активного кислорода, соответствующая 1  раствора тиосульфата натрия концентрации точно с   (0,1 н.), ;

m - масса анализируемой пробы, г.

Методы определения перекиси водорода. Для анализа перекиси водорода могут быть использованы следующие объемные методы - перманганатометрическое, йодометрическое или цериметрическое титрование. В литературе описан целый ряд других методов анализа перекиси водорода (фотоколориметрический, спектрофотометрический, полярографический и пр.).

Наиболее применяемым из указанных выше методов является метод перманганатометрического титрования, описанный в ГОСТе на перекись водорода [29].

Выполнение анализа. Навеску средства, содержащую около 25 мг перекиси водорода, помещают в коническую колбу вместимостью 250 , содержащую 25  дистиллированной воды и 20  раствора серной кислоты (разбавление 1 : 4 по объему), перемешивают и титруют 0,1 н. раствором марганцовокислого калия до розовой окраски, не исчезающей в течение минуты.

Параллельно проводят контрольный опыт в тех же условиях и с тем же количеством реактивов, но без добавления перекиси водорода.

Обработка результатов. Массовую долю перекиси водорода (Х) в процентах вычисляют по формуле:

,

V - объем раствора марганцовокислого калия концентрации с (1/5 )=0,1  (0,1 н.), израсходованный на титрование анализируемой пробы, ;

- объем раствора марганцовокислого калия концентрации точно с (1/5 )=0,1  (0,1 н.), израсходованный на контрольное титрование, ;

0,0017 - масса перекиси водорода, соответствующая 1  раствора тиосульфата натрия концентрации точно с (1/5 )=0,1  (0,1 н.), ;

К - поправочный коэффициент раствора марганцовокислого калия концентрации с (1/5 )=0,1  (0,1 н.);

m - масса анализируемой пробы, г.

Методы определения надуксусной кислоты. Надуксусная (пероксоуксусная) кислота образуется при взаимодействии уксусной кислоты с перекисью водорода. Средства на ее основе получаются смешиванием этих компонентов, поэтому они практически всегда содержат перекись водорода.

Основными методами анализа систем перекись водорода-надуксусная кислота являются методы последовательного перманганатометрически-йодометрического и цериметрически-йодометрического титрования компонентов в одной и той же анализируемой пробе. Сначала перманганатометрическим или цериметрическим титрованием определяют перекись водорода, после чего проводят йодометрическое определение надуксусной кислоты. Для удаления кислорода, выделяющегося при перманганатометрическом и цериметрическом титровании перекиси водорода, к кислому титруемому раствору прибавляют карбонаты натрия. Выделяющийся при этом углекислый газ уносит с собой растворенный кислород.

Выполнение анализа. К навеске средства, содержащей перекись водорода и около 15 мг надуксусной кислоты, прибавляют 90  10% раствора серной кислоты и проводят титрование перекиси водорода 0,1 н. раствором марганцовокислого калия до светло-розового окрашивания, не исчезающего в течение минуты. К оттитрованной пробе прибавляют 1 г карбоната или бикарбоната натрия, колбу взбалтывают в течение 2 минут, после чего прибавляют 10  10% раствора йодида калия и выдерживают 10 минут в темном месте.

Выделившийся йод титруют 0,1 н. водным раствором тиосульфата натрия до светло-желтой окраски, прибавляют 1  1% водного раствора крахмала и продолжают титровать до обесцвечивания раствора.

Обработка результатов. Массовую долю перекиси водорода в смеси ее с надуксусной кислотой вычисляют по формуле, приведенной выше в подразделе "Методы определения перекиси водорода".

Массовую долю надуксусной кислоты (Х) в процентах вычисляют по формуле:

,

где V - объем раствора тиосульфата натрия концентрации с   (0,1 н.), израсходованный на титрование, .

0,0038 - масса надуксусной кислоты, соответствующая 1  раствора тиосульфата натрия концентрации точно с   (0,1 н.), ;

К - поправочный коэффициент раствора тиосульфата натрия концентрации с   (0,1 н.);

m - масса анализируемой пробы, г.

Методы определения озона. Наиболее доступны и применяемы в настоящее время методы количественного определения озона с помощью газоанализаторов.

Для анализа озона в жидких средах используют измеритель концентрации озона ИКО-3.

Принцип действия измерителя заключается в фотоколориметрическом определении озона по собственной полосе поглощения при длине волны 253,7 нм.

Диапазон измеряемой концентрации растворенного озона от 0,1 мг/л до 30 мг/л.

Выполнение измерений проводят согласно Инструкции по применению прибора.

Для анализа озона в воздухе могут быть использованы газоанализаторы озона - Измеритель концентрации озона в газе ИКО-1, оптический газоанализатор озона "Циклон-5.51" и хемилюминисцентный газоанализатор озона модели "3.02П-Р"

Принцип действия ИКО-1 и оптического газоанализатора заключается в фотоколориметрическом определении озона по собственной полосе поглощения при длине волны 253,7 нм.

Диапазон измеряемых концентраций озона прибором ИКО-1 - от 1 до 150 мг/л, газоанализатором "Циклон-5.51" - от 0 до 100 .

Принцип действия газоанализатора озона модели "3.02П-Р" - в эффекте гетерогенной хемилюминисценции, возникающей в результате экзотермической реакции озона с окисляемыми химическими веществами композиции. Интенсивность свечения композиции пропорциональна концентрации озона в газовой смеси, измеряется и преобразуется в цифровой сигнал, отображаемый на мониторе анализатора.

Диапазон измеряемых концентраций - (0-500) .

Выполнение измерений указанными газоанализаторами озона проводят согласно руководствам по их эксплуатации.

4.2.3. Методы определения альдегидов (глутарового альдегида, глиоксаля, формальдегида, орто-фталевого альдегида и др.)

Альдегиды, входящие в состав дезинфицирующих средств, анализируют, в основном, следующими методами: объемными (титриметрическими) - бисульфитным (2 варианта), сульфитным и с использованием гидроксиламина и гидроксиламина солянокислого. В последние годы для их анализа стали использовать методы ГЖХ и ВЭЖХ, которые приводятся в Инструкциях по применению дезинфицирующих средств.

Сущность бисульфитного метода заключается в образовании бисульфитного производного при взаимодействии альдегидов с бисульфитом натрия с последующим определением альдегидов методом йодометрического титрования. В первом классическом варианте метода используется обратное титрование прибавляемого избытка йода раствором тиосульфата натрия. Второй вариант предусматривает прямое титрование раствором йода.

В основе сульфитного метода - образование при взаимодействии альдегидов с сульфитом натрия гидроокиси натрия, титруемой растворами серной или соляной кислот.

При применении в анализе свободного гидроксиламина в спиртовой среде происходит оксимирование, и содержание альдегида определяется разностью объемов соляной кислоты, израсходованных на титрование в контрольном опыте и при титровании анализируемой пробы.

Сущность метода с использованием гидроксиламина солянокислого заключается в том, что при взаимодействии альдегидов с ним образуются альдоксимы с выделением эквивалентного количества соляной кислоты, которая титруется раствором гидроокиси натрия либо потенциометрически до рН в интервале от 3 до 4, либо с индикатором бромфеноловым синим.

Ниже приводится в обобщенном виде наиболее часто применяемый метод количественного определения альдегидов с использованием гидроксиламина солянокислого на примере глутарового альдегида.

Выполнение анализа. Навеску или аликвоту навески средства, содержащие около 250 мг глутарового альдегида, вносят в коническую колбу с притертой пробкой, прибавляют 10  дистиллированной воды и 0,1  0,1% водного раствора бромфенолового синего.

В случае кислой реакции полученного раствора (раствор в присутствии индикатора окрашивается в желтый цвет) прибавляют 0,5 н. раствор гидроокиси натрия до появления синего окрашивания. В случае щелочной реакции раствора (раствор окрашивается в синий цвет) прибавляют 0,5 н. раствор соляной кислоты до светло-желтого окрашивания и затем 0,5 н. раствор гидроокиси натрия до появления синего окрашивания. Затем вносят 25  7% водного раствора гидроксиламина солянокислого, закрывают колбу пробкой, оставляют на 20-30 минут при комнатной температуре, после чего образовавшийся раствор желтого цвета титруют 0,5 н. раствором гидроокиси натрия до появления синего окрашивания.

Обработка результатов. Массовую долю глутарового альдегида (Х) в процентах вычисляют по формуле:

,

где V - объем раствора гидроокиси натрия концентрации с (NaОН)=0,5  (0,5 н.), израсходованный на титрование, ;

0,025 - масса глутарового альдегида, соответствующая 1  раствора гидроксида натрия концентрации точно с (NaОН)=0,5  (0,5 н.), ;

К - поправочный коэффициент раствора гидроокиси натрия концентрации с (NaОН) = 0,5  (0,5 н.);

m - масса анализируемой пробы, г.

4.2.4. Методы определения четвертичных аммониевых солей

Анализ четвертичных аммониевых солей (ЧАС) из ряда катионных ПАВ в дезинфицирующих средствах проводят с использованием методов двухфазного и аргентометрического титрования, фотоколориметрического, спектрофотометрического и др. методов.

В большинстве случаев для анализа ЧАС применяют методики анализа, основанные на методе двухфазного титрования.

Существует много вариантов метода двухфазного титрования ЧАС, отличающихся по величине рН титруемого раствора и по используемым индикаторам. Для анализа дезинфицирующих средств применяют щелочное и кислотное титрования с использованием индикаторов бромфенолового синего, метиленового голубого, смешанных индикаторов метиленового голубого и эозина Н, а также димидиум бромида и дисульфина голубого др.

В основе метода количественного определения ЧАС двухфазным титрованием лежит взаимодействие катионоактивных ЧАС с анионоактивным додецилсульфатом натрия.

Указанные варианты двухфазного титрования позволяют количественно определять ЧАС с большой степенью точности. Они описаны в технических условиях и Инструкциях по применению дезинфицирующих средств, содержащих ЧАС.

Ниже приведена методика анализа алкилдиметилбензиламмоний хлорида методом двухфазного титрования в щелочной среде с использованием индикатора бромфенолового синего.

Приготовление щелочного буферного раствора с рН 11. 50 г сульфата натрия и 3,5 г карбоната натрия растворяют в 500  дистиллированной воды.

Выполнение анализа. В цилиндр или коническую колбу вносят навеску или аликвоту раствора навески средства, содержащие около 15 мг алкилдиметилбензиламмоний хлорида, 30  буферного раствора с рН 11, 20  хлороформа и 8-12 капель 0,1% водного раствора индикатора бромфенолового синего. Титруют 0,004 н. раствором додецилсульфата натрия с интенсивным встряхиванием в закрытой емкости до появления отчетливого фиолетового окрашивания в верхней водной фазе.

Обработка результатов. Массовую долю алкилдиметил-бензиламмоний хлорида (Х) в процентах вычисляют по формуле:

,

где V - объем раствора додецилсульфата натрия концентрации с   (0,004 н.), израсходованный на титрование, ;

0,00143 - масса алкилдиметилбензиламмоний хлорида соответствующая 1  раствора додецилсульфата натрия концентрации точно с   (0,004 н.) при средней молекулярной массе ЧАС 357, ;

К - поправочный коэффициент раствора додецилсульфата натрия концентрации с   (0,004 н.);

m - масса анализируемой пробы, г.

Данный метод не избирателен в присутствии ПГМГ.

4.2.5. Методы определения производных гуанидина (солей полигексаметиленгуанидина гидрохлорида и хлоргексидина биглюконата)

Методы определения полигексаметиленгуанидин гидрохлорида и полигексаметиленгуанидин фосфата. В настоящее время для анализа солей полигексаметиленгуанидина в дезинфицирующих средствах часто используют фотоколориметрический метод с использованием красителя эозина Н. Для анализа солей полигексаметиленгуанидина в составе дезинфицирующих средств разработан также метод двухфазного титрования.

Разные модификации этих методов описаны в Инструкциях по применению средств, содержащих соли полигексаметиленгуанидина.

Ниже приведен один из вариантов фотоколориметрической методики анализа полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ).

Данная методика может быть использована только при отсутствии в составе средства других азотсодержащих органических соединений (ЧАС, аминов и др.)

Сущность метода заключается в фотометрическом определении оптической плотности ионных ассоциатов, образуемых в растворах при взаимодействии ПГМГ с эозином Н.

Приготовление буферного раствора. Готовят два раствора:

Раствор 1-0,1 н. водный раствор соляной кислоты с использованием фиксанала.

Раствор 2-0,75 г глицина и 0,59 г хлористого натрия растворяют в мерной колбе вместимостью 100  с доведением объема дистиллированной водой до метки.

Для приготовления буферного раствора в мерную колбу вместимостью 100  вносят 92,5  раствора 2 и объем жидкости доводят до метки раствором 1. Значение рН буферного раствора должно быть , что необходимо контролировать с помощью рН-метра.

Построение градуировочного графика. График строят в интервале концентраций от 0,4 до 1,6 . Для этого в мерные колбы вместимостью 25  вносят 1, 2, 3 и 4  раствора, содержащего 10  стандартного образца ПГМГ, и доводят объемы во всех колбах до 10  прибавлением соответственно 9, 8, 7 и 6  дистиллированной воды. Затем прибавляют 1  0,05% водного раствора эозина Н, 10  глицинового буферного раствора с рН 3,5, и доводят объем дистиллированной водой до метки. После перемешивания растворы фотометрируют относительно образца сравнения при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 50 мм.

Образец сравнения готовят внесением в мерную колбу вместимостью 25  10  дистиллированной воды, 1  0,05% раствора эозина Н, 10  буферного раствора с доведением объема дистиллированной водой до метки.

Выполнение анализа. Навеску средства, содержащую 20-30 мг ПГМГ, разводят или растворяют в мерной колбе вместимостью 100  с доведением объема дистиллированной водой до метки.

1  приготовленного раствора разводят дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 100  до метки. Берут 10  раствора второго разведения, вносят в мерную колбу вместимостью 25  и далее прибавляют раствор эозина Н, буферный раствор и проводят определение оптической плотности в указанных выше для построения градуировочного графика условиях.

Обработка результатов. Массовую долю ПГМГ (Х) в процентах вычисляют по формуле:

где - концентрация ПГМГ, обнаруженная по градуировочному графику в анализируемой пробе, ;

V - объем раствора анализируемой пробы, равный 100 ;

Р - кратность разведения раствора анализируемой пробы, равная 250 ;

m - масса анализируемой пробы, г.

Методы определения полигексаметиленбигуанидина гидрохлорида

Полигексаметиленбигуанидин гидрохлорид, называемый бигуанидом, олигомером бигуанида или полигексаметиленбигуанидом, может быть количественно определен фотоколориметрически по методике, описанной выше для солей полигексаметиленгуанидина.

Кроме того, для его анализа может быть использован спектрофотометрический метод с проведением измерений при длине волны 233-237 нм.

Методы определения хлоргексидина биглюконата. Количественное определение хлоргексидина биглюконата в дезинфицирующих средствах проводят с использованием следующих методов: метода безводного титрования хлорной кислотой, фотоколориметрического метода, основанного на окрашивании хлоргексидина биглюконата гипобромитом натрия, спектрофотометрического метода и метода ВЭЖХ. Описание последних двух методов дается в ряде Инструкций по применению дезинфицирующих средств.

Приводим описание спектрофотометрического метода анализа хлоргексидина биглюконата.

Выполнение анализа. Навеску средства, содержащую около 1 мг хлоргексидина биглюконата помещают в мерную колбу вместимостью 100 , объем доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 253 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см.

В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду.

Обработка результатов. Массовую долю хлоргексидина биглюконата (Х) в процентах вычисляют по формуле:

,

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

330 - удельный показатель поглощения хлоргексидин биглюконата;

m - масса анализируемой пробы, г.

4.2.6. Методы определения третичного алкиламина - N,N-бис(3-аминопропил) додециламина

Для количественного определения указанного третичного алкиламина в дезинфицирующих средствах используют метод кислотно-основного титрования, в том числе потенциометрическое титрование в спиртовой среде. Кроме того, могут быть использованы метод неводного титрования хлорной кислотой в присутствии индикатора кристаллического фиолетового и метод ГЖХ.

В случае отсутствия в средствах кислых и щелочных компонентов анализ третичного амина проводят описанным ниже методом кислотно-основного титрования в водной среде.

Сущность метода заключается в титровании амина раствором соляной кислоты, с которой амин реагирует с образованием соответствующей соли.

Выполнение анализа. В титровальную колбу вносят навеску средства, содержащую около 100 мг третичного амина, доводят объем дистиллированной водой до 30 , вносят 1,0  0,1% водного раствора индикатора бромтимолового синего и титруют 0,1 н. раствором соляной кислоты до перехода синей окраски в желтую.

Обработка результатов. Массовую долю N,N-бис(3аминопропил)-додециламина (Х) в процентах вычисляют по формуле:

,

где V - объем раствора соляной кислоты концентрации с (НСl)=0,1 , (0,1 н.), израсходованный на титрование, ;

0,00998 - масса N,N-бис(3-аминопропил)додециламина, соответствующая 1  раствора соляной кислоты концентрации точно с (НСl)=0,1 , (0,1 н.), ;

К - поправочный коэффициент раствора соляной кислоты с (НСl)=0,1  (0,1 н.);

m - масса анализируемой пробы, г.

4.2.7. Методы определения низших жирных спиртов (этилового, изопропилового и н-пропилового)

Для анализа низших жирных спиртов каждого в отдельности и их смесей используют газохроматографические методы, в основе которых лежит метод, описанный для парфюмерно-косметических изделий [32].

Количественная оценка спиртов - методом "внутреннего эталона", в качестве которого для этилового и изопропилового спиртов может быть использован н-пропиловый спирт, для н-пропилового спирта - изопропиловый или этиловый спирт.

Средства измерений: Хроматограф лабораторный газовый с пламенно-ионизационным детектором; колонка из нержавеющей стали длиной 200 см и внутренним диаметром 0,3 см, насадка - полисорб-1 с частицами размером 0,1-0,3 мм.

Условия хроматографирования:

Газ-носитель - азот;
Температура термостата	130°С;
Температура испарителя	200°С;
Температура детектора	200°С;
Предел измерения по току, А	5 х
Объемный расход газа-носителя,	40
Объемный расход водорода,	60
Объемный расход воздуха,	300
Скорость движения ленты самописца, мм/ч	240
Объем пробы	(0,6-1,0) .

Определение калибровочного коэффициента. Готовят две искусственные смеси взвешиванием равных количеств анализируемого спирта и внутреннего эталона. Каждую из них хроматографируют 10 раз.

Относительный калибровочный коэффициент рассчитывают по формуле:

,

где m и - массы определяемого спирта и внутреннего эталона с учетом чистоты, г;

S и - площади пиков определяемого спирта и внутреннего эталона, .

Выполнение анализа. К анализируемому образцу прибавляют внутренний эталон в количестве примерно равном определяемому компоненту. Готовят две пробы анализируемого образца, и каждую из них хроматографируют 3 раза.

Обработка результатов. Массовую долю спирта (Х) в процентах вычисляют по формуле:

,

где m - масса анализируемого образца, г;

- масса внутреннего эталона с учетом чистоты, г;

S - площадь пика определяемого спирта, ;

- площадь пика внутреннего эталона, ;

К - относительный калибровочный коэффициент.

Для количественной оценки спиртов применяют также метод абсолютной градуировки.

4.2.8. Метод определения соединений фенольного ряда [2-бифенилола, 2-бензил-4-хлорфенола, 5-хлор-2-гидроксидифенил-метана, 5-хлор-2-(2,4-дихлорфенокси)фенола и др.]

Для определения о-фенилфенола, о-бензил-р-хлорфенола, 2-фенокси-этанола, 2-феноксипропанола, 5-хлор-2(2,4-дихлорфенокси)фенола (триклозана) в дезинфицирующих средствах могут быть применены спектрофотометрические и хроматографические методы в зависимости от состава и концентраций ДВ, а также вспомогательных веществ рецептурного состава средства.

Спектрофотометрические методы определения фенольных соединений проводят с прямым определением вещества по собственному поглощению или в виде окрашенных комплексов.

Спектрофотометрический метод определения фенольных соединений по собственному поглощению основан на измерении оптической плотности раствора средства при длине волны 260-290 нм относительно растворителя с применением градуировочного графика или молярных и удельных коэффициентов погашения.

Метод может быть применен для серийного анализа в условиях производства.

Метод не избирателен в присутствии компонентов рецептурного состава средства, поглощающих в указанной области длин волн, несколько фенольных соединений при совместном присутствии определяются суммарно.

Подготовка пробы к анализу зависит от рецептурного состава средства. Так при определении о-фенилфенола по собственному поглощению в дезинфицирующем средств на основе водного раствора пропилового и этилового спиртов пробу готовят разбавлением средства в этиловом спирте [21] и измеряют оптическую плотность при длине волны 286 нм раствор сравнения - этиловый спирт.

При определении триклозана по собственному поглощению в антибактериальном туалетном мыле подготовка пробы включает экстракционное извлечение триклозана гексаном [22] для устранения мешающего влияния компонентов рецептурного состава, измерение оптической плотности проводят при длине волны 286 нм, раствор сравнения - гексан.

В случае совместного присутствия в дезинфицирующем средстве наряду с фенольными соединениями другого ДВ, характеризующегося значительно меньшими, чем у фенольных ДВ коэффициентами погашения, например 2-феноксипропанола и катионных ПАВ с ароматическими циклами, применяют большое разбавление исследуемого раствора (от 1 : 100 до 1 : 5000) [1].

Спектрофотометрическое определение триклозана в антибактериальном мыле может быть проведено по поглощению окрашенных продуктов его взаимодействия с 4-аминоантипирином в присутствии гексацианоферрата калия при  нм [21]. При этом градуировочные смеси для построения градуировочного графика необходимо готовить путем добавления известных количеств триклозана в водный раствор такого мыла, не содержащего триклозан.

При использовании градуировочного графика в координатах "оптическая плотность - содержание вещества в аликвотной части раствора, мкг" массовую долю определяемого ДВ (Х, %) вычисляют по формуле общего вида:

где а - содержание ДВ в аликвотной части раствора, найденное по градуировочному графику, мг;

- фактор пересчета из мг в г;

- объем раствора средства (или экстракта), мл;

m - масса средства, взятая на анализ, г;

При использовании значений молярных () или удельных () коэффициентов погашения массовую долю определяемого ДВ (Х, %) вычисляют по формуле общего вида:

(2)

где - оптическая плотность анализируемого раствора при длине волны , нм;

М - молярная масса определяемого вещества (ДВ), г/моль;

- объем раствора или экстракта, мл;

- объем фотометрируемого раствора, л;

- молярный коэффициент (, г/моль * см;) или удельный коэффициент () погашения для определяемого вещества (ДВ) при длине волны ;

m - масса средства, взятая для анализа, г;

- объем отобранной аликвотной части раствора или экстракта, л;

l - толщина поглощающего слоя кюветы, см.

В [19, 21] приведены оценочные значения молярных коэффициентов погашения некоторых фенольных соединений при длине волны измерения , , л/моль * см: о-фенилфенол ; о-бензил-р-хлорфенол ; 5-хлор-2(2,4-дихлорфенокси)-фенол ; 2-феноксипропанол .

Приборы, реактивы и растворы. Для выполнения анализа применяют спектрофотометр СФ-26, СФ-46; электрофотоколориметр типа КФК-2 стандартную стеклянную мерную посуду, весы аналитические; примененный растворитель, реактивы для получения окрашенных соединений.

Хроматографические методы определения фенольных соединений

Проблемы анализа фенольных соединений, в том числе раздельного определения нескольких фенольных соединений при совместном присутствии успешно решаются методами ГЖХ с применением пламенно-ионизационного детектирования и ВЭЖХ с применением спектрофотометрического детектирования. Современные хроматографы, снабженные программой управления, сбора и обработки хроматографических данных на базе персонального компьютера, позволяют достаточно быстро подбирать оптимальные условия анализа, гибко изменять программу температурных условий хроматографирования или создавать градиентный режим элюирования, проводить обработку хроматограмм в расширенном диапазоне концентраций определяемых веществ.

При анализе фенольных соединений методом ВЭЖХ применяют хроматографические колонки для обращенно-фазной ВЭЖХ типа Zоrbax ODS, Zоrbax Eclipse - XDB C8 3,5 мкм, Nucleosil 100 10 С18, LiСhrospher 100 RP 18 5 мкм, Intersil ODS-2 и др. В качестве подвижной фазы наиболее часто используют - для изократического хроматографирования растворы в соотношении по объему метанол : вода (90 : 10), ацетонитрил : вода (35 : 65), ацетонитрил : 0,2% водный раствор ортофосфорной кислоты (68 : 32), для градиентного хроматографирования элюенты: метанол и 0,2% водный раст-вор хлорной кислоты, ацетонитрил и 1% водный раствор уксусной кислоты, ацетонитрил и 0,2% водный раствор ортофосфорной кислоты и др.

Для разделения фенольных соединений в ГЖХ применяют насадочные стандартные колонки длиной 1 м, внутренним диаметром 0,2-0,4 мм, в качестве неподвижной фазы используют СКТФ и силиконы SE-30 и ХЕ-60, при содержании 3-5% к весу твердого носителя - силанизированного хроматона N-AW-DMCS и инертона AW-DMCS, зернением 0,20-0,25 мм, для анализа 2-феноксипропанола и 2-феноксиэтанола известно использование в качестве сорбента также карбосфера, пропитанного 0,1% АТ-100 и др.

Разделение смеси действующих веществ 4-хлор-3-метилфенола и о-фенилфенола и глутарового альдегида получено на капиллярной колонке (50 м * 0,32 мм) с неподвижной фазой СР Sil 5 CB, толщиной слоя 1,2 мкм в режиме программирования температуры от 100 до 250°С при скорости нагрева 10°С/мин; время удерживания глутарового альдегида составило 6,4 мин, 4-хлор 3-метилфенола 13,4 мин и о-фенилфенола 16,8 мин.

Выбор режима хроматографирования - изотермического или программирования температуры зависит от содержания, состава ДВ, а также вспомогательных компонентов рецептурного состава дезинфицирующего средства.

Количественную оценку определяемого вещества проводят с использованием абсолютной градуировки, которая целесообразна для выборочного единичного анализа, или с применением внутреннего эталона, рекомендуемого при выполнении массовых рутинных анализов, например, в условиях производственного контроля.

Газохроматографическое определение 2-феноксиэтанола в кожном антисептике в виде геля [23] проводят с применением пламенно-ионизационного детектирования, изотермического хроматографирования раствора пробы после разрушения структуры геля и использованием абсолютной градуировки или внутреннего эталона, в качестве которого применяют 1-тетрадеканол (спирт тетрадециловый).

Приборы, реактивы и растворы. Газовый хроматограф снабженный пламенно-ионизационным детектором, стандартной колонкой (1 м * 3 мм), заполненной силанизированным хроматоном N-AW-DMCS с 5% неподвижной фазы ХЕ-60; стандартная стеклянная мерная посуда; микрошприц типа МШ вместимостью 1 мкл; спирт этиловый ректификованный с объемной долей не менее 96%; аналитический стандарт 2-феноксиэтанола; 1-тетрадеканол; газ-носитель - азот, водород из баллона, воздух от компрессора.

Выполнение анализа. К 50 г анализируемого средства добавляют около 0,25 г хлористого натрия, смесь перемешивают и образовавшийся раствор отфильтровывают через бумажный фильтр. Около 20 г фильтрата взвешивают с точностью до четвертого десятичного знака, добавляют 5 мл раствора тетрадецилового спирта и после перемешивания вводят в хроматограф.

Градуировочные смеси и анализируемую пробу хроматографируют при следующих условиях: расход газов: азот 45 мл/мин; водород 30 мл/мин, воздух 300 мл/мин; температура колонки ()°С, испарителя 250°С, объем вводимой дозы 1 мкл.

Приготовление градуировочных смесей с внутренним эталоном. Для определения градуировочного коэффициентата 2-феноксиэтанола по веществу-внутреннему эталону готовят три градуировочные смеси и раствор вещества-эталона: 0,14, 0,17 и 0,20 г 2-феноксиэтанола растворяют в 20 г этилового спирта; 4 г тетрадецилового спирта растворяют в 100 мл этилового спирта в мерной колбе. Результаты взвешиваний записывают с точностью до четвертого десятичного знака. К каждой градуировочной смеси 2-феноксиэтанола добавляют по 5 мл раствора тетрадецилового спирта, тщательно перемешивают и вводят в хроматограф не менее трех раз. Из каждой хроматограммы определяют площадь хроматографических пиков 2-феноксиэтанола, тетрадецилового спирта в градуировочной смеси и вычисляют градуировочный коэффициент (К) по формуле:

где m - масса 2-феноксиэтанола в градуировочной смеси, г;

- масса вещества-эталона в 5 мл раствора тетрадецилового спирта, г;

и - площади пиков 2-феноксиэтанола и вещества - эталона.

За градуировочный коэффициент (К) принимают среднее арифметическое результатов всех определений, расхождения которых от средней величины не превышают 20%.

Обработка результатов. Массовую долю 2-феноксиэтанола в средстве (Х, %) вычисляют по формуле:

где К - градуировочный коэффициент 2-феноксиэтанола;

S и - площади пиков 2-феноксиэтанола и вещества-эталона в анализируемой пробе;

m и - масса средства, взятая на анализ, и масса вещества-эталона в 5 мл раствора тетрадецилового спирта, г

Газохроматографическое определение о-фенилфенола и о-бензил-р-хлорфенола, 3-метил-4-хлорфенола с применением пламенно-ионизационного детектирования, хроматографирования в режиме программирования температуры и использованием абсолютной градуировки.

Приборы, реактивы и растворы. Газовый хроматограф снабженный пламенно-ионизационным детектором, стандартной колонкой (1 м * 3 мм), заполненной силанизированным хроматоном N-AW-DMCS с 5% неподвижной фазы ХЕ-60; стандартная стеклянная мерная посуда; микрошприц типа МШ вместимостью 1 мкл; ацетон; аналитические стандарты о-фенилфенола и о-бензил-р-хлорфенола; азот из баллона, водород из баллона, воздух от компрессора.

Выполнение анализа. [24] Около 3,3 г средства, взвешенного с точностью до четвертого десятичного знака, растворяют в ацетоне в мерной колбе вместимостью 25 мл и после перемешивания вводят в хроматограф.

Градуировочные смеси и анализируемую пробу хроматографируют при следующих условиях: расход газов: азот 30-40 мл/мин; водород 25-30 мл/мин, воздух 250-300 мл/мин; температура испарителя и детектора 250°С; температура колонки начальная 70°С, нагрев со скоростью 15°С/мин до 190°С; объем вводимой дозы 1 мкл. Порядок выхода определяемых веществ: о-бензил-р-хлорфенол, о-фенилфенол.

Градуировочные смеси готовят с массовой концентрацией по 4-4,5 мг/мл о-фенилфенола и о-бензил-р-хлорфенола в ацетоне.

Обработка результатов. Массовую долю определяемого вещества в средстве (Х, %) вычисляют по формуле:

где S и - площади хроматографических пиков определяемого вещества в анализируемой пробе и градуировочной смеси;

- массовая концентрация аналитического стандарта определяемого вещества в градуировочной смеси, мг/мл;

а - массовая доля основного вещества в аналитическом стандарте, %;

V - объем раствора пробы, мл;

m - масса средства, взятая на анализ, мг.

4.2.9. Метод определения кислот и щелочей

Количественное определение кислот и щелочей проводят методом кислотно-основного титрования с использованием индикаторов кислотно-основного титрования, из которых наиболее часто применяются метиловый оранжевый, фенолфталеин, метиловый красный, бромфеноловый синий и др.).

Приводится обобщенный метод количественного определения кислот на примере серной кислоты.

Сущность метода - в проведении реакции нейтрализации серной кислоты щелочью путем титрования раствором гидроокиси натрия в присутствии индикаторов кислотно-основного титрования.

Выполнение анализа. Навеску средства, содержащую около 50 мг серной кислоты, помещают в коническую колбу, прибавляют дистиллированную воду до 30 , необходимый объем раствора индикатора и титруют 0,1 н. раствором гидроокиси натрия до соответствующего перехода окраски индикатора.

Обработка результатов. Массовую долю серной кислоты (Х) в процентах вычисляют по формуле:

,

где V - объем раствора гидроксида натрия концентрации с (NaОН)=0,1  (0,1 н.), израсходованный на титрование, ;

0,0049 - масса серной кислоты, соответствующая 1  раствора гидроокиси натрия концентрации точно с (NaОН)=0,1  (0,1 н.), ;

К - поправочный коэффициент раствора гидроокиси натрия концентрации с (NaОН)=0,1  (0,1 н.);

m - масса анализируемой пробы, г.

Приводится обобщенный метод количественного определения щелочей на примере гидроокиси натрия.

Сущность метода - в проведении реакции нейтрализации гидроокиси натрия кислотой путем титрования 0,1 н. водным раствором соляной кислоты в присутствии индикаторов кислотно-основного титрования.

Выполнение анализа. Навеску средства, содержащую около 40 мг щелочи, помещают в коническую колбу, прибавляют дистиллированную воду до 30 , необходимый объем раствора индикатора и титруют 0,1 н. раствором соляной кислоты до соответствующего перехода окраски индикатора.

Обработка результатов. Массовую долю гидроокиси натрия (Х) в процентах вычисляют по формуле:

,

где V - объем раствора соляной кислоты концентрации с (НСl)=0,1 , (0,1 н.), израсходованный на титрование, ;

0,0040 - масса гидроокиси натрия, соответствующая 1  раствора соляной кислоты концентрации точно с (НСl)=0,1  (0,1 н.), ;

К - поправочный коэффициент раствора соляной кислоты концентрации с (НСl) = 0,1  (0,1 н.);

m - масса анализируемой пробы, г.

4.2.10. Методы анализа анионных и неионогенных ПАВ

Количественное определение анионных ПАВ проводят с использованием метода двухфазного титрования в присутствии смешанного индикатора метиленового голубого и эозина БА или эозина Н, а также фотоколориметрическим методом, основанным на образовании окрашенного комплекса с азуром 1 с фотоколориметрическим измерением оптической плотности его хлороформного экстракта, согласно ГОСТов на указанные методы [39].

Для анализа неионогенных ПАВ (оксиэтилированных высших спиртов и алкилфенолов) может быть использован метод, сущность которого в осаждении неионогенного ПАВ избытком фосфорномолибденовой кислоты и последующим потенциометрическим титрованием ее избытка раствором диантипирилметана с катодно-поляризованным платиновым электродом [40].

4.2.11. Методы анализа метасиликата натрия

Анализ метасиликата натрия проводят фотоколориметрическим методом, основанным на образовании окрашенного комплекса с молибденовокислым аммонием и гравиметрическим методом, сущность которого в осаждении кремниевой кислоты с определением ее массы. Описание этих методов приводится в ГОСТ на методы анализа силиката натрия [25].

4.3. Методы исследования дезинсекционных средств

Дезинсекционные средства включают инсектицидные, акарицидные, инсектоакарицидные и репеллентные средства.

В инсектицидных средствах в качестве действующих веществ (ДВ) используют пиретроиды, фосфорорганические соединения (ФОС), карбаматы, регуляторы развития насекомых и некоторые вещества из других классов химических соединений, в основном, сложного химического строения, например, фипронил, тиаметоксам, имидаклоприд, гидраметилнон.

В акарицидных и инсектоакарицидных средствах в качестве ДВ применяют пиретроиды и фосфорорганические соединения.

В репеллентных средствах действующими веществами, в основном, являются диметилфталат, N,N-диэтил-м-толуамид (ДЭТА) и этил-3-(N-бутил-ацетамино)-пропионат (ИР3535).

Формами применения дезинсекционных средств являются: жидкие (лосьоны, эмульсии, шампуни, концентраты эмульсий, растворы в беспропеллентных аэрозольных упаковках (БАУ); твердые (смачивающиеся порошки, дусты, карандаши, таблетки, шашки); гели; кремы; аэрозольные баллоны, электрофумигирующие средства (пластины, спирали, жидкости); свечи; а также бумага, ткани, салфетки, пропитанные инсектицидными составами, и др.

К основным показателям качества дезинсекционных средств, контролируемым при регистрации и сертификации, относятся: внешний вид, определяемый визуально, запах, оцениваемый органолептически, и массовая доля ДВ; к дополнительным при характеристике водно-спиртовых лосьонов и шампуней - показатель активности водородных ионов (рН), определяемый потенциометрически по ГОСТ Р 50550-93 [33].

Для идентификации и количественного определения ДВ в дезинсекционных средствах используются методы газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и спектрофотометрический.

Универсальным и наиболее доступным методом анализа ДВ в дезинсекционных средствах является метод ГЖХ, поскольку его можно использовать для количественного определения практически всех применяемых ДВ (за исключением имидаклоприда, гидраметилнона, определяемых методом ВЭЖХ, и азаметифоса, тиаметоксама, определяемых спектрофотометрическим методом).

Преимуществом метода ГЖХ является возможность эффективно разделять смеси ДВ в одном средстве, что затруднено при анализе спектрофотометрическим методом. Метод ГЖХ обладает высокой чувствительностью (0,01-0,05 ), что позволяет определять самые низкие концентрации ДВ в различных формах применения.

Погрешность метода определения ДВ методом ГЖХ не превышает 5% (относительных).

4.3.1. Метод газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) для идентификации и количественного определения действующих веществ в дезинсекционных средствах

Определение массовой доли ДВ включает следующие операции: подготовку анализируемой пробы (часто приходится выделять ДВ из некоторых форм применения методом экстракции); идентификацию и количественное определение ДВ методом ГЖХ.

Способы подготовки пробы при анализе различных форм применения.

Способы подготовки пробы при анализе ДВ зависят от вида форм применения дезинсекционных средств. В случае безводных жидких форм, в которых растворителями являются органические растворители, или концентрированных водных растворов пробу готовят простым разведением средства. В случае же разбавленных жидких водных растворов, эмульсий, порошков и других твердых форм применения обязательной начальной стадией анализа является выделение ДВ путем экстракции его из анализируемых средств органическими растворителями. При этом степень извлечения ДВ зависит от состава средства - массовой доли ДВ и сопутствующих компонентов. Чем сложнее состав средства и чем ниже концентрация в нем ДВ, тем коэффициент извлечения их ниже.

Способы выделения ДВ из различных форм применения дезинсекционных средств приведены в таблице 4.1.

Таблица N 4.1.

Способы выделения действующих веществ из различных форм применения

Форма применения	Действующее вещество, %	Способ подготовки анализируемой пробы
1. Концентраты эмульсии (к.э.)	- перметрин, 5-25, - циперметрин, 25, - альфа-циперметрин, 10 - фенотрин, 10 - дельтаметрин, 2,5 - фентион, 25, - хлорпирифос, 48, - малатион, 50-57, - пропоксур, 20	Разведение концентрата эмульсии полярным или неполярным растворителем до необходимой концентрации
2. Водно-спиртовые лосьоны:		Разведение лосьона полярным растворителем, удаление следов воды прокаленным осушителем
- педикулицид;	- перметрин - 0,5,
- антимольный спиртовой раствор в БАУ;	- перметрин - 0,55,
- репеллентный спиртовой раствор в БАУ	- ИР3535 - 12,0
3. Смачивающийся порошок	- альфациперметрин - 5,0 - фентион - 40,0 - азаметифос - 50,0	Экстракция неполярным растворителем при перемешивании на магнитной мешалке в течение 1-3-х часов; = (90-95)%
4. Твердые формы: - таблетки, шашки, - дусты, - мелок, карандаш	- перметрин - 13,0 (таблетка, шашка); - перметрин- 0,25 (дуст); - ДЭТА - 17,5 (карандаш) - альфа-циперметрин - 0,3 (карандаш)	Измельчение, экстракция неполярным растворителем при перемешивании на магнитной мешалке в течение 1-3-х часов; = (90-95)%
5. Аэрозольные баллоны	- пралле - 0,32, - альфа-циперметрин - 0,20 - пропеллент (УВП) - 50 - цифенотрин - 0,2, - тетраметрин - 0,1, - УВП - 60,0 [40]	Удаление углеводородного пропеллента (УВП) методом испарения, разведение состава соответствующим растворителем до необходимой концентрации = (85-90)%
6. Гели, пасты	- хлорпирифос - 0,6, гель; - ДЭТА - 17,5, крем-гель; - пропоксур - 2,0, приманка	Экстракция неполярным растворителем; удаление следов воды прокаленным осушителем; = (80-85)%
7. Ткани, импрегнированные составом перметрина	- перметрин - 0,5	Экстракция неполярным растворителем;
- бумага, пропитанная хлорпирифосом	- хлорпирифос - 0,6	Экстракция неполярным растворителем

Идентификация и количественное определение действующих веществ методом газожидкостной хроматографии. Сущность метода заключается в разделении смеси веществ на хроматографической колонке. Входным сигналом хроматографа является концентрация или масса определяемого компонента на входе в хроматограф.

Выходным сигналом хроматографа являются: амплитуда в максимуме хроматографического пика (высота пика) или площадь хроматографического пика и время удерживания определяемого компонента. По времени удерживания ДВ осуществляется его идентификация; по высоте хроматографического пика или площади рассчитываются концентрация и массовая доля ДВ.

Средства измерения:

- хроматографы лабораторные разных марок (ЛХМ-80, "Цвет", "Кристалл" или другой аналогичный) с пламенно-ионизационным детектором (ПИД);

- аналитическая колонка (металлическая или стеклянная) длиной 100 см или 200 см и внутренним диаметром 0,3 см;

- наполнитель - хроматон N-AW-HMDS c 5% SЕ-30 или хромосорб W-НР с 3% ОV-210.

Выполнение анализа. Анализ дезинсекционного средства включает следующие операции:

- приготовление градуировочных растворов точной концентрации (0,5-2,0 ) для градуировки хроматографа (построение графика зависимости высоты (площади) хроматографического пика от концентрации ДВ;

- приготовление раствора анализируемой пробы (разведением или экстракцией средства);

- хроматографирование анализируемого раствора параллельно с градуировочным раствором определенной концентрации в аналогичных условиях.

Условия хроматографирования:

Скорость газа-носителя (азота),	30-35
Скорость водорода,	30-35
Скорость воздуха,	300
Чувствительность шкалы электрометра	х А
Концентрация анализируемого и стандартного растворов,	0,5-2,0
Температура колонки, °С*	170-260
Температура детектора, °С	190-270
Температура испарителя, °С	190-280

Температурные интервалы заданы для всех инсектицидов.

На хроматограммах измеряются высоты или площади хроматографических пиков.

Обработка результатов анализа (см. раздел 4.3.2.)

4.3.2. Метод ГЖХ для определения пиретроидов

В настоящее время известны около 18 пиретроидов, используемых в качестве ДВ в составе различных дезинсекционных средств. Распределение пиретроидов по назначению: в качестве педикулицидов используют фенотрин и перметрин (0,3-0,5)%; инсектоакарицидов - циперметрин и альфа-циперметрин (0,20-0,25)%; инсектицидов с высоким "нокдаун-эффектом" в составе аэрозольных баллонов - тетраметрин (0,1-1,0)% и имипротрин (0,1-0,2)% в сочетании с другими пиретроидами (перметрин, циперметрин, фенотрин, цифенотрин) или ФОС (сумитрин); электрофумигирующих средств - изомеры аллетрина (биоаллетрин, эсбиотрин) и праллетрин (10-20 ); в противомольных средствах - вапортрин, перметрин.

Из пиретроидов отобраны 11 (таблица 4.2.3.) наиболее востребованных, для 10 из которых зарегистрированы субстанции (технические продукты).

В качестве примера использования метода ГЖХ для количественного определения пиретроидов приведен анализ технического продукта перметрина.

Массовую долю перметрина определяют методом ГЖХ с использованием пламенно-ионизационного детектирования и количественной оценки перметрина методом абсолютной градуировки по стандартному образцу ГСО 7715-99.

Для анализа используют аналитический газовый хроматограф, снабженный ПИД, металлической колонкой длиной 100 см и диаметром 0,3 см, заполненной силанизированным хроматоном N-AW-DMCS (0,20-0,25), пропитанным 5% неподвижной фазы SE-30.

С целью определения зависимости высоты (площади) хроматографических пиков от концентрации анализируемых растворов разово готовят и хроматографируют рабочие градуировочные растворы с концентрацией ДВ 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0  в четыреххлористом углероде.

После установления линейной зависимости в изучаемой области концентраций анализ перметрина технического проводят следующим образом.

Выполнение анализа. Анализируемый раствор готовят растворением 0,25 г технического продукта в четыреххлористом углероде в мерной колбе вместимостью 50  с последующим разведением аликвоты полученного раствора в 5 раз тем же растворителем.

Приготовленный анализируемый раствор вводят в хроматограф не менее 3-х раз параллельно с рабочим градуировочным концентрации 1,0 .

Условия хроматографирования:

температура колонки	250°С
температура детектора	260°С
температура испарителя	260°С
чувствительность шкалы электрометра	10 х А
объем вводимой пробы	1 мкл
время удерживания перметрина	3 мин 30 с

Обработка результатов. Массовую долю перметрина (Х) в процентах рассчитывают по формуле:

,

где и - высоты хроматографических пиков перметрина, в анализируемом и рабочем градуировочном растворах, мм;

- концентрация перметрина в градуировочном растворе, ;

V - объем анализируемого раствора, ;

m - масса навески субстанции (перметрина технического), мг;

За результат анализа принимают среднее арифметическое значение из 3-х определений, абсолютное расхождение между которыми не превышает 0,5%.

Ниже в таблице 4.2. представлен метод анализа различных форм применения пиретроидов в обобщенном виде. При этом для каждого пиретроида приведены наиболее распространенные формы применения, условия их хроматографирования, метод количественной оценки (абсолютная градуировка с использованием стандартного образца определяемого вещества или метод "внутреннего эталона"), растворитель для разведения или экстракции ДВ из дезинсекционного средства и коэффициент извлечения ДВ.

Таблица 4.2.

Газохроматографический метод определения пиретроидов в различных формах применения

Название ДВ, формы применения	Способ приготовления Анализируемой пробы	Условия хроматографирования
1. ПЕРМЕТРИН 3-Феноксибензил (1RS)-цис,транс-3-(2,2-дихлорвинил)-2,2-диметилцикло-пропанкарбоксилат
- Субстанция "Перметрин технический" не менее 92,0%, (соотношение цис-транс-изомеров 25 : 75)	Растворение в неполярном растворителе	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки; растворитель - четыреххлористый углерод; ; Температура колонки - 250°С; Температура детектора - 260°С; Температура испарителя - 260°С; Время удерживания перметрина - 3 мин 30 с
Формы применения:
- Педикулицидные лосьоны перметрин - 0,5%	Разбавление полярным растворителем до необходимой концентрации, удаление следов воды прокаленным осушителем
- Педикулицидные шампуни перметрин - 0,3%	Экстракция гептаном, удаление следов воды прокаленным осушителем
- Концентраты эмульсий перметрин - 5-25%	Разведение неполярным растворителем до определенной концентрации
- Мыла перметрин - 0,5%	Экстракция гептаном
- Аэрозольные баллоны перметрин - 0,2%	Удаление пропеллента путем испарения, разведение состава неполярным растворителем до необходимой концентрации
- Таблетки, - шашки перметрин -13,0%	Экстракция неполярным растворителем
- Растворы, БАУ перметрин - 0,55%	Разведение полярным растворителем до необходимой концентрации, удаление следов воды прокаленным осушителем
- Кремы перметрин - 1,0%	Экстракция смесью полярного и неполярного растворителей в соотношении (1 : 4), удаление следов воды прокаленным осушителем
2. ЦИПЕРМЕТРИН Альфа-циано-3-феноксибензил (1RS)-цис, транс-3-(2,2-дихлорвинил)-2,2-диметилциклопропанкарбоксилат
- Субстанция "ЦИПЕРМЕТРИН технический", не менее 95,0% (соотношение цис-, транс-изомеров 50 : 50)	Растворение в неполярном растворителе	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки; растворитель - четыреххлористый углерод; ; температура колонки - 250°С; температура детектора - 260°С; температура испарителя - 260°С; время удерживания циперметрина - 4 мин 30 с
Формы применения: - Концентраты эмульсий 25,0% к.э. циперметрина	Разбавление полярным растворителем до необходимой концентрации, удаление следов воды прокаленным осушителем
- Смачивающийся порошок циперметрин - 2,9%, малатион - 14,0%	Экстракция неполярным растворителем
- Твердые формы: дуст (циперметрин - 0,24%); меловой карандаш циперметрин - 0,24%;	Экстракция неполярным растворителем
- Аэрозольные баллоны циперметрин - 0,1%, имипротрин 0,08%; МГК 264 - 0,8%; УВП - 50,0%	Удаление пропеллента путем испарения, разведение состава неполярным растворителем до необходимой концентрации
- Гели циперметрин - 0,1%	Экстракция неполярным растворителем
3. АЛЬФА-ЦИПЕРМЕТРИН (сумма 2-х цис-изомеров циперметрина)
- Субстанция "Альфа-циперметрин" (технический)", не менее 95,0%	Растворение в неполярном растворителе	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки; растворитель - четыреххлористый углерод ; температура колонки - 250°С; температура детектора - 260°С; температура испарителя - 260°С; время удерживания альфа-циперметрина - 4 мин 30 с
Формы применения:
- Аэрозольные баллоны альфа-циперметрин - 0,15%, перметрин - 0,2%	Удаление пропеллента путем испарения, разведение состава неполярным растворителем
- Растворы, БАУ альфа-циперметрин - 0,22%	Разведение полярным растворителем до необходимой концентрации, удаление следов воды прокаленным осушителем
- Твердые формы: - карандаш, альфа-циперметрин - 0,3%; - таблетка, альфа-циперметрин - 2,0%, малатион - 8,0%;	Экстракция неполярным растворителем
- Концентраты эмульсий альфа-циперметрин - 10,0%	Разбавление полярным растворителем до необходимой концентрации, удаление следов воды прокаленным осушителем
Гели альфа-циперметрин - 0,2%	Экстракция неполярным растворителем
4. ДЕЛЬТАМЕТРИН (S)-альфа-циано-3-феноксибензил (1R, 3 R)-3-(2,2-дибромвинил)-2,2-(диметил)-цикло-пропанкарбоксилат
- Субстанция, содержащая не менее 98,0% основного вещества	Растворение в неполярном растворителе
Формы применения: - Концентраты эмульсий дельтаметрин - 2,5%	Экстракция неполярным растворителем	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки; растворитель - четыреххлористый углерод; ; температура колонки - 250°С; температура детектора - 260°С; температура испарителя - 260°С; время удерживания дельтаметрина - 6 мин 30 с
- Твердые формы: - Дуст дельтаметрин - 0,025%, фентион - 0,40%; мелок дельтаметрин - 0,1%, зетациперметрин - 0,05%;	Экстракция неполярным растворителем
- Аэрозольные баллоны дельтаметрин - 0,02%,	Удаление пропеллента путем испарения, экстракция из состава неполярным растворителем, удаление следов воды прокаленным осушителем
5. ЭСБИОТРИН (1RS)-Аллил-2-метил-4-оксо-циклопент-2-енил-(1R, 3 R)- 2,2-диметил-3-(2-метил-проп-1-енил)-циклопропанкарбоксилат
- Субстанция "Эсбиотрин", суммарное содержание ДВ в техническом продукте не менее 93,0%.	Растворение в полярном растворителе	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки или методом "внутреннего эталона" по дибутилфталату; растворитель - ацетон ; температура колонки - 200°С; температура детектора - 250°С; температура испарителя - 250°С; время удерживания эсбиотрина - 2 мин 20 с
Формы применения:
-Электрофумигирующие средства: - Электрофумигатор жидкостной эсбиотрин - 3,0%	Разведение полярным растворителем
- Электрофумигатор с пластинами от комаров, эсбиотрин - 20,0 мг/на пластину;	Измельчение, экстракция полярным растворителем
- Свеча эсбиотрин - 0,16%	Экстракция полярным растворителем
6. ПРАЛЛЕТРИН (ЭТОК) (S)-2-метил-4-оксо-3-проп-2-инил-циклопент-2- енил-(1R)-2,2-димедиметил-3-(2-метилпроп-1-енил)-циклопропанкар-боксилат
- Субстанция ЭТОК с содержанием действующего вещества в техническом продукте не менее 93,0%;	Растворение в полярном растворителе	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки или методом внутреннего эталона по дибутилфталату; растворитель - ацетон ; температура колонки - 200°С; температура детектора - 250°С; температура испарителя - 250°С; время удерживания праллетрина - 2 мин 20 с
Формы применения:
- Электрофумигирующее средство в форме пластины содержание праллетрина - 10 мг/на пластину	Измельчение пластины, экстракция полярным растворителем
7. НЕОПИНАМИН ФОРТЕ (d-ТЕТРАМЕТРИН) 3,4,5,6-Тетрагидро-фталимидометил-(1R)-цис,транс-хризантемат
- Субстанция содержит минимум 92,0% активных d-транс изомеров	Растворение в неполярном растворителе	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка методом абсолютной градуировки или методом "внутреннего эталона" по дибутилфталату; растворитель - ацетон; ; температура колонки - 250°С; температура детектора - 270°С; температура испарителя - 260°С; время удерживания тетраметрина - 2 мин 30 с; программирование температуры от 200 до 250°С
Формы применения:
- Аэрозольные баллоны для летающих и ползающих насекомых перметрин - 0,2%, циперметрин - 0,2%, тетраметрин - 0,2%, ППБ - 1,0%, УВП - 40,0%	Удаление пропеллента путем испарения, разведение состава неполярным растворителем
- Твердые формы: Дуст тетраметрин - 0,05% перметрин - 0,45%, фенвалерат - 0,15%	Экстракция неполярным растворителем
8. ПРАЛЛЕ (50,0% ИМИПРОТРИН), [2,5-Диоксо-3-(2-пропинил)-1-имид азолидинил]-метил (1RS)- цис,транс-хризантемат
- Субстанция ПРАЛЛЕ (50% имипротрин)	Растворение в неполярном растворителе	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка методом абсолютной градуировки или методом "внутреннего эталона" по дифенилфталату; растворитель - ацетон ; температура колонки - 190°С-260°С; температура детектора - 260°С; температура испарителя - 260°С; время удерживания имипротрина - 2 мин 15 с
Формы применения:
- Аэрозольные баллоны: Инсектицидное средство имипротрин - 0,1% d-цифенотрин - 0,3% УВП - 40,0%	Удаление пропеллента путем испарения, разведение состава полярным растворителем
Акарицидное средство пралле - 0,32% альфациперметрин - 0,2% УВП - 50%	Удаление пропеллента путем испарения, разведение состава полярным растворителем
9. ГОКИЛАТ-S (ЦИФЕНОТРИН) (RS)-Альфа-циано-3-феноксибензил-(1R)-цис,транс-хризантемат
- Субстанция ГОКИЛАТ-S (ЦИФЕНОТРИН) - технический продукт с содержанием основного вещества - 96,0%	Растворение в полярном растворителе	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка методом абсолютной градуировки; растворитель - четыреххлористый углерод; ; температура колонки, детектора и испарителя - 250°С; время удерживания цифенотрина - 2 мин 30 с
Формы применения:
- Аэрозольные баллоны Инсектицидное средство цифенотрин - 0,2% d-тетраметрин - 0,1% УВП - 60,0%	Удаление пропеллента путем испарения, разведение неполярным растворителем
- Концентрат эмульсии цифенотрин - 10%	Разведение неполярным растворителем до необходимой концентрации
10. d-ФЕНОТРИН (СУМИТРИН) 3-Феноксибензил-(1RS)- цис,транс-2,2-диметил-3-(2,2-диметилвинил)-циклопропанкар-боксилат
- Технический продукт с содержанием основного вещества - 93,7%	Растворение в неполярном растворителе	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки или методом "внутреннего эталона" по диоктилфталату; растворитель - четыреххлористый углерод; ; температура колонки - 230°С; температура детектора - 250°С; температура испарителя - 250°С; время удерживания d-фенотрина - 4 мин 15 с
Формы применения:
- Аэрозольные баллоны Инсектицидное средство d-фенотрина - 0,15% d-тетраметрин - 0,15%	Удаление пропеллента путем испарения, разведение неполярным растворителем
- Ловушки Инсектицидное средство, ловушка от муравьев фенотрин - 0,1% аттрактант - 98,6%	Экстракция неполярным растворителем
- Концентрат эмульсии фенотрин - 10,0%	Разведение неполярным растворителем до нужной концентрации
11. ВАПОРТРИН (ЭМПЕНТРИН) (RS)-1-Этинил-2-метилпент-2-енил (1R)-цис,транс-хризантемат
- Субстанция вапортрина технический продукт с содержанием основного вещества - не менее 93,0%	Растворение в полярном растворителе	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки; растворитель - ацетон" ; температура колонки - 170°С; температура детектора - 250°С; температура испарителя - 250°С; время удерживания вапортрина - 2 мин 10 с
Формы применения
- Инсектицидное средство, в виде бумажных пластин, пропитанных раствором вапортрина; вапортрин - 8,6%	Экстракция полярным растворителем
- Инсектицидное средство от мух в виде жидкости с содержанием вапортрина - 2,8%	Разведение полярным растворителем

4.3.3. Методы определения фосфорорганических соединений

Основными фосфорорганическими соединениями, используемыми в качестве ДВ в составе различных инсектицидов и акароинсектицидов в настоящее время, являются: хлорпирифос, хлорофос, малатион (карбофос), фентион (сульфидофос), сумитион (фенитротион), диазинон и азаметифос.

В качестве субстанций зарегистрированы: хлорофос, хлорпирифос и фентион технический (сульфидофос).

Анализ хлорофоса осуществляют методом ВЭЖХ, анализ азаметифоса проводится спектрофотометрическим методом при длине волны - 295 нм.

Остальные пять фосфорорганических соединений определяют методом ГЖХ/ПИД при температуре колонки - 190-210°С, температуре испарителя и детектора - 200-230°С.

В качестве внутреннего стандарта используют дибутилфталат или дифенил.

В таблице 4.3. представлены методы количественного определения фосфорорганических соединений в обобщенном виде для различных форм применения.

Подробно условия хроматографирования при использовании метода ГЖХ приведены в п. 4.3.2.

Таблица 4.3.

Методы определения фосфорорганических соединений

Действующие вещества, препаративные формы	Способ подготовки анализируемой пробы	Условия хроматографирования
1. ХЛОРПИРИФОС О,О-Диэтил-О-(3,5,6-трихлор-2-пиридинил)-тиофосфат
-Технический продукт (субстанция) с содержанием основного продукта - 97,0%	Растворение в неполярном растворителе	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки; растворитель - четыреххлористый углерод; ; температура колонки - 180°С; температура детектора - 190°С; температура испарителя - 210°С; время удерживания хлорпирифоса - 3 мин 40 с
Формы применения:
- Концентрат эмульсии (хлорпирифос - 20%) в форме микрокапсулированной суспензии	Разбавление смесью ацетонитрила и четыреххлористого углерода (2 : 3), удаление следов воды прокаленным осушителем
- 48,0% к.э. хлорпирифоса	Разбавление неполярным растворителем
- Гели гель от тараканов хлорпирифос - 0,6%	Экстракция смесью полярного и неполярного растворителей (1 : 1), удаление следов воды прокаленным осушителем
Инсектицидное средство в виде гелеобразной пасты хлорпирифос - 0,5%	Экстракция полярным растворителем
- Приманки, ловушки приманка от тараканов" хлорпирифос - 0,6%;	Экстракция смесью полярного и неполярного растворителей (1 : 1)
бумага от моли, хлорпирифос - 2,9%	Экстракция полярным растворителем
порошок-приманка хлорпирифос - 2,0%	Экстракция неполярным растворителем
антимоль, хлорпирифос - 0,6 г/ на ленту	Экстракция неполярным растворителем
2. ФЕНТИОН (Сульфидофос) О,О-Диметил-О-(4-метилтио-м-толил)-тиофосфат
- Технический продукт (субстанция) "Фентион технический" с содержанием основного вещества не менее 90%	Растворение в неполярном растворителе	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки; растворитель - четыреххлористый углерод; ; температура колонки - 190°С; температура детектора - 250°С; температура испарителя -250°С; время удерживания фентиона - 2 мин 50 с
Формы применения:
- Концентраты эмульсий 25% к.э. фентиона	Разбавление неполярным растворителем
- Смачивающийся порошок 40% с.п. фентиона	Экстракция неполярным растворителем
- Гели Средство инсектицидное в форме геля фентион - 0,24% альфа-циперметрин - 0,03%	Экстракция неполярным растворителем
- Твердые формы дуст фентион - 0,4% дельтаметрин - 0,025%	Экстракция неполярным растворителем
3. ХЛОРОФОС О,О-Диметил-(1-окси-2,2,2-трихлорэтил)-фосфонат
-Технический продукт (субстанция) с содержанием хлорофоса - 98,0%	Разбавление элюентом метанол - 0,3% водный раствор ортофосфорной кислоты (55:45)	Метод ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны - 220 нм; сорбент - IP, элюент - метанол-ортофосфорная кислота (55:45); количественная оценка - методом абсолютной градуировки
Инсектицидное средство хлорофос- 80,0% с.п.	Экстракция элюентом
4. МАЛАТИОН (КАРБОФОС) О,О-Диметил-S-[1,2-ди (этоксикарбонил)этилдитио]-фосфат
Формы применения
- Концентраты эмульсий - малатион - 57% к.э.	Разбавление неполярным растворителем	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки; растворитель - четыреххлористый углерод; ; температура колонки - 190°С; температура детектора - 200°С; температура испарителя - 220°С; время удерживания малатиона - 2 мин 30 с
- малатион - 10,0%: циперметрин - 20,0%)
- малатион - 50,0% к.э.
- Твердые формы таблетка малатион - 8,0%: альфа-циперметрин - 20%	Экстракция неполярным растворителем
Инсектицидное средство в виде порошка малатион - 14,0%, циперметрин - 2,9%	Экстракция неполярным растворителем
5. ДИАЗИНОН О,О-Диэтил-О-(2-изопропил-(4-метил-пиримидил-6)-тиофосфат
- Гели, ловушки Инсектицидное средство в форме таблетки диазинон - 6,0%	Экстракция неполярным растворителем	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки; растворитель - четыреххло-ристый углерод; ; температура колонки - 170°С; температура детектора - 200°С; температура испарителя - 220°С; время удерживания диазинона - 2 мин 10 с
Инсектицидное средство в форме геля диазинон - 0,2% хлорпирифос - 0,3%	Экстракция неполярным растворителем
Инсектицидное средство в форме гель-пасты диазинон - 0,3% альфациперметрин - 0,05%	Экстракция неполярным растворителем
Инсектицидное средство в форме геля, диазинон - 0,225% циперметрин - 0,075%	Экстракция полярным растворителем
6. ФЕНИТРОТИОН (СУМИТИОН) О,О-Диметил-О-(4-нитро-м-толил)-тиофосфат
Формы применения:
- Аэрозольные баллоны Аэрозольный баллон для нелетающих насекомых, фенитротион - 1,0% тетраметрин - 0,1% УВП - 55%	Удаление пропеллента путем испарения, разбавление неполярным растворителем	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки; растворитель - четыреххлористый углерод; ; температура колонки - 200°С; температура детектора - 250°С; температура испарителя -250°С; время удерживания фенитротиона - 2 мин 30 с
Аэрозольный баллон для летающих насекомых тетраметрин - 0,075% перметрин - 0,04% фенитротион - 0,3% синергист - пиперонилбутоксид (ППБ) - 0,3% УВП - бутан - 67,5%	Удаление пропеллента путем испарения, разбавление неполярным растворителем
7. АЗАМЕТИФОС О,О-диметил-S- -(2-оксо-6-хлор-пиридооксазолил-3-метил)-тиофосфат
Инсектицидное средство "Альфакрон 50% с.п."	Экстракция неполярным растворителем	Спектрофотометрический метод (длина волны - 295 нм)
Инсектицидное средство в форме порошка альфакрон - 0,4% или азаметифос - 0,2%	Экстракция неполярным растворителем
Приманка для мух в виде пластины азаметифос - 1,0 мг/ на пластину	Экстракция неполярным растворителем

4.3.4. Метод ГЖХ для определения карбаматов

За последние 5 лет нашли применение средства с двумя ДВ из класса карбаматов - метомилом и пропоксуром.

В нижеследующей таблице 4.4. приведены методики количественного определения указанных ДВ в средствах на основе карбаматов.

Подробно условия хроматографирования приведены в п. 4.3.2.

Таблица 4.4.

Методики определения карбаматов

Действующие вещества, формы применения	Способ подготовки анализируемой пробы	Условия хроматографирования
1. МЕТОМИЛ 1-Метилтиоацетальдегида О-(N-метил-карбамоил)оксим
- Технический продукт Субстанция "Метомил" с содержанием основного вещества - не менее 98,0%	Растворение в неполярном растворителе	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка методом абсолютной градуировки; растворитель - четыреххлористый углерод; ; температура колонки - 100°С; температура детектора - 200°С; температура испарителя - 200°С; время удерживания метомила - 2 мин 20 с
- Приманка от мух Инсектицидное средство в виде гранулированной приманки для мух метомил - 1,0%	Экстракция неполярным растворителем
2. ПРОПОКСУР О-(2-Изопропокси-карбонилпропен-1-ил-2)-О-метил-N-этиламидотио-фосфат
- Концентрат эмульсии (Пропоксур, 20% к.э.)	Разведение полярным растворителем	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка методом абсолютной градуировки; растворитель - четыреххлористый углерод; ; температура колонки - 180°С; температура детектора - 230°С; температура испарителя - 230°С; время удерживания пропоксура - 2 мин 20 с
- Приманка для уничтожения тараканов" (пропоксур - 2,0%)	Экстракция полярным растворителем

4.3.5. Метод ГЖХ для определения регулятора размножения тараканов - (S)-гидропрена

Метод ГЖХ для определения регулятора размножения тараканов - (S)-гидропрена представлен в таблице 4.5.

Подробно условия хроматографирования приведены в п. 4.3.2.

Таблица 4.5.

Метод ГЖХ для определения регулятора размножения тараканов (S)-гидропрена

Действующее вещество, формы применения	Способ подготовки анализируемой пробы	Условия хроматографирования
(S)-Гидропрен
- Средство инсектицидное регулятор размножения тараканов "(S)-Гидропрен" с содержанием основного вещества - не менее 99,1%.	Растворение в неполярном растворителе	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки; растворитель - гексан; ; температура колонки - 200°С, температура детектора - 250°С; температура испарителя - 250°С; время удерживания (S)-гидропрена - 3 мин 5 с

4.3.6. Методы идентификации и количественного определения действующих веществ в репеллентных средствах

Основными репеллентами, широко применяемыми в сфере медицинской дезинсекции являются диметилфталат (ДМФ), N,N-диэтил-мета-толуамид (ДЭТА), N-гексилоксиметилкапролактам (акреп), этил-3-(N-бутилацетамино)-пропионат (репеллент ИР3535), 1-(1-метилпропокси-карбонил)-2-(2-гидроксиэтилен)-пиперидин (КБР).

Основные формы применения - аэрозольные баллоны, растворы в беспропеллентной упаковке (БАУ), лосьоны, эмульсии, кремы, карандаши, салфетки.

Наиболее востребованным репеллентом является ДЭТА. В составе аэрозольных баллонов, предназначенных для уничтожения кровососущих насекомых, его содержание - (10,0-20,0)%, в составе аэрозольных баллонов, предназначенных для защиты от клещей - (30-32)%. Часто ДЭТА комбинируют с другими репеллентами, например, в составе лосьонов с ДМФ, в сочетании с репеллентом ИР3535 в спреях или в сочетании с альфа-циперметрином в акароинсектицидных средствах в форме аэрозольных баллонов.

Акреп - репеллент отечественного производства - используется для изготовления эмульсий, как правило, в сочетании с ДМФ.

В качестве субстанций в настоящее время зарегистрированы репеллент ИР3535 производства фирмы "Мерк" (Германия) и ДЭТА производства фирмы "МакЛафлин Гормли Кинг" (США).

Анализ всех репеллентов осуществляют методом ГЖХ на хроматографе с ПИД и количественной оценкой ДВ методом абсолютной градуировки или методом "внутреннего эталона" по дипропилфталату или по дифенилу.

Основная задача при анализе различных репеллентных средств заключается в количественном выделении ДВ из препаративной формы путем подбора оптимальных условий выделения: растворителя для экстракции ДВ, времени экстракции, температурного режима. Наименьший коэффициент извлечения (85-90)% достигается при анализе кремов, что обусловлено их сложным составом.

В таблице 4.6. представлен анализ репеллентов в обобщенном виде для различных препаративных форм. Для каждого репеллента приведены наиболее распространенные формы применения, ДВ в препаративной форме, условия хроматографирования, растворитель для экстракции и коэффициент извлечения ДВ.

Подробно условия хроматографирования приведены в п. 4.3.2.

Таблица 4.6.

Газохроматографический метод анализа репеллентов в различных формах применения

Название ДВ, формы применения	Способ подготовки анализируемой пробы	Условия хроматографирования
1. ДМФ Диметилфталат
Формы применения:		Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки [18] или методом "внутреннего эталона" по дециловому спирту; растворитель - этиловый спирт; ; температура колонки - 160°С; температура детектора - 170°С; температура испарителя - 160°С; время удерживания ДМФ - 2 мин 30 с
Репеллентное средство лосьон (ДМФ - 30%)	Разведение этиловым спиртом
Репеллентное средство в виде водно-спиртового раствора в БАУ; ДЭТА - 14,0% ДМФ - 9,0%	Разведение этиловым спиртом
Репеллентное средство в форме эмульсии ДМФ - 20,0%, акреп - 20,0%	Разведение этиловым спиртом	Количественная оценка методом "внутреннего эталона" по дипропилфталату; время удерживания ДМФ - 3 мин 30 с; время удерживания акрепа - 5 мин 55 с
2. ДЭТА N,N-диэтил-мета-толуамид
Формы применения:		Метод ГЖХ с ПИД, количественная оценка - методом абсолютной градуировки или методом "внутреннего эталона" по дибутилфталату; растворитель - этиловый спирт; ; температура колонки - 170°С; температура детектора - 180°С; температура испарителя - 190°С; время удерживания ДЭТА - 3 мин 30 с
Репеллентное средство в аэрозольной упаковке ДЭТА - 25,0%	Удаление пропеллента путем испарения, разбавление состава растворителем
Инсектицидно-репеллентное средство в аэрозольной упаковке ДЭТА - 15,0% альфа-циперметрин - 0,18%	Удаление пропеллента путем испарения, разбавление состава растворителем
Инсектоакарицидное средство (ДЭТА - 30,0%) в форме аэрозольного баллона
Репеллентное средство в форме водно-спиртового раствора (БАУ) ДЭТА - 10,0%	Разведение полярным растворителем
Репеллентное средство в виде карандаша ДЭТА - 17,5%	Экстракция полярным растворителем
Средство репеллентное в виде карандаша ДЭТА - 15,0%	Экстракция этиловым спиртом
Репеллентное средство в виде крем-геля ДЭТА - 17,5%	Экстракция смесью ацетон: четыреххлористый углерод (1:1)
3. ИР3535 Этил-3-(N-бутил-ацетамидо)-пропионат
Субстанция "ИР 3535" - технический продукт, содержащий не менее 98,0% основного вещества	Растворение в неполярном растворителе	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки; растворитель - четыреххлористый углерод; ; температура колонки - 150°С; температура детектора - 210°С; температура испарителя -210°С; время удерживания ИР3535 - 2 мин 30 с Температура колонки - 130°С-160°С; температура детектора и испарителя - 230°С; время удерживания: гександиола - 2 мин 20 с; ДЭТА - 6 мин 23 с; ИР 3535 - 6 мин 45 с
Формы применения:
Репеллентное средство антикомариный спрей для детей, в форме БАУ; ИР3535 - 12,0%	Разбавление этиловым спиртом
Репеллентное средство антикомариный спрей для взрослых ИР3535 - 4,0% ДЭТА -5,0% гександиол - 5,0%	Разбавление этиловым спиртом
4. КБР 1-Пиперидин карбоновая кислота, 2-(2-гидроксиэтил)-1-метилпропиловый эфир
Формы применения:
- Лосьоны Репеллентное средство лосьон в форме водно-спиртового раствора (БАУ); КБР - 20,0%	Разведение этиловым спиртом	Метод ГЖХ с ПИД, количественная оценка - методом абсолютной градуировки; растворитель - этиловый спирт; ; температура колонки - 160°С; температура детектора - 200°С; температура испарителя - 200°С; время удерживания КБР - 3 мин 50 с
Репеллентное средство молочко для защиты от летающих насекомых в форме эмульсии КБР - 10,0%	Разведение этиловым спиртом
- Крем Репеллентное средство крем для защиты от летающих насекомых КБР - 10,0%	Разведение этиловым спиртом
5. АКРЕП N-(Гексилокси-метил)-капролактам
Формы применения:
Репеллентное средство в форме эмульсии акреп - 22,0% ДМФ - 18,0%	Экстракция неполярным растворителем	Метод ГЖХ с ПИД; количественная оценка - методом абсолютной градуировки или методом "внутреннего эталона" по дипропилфталату или по дифенилу; растворитель - этиловый спирт; ; температура колонки - 160-190°С; температура детектора - 230°С; температура испарителя - 230°С; время удерживания акрепа - 5 мин 55 с Метод "внутреннего эталона" по дифенилфталату - 0,90-0,95;

4.4. Методы исследований дератизационных средств

В средствах для медицинской дератизации применяют действующие вещества (ДВ) различной химической природы и различного механизма действия. В настоящее время в России зарегистрированы родентицидные ДВ, представляющие собой яды острого типа действия и яды пролонгированного действия - антикоагулянты индандионового ряда и кумаринового ряда.

Острые яды, такие как фосфид цинка, глифтор и нафтилтиомочевина имеют ограниченное применение. Наибольшее применение получили ДВ пролонгированного действия - антикоагулянты индандионового ряда (дифенацин, этилфенацин, изопропилфенацин, хлорфасинон) и кумаринового ряда (зоокумарин и его натриевая соль, бромадиолон, бродифакум, дифетиалон, дифенакум, куматетралил).

Дератизационные средства выпускают в различных препаративных формах: в виде ДВ (индивидуальных и смесевых) с содержанием основного вещества от 30 до 99,8%, жидких и диспергированных твердых (порошки) концентратов с содержанием ДВ от 0,25 до 2,5%, а также в виде отравленных приманок на пищевой основе с содержанием ДВ от 0,0025 до 3%.

Специфическими требованиями к выпускаемым препаративным формам дератизационных средств являются обязательное добавление интенсивных красителей и горечи (бензоат натрия, битрекс), которые обеспечивают отличие отравленных приманок от пищевых продуктов и предохраняют от случайного отравления на этапах производства и применения дератизационных средств. Исключение составляют фосфид цинка и 1-нафтилтиомочевина, собственная окраска которых не требует дополнительного предупредительного окрашивания.

Основными показателями, которые позволяют идентифицировать средство, являются внешний вид, цвет и содержание ДВ. Внешний вид и цвет определяют визуально. Выбор метода определения ДВ зависит от его физико-химических свойств и уровня содержания, а также состава инертных компонентов в рецептуре средства.

Разнообразие физико-химических свойств ДВ, применяемых в дератизационных средствах, обусловливает возможность применения различных методов их определения: химических - титрование, и физико-химических инструментальных методов - спектрофотометрия, газовая хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография.

4.4.1. Методы определения фосфида цинка в дератизационных субстанциях и средствах

Фосфид цинка представляет собой порошок темно-серого цвета. Действующим веществом является фосфин (фосфористый водород) - , выделяющийся при гидролизном расщеплении фосфида цинка. В качестве примесей технический фосфид цинка может содержать металлический цинк, оксиды цинка и оксиды железа.

Анализ ДВ в техническом продукте фосфида цинка проводят объемным (волюмометрическим) методом [27] или титриметрическим методом. Указанные методы применимы для анализа фосфида цинка и в препаративных формах дератизационных средств.

Поскольку ратицидная активность фосфида цинка определяется именно токсичностью фосфина, образующегося при кислотном гидролизе фосфида цинка, его определение является предпочтительным для оценки качества дератизационного средства.

Объемный (волюмометрический) метод определения фосфида цинка основан на кислотном гидролизе фосфида цинка и измерении объема выделившегося фосфина с применением водного раствора сернокислой меди.

Содержание ДВ может быть охарактеризовано по фосфидному фосфору или по фосфидному цинку, которые вычисляют по результатам измерения объема фосфина.

Метод избирателен, примеси в техническом продукте и другие компоненты рецептурного состава в дератизационных средствах не мешают определению.

Приборы, реактивы и растворы. Специальный прибор для измерения объема выделившегося фосфина, в котором последовательно соединены капельная воронка вместимостью 50 мл, круглодонная колба вместимостью 25-30 мл, измерительная ячейка вместимостью 100 мл, снабженная водяной рубашкой и уравнительным сосудом с затворной жидкостью - раствором хлористого натрия; поглотительный сосуд с раствором сернокислой меди; весы аналитические; 20% раствор соляной кислоты; 5% раствор сернокислой меди - поглотительная жидкость; насыщенный раствор хлористого натрия - затворная жидкость; азот газообразный; вода дистиллированная.

Выполнение анализа. Масса средства для анализа берется из расчета 20-80 мг фосфидного фосфора или 80-400 мг фосфидного цинка в пробе. Анализируемую пробу средства, взвешенную в граммах с точностью до четвертого десятичного знака (около 0,15 г фосфида цинка или около 4 г зерновой приманки), помещают в круглодонную колбу, присоединяют к коммуникациям прибора и, заполнив измерительную бюретку затворной жидкостью, продувают слабым потоком азота в течение двух минут, после чего в капельницу при закрытом кране наливают около 20 мл раствора соляной кислоты. Затем по каплям подают раствор в круглодонную колбу, содержащую анализируемое средство, для разложения фосфида цинка. Постепенно нагревают содержимое колбы до кипения. По окончании реакции газ, оставшийся в колбе, вытесняют в измерительную бюретку насыщенным раствором хлористого натрия. После охлаждения газа в бюретке замеряют его объем. Затем с помощью прибора проводят поглощение фосфина раствором сернокислой меди. Объем выделившегося фосфина определяют по разности объема газа до и после его поглощения.

Обработка результатов. Измеренный объем фосфина приводят к нормальным условиям (, мл) по формуле:

где V - объем фосфина, измеренный в опыте, мл;

Р - атмосферное давление, Па (мм рт. ст. );

р - упругость водяных паров над насыщенным раствором хлористого натрия, Па (мм рт. ст.);

- нормальное атмосферное давление, равное 10325 Па (760 мм рт. ст.);

t - температура газа, °С.

Массовую долю фосфина в средстве (Х) в процентах вычисляют по формуле:

где 0,001518 - масса фосфина, содержащаяся в 1 мл газообразного фосфина, г;

m - масса средства, взятая для анализа, г.

Для того, чтобы вычислить массовую долю фосфидного фосфора в техническом продукте, измеренный объем фосфина пересчитывают на фосфидный фосфор () в процентах по формуле:

где 0,001318 - масса фосфидного фосфора, содержащаяся в 1 мл газообразного фосфина, г.

Массовую долю фосфидного цинка () в процентах вычисляют из соотношения:

где 4,16 - масса фосфида цинка, соответствующая 1 г фосфидного фосфора, определяемая из отношения молекулярной массы фосфида цинка к массе двух атомов фосфора 258,06 г/2 х 31 г.

Титриметрический метод определения фосфидного цинка в техническом продукте (субстанции) [27] основан на раздельном титровании общего и свободного (металлического) цинка. Содержание фосфидного цинка определяют по разности полученных результатов.

Приборы, реактивы и растворы. Весы аналитические; бюретка и стеклянная мерная посуда; точно 0,1 н раствор тиосульфата натрия; 10% раствор йодистого калия; 1 М раствор гидроокиси натрия; аммиачно-хлоридный буфер с рН 10,0-10,5; 0,1 М раствор уксусной кислоты; 2 М раствор серной кислоты; 0,1 М раствор сернокислой меди; точно 0,1 н. раствор трилона Б; 1% раствор крахмала (индикатор); эриохром черный Т (индикатор).

Выполнение анализа.

Определение металлического цинка.

В мерную колбу вместимостью 25  вносят навеску фосфида цинка массой 0,1 г, взвешенную с точностью до 0,0002 г, или эквивалентное количество отравленной приманки. Приливают 5  0,1 М раствора сульфата меди. Смесь оставляют на 30 минут, периодически встряхивая. Затем раствор отфильтровывают через бумажный фильтр, осадок промывают на фильтре дважды по 5  дистиллированной воды, приливают к фильтрату 1  0,1 М уксусной кислоты, 5  10% раствора йодистого калия. Выделившийся йод титруют 0,1 н. раствором тиосульфата натрия до слабо-желтой окраски. Аналогично титруют 5  0,1 М раствора сульфата меди после прибавления 1  0,1 М уксусной кислоты и 5  10% раствора йодистого калия (холостую пробу).

Обработка результатов. Массовую долю металлического цинка в средстве (Zn, %) вычисляют по формуле:

где 0,00327 - масса цинка, соответствующая 1 мл точно 0,1 н. раствора тиосульфата натрия, г;

- объем 0,1 н. раствора тиосульфата натрия, израсходованный на титрование холостой пробы, ;

V - объем 0,1 н. раствора тиосульфата натрия, израсходованный на титрование холостой пробы, ;

m - масса средства, взятая на анализ, г.

Определение массовой доли основного вещества. К навеске технического образца фосфида цинка массой 0,1 г, взвешенной с точностью до 0,0002 г, или у эквивалентному количеству отравленной приманки прибавляют 5-10  5 М серной кислоты. 25  дистиллированной воды и кипятят в течение 15 минут. Смесь охлаждают и нейтрализуют 1 М раствором гидроксида натрия до рН 3-5, приливают 5  аммиачно-хлоридного буфера с рН 10-10,5 и титруют раствором трилона Б с применением индикатора эриохром черного Т до перехода окраски от красно-фиолетовой до синей.

Обработка результатов. Содержание фосфидного цинка в средстве () в процентах определяют по формуле:

где 0,00863 - масса , соответствующая 1  точно 0,1 н. раствора трилона Б, г;

Zn - массовая доля металлического цинка в пробе, определенная при титровании тиосульфатом натрия, %;

V - объем 0,1 н. раствора трилона Б, израсходованный на титрование, ;

m - масса средства, взятая на анализ, г.

(V х 0,00863 х 100 / m) - суммарное содержание фосфидного и металлического цинка, найденное при титровании тиосульфатом натрия, %.

4.4.2. Методы определения 1-(1-нафтил)-2-тиомочевины в дератизационных субстанциях и средствах

4.4.2.1. Спектрофотометрические методы определения 1-(1-нафтил)-2-тиомочевины

Определение 1-(1-нафтил)-2-тиомочевины (НТМ) спектрофотометрическим методом по собственному поглощению в ультрафиолетовой области спектра основано на измерении оптической плотности растворов НТМ при длине волны в диапазоне 280-300 нм.

Определению могут мешать вещества, поглощающие в указанном волновом диапазоне. Метод может использоваться при серийном анализе в условиях производства.

Приборы и реактивы. Для выполнения анализа применяется спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или другой марки; стандартная стеклянная мерная посуда; весы аналитические; этиловый спирт 96%.

Выполнение анализа. Подготовка пробы к спектрофотометрическому измерению включает растворение технического продукта в этиловом спирте для последующего фотометрирования. Из препаративной формы средства в виде приманки проводят извлечение ДВ 96% этиловым спиртом при повышенной температуре (60°С) в течение 15 мин. Оптическую плотность приготовленного раствора измеряют при длине волны 285 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см. В качестве раствора сравнения используют экстракт, полученный в таких же условиях из "холостой" пробы (не содержащей НТМ).

Обработка результатов. Массовую долю ДВ в средстве (Х) в процентах вычисляют по формуле:

где D - оптическая плотность раствора;

202,3 - молекулярная масса НТМ;

К - кратность разведения экстракта;

V - объем экстракта, л;

- значение молекулярного коэффициента поглощения НТМ при 285 нм, л/моль·см;

m - масса анализируемой пробы, г.

l - толщина поглощающего слоя, см.

Применение справочного значения молярного коэффициента поглощения НТМ при длине волны 285 нм позволяет исключить построение калибровочного графика.

Для определения НТМ в дератизационных средствах применяют также спектрофотометрический метод, основанный на измерении оптической плотности раствора азосоединения, образующегося при взаимодействии НТМ и сульфанилата диазония, при длине волны 490 нм.

Метод избирателен.

Приборы, реактивы и растворы. Для выполнения анализа применяется спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или электрофотоколориметр КФК-2; стандартная стеклянная мерная посуда, весы аналитические; этиловый спирт 96%, аналитический стандарт НТМ; раствор сульфанилата диазония с массовой концентрацией 5 мг/мл; 0,1 М раствор соляной кислоты; 0,1 М раствор натрия гидроокиси.

Выполнение анализа. При анализе дератизационного средства в виде приманки ДВ извлекают 96% этиловым спиртом при повышенной температуре (60°С) и вносят в аликвоту экстракта реактивы, необходимые для получения азосоединения: раствор НТМ с концентрацией 0,1 мг/мл; раствор сульфанилата диазония с концентрацией 5 мг/мл и 0,1 М раствор соляной кислоты. Смесь выдерживают в течение 5 мин, затем добавляют 0,1 М раствор гидроокиси натрия и фотометрируют при длине волны 490 нм относительно "холостого" раствора калибровочного графика. Для построения калибровочного графика готовят калибровочные растворы азосоединения, эквивалентные содержанию в пробе 20, 40 и 60 мкг НТМ.

Обработка результатов. Массовую долю действующего вещества (Х) в процентах вычисляют по формуле, используя калибровочный график:

где а - содержание НТМ в аликвоте, найденное по калибровочному графику, мкг;

- коэффициент пересчета из мкг в г;

К - кратность разведения пробы;

m - масса средства, взятая на анализ, г;

l - толщина поглощающего слоя, см.

4.4.2.2. Хроматографический метод определения 1-(1-нафтил)-2-тиомочевины

Анализ НТМ в зерновой приманке проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением спектрофотометрического детектирования, градиентного режима хроматографирования и использованием абсолютной градуировки.

Метод избирателен, компоненты рецептурного состава средства не мешают определению.

Приборы, реактивы и растворы. Аналитический жидкостный хроматограф, снабженный спектрофотометрическим детектором, градиентной системой, инжектором с дозирующей петлей 5-10 мкл, программой обработки хроматографических данных на базе персонального компьютера; весы аналитические; магнитная мешалка; ротационный испаритель; стандартная стеклянная мерная посуда, НТМ - аналитический стандарт; рабочая градуировочная смесь НТМ в ацетонитриле с массовой концентрацией 0,1 мг/мл; ацетонитрил градации для жидкостной хроматографии; хлористый метилен ч.д.а.; вода бидистиллированная.

Выполнение анализа. Подготовка пробы к анализу предусматривает извлечение ДВ из средства хлористым метиленом в течение 4 часов с помощью магнитной мешалки. Из отфильтрованного экстракта под разрежением отгоняют растворитель, сухой остаток растворяют в ацетонитриле и хроматографируют. Предварительно хроматографируют рабочую градуировочную смесь. Из полученных хроматограмм определяют удерживаемый объем и площади хроматографических пиков НТМ в градуировочной смеси и в анализируемом растворе.

Хроматографирование проводят на колонке для обращеннофазной хроматографии типа ACCUBOND ODS 5 мкм. В качестве элюентов используют ацетонитрил и воду. Градиент по ацетонитрилу от 40% до 100%. Длина волны измерений 290 нм.

Обработка результатов. Массовую долю НТМ в средстве (Х) в процентах вычисляют по формуле:

где S и - площади хроматографических пиков определяемого вещества в анализируемой пробе и рабочей градуировочной смеси;

- массовая концентрация аналитического стандарта определяемого вещества в рабочей градуировочной смеси;

а - массовая доля основного вещества в аналитическом стандарте, %;

V - объем анализируемого раствора, мл;

m - масса средства, взятая на анализ, мг.

4.4.3. Методы определения индандионов в дератизационных субстанциях и средствах

Особенности химико-аналитических исследований дератизационных ДВ (субстанций) для производства препаративных форм определяются их составом: содержанием основного вещества, уровнем примесей и содержанием технологических добавок. Для анализа применяют титрование раствором гидроокиси натрия, спектрофотометрические методы с прямым фотометрированием определяемого вещества и в виде окрашенных комплексов, высокоэффективную жидкостную хроматографию со спектрофотометрическим детектированием в ультрафиолетовой области спектра.

4.4.3.1. Титриметрический метод определения дифенацина, этилфенацина и изопропилфенацина

Определение содержания ДВ в субстанциях дифенацина, этилфенацина и изопропилфенацина и концентратах титриметрическим методом [41] основано на титровании индандиона раствором гидроокиси натрия в среде органического растворителя (диоксан, этанол, ацетон) с добавлением индикатора (бромтимоловый синий, феноловый красный) или с применением потенциометрических измерений.

Метод не избирателен, определению могут мешать вещества, титруемые гидроокисью натрия, в связи с этим метод не применим для определения действующего вещества в таких технических продуктах как трифенацин, тетрафенацин.

Метод может быть рекомендован для рутинных анализов в условиях производства.

Приборы, реактивы и растворы. Весы аналитические; бюретка вместимостью 25 мл; стандартная стеклянная мерная посуда; диоксан; 0,1 М раствор гидроокиси натрия; спиртовый раствор бромтимолового синего (индикатор); иономер универсальный ЭВ-74 со стеклянным и каломельным электродами.

Выполнение анализа. Анализируемую пробу растворяют в диоксане и титруют с помощью раствора гидроокиси натрия в присутствии индикатора бромтимолового синего с визуальным или потенциометрическим определением конца титрования.

Обработка результатов. Массовую долю определяемого вещества (Х) в процентах вычисляют по известной формуле:

где V - объем точно 0,1 М раствора гидроокиси натрия, израсходованный на титрование пробы, мл;

T - масса определяемого вещества, соответствующая 1 мл точно 0,1 М раствора гидроокиси натрия, г/мл;

m - масса анализируемой пробы, г.

4.4.3.2. Спектрофотометрические методы определения дифенацина, этилфенацина и изопропилфенацина

Определение дифенацина, этилфенацина, изопропилфенацина, хлорфасинона в дератизационных субстанциях (технический продукт, жидкие и диспергированные твердые концентраты) и в препаративных формах проводят спектрофотометрическим методом с прямым определением вещества или в виде окрашенных комплексов.

Спектрофотометрический метод прямого определения изопропилфенацина основан на измерении оптической плотности индан-1,3-диона, в растворе органического растворителя при длине волны 325 и 340 нм относительно растворителя с применением градуировочного графика или молярных коэффициентов поглощения.

Метод избирателен в отсутствии компонентов рецептурного состава средства, поглощающих в указанной области длин волн. Не избирателен в присутствии нескольких веществ индандионового ряда, которые определяются суммарно.

Метод может быть применен для серийного анализа в условиях производства.

Приборы, реактивы и растворы. Для проведения анализа используют спектрофотометр типа СФ-46; стеклянную мерную посуду; этиловый спирт.

Выполнение анализа. Подготовка пробы к анализу заключается в выделении ДВ в раствор. Способ выделения определяемого вещества зависит от рецептурного состава средства. Технический продукт растворяют; из концентратов и приманок ДВ извлекают жидкостной экстракцией с применением этилового спирта и фотометрируют на спектрофотометре при двух длинах волн.

Обработка результатов. Содержание индан-1,3-диона определяют, используя калибровочный график в координатах оптическая плотность - содержание вещества, мг.

При использовании значений молярных коэффициентов поглощения определяемого индан-1,3-диона содержание ДВ (Х) в процентах вычисляют по формуле:

где - разница оптической плотности анализируемого раствора при разных длинах волн;

М - молекулярная масса определяемого индан-1,3-диона, г/моль;

V - объем раствора или экстракта, л;

- разность молярных коэффициентов поглощения индан-1,3-диона при 325 и 340 нм, л/моль·см.

m - масса анализируемой пробы, г;

l - толщина поглощающего слоя, см.

Спектрофотометрический метод определения дифенацина, этилфенацина и изопропилфенацина в виде окрашенных комплексов основан на образовании водорастворимых окрашенных комплексов ионов железа (III) с индандионами и измерении их оптической плотности при длине волны 490 нм с применением калибровочного графика или молярных коэффициентов поглощения.

Метод избирателен в отношении традиционно применяемых красителей и других экстрагируемых компонентов рецептурного состава средства. Не избирателен в присутствии нескольких веществ индандионового ряда, которые определяются суммарно.

Метод может быть применен для серийного анализа в условиях производства.

Приборы, реактивы и растворы. Для проведения анализа используют электрофотоколориметр типа КФК или спектрофотометр типа СФ-46; стеклянную мерную посуду; диоксан; 6% раствор железа треххлористого.

Выполнение анализа. Подготовка пробы к анализу заключается в выделении ДВ в раствор. Способ выделения определяемого вещества зависит от рецептурного состава средства. Технический продукт растворяют; из концентратов и приманок действующие вещества извлекают жидкостной экстракцией с применением диоксана.

Навеску технического продукта, из расчета получения молярной концентрации раствора  М, растворяют в смешивающемся с водой растворителе (диоксан, ацетон) с добавлением небольшого количества воды (до 5%) и 6% водного раствора . Оптимальная концентрация Fe(III)  М. Раствор фотометрируют при 490 нм. Содержание определяемого индан-1,3-диона вычисляют, используя калибровочный график или молярный коэффициент поглощения комплекса определяемого индан-1,3-диона с железом.

Обработка результатов. Содержание индан-1,3-диона определяют, используя калибровочный график в координатах оптическая плотность - содержание вещества, мг.

При использовании значений молярных коэффициентов поглощения комплекса определяемого индан-1,3-диона с железом содержание действующего вещества (Х) в процентах вычисляют по формуле:

где - разница оптической плотности анализируемого и контрольных растворов;

М - молекулярная масса определяемого индандиона, г/моль;

V - объем раствора или экстракта, л;

- молярный коэффициент поглощения комплекса железа (lll) с индандионом, л/моль·см;

m - масса пробы, взятой на анализ, г;

K - коэффициент, учитывающий разбавление фотометрируемого раствора водой и солью железа;

l - толщина поглощающего слоя, см.

Экспериментально установлены значения молярных коэффициентов поглощения комплекса железа (III) для некоторых веществ: дифенацин ; хлорфасинон ; изопропилфенацин ; этилфенацин .

4.4.3.3. Хроматографические методы определения антикоагулянтов индандионового ряда

Определение антикоагулянтов индан-1,3-дионового ряда (дифенацин, изопропилфенацин, хлорфасинон, этилфенацин) в субстанциях (технические продукты, жидкие и порошковые концентраты) и различных препаративных формах дератизационных средств проводят методом прямой или обращено-фазной высокоэффективной хроматографии с применением спектрофото-метрического детектирования. Для идентификации и хроматографических измерений антикоагулянтов индан-1,3-дионового ряда применяют спектро-фотометрические детекторы на диодной матрице для измерений в области 190-400 нм и детекторы для измерений при одной длине волны. Надежность идентификации ДВ, характеризующихся близкими спектрами поглощения в ультрафиолетовой области, достигается использованием двух критериев:

1 - спектр поглощения в области 190-400 нм, 2 - время удерживания в заданных условиях хроматографических измерений.

При анализе технических продуктов (трифенацин, тетрафенацин), представляющих собой малоочищенную технологическую смесь, в которой содержится несколько индандионов с разным содержанием, применение диодноматричного детектора позволяет записать спектры поглощения каждого пика хроматограммы в диапазоне 190-400 нм и идентифицировать индандионы по спектрам поглощения в рабочей градуировочной смеси и испытуемой пробе.

Специфические условия подготовки пробы для анализа обусловливаются содержанием действующего вещества и свойствами ингредиентов рецептуры средства (технологические и функциональные добавки, в том числе натуральные пищевые аттрактанты).

Технические продукты и жидкие концентраты растворяют в растворителе, совместимом с хроматографической подвижной фазой. Из порошковых концентратов и пищевых приманок требуется выделение действующего вещества в органическую фазу с помощью экстракции. При этом из-за низкого уровня содержания ДВ в пищевых приманках на фоне сложного рецептурного состава и пищевой основы повышаются требования к селективному выделению действующего вещества и условиям эффективного хроматографического разделения компонентов пробы.

Хроматографический метод определения индандионов с применением прямофазной высокоэффективной хроматографии основан на применении УФ-детектирования, хроматографировании пробы на аминной колонке в изократическом режиме с использованием абсолютной градуировки. В качестве элюента (подвижной фазы) применяют смесь ацетонитрил: вода в соотношении 80 : 20 по объему.

Избирательность метода. Метод избирателен в присутствии нескольких ДВ индан-1,3-дионового ряда. Определению не мешают технологические примеси в техническом продукте.

Приборы. Аналитический жидкостный хроматограф "Стайер" или другого типа, снабженный спектрофотометрическим детектором на диодной матрице или детектором для измерений при одной длине волны в ультрафиолетовой области спектра, термостатируемой колонкой, изократической системой микронасосов, инжектором типа Реодайн (или другого типа) с дозирующей петлей объемом от 5 до 20 мкл, программой управления оборудованием и обработки хроматографических данных на базе персонального компьютера.

Хроматографическая колонка, как правило, заводского заполнения сорбентом, с соответствующей предколонкой. Микрошприц вместимостью 100-250 мкл для ручного ввода пробы в инжектор и промывки инжектора. Фильтрующее устройство с фильтром 0,45 мкм. Ультразвуковая ванна для дегазации элюентов и подготовки пробы. Общелабораторное оборудование (аналитические весы с точностью взвешивания до 0,1 мг; мерная стеклянная посуда).

Реактивы и растворы. Ацетонитрил градации для жидкостной хроматографии (210-230 нм), вода бидистиллированная или очистки супер-q на оборудовании Миллипор. Подвижная фаза (элюент) - ацетонитрил: вода (80 : 20 по объему), дегазированная перед использованием с помощью ультразвуковой ванны или потока гелия. Сорбенты для прямофазной хроматографии типа сепарон SGX , лихросорб .

Выполнение анализа. Точную навеску технического продукта около 0,05-0,1 г (0,5-0,7 г жидкого концентрата) или аналитического стандарта определяемого вещества помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и растворяют в 5-7 мл хлороформа, затем проводят разбавление приготовленного раствора элюентом (из расчета получения концентрации в рабочей градуировочной смеси и испытуемом растворе 0,010-0,005 мг/мл) и 4 мкл приготовленного раствора вводят в хроматограф. Условия хроматографирования: колонка типа сепарон SGX NH2 5 мкм (150 х 3,3 мм); скорость элюента - 0,4 мл/мин; температура колонки 60°С. Спектрофотометрические измерения проводят при длине волны 288 нм.

Из полученных хроматограмм рабочей градуировочной смеси определяют время удерживания и площадь хроматографического пика определяемого вещества в рабочей градуировочной смеси. По совпадению времени удерживания на хроматограммах градуировочной смеси и хроматограммах анализируемой пробы проводят идентификацию веществ и вычисляют площади их хроматографических пиков в пробе.

Обработка результатов. Вычисление массовой доли ДВ в средстве (Х) в процентах с применением абсолютной градуировки проводится по формуле:

,

где S и - площади хроматографических пиков определяемого вещества в испытуемой пробе и рабочей градуировочной смеси;

- массовая концентрация аналитического стандарата определяемого вещества в рабочей градуировочной смеси, мг/мл;

а - массовая доля основного вещества в аналитическом стандарте, %;

V - объем раствора пробы, мл;

k - кратность разведения раствора пробы;

m - масса анализируемой пробы, мг.

В отсутствие стандартных образцов определяемых веществ при анализе дератизационных субстанций в виде малоочищенной технологической смеси (трифенацин, тетрафенацин) в качестве аналитического стандарта может быть принят стандарт дифенацина, имеющий квалификацию государственного стандартного образца. Массовую долю ДВ вычисляют по сумме площадей всех хроматографических пиков, характеризующихся спектрами индан-1,3-дионов.

При вычислении содержания примесей в техническом продукте может быть применен метод нормализации площадей.

Хроматографический метод определения индандионов с применением обращенно-фазной высокоэффективной хроматографии основан на применении УФ-детектирования, хроматографировании пробы в градиентном режиме и использовании абсолютной градуировки.

Хроматографирование проводят на колонках, заполненных сорбентом типа сепарон С18, ультрасфер ODS партисил ODS 2; в качестве элюента используют смеси растворителей, приготавливаемые по объему: метанол: изопропанол : 0,1% раствор фосфорной кислоты в соотношении 65 : 15 : 20, ацетонитрил : 0,2% раствор фосфорной кислоты в соотношении 75 : 25, а также применяют другие хроматографические системы сорбент - элюент для обращенно-фазной хроматографии.

Метод избирателен. Спектрофотометрическому измерению дифенацина, этилфенацина, изопропилфенацина и хлорфасинона не мешают технологические и функциональные добавки, типичные для рецептурного состава приманок: битрекс, бензоат натрия, красители. В зависимости от состава пищевой основы экспериментально подбирают условия экстракционного выделения ДВ и очистки экстракта с помощью тест-пробы.

Выполнение анализа. Подготовка пробы. В навеску зерновой приманки массой 10-20 г добавляют 100 мл органического растворителя и проводят экстрагирование с помощью ультразвуковой ванны в течение 30-50 мин. В качестве экстрагента может быть применен ацетонитрил; ацетонитрил, подкисленный уксусной кислотой (1% об.); ацетонитрил : метанол в соотношении 1 : 1 и др. После отстаивания отбирают аликвоту экстракта, фильтруют через фильтр 0,45 мкм и хроматографируют в градиентном режиме обращенно-фазной хроматографии.

При анализе зерновой приманки в виде парафинированного брикета может быть использована последовательная экстракция растворителями разной полярности. Сначала проводят экстракцию небольшими порциями гексана при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Экстракцию повторяют несколько раз, проэкстрагированный гексаном образец подсушивают до воздушно-сухого состояния, после чего проводят экстракцию ацетонитрилом с помощью ультразвуковой ванны в течение 30 мин. В гексановый экстракт добавляют сорбент - оксид алюминия и после выдерживания в течение 20-30 мин. фильтруют. Осадок на фильтре промывают ацетонитрилом, полученный фильтрат вносят в подсушенный образец и проводят экстракцию ацетонитрилом с помощью ультразвуковой ванны в течение 30 мин. После отстаивания отбирают аликвоту экстракта, фильтруют через фильтр 0,45 мкм и хроматографируют в градиентном режиме обращенно-фазной хроматографии.

Условия хроматографирования: колонка типа LUNA C18 3 мкм (150 х 3,3 мм); элюент А - ацетонитрил; элюент Б - 0,16% раствор фосфорной кислоты. Градиент по ацетонитрилу от 60% до 85% за 10 мин.; скорость подвижной фазы 0,4 мл/мин.; температура колонки - комнатная; объем хроматографируемой дозы 10 мкл. Примерное время удерживания хлорфасинона 8,9 мин, дифенацина 10,2 мин.

Идентификацию определяемого вещества проводят сравнением времени удерживания в градуировочной смеси и анализируемой пробе при одной длине волны в интервале 250-280 нм, дополнительно могут быть использованы спектры поглощения в области 190-400 нм в исследуемой пробе и градуировочной смеси.

Обработка результатов. Массовую долю ДВ в приманке (Х) в процентах с применением абсолютной градуировки вычисляют с учетом фактора извлечения по формуле:

,

где S и - площади хроматографических пиков определяемого вещества в

анализируемой пробе и рабочей градуировочной смеси;

- массовая концентрация анализируемого стандарта определяемого вещества в рабочей градуировочной смеси, мг/мл;

а - массовая доля основного вещества в аналитическом стандарте, %;

V - объем раствора пробы, мл;

k - кратность разведения раствора пробы;

m - масса пробы, взятая на анализ, мг;

- фактор извлечения, устанавливают по контрольному образцу с известным содержанием определяемого вещества, .

4.4.4. Методы определения антикоагулянтов кумаринового ряда

4.4.4.1. Спектрофотометрические методы определения зоокумарина и бромадиолона

Определение зоокумарина и бромадиолона в дератизационных средствах спектрофотометрическим методом может быть проведено по собственному поглощению в ультрафиолетовой части спектра и по измерению оптической плотности растворов натриевой соли.

Спектрофотометрический метод определения зоокумарина и бромадиолона по собственному поглощению в ультрафиолетовой части спектра основан на измерении оптической плотности раствора пробы в органическом растворителе с использованием молярного коэффициента поглощения определяемого вещества.

Приборы, реактивы и растворы. Спектрофотометр СФ-26 или другого типа; весы аналитические; ротационный испаритель; стеклянная мерная посуда; 2% раствор натрия гидроокиси; хлороформ; диоксан; этанол; оксид алюминия для хроматографии.

Выполнение анализа. Зоокумарин (3%) из навески порошкового средства массой около 0,1 г экстрагируют 25 мл диоксана с помощью магнитной мешалки и разбавляют диоксаном в 10 раз, после фильтрования проводят измерение оптической плотности раствора при длине волны 310 нм.

Обработка результатов. Содержание зоокумарина в средстве (Х) в процентах вычисляют по формуле:

где D и - оптические плотности анализируемого раствора и раствора "холостой" пробы средства, не содержащей зоокумарина;

308,2 - молекулярная масса зоокумарина, г/моль;

V - объем фотометрируемого раствора, мл;

10 - кратность разведения экстракта;

- молярный коэффициент поглощения зоокумарина в диоксане, равный 14500 л/моль·см;

m - масса средства, г;

l - толщина поглощающего слоя, см.

При определении бромадиолона (0,25%) в концентрате навеску средства массой около 0,04 г растворяют в 5 мл этанола. Измерения проводят при длинах волн 320 и 340 нм. При вычислении содержания бромадиолона применяют разность молярных коэффициентов поглощения бромадиолона при 320 и 340 нм, равную 7800 л/моль·см.

Метод не избирателен в присутствии растворимых веществ рецептурного состава средства, поглощающих в указанных областях спектра. Метод может быть применен для серийных анализов в условиях производства.

Спектрофотометрический метод определения зоокумарина по поглощению его натриевой соли основан на измерении при 306-308 нм оптической плотности раствора натриевой соли зоокумарина, получаемой с помощью 2% раствора гидроокиси натрия.

Метод не избирателен в присутствии веществ в пробе, поглощающих при длине волны измерения 306-308 нм. Метод может быть применен для серийных анализов в условиях производства.

Выполнение анализа. При анализе технического продукта пробу растворяют в 2% растворе гидроокиси натрия и измеряют оптическую плотность при 306-308 нм.

При анализе препаративных форм проводят извлечение хлороформом, при необходимости - сорбционную очистку экстракта на колонке с окисью алюминия. Растворитель отгоняют и растворяют сухой остаток в 2% растворе гидроокиси натрия. После фильтрования измеряют оптическую плотность при 308 нм, используя в качестве раствора сравнения "холостую пробу". Количество ДВ измеряют по калибровочному графику в интервале 25, 50, 100 и 200 мкг, для построения которого применяют стандартный раствор натриевой соли зоокумарина 0,1 мг/мл.

Обработка результатов. Массовую долю зоокумарина в средстве (Х) в процентах вычисляют по формуле:

где С - содержание зоокумарина, найденное по калибровочному графику, мкг;

V - объем раствора средства, мл;

-объем раствора, взятый для анализа, мл;

m - масса средства, взятая для анализа, г.

- коэффициент пересчета мкг в г.

4.4.4.2. Хроматографические методы определения антикоагулянтов оксикумаринового ряда

Определение антикоагулянтов кумаринового ряда (бродифакума, бромадиолона, дифетиалона, зоокумарина, куматетралила, флокумафена) в субстанциях (технических продуктах, жидких и порошковых концентратах) и различных препаративных формах дератизационных средств проводят методом прямой или обращенно-фазной высокоэфективной хроматографии с применением спектрофотометрического детектирования. Для идентификации и хроматографических измерений антикоагулянтов оксикумаринового ряда применяют спектрофотометрические детекторы для измерений при одной длине волны, а также детекторы на диодной матрице для измерений в области 190-400 нм, которые позволяют повысить надежность идентификации веществ за счет использования двух критериев: 1 - спектр поглощения в области 190-400 нм, 2 - время удерживания в заданных условиях хроматографических измерений.

Специфические условия подготовки пробы и спектрофотометрического детектирования обуславливаются содержанием ДВ и составом ингредиентов рецептуры средства (технологические и функциональные добавки, в том числе натуральные пищевые аттрактанты).

Субстанции - (технические продукты и жидкие концентраты) растворяют в растворителе, совместимом с хроматографической подвижной фазой. Определение ДВ проводят в условиях прямой или обращенно-фазной высокоэффективной хроматографии. При анализе технического продукта определяют содержание основного вещества с использованием абсолютной градуировки или "внутреннего эталона", для количественной оценки примесей применяют метод нормализации площадей.

Из порошковых концентратов, требуется выделение ДВ в органическую фазу жидкостной экстракцией.

Из пищевых приманок также извлекают ДВ с помощью жидкостной экстракции. При этом из-за низкого уровня содержания ДВ (%) в пищевых приманках на фоне сложного рецептурного состава и пищевой основы повышаются требования к селективному выделению ДВ и условиям эффективного хроматографического разделения компонентов пробы.

Метод избирателен. Определению бродифакума, бромадиолона, дифетиалона, зоокумарина, куматетралила, флокумафена не мешают технологические примеси в техническом продукте.

Приборы. Аналитический жидкостный хроматограф "Стайер" или другого типа, снабженный спектрофотометрическим детектором на диодной матрице или детектором для измерений при одной длине волны в ультрафиолетовой области спектра, термостатируемой колонкой, изократической системой микронасосов, инжектором типа Реодайн (или другого типа) с дозирующей петлей объемом от 5 до 20 мкл, программой управления оборудованием и обработки хроматографических данных на базе персонального компьютера.

Хроматографическая колонка, как правило, заводского заполнения сорбентом, с соответствующей предколонкой. Микрошприц вместимостью 100-250 мкл для ручного ввода пробы в инжектор и промывки инжектора. Фильтрующее устройство с фильтром 0,45 мкм. Ультразвуковая ванна для дегазации элюентов и подготовки пробы. Общелабораторное оборудование (аналитические весы с точностью взвешивания до 0,1 мг, мерная стеклянная посуда).

Реактивы и растворы. Ацетонитрил градации для жидкостной хроматографии (210-230 нм); уксусная кислота х.ч.; вода бидистиллированная или очистки супер-q на оборудовании Миллипор. Сорбенты для прямофазной и обращенно-фазной хроматографии типа сепарон SGX , лихросорб , МАХ RP C12, зорбакс ODS, лихросорб RP 18 и др.

Элюент (подвижная фаза) - ацетонитрил : вода 80 : 20 (по объему); ацетонитрил : вода : уксусная кислота 80 : 20 : 1 (по объему), дегазированные перед использованием с помощью ультразвуковой ванны или потока гелия.

Выполнение анализа. Точную навеску технического продукта 0,05 г или аналитического стандарта определяемого вещества растворяют в мерной колбе вместимостью 50-100 мл в соответствующем органическом растворителе (ацетонитрил, этиловый спирт и др.) с помощью ультразвуковой ванны, затем проводят последовательное разбавление исходного раствора ацетонитрилом или элюентом (из расчета получения концентрации в рабочей градуировочной смеси и испытуемом растворе 0,010-0,005 мг/мл) и хроматографируют в условиях прямофазной или обращенно-фазной высокоэффективной хроматографии. Из полученных хроматограмм рабочей градуировочной смеси определяют время удерживания и площадь хроматографического пика определяемого вещества в рабочей градуировочной смеси. Из хроматограмм испытуемой пробы проводят идентификацию определяемого вещества по совпадению времени удерживания и вычисляют площадь хроматографического пика в испытуемой пробе. Применение диодноматричного детектора позволяет записать и сравнить спектры поглощения хроматографического пика определяемого вещества в диапазоне 190-400 нм в рабочей градуировочной смеси и испытуемой пробе. Близким характером спектров поглощения характеризуются зоокумарин и куматетралил, бродифакум и бромадиолон.

Условия хроматографирования при прямофазной и обращенно-фазной высокоэффективной хроматографии приведены в таблице 4.7.

Таблица 4.7.

Параметры	Прямофазная высокоэффективная хроматография	Обращенно-фазная высокоэффективная хроматография
Подвижная фаза	ацетонитрил : вода 80 : 20	Ацетонитрил : вода : уксусная кислота 80 : 20 : 1
Скорость подвижной Фазы	0,5 мл/мин	0,5 мл/мин
Колонка	Сепарон 5мкм (150 х 3,3мм)	Мах RP () 4 мкм (250 х 4мм)
Температура колонки	37°С	37°С
Хроматографируемая доза	20 мкл	20 мкл

В указанных условиях бродифакум и бромадиолон детектируются двумя пиками стереоизомеров. Примерное относительное время удерживания действующих веществ по основному пику бромадиолона приведено в таблице 4.8.

Таблица 4.8.

Действующее вещество	Прямофазная высокоэффективная хроматография	Обращенно-фазная высокоэффективная хроматография
Дифетиалон	1,5	0,7
Бродифакум	1,4	0,8
Бромадиолон	1	1
Куматетралил	0,9	1,8
Зоокумарин	0,8	2,9

Обработка результатов. Вычисление массовой доли основного вещества (Х) в процентах в техническом продукте с применением абсолютной градуировки проводится по формуле:

,

где S и - площадь хроматографического пика определяемого вещества в анализируемой пробе и рабочей градуировочной смеси;

C - массовая концентрация анализируемого стандарата определяемого вещества в рабочей градуировочной смеси, мг/мл;

a - массовая доля действующего вещества в аналитическом стандарте, %;

V - объем раствора пробы, мл;

k - кратность разведения пробы;

m - масса средства, мг.

Определение ДВ в порошковых и жидких концентратах основано на разбавлении или экстракционном извлечении ДВ, разделении компонентов пробы в хроматографической системе сорбент - подвижная жидкая фаза (элюент) в изократическом режиме и последующем спектрофотометрическом измерении в элюате определяемого вещества с применением абсолютной градуировки.

Метод избирателен. Спектрофотометрическому измерению бродифакума, бромадиолона, дифетиалона, зоокумарина, куматетралила, флокумафена не мешают технологические и функциональные добавки, типичные для рецептурного состава концентратов: битрекс, бензоат натрия, красители (например, метиленовый голубой, красный темный), и растворители (например, этиловый и пропиловый спирт, триэтиленгликоль, пропиленгликоль).

Выполнение анализа. Подготовка пробы. Масляный концентрат (около 0,1 г) растворяют в ацетонитриле в мерной колбе вместимостью 25 мл, затем 20 мл полученного раствора вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и добавляют до метки элюент (смесь ацетонитрил : вода 80 : 20), после перемешивания хроматографируют.

Гелеобразный жидкий концентрат (около 0,5 г) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, и растворяют в 2,5 мл диметилформамида при периодическом перемешивании или с помощью ультразвуковой ванны, затем добавляют ацетонитрил. После отстаивания 2 мл прозрачного раствора вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и добавляют до метки элюент (смесь ацетонитрил : вода 80 : 20), после перемешивания хроматографируют.

Порошковый концентрат (0,05-0,15 г) экстрагируют 50 мл ацетонитрила с помощью ультразвуковой ванны в течение 20-25 мин., затем центрифугируют и полученный раствор хроматографируют. В качестве экстрагента может быть применен также водный ацетонитрил (1 : 1), хлористый метилен, насыщенный муравьиной кислотой - в этом случае отгоняют экстрагент с помощью ротационного испарителя, сухой остаток растворяют в элюенте (метанол : вода : уксусная кислота 94,2 : 5 : 0,8) и хроматографируют. При необходимости проводят сорбционную очистку экстракта от красителя на слое целита 545.

Условия хроматографирования при прямофазной и обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для прямофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии может быть использована хроматографическая система: аминная колонка с сорбентом типа сепарон SGX 5 мкм, лихросорб 5 мкм - элюент ацетонитрил : вода 80 : 20. Для обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии - хроматографическая система: колонка с сорбентом типа МАХ RP С12, зорбакс ODS, нуклеосил С18, лихросорб RP 18 - элюент ацетонитрил : вода : уксусная кислота 80 : 20 : 1; метанол: вода : уксусная кислота 94,2 : 5 : 0,8 и др.

Длина волны измерений может быть применена в диапазоне от 254 нм до 288 нм. Скорость элюента применяется в интервале от 0,4 до 2 мл/мин., температура колонки в диапазоне 25-60°С, объем хроматографируемой пробы 5-20 мкл.

Рабочие градуировочные смеси готовят с массовой концентрацией определяемых ДВ 0,005-0,010 мг/мл. Из полученных хроматограмм рабочей градуировочной смеси определяют время удерживания и площадь хроматографического пика вещества в рабочей градуировочной смеси. Из хроматограмм испытуемой пробы проводят идентификацию определяемого вещества по совпадению времени удерживания и вычисляют площадь хроматографического пика в анализируемой пробе. Для идентификации определяемого вещества дополнительно могут быть использованы спектры поглощения в области 190-400 нм в исследуемой пробе и градуировочной смеси.

Обработка результатов. Массовую долю ДВ в концентрате определяют по известной формуле при применении абсолютной градуировки.

Определение ДВ в дератизационных приманках основано на его экстракционном извлечении, хроматографическом разделении компонентов пробы в градиентном режиме и последующем спектрофотометрическом измерении определяемого вещества в элюате с применением абсолютной градуировки.

Метод избирателен. Спектрофотометрическому измерению бродифакума, бромадиолона, дифетиалона, зоокумарина, куматетралила, флокумафена не мешают технологические и функциональные добавки, типичные для рецептурного состава приманок: красители (например, метиленовый голубой, красный темный), битрекс, бензоат натрия и растворители (например, этиловый и пропиловый спирт, триэтиленгликоль, пропиленгликоль). Идентификацию определяемого вещества проводят сравнением времени удерживания при одной длине волны в интервале 250-280 нм, дополнительно могут быть использованы спектры поглощения в области 190-400 нм в исследуемой пробе и градуировочной смеси.

Выполнение анализа. Зерновые приманки. Навеску зерновой приманки массой 10-20 г экстрагируют ацетонитрилом и обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 30 мин. В качестве экстрагента может быть применен ацетонитрил, подкисленный уксусной кислотой (1% об.). После отстаивания отбирают аликвоту экстракта, фильтруют через фильтр 0,45 мкм и хроматографируют в градиентном режиме обращенно-фазной хроматографии. Условия хроматографирования: колонка с сорбентом нуклеосил С18 (125 х 3 мм); элюент А - ацетонитрил, элюент Б - 0,16% (об.) раствор ортофосфорной кислоты. Градиент по ацетонитрилу от 40% до 75% за 10 мин.; 75% изократика 5 мин.; скорость подвижной фазы 0,4 мл/мин.; длина волны 284 нм; объем хроматографируемой дозы 10 мкл.

Гранулированные приманки. Навеску 20-40 г измельченной гранулированной приманки помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, добавляют 250 мл экстрагента и интенсивно перемешивают на магнитной мешалке в течение 20 мин. В качестве экстрагента применяют хлористый метилен, насыщенный муравьиной кислотой. Затем содержимое колбы количественно переносят на фильтр с целитом и трижды промывают экстрагентом порциями по 50 мл. Фильтрат упаривают с помощью ротационного испарителя. К сухому остатку добавляют 10 мл смеси метанол : хлористый метилен 3 : 2 (по объему), центрифугируют и раствор вводят в хроматограф. Условия хроматографирования: колонка с сорбентом для обращенно-фазной хроматографии зорбакс ODS 5 мкн (250 х 4,6 мм); подвижная фаза метанол : вода : уксусная кислота 94,2 : 5 : 0,8; скорость 1 мл/мин.; длина волны 254 нм; объем хроматографируемой дозы 10 мкл. Рабочая градуировочная смесь в растворителе - метанол : хлористый метилен (3 : 2) с концентрацией определяемого вещества 0,2 мг/мл.

Обработка результатов. Массовую долю ДВ в приманке (Х) в процентах с применением абсолютной градуировки вычисляют по следующей формуле с учетом фактора извлечения :

,

где S и - площади хроматографических пиков определяемого вещества в испытуемой пробе и рабочей градуировочной смеси;

- массовая концентрация анализируемого стандарта определяемого вещества в рабочей градуировочной смеси, мг/мл;

а - массовая доля основного вещества в аналитическом стандарте, %;

V - объем раствора пробы, мл;

k - кратность разведения раствора пробы;

m - масса пробы, взятая на анализ, мг;

- фактор извлечения, устанавливают по контрольному образцу с известным содержанием определяемого вещества, .

4.5. Библиографические данные

1. Крейнгольд С.У. "Практическое руководство по химическому анализу дезинфекционных препаратов", М., 2002, 156 с.

2. Шамб У., Сеттерфилд Ч., Вентворс Р. /"Перекись водорода", М. 1958. С. 460-468.

3. Губен-Вейль. "Методы органической химии. Методы анализа", - М.: Химия, 1967. С. 52-462.

4. Сукиасян А.Н., Копылова А.И. Количественное определение глутарового альдегида в разбавленных водных растворах./Теория и практика дезинфекции и стерилизации, сборник научных трудов, М. 1983, С. 116-119.

5. Сукиасян А.Н., Свитова И.Р. Количественное определение надкислот в растворах, содержащих перекись водорода. Хим.-фарм. журнал, 1983, N 3, С. 366-368.

6. Сукиасян А.Н., Свитова И.Р. Модификация цериметрически-йодометрического метода анализа перекисных компонентов в растворах, содержащих надкислоту и перекись водорода./ Проблемы дезинфекции и стерилизации, Сб. научн. тр., М. 1980, С. 115-119.

7. Газоанализатор 3.02П-Р. Руководство по эксплуатации ИРМБ. 4 133 12.005-02 РЭ, СПб, 2001.

8. Оптический анализатор озона "Циклон-5.51". Руководство по эксплуатации ИРМБ. 4 133 13.009 РЭ, СПб, 2001.

9. Мельников Н.Н., Новожилов К.Б., Белан С.Р. Пестициды и регуляторы роста растений. Справочник, М., 1995.

10. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде, Колос. М., 1992. т. 1, 2. N 94.

11. Гигиенические критерии состояния окружающей среды, N 94, Перметрин, ВОЗ, Женева, 1992.

12. Гигиенические критерии состояния окружающей среды, N 82, Циперметрин, ВОЗ, Женева, 1991.

13. Гигиенические критерии состояния окружающей среды, N 97, Дельтаметрин, ВОЗ, Женева, 1992.

14. Гигиенические критерии состояния окружающей среды, N 87, Аллетрины, ВОЗ, Женева, 1992.

15. Гигиенические критерии состояния окружающей среды, d-Фенотрин, ВОЗ, N 96, Женева, 1993.

16. Крейнгольд С.У. и Шестаков К.А. Методика определения фосфида цинка в техническом препарате//Дезинфекционное дело N 2, 2003, С 23-24.

17. Хубер Л. Применение диодно-матричного детектирования в ВЭЖХ - Мир, М.: 1993, 95 с., ил.

18. Методические указания по определению зоокумарина в тканях и крови животных, в приманках и препарате (пенокумарин) хроматографическими и спектрофотометрическими методами N 1550-76 от 20.12.1976//Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Справочное. Мин. сель. хоз. СССР. Гос. Комиссия по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками; под ред. М.А. Клисенко. Колос. - М.: 1983, С. 227-331.

19 С.У. Крейнгольд. Простые и экспрессные методы химического контроля качества дезинфекционных препаратов//Дез дело N 4, 2002, С 37-39.

20. С.У. Крейнгольд. Спектрофотометрическое определение фенолов в дезинфицирующих средствах после разделения их методом тонкослойной хроматографии.//Дез дело N 4, 2003, С 45-47.

21. С.У.Крейнгольд и К.А.Шестаков. Определение триклозана в жидком туалетном антибактериальном мыле.//Дез дело N 3, 2003, С 46-47.

22. Мыло жидкое с дезинфицирующим эффектом "НИКА-СВЕЖЕСТЬ антибактериальное" ТУ 9392-023-12910434-2005 ООО НПФ "ГЕНИКС"

23. Средство дезинфицирующее "ДЕЛАСЕПТ-ГЕЛЬ" (кожный антисептик). Технические условия ТУ 9392-051-00479095-2005. ЗАО "Петроспирт".

24. Средство дезинфицирующее КЕМИ-САЙД. Технические условия ТУ 9392-001-56715159-2004 ООО "КЕМИТРЕЙД"

5. Микробиологические методы исследований и критерии оценки эффективности дезинфицирующих и стерилизующих средств

Общие положения

Современные дезинфицирующие средства (ДС) представляют собой индивидуальные химические соединения или композиционные составы, включающие одно или несколько действующих веществ (ДВ). Кроме того, в их состав могут входить вспомогательные компоненты: стабилизаторы, ингибиторы коррозии, моющие вещества, красители, отдушки и др.

В качестве действующих веществ в ДС используют хлорактивные, кислородактивные соединения, альдегиды, четвертичные аммониевые соединения, амины, гуанидины, спирты и др.

ДС производятся в форме жидких концентратов, готовых к применению жидкостей, порошков, таблеток, гелей, спреев, салфеток, биоцидных лакокрасочных материалов и др.

ДС должны отвечать следующим требованиям [14, 21, 23, 51, 66]:

- обладать достаточной антимикробной активностью в отношении патогенных и условно-патогенных видов микроорганизмов: бактерий, грибов, вирусов, а также споровых форм микроорганизмов;

- относительно низкой токсичностью для человека;

- быть экологически безопасными;

- быть стабильными при хранении;

- не иметь резкого неприятного запаха;

- хорошо растворяться в воде;

- не повреждать обрабатываемые объекты;

- иметь оптимальное соотношение стоимость-качество.

К некоторым средствам узко целевого назначения дополнительно предъявляют индивидуальные требования, изложенные в соответствующих главах.

ДС могут быть универсального назначения, которые рекомендуется применять для дезинфекции многих объектов при разных инфекциях, или узко целевого назначения, предназначенные для дезинфекции одного конкретного объекта, например, для дезинфекции стоматологических оттисков, или воздуха, или поверхностей и т.д.

Предполагаемая сфера применения ДС определяет объем микробиологических исследований, необходимых для разработки режимов обеззараживания соответствующих объектов.

Микробиологические исследования начинают только после получения результатов химико-аналитических исследований, подтверждающих соответствие средства требованиям нормативно-технической документации (НТД): технических условий - на отечественные средства, спецификации - на зарубежные.

Этапы исследований дезинфицирующих веществ и дезинфицирующих средств. Микробиологические исследования включают изучение активности ДВ и изучение эффективности ДС [51, 52, 66].

При исследовании субстанций, предназначенных для производства ДС, определяют спектр антимикробного действия в экспериментах in vitro.

Исследование свойств ДС проводят в 3 этапа:

1) определение in vitro спектра антимикробной активности ДС и влияния на нее различных факторов: рН, органических веществ, температуры.

2) эффективность обеззараживания искусственно контаминированных тест-микроорганизмами объектов в лабораторных условиях с целью разработки режимов применения ДС в зависимости от концентрации ДВ, времени воздействия, характера объекта, способа обработки и других факторов.

3) испытание ДС в практических условиях для подтверждения эффективности разработанных режимов в реальных условиях применения в случаях: исследования средства, содержащего новое ДВ; нового способа применения, значительного снижения концентрации и времени воздействия по сравнению с ранее разрешенными режимами и пр.

5.1. Методы изучения и оценки бактерицидной активности дезинфицирующих средств и их субстанций

5.1.1. Тест-микроорганизмы для изучения бактерицидной активности ДС и их субстанций. Требования к тест-микроорганизмам

При изучении бактерицидной активности дезинфицирующих субстанций и ДС в качестве тест-микроорганизмов используют [66]:

Escherichia coli (штамм 1257), Pseudomonas aeruginosa (штамм АТСС 27853), Salmonella typhimurium (штамм) - для оценки бактерицидной активности в отношении грамотрицательных бактерий; Staphylococcus aureus (штамм 906) - для оценки бактерицидной активности в отношении грамположительных бактерий.

При сертификационных испытаниях и экспертной оценке ранее зарегистрированных ДС набор тест-микроорганизмов может быть ограничен наиболее устойчивыми представителями каждой группы.

Перечень тест-микроорганизмов, если он шире стандартного, указан в соответствующих разделах по изучению эффективности ДС при обеззараживании отдельных объектов.

Условия культивирования тест-микроорганизмов. Тест-микроорганизмы культивируют на следующих питательных средах:

Е.coli, S.typhimurium, P.aeruginosa и S.aureus - на казеиновом бульоне, мясо-пептонном бульоне, агаре Эндо, казеиновом агаре, мясо-пептонном агаре и др. при температуре плюс 37°С в течение 18-24 ч.;

Музейные культуры указанных выше микроорганизмов хранят при температуре плюс °С в ампулах (после лиофильной сушки) или на плотных питательных средах (посев уколом) под слоем стерильного вазелинового масла (толщина слоя 1,5-3 мм), а рабочие культуры - на скошенном агаре или в бульоне.

Тест-микроорганизмы должны иметь типичные биохимические, морфологические, тинкториальные, культуральные и ферментативные свойства, присущие данному виду [66] и обладать стандартной устойчивостью к эталонным дезинфицирующим средствам: растворам хлорамина, перекиси водорода, Катамина АБ - алкилдиметилбензиламмония хлорида (АДБАХ), глутарового альдегида (таблица 5.1).

Таблица 5.1.

Устойчивость тест-микроорганизмов к дезинфицирующим агентам

Дезинфицирующее вещество	Концентрация раствора по ДВ, %	Время гибели тест-микроорганизмов, мин не менее
		Е.coli, шт. 1257	S.aureus, шт. 906
Хлорамин	0,020* 0,200*	5 -	- 15
АДБАХ	0,025	20	10
Глутаровый альдегид	0,030 0,060	10 -	- 10
Перекись водорода	2,000 3,000	10 -	- 25

Примечание - Знак (*) обозначает, что концентрация раствора указана по препарату.

Устойчивость тест-микроорганизмов к эталонным дезинфицирующим средствам определяют методом батистовых тест-объектов (п. 5.1.2.2.).

Проверку устойчивости тест-микроорганизмов проводят не реже 1 раза в месяц. При снижении резистентности культур делают их пересевы на обогащенные питательные среды до восстановления устойчивости.

5.1.1.1. Методы приготовления суспензии тест-микроорганизмов. Определение биологической концентрации тест-микроорганизмов в бактериальной суспензии

Культуры тест-микроорганизмов подвергают контролю их качества. В частности, непосредственно перед использованием тест-культур для исследовательских целей необходимо убедиться в том, что тест-штаммы, выросшие на питательной среде, не загрязнены посторонней микрофлорой. Для оценки роста культур тест-штаммов визуально просматривают каждую пробирку и учитывают характер и массивность роста, изменение цвета питательной среды. Проводят микроскопию мазка выросших культур, окрашенных по Грамму.

Рабочую суспензию тест-культур готовят из культуры данного тест-штамма, выращенного на плотной питательной среде (МПА или казеиновый агар) при температуре 37°С в течение 18-24 часов. Для приготовления бактериальной взвеси культуру смывают с агара стерильной питьевой водой. Полученную взвесь микробов фильтруют через ватно-марлевый фильтр и разводят стерильной питьевой водой до концентрации, соответствующей по мутности оптическому стандарту мутности (ФГУН "Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора") N 20 (он соответствует микробных тел в 1 мл).

В связи с тем, что суспензия может содержать наряду с живыми мертвые микроорганизмы, необходимо определять бактериологическую концентрацию фактического количества живых клеток в приготовленной суспензии, чтобы, при необходимости, внести коррективы и обеспечить требуемые уровни контаминации батистовых тест-объектов жизнеспособными микроорганизмами.

Определение биологической концентрации тест-микроорганизмов выполняют методом последовательных десятикратных разведений суспензии тест-микроорганизма в стерильной питьевой воде с последующим высевом суспензии в чашки Петри с плотной питательной средой (казеиновый агар, агар Эндо, МПА). После определенного времени инкубации при соответствующей температуре проводят подсчет выросших колониеобразующих единиц (КОЕ) и определяют количество жизнеспособных бактерий в одном мл суспензии.

Из практики известно, что суспензия, содержащая такое количество живых микробов, при контаминации ею батистовых тест-объектов обеспечивает требуемые (порядка  ) уровни их обсеменения живыми клетками тест-микроба.

5.1.1.2. Приготовление рабочих растворов ДС и их субстанций

Рабочие растворы ДС и их субстанций готовят непосредственно перед проведением исследований (кроме тех случаев, когда изучают стабильность рабочих растворов в процессе хранения).

При изучении средств, производимых в форме гранул, порошков, таблеток и др., рабочие растворы используют только после полного растворения ДВ дезинфицирующего средства (если не указано на возможность выпадения осадка).

Для оценки антимикробного действия субстанций и ДС в лабораторных условиях и исследования эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания различных объектов растворы готовят на стерильной питьевой воде. Для этого необходимое количество сухого ДС или жидкого концентрата вносят в пробирку (колбу) и добавляют расчетное количество воды, тщательно размешивают и закрывают пробкой. Отмечают время полного растворения и внешний вид приготовленного рабочего раствора.

Температура растворов ДС должна быть в пределах плюс °С (если по условиям эксперимента не рекомендована другая температура) независимо от температуры окружающей среды. Для поддержания требуемой температуры используют водяную баню.

При испытании ДС в практических условиях рабочие растворы готовят на нестерильной питьевой воде комнатной температуры (плюс °С) или при необходимости - умеренно повышенной температуры (плюс 45-50°С). Навеску средства или отмеренное количество жидкого концентрата вносят в соответствующую емкость, добавляют воду, размешивают и закрывают крышкой. Работу с раствором начинают после полного растворения ДВ. Рабочие растворы из ДС в форме таблеток готовят путем добавления в отмеренный объем воды определенного числа таблеток.

Рабочие растворы субстанций и ДС готовят с соблюдением мер предосторожности. Если ДВ относится к летучим веществам и представляет опасность при ингаляционном воздействии, растворы готовят в вытяжном шкафу или в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией в респираторе РУ 60М или РПГ-67, кожу рук защищают резиновыми перчатками, глаза - защитными очками.

Исследуемые ДС (перед, во время и после исследований) следует хранить в соответствии с требованиями технических условий или спецификации; при отсутствии таковых - в соответствии с СП 3.5.1378-03 [14].

5.1.2. Методы исследований и оценки результатов бактерицидной активности ДС и их субстанций in vitro

Целью исследований является определение уровня и спектра антимикробной активности ДС и их субстанций.

Субстанции, предназначенные для производства ДС, должны соответствовать следующим требованиям:

- хорошо растворяться в воде или других растворителях;

- обладать бактерицидной активностью, т.е. убивать бактерии, а не задерживать их рост;

- иметь удовлетворительные органолептические (по цвету, запаху) и физико-химические (по растворимости, биоразлагаемости и стабильности при хранении и др.) свойства.

Антимикробную активность ДС и их субстанций изучают суспензионным методом или методом батистовых тест-объектов.

5.1.2.1. Суспензионный метод

Для приготовления растворов ДС в различных концентрациях ДВ разводят или растворяют в стерильной питьевой воде, далее по 4,5 мл разливают в стерильные пробирки, в которые добавляют 0,5 мл взвеси тест-микроорганизма или бульонной культуры, содержащей  мк/мл, и тщательно перемешивают. Через определенные интервалы времени (5 мин) по 0,5 мл взвеси "тест-микроорганизм+ДВ" добавляют к 4,5 мл соответствующего нейтрализатора, снова тщательно перемешивают и оставляют на 5 мин. Затем по 0,5 мл вносят в пробирку с 4,5 мл стерильной питьевой воды, после чего 0,1 мл из этой пробы вносят в пробирки с 5 мл жидкой и на поверхность твердой питательной среды. В контрольных опытах вместо растворов ДС используют стерильную питьевую воду, а посевы делают в среду без нейтрализации или с нейтрализацией.

Температура инкубирования посевов в термостате -37°С, сроки учета результатов опыта - 24-48 часов. Для подтверждения снятия биоцидного действия ДВ из пробирок, в которых отсутствовал рост тест-культуры, ежедневно делают пересев по 0,5 мл в 4,5 мл новой питательной среды.

Результаты опыта оценивают по наличию или отсутствию роста микроорганизмов в жидкой и на твердой питательной среде. Сравнение проводят с контролем опыта, которым является посев тест-микроорганизмов в питательную среду без добавления ДС или субстанции.

Эффективной считают концентрацию средства, при которой трижды повторенный опыт при определенном времени воздействия дает отрицательный результат (отсутствие роста микроорганизмов) при наличии типичного роста тест-культуры в контроле.

5.1.2.2. Метод батистовых тест-объектов

Подготовка батистовых тест-объектов.

Перед приготовлением батистовых тест-объектов кусок батиста погружают на 24 часа в холодную воду для удаления аплитуры, крахмала. Затем его тщательно стирают с мылом, кипятят, сушат и гладят утюгом. С помощью иглы в приготовленном куске ткани выдергивают нитки в продольном направлении на расстоянии 11 мм друг от друга, а в поперечном - на расстоянии 6 мм. По этим линиям батист разрезают ножницами на тест-объекты и по 50 штук раскладывают в чашки Петри, последние заворачивают в бумагу и стерилизуют паровым методом при плюс 132°С (2,0 ) 20 мин.

Контаминация батистовых тест-объектов.

Приготовление суспензии тест-микроорганизмов (Е.coli, S.aureus, P.aeruginosa, S.typhimurium) проводят в соответствии с п. 5.1.1.1. Для контаминации стерильные батистовые тест-объекты в чашке Петри заливают суспензией тест-микроорганизма из расчета 0,5 мл на 1 тест-объект, равномерно смачивая все тест-объекты. Чашку Петри закрывают крышкой и оставляют на 20 минут. Затем в асептических условиях батистовые тест-объекты, пропитанные суспензией тест-микроорганизмов, переносят на поверхность стерильной фильтровальной бумаги (2-4 слоя на дне чашки Петри), прикрывают их сверху стерильной фильтровальной бумагой и закрывают чашку Петри крышкой. Через 10 мин после удаления избытка жидкости тест-объекты переносят на поверхность сухой стерильной фильтровальной бумаги в чашке Петри и сверху прикрывают стерильным листом фильтровальной бумаги, подсушивают в термостате при плюс 37°С в течение 20 мин с приоткрытой крышкой.

Хранят контаминированные батистовые тест-объекты в чашках Петри в холодильнике при температуре плюс 4°С.

Срок хранения тест-объектов, контаминированных E.coli, S.typhimurium, P.aeruginosa - 1 сутки, S.aureus - 4 суток.

Постановка опыта. При постановке опытов в стерильную пробирку пипеткой наливают требуемый объем приготовленного дезинфицирующего раствора (из расчета 0,5 мл на каждый тест-объект) и, не касаясь краев колбы, опускают в него с помощью стерильного пинцета все тест-объекты, используемые в эксперименте (по 2 на каждую экспозицию). Легким покачиванием колбы достигают смачивания тест-объектов исследуемым раствором. Колбу помещают в водяную баню с температурой плюс 18-20°С и поддерживают данную температуру в течение всего эксперимента. При постоянной температуре в помещении плюс 18-20°С эксперименты можно проводить без использования водяной бани.

Отсчет времени воздействия эталонного раствора начинают с момента смачивания всех тест-объектов раствором. Через определенные интервалы времени (5 мин) стерильным пинцетом или платиновой петлей извлекают по 2 тест-объекта из раствора и погружают в пробирки с 5 мл стерильного раствора соответствующего нейтрализатора. Через 5 мин тест-объекты переносят в пробирку со стерильной питьевой водой, а еще через 5 мин каждый из двух тест-объектов в отдельности переносят в пробирки с жидкой питательной средой, необходимой для культивирования изучаемого тест-микроорганизма.

Контролем являются 2 тест-объекта, погруженные на весь период эксперимента в раствор нейтрализатора, и 2 тест-объекта, погруженные на этот же срок в питьевую воду, которые по окончании эксперимента переносят в питательную среду. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С. Результаты оценивают качественно по отсутствию/наличию роста тест-микроорганизма в питательном бульоне.

Критерием активности ДС и субстанций является 100% гибель тест-микроорганизмов (отсутствие роста в опытных пробах) при времени дезинфекционной выдержки S.aureus, E.coli, S.typhimurium, P.aeruginosa - не более 30 мин.

5.1.2.3. Методы исключения бактериостатического действия действующих веществ

Для определения микробоцидного и исключения бактериостатического действия ДВ по истечении экспозиции необходимо прекратить воздействие ДВ на тест-культуру. Это достигается путем использования следующих методов:

- применения химического нейтрализатора;

- посева в большой объем питательной среды;

- ежедневного пересева на новые питательные среды;

- биологической пробы на животных.

Применение химического нейтрализатора действующего вещества.

Для нейтрализации действующего вещества, которое может быть перенесено с материалом тест-объекта при его посеве в питательную среду, используют нейтрализатор - вещество, которое устраняет (нейтрализует) действие химического агента на микробную клетку, но не убивает и не задерживает рост тест-микроорганизма. Тест-объекты после воздействия химического агента промывают в нейтрализаторе или добавляют его непосредственно в питательную среду (если установлено, что вносимая концентрация нейтрализатора не убивает и не задерживает рост тест-бактерий).

В качестве нейтрализаторов ДВ из различных химических групп применяют для:

- галоидактивных (хлор-, бром- и йодактивные) и кислородактивных (перекись водорода, ее комплексы с солями, надуксусная кислота, озон) - 0,1-1,0% растворы тиосульфата натрия;

- четвертичных аммониевых солей (алкилдиметилбензиламмоний хлорид, дидецилдиметиламмоний хлорид и др.), производные гуанидина (полигексаметиленгуанидин гидрохлорид, хлоргексидин биглюконат и др.) - 0,1-1,0% растворы лаурилсульфата натрия (сульфонол) или растворы лаурилсульфата натрия с 10% обезжиренного молока или универсальный нейтрализатор (см. ниже);

- альдегидов (глутаровый альдегид, глиоксаль, формальдегид, ортофталевый альдегид) - 1,0% раствор пиросульфита (метабисульфита) натрия или универсальный нейтрализатор (см. ниже);

- кислот - щелочи в эквивалентном количестве;

- щелочей - кислоты в эквивалентном количестве;

- спиртов - разведение в воде до не действующей концентрации;

- композиционных средств - универсальный нейтрализатор, содержащий Твин 80 (3%), сапонин (0,3-3%), гистидин (0,1%), цистеин (0,1%). Если в состав композиции входят окислители, в нейтрализатор дополнительно вводят тиосульфат натрия.

Методика контроля полноты нейтрализации действующего вещества с использованием культуры бактерий. В целях сокращения времени на подбор оптимального нейтрализатора, а также объективного подтверждения того, что ДВ, входящие в состав субстанции или ДС, полностью нейтрализованы, используют культуру бактерий, чувствительную к исследуемому ДВ, например, тест-штамм Е.соli (штамм 1257) или S.aureus (штамм 906), выращенные, как описано в п. 5.1.1.

Поэтому каждый случай проведения испытания ДС должен предварительно сопровождаться экспериментальным контролем эффективности нейтрализации остаточного действия ДС на микробную клетку, а также на бактерицидное и бактериостатическое действие используемой концентрации нейтрализатора.

Для контроля эффективности нейтрализатора и полноты нейтрализации ДС используют суспензионный метод, предусматривающий проведение исследования, основные операции которого и их назначение приведены на схеме 5.1 и в таблице 5.2.

Схема 5.1.

Проведение эксперимента по контролю эффективности нейтрализации действия ДС на Е.соli используемым нейтрализатором

Таблца 5.2.

Назначение операций эксперимента по оценке эффективности нейтрализации остаточного действия ДС

N пробы	Назначение операции исследования	Процедура выполнения операции исследования	Ожидаемый результат
1	Контроль губительного действия ДС	к 9 мл суспензии тест-культуры ( КОЕ/мл) на дист. воде + 1 мл раствора ДС	Рост микроорганизмов должен отсутствовать
2	Контроль полноты нейтрализации ДС	к 9 мл суспензии тест-культуры ( КОЕ/мл) на нейтрализаторе + 1 мл раствора ДС	Примерно одинаковое количество колоний в посевах проб (по 0,1 мл) на плотной питательной среде
3	Контроль отсутствия антимикробного эффекта у нейтрализатора	к 9 мл суспензии тест-культуры ( КОЕ/мл) на нейтрализаторе + 1 мл раствора нейтрализатора
4	Референс - контроль количества бактерий (Е.соli)	к 9 мл суспензии тест-культуры ( КОЕ/мл) на д.в. + 1 мл дист. воды
Примечание: спустя 5 минут после постановки опыта, из каждой из четырех проб производят посев смеси по 0,1 мл, как минимум, на 3 пробирки со скошенной питательной средой, которые инкубируют в термостате при 37°С, по истечении 2-3 суток учитывают результаты исследований.

Критерии отбора действующих веществ (субстанций). Критерием отбора действующего вещества в качестве субстанции для создания ДС является наличие у него бактерицидной активности.

Гибель тест-микроорганизмов должна составлять 100% при времени действия (мин) ДС в минимальной концентрации в отношении бактерий (S.aureus, E.coli, S.typhimurium, P. aeruginosa) - не более 30 мин.

5.1.2.4. Методы изучения факторов, влияющих на бактерицидную активность ДС и их субстанций

Исследования включают определение спектра антимикробного действия ДС, а при проведении углубленного изучения - дополнительно - влияние различных факторов (рН, температура, органические вещества) на антимикробную активность растворов ДС. Такая необходимость возникает при изучении ДС, созданных на основе нового, ранее не изученного ДВ.

Изучение спектра антимикробной активности и влияние на активность различных факторов проводят методом батистовых тест-объектов (п. 5.1.2.2), контаминированных тест-микроорганизмами.

Изучение зависимости активности ДС от присутствия органических веществ проводят при добавлении к суспензии микроорганизмов 20% инактивированной лошадиной сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота при контаминации батистовых тест-объектов.

Для инактивации нормальной сыворотки ее прогревают на водяной бане при температуре плюс 56°С в течение 30 мин.

Испытание бактерицидной активности ДС в присутствии органических веществ проводят с теми концентрациями, которые оказались эффективными при обеззараживании тест-объектов, контаминированных тест-микроорганизмами без добавления сыворотки.

Если активность средства при таких условиях эксперимента не снижается, концентрацию сыворотки увеличивают до 40%. При отсутствии снижения активности ДС и при добавлении 40% белка считают, что в присутствии белка активность средства не снижается.

Влияние температуры на активность исследуемого ДС изучают при обеззараживании контаминированных батистовых тест-объектов растворами средств при различных температурах растворов (от минус 30 до плюс 50 С). Для этого колбу с исследуемым раствором ДС помещают в водяную баню или холодильную камеру и устанавливают необходимую температуру. Температуру раствора доводят до желаемого уровня и опускают в него контаминированные тест-микроорганизмами батистовые тест-объекты. Далее порядок проведения опыта такой, как при изучении спектра антимикробного действия субстанций (п. 5.1.2.2). Температуру поддерживают в течение заданной экспозиции. Если эффективная концентрация одинаковая при температуре растворов плюс 18-20°С и других значениях, то считают, что температура не влияет на активность ДС и соответственно, если эффективная концентрация увеличивается или уменьшается, то считают, что с повышением или понижением температуры эффективность ДС снижается или повышается.

Изучение влияния рН среды на активность исследуемого ДС изучают при обеззараживании контаминированных тест-микроорганизмами батистовых тест-объектов в растворах ДС, имеющих различное значение рН (5,6-6,0; 7,0; 8,5-9,0). Готовят ряд разведений исследуемого вещества искусственно подкисляя или подщелачивая растворы. Для подкисления используют децинормальный раствор соляной или другой кислоты, а для подщелачивания - децинормальный раствор щелочи. Порядок проведения опыта такой же, как при оценке спектра антимикробного действия субстанций (п. 5.1.2.2.).

Влияние факторов среды на активность ДС учитывается при разработке оптимальных режимов и применении ДС в практике.

5.1.3. Методы исследования бактерицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания объектов внешней среды, контаминированных тест-микроорганизмами

Цель исследования - разработка режимов применения ДС с учетом условий их дальнейшего применения в практике для обеззараживании изделий медицинского назначения (ИМН), предметов ухода за больными, игрушек, белья, поверхностей, посуды, выделений и пр., в зависимости от вида контаминации, концентрации действующего вещества, времени воздействия, нормы расхода, характера объекта, наличия на нем органического загрязнения и его специфики, температуры, способа и кратности обработки.

5.1.3.1. Исследование бактерицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания ИМН

При выборе ДС для исследований с указанной целью следует учитывать:

- назначение и кратность применения ИМН (многократного или однократного применения);

- наличие у ДС негативных свойств, например, корродирующего или фиксирующего действия и др., ограничивающих возможности его использования или требующих индивидуального методического подхода при исследовании;

- материал (материалы), из которого изготовлено ИМН;

- функциональные особенности изделия и условия его эксплуатации, обуславливающие особенности методики проведения эксперимента и последующих рекомендаций по технологии их обеззараживания.

Исследование эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания ИМН из различных материалов (кроме эндоскопов). В качестве тест-изделий используют стерильные инструменты и ИМН (катетеры, микропипетки, пластмассовые шпатели и др.) из различных материалов (металлов, резин, стекла, пластмасс) или имитирующие их тест-объекты. Перечень инструментов, взятых в эксперимент, должен включать не менее трех инструментов, имеющих замковые части (щипцы, ножницы, корнцанг) и не менее двух, не имеющих замковых частей (пинцеты, шпатели), а также стоматологические, в том числе вращающиеся, инструменты (не менее 4) - бор, бурав корневой, зеркало, диск шлифовальный. В качестве тест-изделий из резин, стекла, пластмасс используют фрагменты изделий (катетеров, микропипеток, шпателей и пр.).

В качестве тест-микроорганизмов используют S.aureus, P.aeruginosa. На поверхность тест-изделия (у замковых ИМН - в область замка, а при наличии каналов и полостей - также в канал изделия) с помощью пипетки наносят по 0,1 мл 1 млрд. суспензии того или иного вида тест-микроорганизмов, содержащей 40% инактивированной лошадиной сыворотки. Тест-изделия подсушивают до полного высыхания. Мелкие тест-изделия погружают в указанную взвесь тест-микроорганизмов на 15 мин, затем их извлекают и подсушивают (до полного высыхания). При испытании ДС, обладающих фиксирующими свойствами, количество добавляемой сыворотки уменьшают до 5%.

Дезинфицирующие растворы готовят на стерильной питьевой воде. После подсушивания контаминированные изделия полностью погружают в раствор испытываемого ДС, заполняя им все каналы и полости изделий, избегая образования воздушных пробок. Инструменты, имеющие замковые части, погружают раскрытыми, предварительно сделав ими в растворе ДС несколько рабочих движений для лучшего проникновения раствора в труднодоступные участки изделий в области замка. Толщина слоя раствора ДС над изделиями должна быть не менее 1 см. Параллельно для контроля изделия погружают в воду.

Через определенное время (от 5 до 120 мин) изделия извлекают из дезинфицирующего раствора и марлевой салфеткой размером 5 х 5 , пропитанной нейтрализатором, с поверхности изделия делают смывы, затем салфетку помещают в пробирку с 10 мл того же нейтрализатора и встряхивают с бусами в течение 5-10 мин. Канал изделия промывают раствором нейтрализатора. Мелкие изделия погружают в раствор нейтрализатора на 5 мин, а затем переносят в пробирки с жидкой питательной средой. Для контроля эффективности обеззараживания смывную жидкость с поверхности изделия и из канала засевают на соответствующие питательные среды. Посевы выдерживают в термостате при температуре и времени, оптимальных для роста использованного тест-микроорганизма.

Кратность постановки эксперимента должна быть достаточной для получения статистически достоверных результатов.

Эффективным считают режим (концентрация-время-температура), обеспечивающий гибель тест-микроорганизма на всех изделиях. При наличии положительных проб эксперимент повторяют, увеличивая концентрацию или время воздействия.

Критерий эффективности обеззараживания - 100% гибель тест-микроорганизма.

Время обеззараживания ИМН, контаминированных S.aureus, P.аeruginosa - не более 60 мин.

Исследование бактерицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания эндоскопов, включая дезинфекцию высокого уровня (ДВУ)

В качестве тест-объектов используют стерильные фрагменты эндоскопа или эндоскоп (гибкий - гастроскоп, жесткий - цистоскоп), а в качестве тест-микроорганизма - S.aureus.

На наружную поверхность тест-объекта наносят по 0,1 мл 1 млрд. суспензии тест-микроорганизма, содержащей 5% сыворотки; через канал эндоскопа с помощью пипетки пропускают не менее 5 мл такой же суспензии. После этого эндоскоп подсушивают в течение 20 мин. Затем контаминированное изделие погружают в раствор ДС, заполняя полости и каналы эндоскопа. Через определенные интервалы времени в течение 5-60 мин изделие извлекают из раствора и делают смыв с наружной поверхности марлевой салфеткой, смоченной в растворе нейтрализатора. Канал изделия промывают нейтрализатором. Смывную жидкость засевают на соответствующие питательные среды.

Критерий эффективности обеззараживания эндоскопов - 100% гибель тест-микроорганизма. Время обеззараживания эндоскопов, контаминированных S.aureus - не более 60 мин.

5.1.3.2. Исследование бактерицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания стоматологических оттисков

ДС, предназначенное для обеззараживания стоматологических оттисков, должно иметь широкий спектр антимикробной активности, не вызывать изменений свойств и размеров оттисков, иметь короткое время дезинфекционной выдержки (не более 30 мин).

При разработке режимов обеззараживания стоматологических оттисков в качестве тест-микроорганизмов используют S.aureus, P.aeruginosa, в качестве тест-объектов - оттиски из альгинатных, силиконовых или других материалов. Для изготовления оттисков слепочную массу, полученную в соответствии с рекомендациями изготовителя, помещают в пластмассовую или металлическую ложку и делают оттиск с пластмассовых зубных протезов с моделированной десной. На оттиски наносят по 0,1 мл 1 мрлд суспензии тест-микроорганизма (с добавлением 40% инактивированной сыворотки), подсушивают их в течение 2-3 мин, затем полностью погружают в раствор ДС. При установленном фиксирующем действии ДС оттиски перед погружением в дезинфицирующий раствор промывают проточной питьевой водой. Параллельно для контроля контаминированные оттиски погружают в воду. Через определенное время (5-30 мин) оттиски извлекают из раствора и марлевой салфеткой, пропитанной нейтрализатором, делают смывы. Салфетки помещают в стерильные пробирки с бусами, содержащие 10 мл нейтрализатора, и встряхивают в течение 10 мин. Затем делают посев смывной жидкости на питательные среды для контроля эффективности обеззараживания. Критерий эффективности обеззараживания - 100%.

5.1.3.3. Исследование бактерицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания предметов ухода за больными, игрушек

В качестве тест-объектов используют предметы ухода за больными (подкладные клеенки, резиновые грелки, судна, термометры, пластмассовые наконечники для клизм и др.), игрушки (пластмассовые, металлические, деревянные, резиновые, кроме мягких) или тест-объекты, их имитирующие. В качестве тест-культур используют S.aureus и E.coli.

Перед контаминацией тест-микроорганизмами тест-объекты подвергают механической очистке - моют водой с мылом и щеткой. Для имитации загрязнения используется 40% инактивированной лошадиной сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота. Для этого перед контаминацией объектов к суспензии тест-микроорганизмов добавляют необходимое количество сыворотки.

После подсушивания контаминированные тест-объекты располагают горизонтально и на них пипеткой наносят взвесь тест-микроорганизмов из расчета 0,5 мл 2 млрд. микробной взвеси на площадь в 100 . Суспензию равномерно распределяют по поверхности тест-объектов стеклянным шпателем, подсушивают (до полного высыхания) при комнатной температуре плюс 18-20°С и относительной влажности воздуха 50-60%, затем обрабатывают дезинфицирующим раствором.

Обработку предметов ухода за больными и игрушек проводят способами протирания, погружения, а для крупных игрушек - способом орошения (капельное).

Норму расхода дезинфицирующего раствора при обеззараживании способами протирания или орошения определяют в зависимости от способа обработки аналогично опытам по обеззараживанию поверхностей (5.1.3.5.). Двукратное протирание или орошение проводят через 5-15 мин после первого.

При обработке способом погружения в дезинфицирующий раствор предметов ухода за больными и мелких игрушек последний должен полностью и с избытком покрывать все объекты. При погружении мелких игрушек необходимо препятствовать их всплытию.

Время обеззараживания объектов определяют в интервале от 15 до 120 мин в зависимости от вида тест-микроорганизма и наличия органического загрязнения.

Контрольные тест-объекты обрабатывают стерильной питьевой водой из того же расчета, что и опытные.

Контроль эффективности обеззараживания контаминированных тест-объектов проводят следующим образом: марлевой салфеткой (размером 5 х 5 ), смоченной в растворе нейтрализатора соответствующего для данного ДС, тщательно протирают тест-объект и погружают ее в 10 мл этого же нейтрализатора, находящегося в пробирках с бусами. Время отмыва марлевой салфетки 10 мин при постоянном встряхивании. Отмывную жидкость сеют на 2-3 чашки по 0,2-0,5 мл в каждую на твердые питательные среды.

Посевы помещают в термостат при температуре плюс 37°С и учитывают результаты через 2 суток.

Критерий эффективности обеззараживания - не менее 100%.

Время обеззараживания (мин) объектов, контаминированных S.aureus, - не более 60 мин.

5.1.3.4. Исследование бактерицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания белья

Эффективность обеззараживания белья ДС определяют с помощью тест-объектов, представляющих собой кусочки ткани из бязи размером 2 х 2 см. В качестве тест-культур используют S.aureus и E.coli.

При разработке режима обеззараживания загрязненного белья к суспензии микроорганизмов перед контаминацией тест-объектов добавляют 40% инактивированной сыворотки (6 мл 2-х млрд. взвеси тест-культуры смешивают с 4 мл инактивированной сыворотки) или 40% фекальной эмульсии (6 мл 2-х млрд. взвеси тест-культуры смешивают с 4 мл фекальной эмульсии). Для приготовления фекальной эмульсии 8 г фекалий растирают в ступке с 20 мл воды. Контаминированные тест-объекты подсушивают в термостате при плюс 37°С в течение 20-25 мин или 1,5-2 часа при комнатной температуре до полного высыхания.

Стерильные тест-объекты пропитывают 2-х млрд. взвесью тест-микроорганизмов из расчета 20 мл на 10 тест-объектов и подсушивают в термостате. Далее контаминированные тест-объекты помещают в стерильные бязевые мешочки размером 5 х 8 см по 2 штуки в каждый.

При разработке режимов обеззараживания белья, не загрязненного выделениями, белье погружают в емкость с дезинфицирующим раствором из расчета 4 л раствора на 1 кг сухого белья. При разработке режимов обеззараживания белья, загрязненного выделениями, его погружают в емкость с дезинфицирующим раствором из расчета 5 л раствора на 1 кг сухого белья. Белье погружают в раствор последовательно, одну вещь за другой, следя за тем, чтобы между вещами не образовывалось воздушных полостей, препятствующих процессу дезинфекции. Мешочки с контаминированными тест-объектами распределяют между слоями белья (сверху, в середине, внизу). Через заданное время воздействия ДС (например, 15, 30, 60 мин) извлекают по 1 мешочку с каждого уровня, стерильным пинцетом вынимают тест-объекты, переносят их в раствор нейтрализатора на 5 мин, затем промывают 5 мин в стерильной питьевой воде, затем помещают в жидкие питательные среды. В контрольных опытах вместо дезинфицирующего раствора используют стерильную питьевую воду.

Критерий эффективности - 100% гибель тест-культуры.

Время обеззараживания (мин) белья без видимых загрязнений, контаминированного S.aureus, E.coli - не более 120 мин.

Время обеззараживания (мин) белья, загрязненного выделениями и контаминированного S.aureus, E.coli - не более 240.

5.1.3.5. Исследование бактерицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания поверхностей

Исследования проводят в зависимости от вида поверхностей, их положения (горизонтальное, вертикальное), способа и кратности обработки.

В качестве тест-поверхностей используют поверхности размером 10 х 10 см из различных материалов: гладкие, шероховатые, впитывающие и не впитывающие (деревянные, оштукатуренные, поверхности, окрашенные масляной, силикатной, водоэмульсионной или клеевой краской; оклеенные обоями, поверхности из линолеумных покрытий, поверхности из окрашенного или неокрашенного металла - нержавеющая хром - никелевая кислотостойкая сталь, пластика, стекла, искусственной или натуральной кожи, поверхности из облицовочной плитки - кафельной и метлахской, фаянса и др.), но не менее 5 видов поверхностей. Набор тест-поверхностей для исследований определяется назначением средства.

В качестве тест-микроорганизмов используют S.aureus, E.coli, S.typhimurium, P.aeruginosa.

При разработке режима обеззараживания технологического оборудования и поверхностей в помещениях в различных отраслях пищевой промышленности в качестве тест-поверхностей используют неокрашенный металл, пластик, облицовочную плитку (кафельная, метлахская, фаянсовая), контаминированные санитарно-показательными и специфическими для предприятий данного вида промышленности микроорганизмами.

Перед контаминацией тест-культурой поверхности подвергают механической очистке - моют водой с мылом и щеткой (за исключением поверхностей, оклеенных обоями и окрашенных клеевой краской). Последние протирают несколько раз стерильной салфеткой, увлажненной стерильной питьевой водой.

Высушенные поверхности располагают горизонтально и на них пипеткой наносят взвесь тест-микроорганизмов из расчета 0,5 мл 2 млрд. микробной взвеси на площадь в 100  и равномерно распределяют ее по поверхности стеклянным шпателем. Поверхности подсушивают (до полного высыхания) при температуре плюс 18-20°С и относительной влажности воздуха 50-60%, затем обрабатывают дезинфицирующим раствором.

При изучении эффективности обеззараживания линолеум, плитку метлахскую, искусственную или натуральную кожу, стекло располагают горизонтально, а дерево, окрашенное масляной, силикатной, водоэмульсионной или клеевой красками, поверхности, оклеенные обоями, пластик, кафельную и фаянсовую плитки - вертикально.

Для имитации загрязнения поверхностей используют белковое или фекальное загрязнение: 40% инактивированной сыворотки, 40% фекальная эмульсия (при разработке режимов обеззараживания унитазов).

Обработку поверхностей проводят способами протирания или орошения (крупнокапельное и аэрозольное).

Для определения нормы расхода при однократной обработке дезинфицирующий раствор наносят с помощью пипетки на поверхность размером 10 х 10см при применении способа протирания в количестве 1,0, 1,5 или 2,0 мл, а при крупнокапельном орошении наносят с помощью дозатора 1,5-3,0 мл. При аэрозольном методе обработки изучают эффективность обеззараживания при норме расхода 30-50-100  (в зависимости от вида аэрозольного генератора и применяемой аэрозольной насадки). Многократное протирание или орошение проводят с интервалом между обработками 5-15-30 мин.

Время обеззараживания поверхностей определяют в интервале от 5 до 120 мин. Выбор экспозиции зависит от назначения и рекомендуемых условий применения ДС.

Контрольные поверхности обрабатывают стерильной питьевой водой также и из того же расчета, что и опытные.

Исследования проводят при температуре плюс 18-20°С. При необходимости оценивают эффективность обеззараживания поверхностей при повышенной до плюс 50°С или пониженной до минус 30°С температуре (исследования проводят в термо- или холодильной камере).

Контроль эффективности обеззараживания тест-поверхностей проводят следующим образом: марлевой салфеткой (размером 5 х 5 ), смоченной в растворе соответствующего для данного дезинфицирующего средства нейтрализатора, тщательно протирают тест-поверхность, затем ее погружают в 10 мл этого же нейтрализатора, находящегося в пробирках с бусами. Время отмыва марлевой салфетки 10 мин при постоянном встряхивании. Отмывную жидкость сеют (на 2-3 чашки по 0,1-0,2 мл в каждую) на твердые дифференциально-диагностические питательные среды.

В зависимости от вида тест-микроорганизма посевы выращивают в термостате при температуре плюс 37°С. Учет результатов проводят в течение 1-2 суток путем подсчета количества выросших колоний, затем рассчитывают плотность контаминации 100  поверхности и % обеззараживания, принимая количество колоний, снятых с контрольных поверхностей, за 100%.

Критерий эффективности обеззараживания поверхностей - не менее 99,99% гибели тест-микроорганизмов; время обеззараживания (мин) при контаминации S.aureus, E.coli, S.typhimurium, P.aeruginosa - не более 120 мин.

5.1.3.6. Исследование бактерицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания посуды

В зависимости от назначения ДС исследования проводят при обеззараживании посуды столовой и кухонной, лабораторной и из-под выделений.

В качестве тест-объектов при разработке режимов обеззараживания столовой и кухонной посуды используют тарелки, стаканы, кружки из различных материалов (фарфор, фаянс, алюминий, стекло, пластик, посуда, покрытая эмалью) и столовые приборы - ножи, вилки, ложки из различных материалов (нержавеющая сталь, алюминий, пластик); лабораторной посуды - предметные и покровные стекла, пипетки, чашки Петри, планшеты для иммунологического анализа и др.; посуды из-под выделений - подкладные судна, мочеприемники, горшки, плевательницы и др. или тест-объекты их имитирующие. В качестве тест-микроорганизмов при контаминации столовой посуды используют S.aureus, E.coli.

Для имитации загрязнения чайной посуды используют кисель (к 10 г киселя добавляют 1 мл 2-х млрд. микробной взвеси), лабораторной посуды - 40% инактивированной сыворотки, а посуды из-под выделений - 40% фекальную эмульсию или мокроту, контаминированные тест-микроорганизмами (на 10 мл - 1 мл  млрд. взвеси).

Перед контаминацией микроорганизмами посуду и столовые приборы подвергают механической очистке - моют водой с мылом и щеткой. Посуду располагают горизонтально и на нее пипеткой наносят взвесь тест-микроорганизмов из расчета 0,5 мл 2 млрд. взвеси на площадь в 100  и равномерно распределяют ее по поверхности посуды стеклянным шпателем. Столовые приборы для контаминации погружают в бактериальную суспензию на 1-2 мин, оставляя незараженными их ручки.

Посуду подсушивают (до полного высыхания) при комнатной температуре плюс 18-20°С и относительной влажности воздуха 50-60%, затем обрабатывают дезинфицирующим раствором.

Для разработки режимов обеззараживания посуды с остатками пищи до ее контаминации микробную взвесь смешивают с овсяной, манной или другой кашей, сваренной на молоке со сливочным маслом (к 10 г каши добавляют 1 мл 2-х млрд. микробной взвеси).

Обработку столовой, чайной, лабораторной посуды и столовых приборов проводят способом погружения в дезинфицирующий раствор. Растворы готовят на питьевой воде. Температура испытуемого раствора плюс 18-20°С. При необходимости изучают эффективность растворов, имеющих температуру плюс 50°С.

Контролем служит аналогично контаминированная посуда, которую погружают в такой же объем стерильной питьевой воды.

Дезинфицирующий раствор должен полностью и с избытком покрыть всю посуду и приборы (из расчета не менее 2 л на 1 комплект).

Через определенные интервалы времени (например, 15, 30, 60 мин и т.д.) извлекают из дезинфицирующего раствора по одному предмету (например, тарелка, стакан, предметное стекло, нож и т.д.) и стерильной марлевой салфеткой (размер 5 х 5 ), смоченной в растворе нейтрализатора, соответствующего данному ДС; тщательно протирают зараженную часть каждого предмета, погружают салфетку в 10 мл этого же нейтрализатора, находящегося в пробирках с бусами. Время отмыва марлевой салфетки 10 мин при постоянном встряхивании. После отмыва марлевую салфетку погружают в соответствующую жидкую питательную среду. Отмывную жидкость сеют на 2-3 чашки по 0,2-0,5 мл в каждую на твердые питательные среды.

Посевы помещают в термостат при температуре плюс 37°С и учитывают через 2 суток.

Время обеззараживания посуды определяют в интервале от 15 до 240 мин в зависимости от вида тест-микроорганизма и наличия загрязнения.

Критерий эффективности обеззараживания - не менее 100%.

Время обеззараживания столовой посуды без остатков пищи, контаминированной: S.aureus, E.coli - не более 60 мин.

Время обеззараживания посуды с остатками пищи, контаминированной S.aureus, E.coli, S.typhimurium, не более 120 мин.

Время обеззараживания лабораторной посуды, контаминированной S.aureus, E.coli, - не более 120 мин.

Время обеззараживания посуды из-под выделений, контаминированной E.coli, S.typhimurium, - не более 120 мин.

5.1.3.7. Исследование бактерицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания выделений

Дезинфицирующие средства, предназначенные для обеззараживания выделений, должны обладать способностью гомогенизировать органический субстрат (фекалии, мокрота). Препараты, не обладающие этим свойством, для обеззараживания выделений не пригодны.

Изучение активности ДС при обработке выделений проводят с учетом их консистенции и соотношения с дезинфицирующим раствором или сухим препаратом.

В качестве тест-микроорганизмов при разработке режимов обеззараживания выделений используют S.aureus, E.coli, S.typhimurium.

Определение эффективности ДС при обработке мочи проводят следующим образом: берут несколько пробирок, наливают в них по 9 мл мочи, прибавляют по 1 мл взвеси тест-микроорганизма, содержащей  КОЕ/мл. Неразведенное ДС или его растворы добавляют к моче в различных соотношениях (равном, двойном и т.д.). По истечении времени воздействия (15, 30, 60, 90, 120 мин) пипеткой берут 1 мл опытной смеси и переносят в нейтрализатор объемом 9 мл, а затем из нее 1 мл смеси в пробирку с 5 мл бульона. После тщательного перемешивания 1мл переносят во вторую пробирку с бульоном, а затем делают посевы по 0,1 мл на твердые питательные среды, как из первой, так и из второй пробирок. Чашки Петри с посевами ставят в термостат.

Контролем служат аналогично поставленные опыты с добавлением к моче не дезинфицирующего раствора, а стерильной водопроводной (питьевой) воды.

Эффективным считают ДС, обеспечивающее 100% гибель тест-микроорганизмов в 6-8 опытах с совпадающими результатами.

Определение эффективности ДС при обработке фекалий: 20 г фекалий растирают в ступке и добавляют 80 мл стерильной питьевой воды. Полученную эмульсию фильтруют через двойной слой марли, разливают в пробирки по 9 мл и добавляют по 1 мл взвеси тест-микроорганизмов, содержащей  КОЕ/мл.

Приготовленную эмульсию фекалий заливают равным или двойным количеством дезинфицирующего раствора или вносят различное количество сухого препарата. После контакта с ДС производят высевы так же, как и при обеззараживании мочи. Результаты учитывают через двое суток.

При положительных результатах проводят опыты с большим количеством оформленных фекалий (200-250 г). Для этого помещают их в сосуд и заливают дезинфицирующим раствором в равном или двойном количестве по отношению к весу фекалий или засыпают сухим препаратом. Затем небольшую часть фекальных масс стеклянной палочкой перемешивают с жидкостью, а остальную массу оставляют в виде небольших комочков. Через определенные промежутки времени (30, 60, 90 и 120 мин) проводят раздельные высевы жидкой части и комочков.

Жидкую часть фекальных масс набирают пипеткой и производят посев так же, как мочи. Плотные части фекалий забирают петлей и опускают в 5 мл питательной среды, растерев их о край пробирки и тщательно перемешав с бульоном; затем переносят из этой пробирки 1 мл смеси во вторую пробирку, также содержащую 5 мл бульона. Как из первой, так и из второй пробирки производят посев по 0,1 мл на чашки Петри с плотной питательной средой.

Контролем служат аналогично поставленные опыты с добавлением к фекальной эмульсии стерильной воды вместо ДС.

Об эффективности исследуемого ДС судят на основании 6-8 опытов с совпадающими результатами. Эффективным считают ДС, обеспечивающее 100% гибель тест-микроорганизмов в обеззараживаемом материале.

При определении эффективности ДС при обработке фекально-мочевой взвеси с целью снижения микробной обсемененности (консервации) в качестве тест-микроорганизма используют культуру E.coli (шт. 1257). Фекально-мочевую взвесь готовят из расчета: 1 часть фекалий и 4 части мочи. В пробирки разливают по 4,5 мл фекально-мочевой взвеси и добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл взвеси тест-культуры, содержащей  КОЕ/мл. Неразведенное ДС или его растворы добавляют к фекально-мочевой взвеси в различных соотношениях. По истечении времени воздействия из каждой пробы отбирают по 0,5 мл жидкости и переносят в пробирки с 4,5 мл казеинового бульона. Это обеспечивает нейтрализацию ДС. После ряда серийных разведений из каждой пробирки производят высев на чашки Петри с питательным агаром (мясо-пептонный, Эндо). Результаты эксперимента учитывают через 48 часов инкубации при плюс 37°С. В контрольных пробах вместо препарата применяют стерильную питьевую воду.

Эффективным считают ДС, обеспечивающее снижение микробной обсемененности фекально-мочевой взвеси не менее чем на 99,9% и не более чем через 120 мин.

Критерий эффективности обеззараживания выделений - 100% гибель тест-микроорганизмов. Время обеззараживания выделений, контаминированных тест-микроорганизмами (S.aureus, E.coli, S.typhimurium) - не более 6 часов.

5.1.3.8. Исследование бактерицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания воздуха

Целью исследования является определение эффективности химических ДС и разработка режимов их применения для обеззараживания воздуха в помещениях.

Химические ДС применяют для обеззараживания воздуха в помещениях в виде аэрозолей или паров растворов ДС, а также газов.

При исследовании эффективности обеззараживания воздуха химическими ДС в качестве тест-микроорганизмов используют S.aureus.

Исследования проводят в испытательных камерах объемом 1-2 . Предварительно внутреннюю поверхность камеры моют раствором моющего средства, остатки которого затем смывают водопроводной водой и включают бактерицидный УФ-облучатель. В центре камеры располагают продезинфицированный вентилятор, производительностью 15-25 , назначение которого - предотвращение быстрого оседания микроорганизмов.

Помещение, в котором находится испытательная камера, должно быть оборудовано УФ-облучателем рециркуляторного типа, который функционирует в течение всего эксперимента. Перед началом работы исследователь надевает халат, резиновые перчатки и маску.

При определении эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания воздуха, используют 2 метода: седиментационный и аспирационный методы.

Седиментационный метод. Для проведения исследований седиментационным методом камера должна иметь окошко с дверцей размером 20 х 20 см для внесения в камеру чашек Петри.

Растопленный агар с добавленным нейтрализатором разливают по чашкам Петри (питательную среду не подсушивают).

До начала распыления суспензии тест-микроорганизма отбирают пробу на контроль обсемененности воздуха в камере, для чего открытую чашку Петри с питательной средой помещают на 30 мин в камеру.

Затем в камере распыляют суспензию тест-микроорганизма в количестве, достаточном для создания в воздухе камеры концентрации микроорганизмов  .

Аэрозоль создают с помощью распыливающей аппаратуры, которая обеспечивает образование в воздухе не менее 80% частиц с дисперсностью  мкм, и включают вентилятор. Для контроля степени контаминации воздуха открытую чашку Петри с питательной средой помещают в камеру на 10 мин.

Затем в камере распыляют раствор исследуемого средства и через определенные промежутки времени проверяют обсемененность воздуха.

Аспирационный метод. Этот метод основан на аспирировании воздуха через жидкость. При использовании аспирационного метода для оценки эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания воздуха, необходимо следующее оборудование:

- воздуходувка с производительностью 15-25 л/мин;

- стерильные склянки Дрекселя с 50 мл стерильной водопроводной воды из расчета 2 шт. на 1 пробу. Предварительно в стерильную воду вносят соответствующий нейтрализатор;

- трубка диаметром 8-10 мм, длиной 50-60 см, которая вводится в камеру для забора проб воздуха в центре камеры;

- стерильные резиновые шланги, соединяющие склянки Дрекселя (последовательно одну за другой) и далее с воздуходувкой.

Подготовка камеры к эксперименту осуществляется, как указано выше. Для исследования отбирается 50 л воздуха (объем пробы).

Очередность отбора проб следующая:

- контроль обсемененности воздуха до начала распыления суспензии тест-микроорганизмов;

- контроль обсемененности воздуха после распыления суспензии тест-микроорганизма;

- контроль эффективности обеззараживания - отбор проб через каждые 5-10 мин в зависимости от предполагаемой эффективности ДС.

После отбора проб жидкость из 2-х склянок Дрекселя смешивают и по 1-2 мл вносят в стерильную чашку Петри; затем заливают растопленным агаром. Посевы помещают в термостат. После инкубации подсчитывают количество выросших колоний и рассчитывают обсемененность 1  воздуха.

Пример:

Х -

10 - количество колоний, выросших на чашке Петри;

0,05 - объем стерильной питьевой воды, л;

1000 = 1  воздуха камеры, л;

50 - объем пробы воздуха, л.

Критерий эффективности обеззараживания воздуха в соответствии с категорией помещения, % (не менее): I - 99,9; II - 99,0; III - 95,0; IV - 90,0; V - 85,0.

5.1.3.9. Исследование эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания питьевой воды и воды плавательных бассейнов

Методы распространяются на испытания химических ДС для обеззараживания индивидуальных и групповых запасов питьевой воды и воды плавательных бассейнов. Обеззараженная питьевая вода должна соответствовать требованиям СанПиН 2.1.4.1175-02 "Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников" [20], ГОСТ 27283-87 [28], а вода плавательных бассейнов - требованиям СанПиН 2.1.2.1188-03 "Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества" [22].

ДС для обеззараживания питьевой воды должны обеспечивать гибель в воде тест-микроорганизмов при их исходной концентрации:

- бактерий, не образующих споры,  КОЕ/л;

- вирусов  УЕ/л;

- бактерий в споровой форме не менее спор/л (при необходимости - в зависимости от назначения средства, см. п. 5.8.).

ДС для обеззараживания воды плавательных бассейнов должны обеспечивать гибель в воде тест-микроорганизмов при исходной концентрации:

- при разработке режимов для постоянного обеззараживания воды в присутствии посетителей:

- бактерий, не образующих споры,  КОЕ/л;

- вирусов УЕ/л.

- при разработке режимов для обеззараживания воды во время продолжительного перерыва в работе бассейна (более 2 ч):

бактерий, не образующих споры,  КОЕ/л;

вирусов УЕ/л;

Тест-микроорганизмы. В качестве тест-микроорганизмов при изучении средств обеззараживания питьевой воды используют культуры E.coli (штамм 1257), (S.typhimurium штамм), РНК-содержащего колифага МS2.

В качестве тест-микроорганизмов при изучении средств обеззараживания воды плавательных бассейнов используют культуры E.coli (штамм 1257), S.aureus (штамм 906) и РНК-содержащего колифага МS2.

Питательные среды, методы культивирования и приготовления для экспериментов тест-культур бактерий, не образующих споры, приведены в п.п. 5.1, 5.3, 5.7.

Колифаг МS2 (штамм ВКПМ-3254) и штамм культуры клеток-хозяина E.coli К12 получают во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ГНИИ "Генетика", адрес: 113545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1.

Исследования проводят в соответствии с Методическими указаниями "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды" МУК 4.2.1018-01, Минздрав России, М., 2001 [81].

Питательные среды и реактивы для колифага МS2 и E.coli К12 :

Сухой питательный бульон

Агар питательный сухой ТУ 42-14-33-75

Стрептомицин стерильный

Хлороформ технический ГОСТ 20015-76

Приготовление питательных сред для колифага МS2 и E.coli К12 . Питательный бульон готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке; питательный бульон (десятикратный) для колифагов - путем увеличения в 10 раз навески сухого препарата, указанной на этикетке; питательный агар - из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке; питательный агар двойной концентрации для определения колифагов прямым методом - путем увеличения навески сухого препарата в 2 раза от прописи.

Питательный агар запрещается выдерживать в расплавленном состоянии более 8 ч. Оставшийся неиспользованным агар повторному расплавлению не подлежит.

Полужидкий питательный агар готовят следующим образом: сухой питательный бульон (15 г) и агар микробиологический (3 г) растворить при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды. Довести рН до 7,0-7,2, разлить в пробирки и стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин.

Питательный агар со стрептомицином готовят из расчета содержания 100 мкг стрептомицина на 1 мл питательного агара, приготовленного по стандартной прописи. Стерильно на стерильной дистиллированной воде готовят раствор стрептомицина в концентрации 10 мг на 1 мл. В готовый питательный агар, отмеренный по объему и остуженный до температуры (45-49)°С, вносят приготовленный стерильный раствор стрептомицина из расчета 0,1 мл на 10 мл питательного агара. Разливают в пробирки для приготовления скошенного агара. Повторное расплавление питательной среды со стрептомицином запрещается.

Ведение культур колифага МS2 и культуры клеток-хозяина E. coli К12 . Процесс ведения культур колифага МS2 и E.coli К12 включает:

- восстановление лиофилизированных культур колифага МS2 и E.coli К12 ;

- создание запасов культур колифага МS2 и E.coli К12 для целевого использования.

Для восстановления лиофилизированной культуры E.coli К12 оттянутый конец ампулы с лиофилизированной культурой нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины. Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70%-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом. После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение 1-2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят ~0,5 мл питательного бульона для регидратации. Содержимое ампулы перемешивают, переносят стерильной пастеровской пипеткой или шприцем в пробирку с питательным бульоном и инкубируют при температуре ()°С в течение 18-24 ч.

После инкубации из питательного бульона делают высев петлей на скошенный питательный агар по ТУ 42-14-33-75, содержащий стрептомицин. Посевы инкубируют при температуре ()°С в течение 18-24 ч.

Культуру на скошенном питательном агаре проверяют на способность лизироваться специфическим колифагом МS2, а также на загрязненность фагом. При удовлетворительных результатах указанных проверок культура считается пригодной для проведения исследований с колифагом МS2.

Для создания запасов рабочей культуры E.coli К12 культуру со скошенного питательного агара со стрептомицином засевают уколом в столбик с полужидким питательным агаром. Посевы инкубируют при температуре ()°С в течение 18-24 ч. При наличии роста пробирки закрывают резиновыми (силиконовыми) пробками и закладывают на хранение при температуре 4-8°С. Восполнение запасов рабочей культуры проводят через 3 месяца [81].

На всех этапах исследования используют бактериальную взвесь культуры E.coli К12 , приготовленную следующим образом. Культуру, выращенную в пробирке со скошенным питательным агаром со стрептомицином, смывают с косяка 5 мл стерильного физиологического раствора и по стандарту мутности готовят взвесь в концентрации бактериальных клеток в 1 мл. Допускается использование 4-часовой бульонной культуры E.coli, полученной путем подращивания в термостате при температуре ()°С. Концентрация бактериальных клеток E.coli содержится в 2 мл.

Для восстановления лиофилизированной культуры колифага МS2 оттянутый конец ампулы с лиофилизированной культурой нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины. Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70%-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом. После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение 1-2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят ~0,5 мл питательного бульона для регидратации.

Для создания запасов культуры колифага МS2 используют рабочую культуру клеток-хозяина E.coli К12 , хранящуюся на полужидком агаре, которую засевают в пробирку с 10 мл питательного бульона. Посевы инкубируют при температуре ()°С в течение 18-24 ч.

После инкубации 0,1 мл полученной бульонной культуры E.coli К12 повторно засевают в 3-4 пробирки с 10 мл питательного бульона и помещают в термостат при температуре ()°С. Через 2 ч инкубации в каждую пробирку вносят регидрированную культуру фага МS2, инкубацию продолжают до 18-24 ч. После инкубации в пробирку добавляют по 1 мл хлороформа, герметично укупоривают, интенсивно встряхивают и помещают в холодильник.

Титр полученной культуры колифага МS2 определяют следующим образом. Готовят 7 - 8 десятикратных разведений культуры колифага МS2. По 1 мл из каждого разведения вносят в чашки Петри и заливают смесью питательного агара и взвеси культуры E.coli К12 из расчета 1 мл взвеси на 100 мл агара. Посевы инкубируют при температуре ()°С. Пробирки с разведениями закупоривают резиновыми (силиконовыми) пробками и хранят до получения результатов при температуре ()°С для получения рабочих суспензий фага.

Через 18-24 ч инкубации подсчитывают число бляшек на чашках. Учету подлежат чашки, на которых отмечается рост 30-100 негативных колоний фага. Для использования допускается культура с титром не менее .

При получении титра менее фаг можно размножить. Для этого необходимо повторить описанную процедуру.

Методика постановки экспериментов. В качестве исходной воды используют водопроводную или природную воду (колодезную, речную), показатели качества которой соответствуют назначению испытываемого дезинфицирующего средства. Водопроводную воду перед использованием дехлорируют нагреванием при температуре 50-60°С с последующим выдерживанием в течение одних суток. В образцах природной воды определяют общее микробное число и общие колиформные бактерии.

Исходную воду наливают в емкости с нижним тубусом объемом 5-10 л и контаминируют культурами тест-микроорганизмов.

После внесения расчетной дозы микроорганизмов воду тщательно перемешивают и отбирают пробы для определения концентрации исходного заражения воды микроорганизмами.

Концентрацию исходного заражения воды бактериями определяют следующим образом. Из емкости отбирают 1-3 пробы воды (в зависимости от объема емкости) по 3-5 мл. Из каждой пробы делают по 3-4 последовательных десятикратных разведения в стерильном физиологическом растворе или стерильной водопроводной воде, в которых затем определяют число бактерий в 1 мл пробы воды методом мембранной фильтрации.

Сущность метода заключается в концентрировании микроорганизмов из определенного объема анализируемой воды путем фильтрования через мембранные фильтры, выращивании посевов при температуре ()°С на плотной питательной среде и в подсчете количества бактерий в единице объема воды. Используют мембранные фильтры для микробиологических целей с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм или другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации, имеющие сертификат качества. Мембранные фильтры готовят к анализу в соответствии с указаниями производителя.

Фильтрование воды проводят с помощью прибора для мембранной фильтрации под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм с устройством для создания разрежения (0,5-1,0) атм. воронку и столик прибора перед анализом воды стерилизуют в паровом или воздушном стерилизаторе. На нижнюю часть прибора (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр; прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой); закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора, наливают при соблюдении правил стерильности необходимый объем воды и создают вакуум в приемном сосуде. Фильтруют сначала меньшие, затем большие объемы воды через один фильтровальный прибор, сменяя каждый раз фильтры. После окончания фильтрования стакан (воронку) снимают, фильтр осторожно приподнимают за край фламбированным пинцетом при сохранении вакуума для удаления излишней влаги на нижней стороне фильтра, а затем переносят его, не переворачивая, на плотную питательную среду в чашку Петри так, чтобы между средой и фильтром не было пузырьков воздуха.

При определении числа бактерий E.coli используют питательный агар Эндо, S.aureus, S.Typhimurium - казеиновый или мясо-пептонный агар. Под каждым фильтром на обратной стороне дна чашки Петри делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, даты посева и номера пробы. Посевы с E.coli, S.aureus, S.Typhimurium инкубируют при температуре ()°С в течение 24-48 ч. По окончании инкубации учитывают количество выросших на фильтрах колоний и определяют концентрацию тест-микроорганизмов в 1 л воды по формуле:

,

где С - количество тест-микроорганизмов, содержащихся в 1 л воды;

К - кратность разведения;

V - посеянный объем в мл;

N - среднее арифметическое числа колоний, выросших на мембранных фильтрах при высевах одинаковых разведений.

Результат анализа при определении числа бактерий выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 л воды.

Концентрацию исходного заражения воды колифагом МS2 определяют следующим образом. При исходной концентрации колифага на уровне  БОЕ/л из емкости отбирают пробу воды объемом 5-10 мл. Готовят 3-4 последовательных десятикратных разведения в стерильном физиологическом растворе или стерильной водопроводной воде. По 1 мл из каждого разведения вносят в чашки Петри и заливают смесью питательного агара и взвеси культуры E.coli К12 из расчета 1 мл взвеси на 100 мл агара. Посевы инкубируют при температуре ()°С. Через 18-24 ч инкубации подсчитывают количество бляшек на чашках. Учету подлежат чашки, на которых отмечается рост 30-100 негативных колоний фага. Подсчитывают число негативных колоний на 2-3 чашках с наиболее характерным и четким ростом. По этим данным определяют среднее число колоний, которое умножают на величину наибольшего разведения.

При исходной концентрации колифага на уровне  БОЕ/л из емкости отбирают пробу воды объемом 150-200 мл. Готовят десятикратное разведение в стерильном физиологическом растворе или стерильной водопроводной воде. Колифаг определяют в 1 мл из десятикратного разведения, а также в 1, 10 и 100 мл исходной зараженной воды.

Посев 1 мл из десятикратного разведения, а также 1 мл исходной воды осуществляют как при исходном заражении воды на уровне  БОЕ/л.

Посев 10 мл исходной воды осуществляют следующим образом. 10 мл исходной воды вносят в питательный агар двойной концентрации, расплавленный и остуженный до 45-49°С, добавляют смыв E.coli К12 из расчета 2 мл смыва (или 4 мл 4-часовой бульонной культуры) на каждые 100 мл агара, перемешивают. Чашки с посевами оставляют при комнатной температуре до застывания. Чашки с застывшим агаром помещают дном вверх в термостат и инкубируют при температуре ()°С в течение  ч.

Посев 100 мл исходной воды осуществляют следующим образом. В питательный агар двойной концентрации, расплавленный и остуженный до 45-49°С, добавляют смыв E.coli К12 из расчета 2 мл смыва (или 4 мл 4-часовой бульонной культуры) на каждые 100 мл агара, перемешивают. Исследуемые 100 мл воды разливают по 20 мл в большие пробирки, нагревают до 35-44°С и немедленно (не более чем через 5 мин по достижении требуемой температуры) разливают в 5 чашек Петри и сразу же вносят в каждую чашку по 20 мл смеси агара с культурой E.coli К12 , осторожно перемешивают.

Для контроля культуры E.coli К12 в одну чашку Петри вносят 20 мл стерильной водопроводной воды, предварительно прогретой до 35-44°С, заливают 20 мл приготовленного агар с E.coli К12 и осторожно перемешивают.

Чашки с посевами оставляют при комнатной температуре до застывания. Затем чашки с застывшим агаром помещают дном вверх в термостат и инкубируют при температуре ()°С в течение  ч. Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл пробы воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.

По результатам определения числа частиц колифага в 1, 10 и 100 мл исходной воды рассчитывают исходное заражение воды колифагом и выражают его в БОЕ/л.

Для обеззараживания воды ДС вносят в емкость с зараженной водой в необходимых концентрациях и тщательно перемешивают. Через заданные промежутки времени при соблюдении условий стерильности отбирают пробы воды объемом 1 л в стерильные флаконы с внесенным в них нейтрализатором, подобранным в соответствии с рецептурой дезинфицирующего средства, и определяют микробиологические показатели обеззараженной воды. Пробы воды должны быть исследованы не позднее чем через 1 ч после их отбора. При условии хранения проб в холодильнике при температуре 1-5°С допускается проводить анализ не позже чем через 6 ч после отбора проб.

Число бактерий культур S.aureus, E.coli, S.typhimurium в обеззараженной воде определяют методом мембранной фильтрации.

На начальных этапах обеззараживания воды анализируют не менее двух проб воды, отличающихся по объему в 10 раз и выбранных таким образом, чтобы на одном из фильтров выросло не более 300 колоний. На одну чашку можно поместить 3-4 фильтра с условием, чтобы фильтры не касались друг друга.

При анализе воды на конечных этапах обеззараживания исследуют объем не менее 1 л, профильтровывая это количество не менее чем через 3-4 фильтра.

Посевы инкубируют как указано в п. 5.2. Учитывают количество выросших колоний на фильтрах, результат анализа выражают числом бактерий в 1 л воды.

Идентификация общих и термотолерантных колиформных бактерий. К общим колиформным бактериям (ОКБ) относятся грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре ()°С в течение 24-48 ч.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре ()°С в течение 24 ч.

При отсутствии роста на фильтрах или при наличии только пленчатых, губчатых, плесневых, прозрачных и расплывчатых колоний через 18-24 ч. дают отрицательный ответ.

При росте на фильтрах колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском и без него, красных, розовых слизистых, розовых с темным центром, бесцветных, с отпечатком на обратной стороне фильтра), выполняют оксидазный тест, для чего мембранный фильтр колониями вверх переносят на кружок фильтровальной бумаги, смоченный реактивом для определения оксидазной активности.

Учитывая бактерицидность реактивов для определения оксидазной активности, мембранный фильтр сразу после проявления реакции следует перенести обратно на среду Эндо.

Наличие активной оксидазы (изменение цвета колоний на сине-фиолетовый) у всех колоний, за исключением нехарактерных для ОКБ и ТКБ, позволяет дать отрицательный ответ и закончить анализ через 18-24 ч.

Если выросли колонии, не обладающие оксидазной активностью, то из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Отсутствие в мазках грамотрицательных, не образующих спор палочек, позволяет дать отрицательный ответ и закончить анализ через 18-24 ч.

Красные и темно-красные колонии с металлическим блеском и без него (лактозоположительные), образованные грамотрицательными палочками, не обладающими оксидазной активностью, подсчитывают и относят к общим и термотолерантным колиформным бактериям.

Результат анализа выражают числом бактерий в 1 л воды.

Определение числа частиц колифага МS2 в обработанной воде в пробах объемом 1 л проводят методом обогащения (Корнилова Н.М., 1988 г.). Для этого пробу обеззараженной воды объемом 1 л разливают в стерильные флаконы по 500, 200, 100, 50 и 20 мл, добавляют 10% десятикратного питательного бульона для колифагов и суспензию суточной культуры E.coli К12 . После инкубирования при температуре ()°С в течение 18-24 ч жидкость разливают в пробирки, встряхивают с хлороформом для устранения бактериальной флоры и определяют число частиц колифага МS2. Для этого по 1 мл из каждой пробирки вносят в чашки Петри и заливают смесью питательно агара и взвеси культуры E.coli К12 из расчета 1 мл взвеси на 100 мл агара. Посевы инкубируют при температуре ()°С. Через 18-24 ч инкубации подсчитывают число бляшек на чашках. В зависимости от того, в каком из объемов выявлен рост колифага, вычисляют наиболее вероятное число фаговых частиц в 1 л воды, пользуясь табл. 5.3.

Таблица 5.3.

Расчет числа фаговых частиц при определении титра фага в 1 л воды методом обогащения

Присутствие фага после инкубации в пробах воды объемом (мл)					Число БОЕ в 1 л воды
500	200	100	50	20
-	-	-	-	-	0
+	-	-	-	-	2
+	+	-	-	-	5
+	+	+	-	-	10
+	+	+	+	-	20
+	+	+	+	+	>=50

Обработка и оценка результатов микробиологических исследований. Статистическая обработка результатов микробиологических анализов по оценке эффективности способов и средств обеззараживания воды имеет целью исключить случайные ошибки, оценить отклонение результатов анализов от действительной величины и дать искомые результаты с заданной вероятностью.

Случайные ошибки бактериологических анализов, как правило, распределены по нормальному закону, поэтому в процессе статистической обработки результатов экспериментальных исследований рекомендуется использовать при определении концентрации заражения исходной воды и на промежуточных этапах обработки - среднюю арифметическую (x), а при оценке эффективности обеззараживания воды на завершающем этапе - медианное значение (Ме).

Количество проб n, необходимых для действительной оценки результатов микробиологических исследований, определяют по формуле:

,

где - квадратичное отклонение;

- максимальное допустимое отклонение от средней, оцениваемое с вероятностью p=0,99;

- коэффициент, зависящий от числа опытов (не менее 10), по которым определялась величина .

Если определяется по данным 16 опытов, то .

Число проб для оценки содержания микроорганизмов в обеззараженной воде должно быть не менее 16.

Оценку результатов бактериологических анализов проводят для заданной вероятности 0,99, соответственно для того же значения определяют доверительный интервал средней арифметической и медианы.

Доверительный интервал средней арифметической определяют по данным величины квадратичного отклонения и средней ошибки .

Величину квадратичного отклонения вычисляют по формуле:

,

где - сумма квадратов отклонений результатов отдельных измерений от средней арифметической, а n - число отдельных измерений.

Среднюю ошибку вычисляют по формуле

Вероятности 0,99 отвечает доверительный интервал I, вычисляемый по формуле

Доверительный интервал медианы (медианного значения) для требуемого уровня вероятности 0,99 определяют в зависимости от числа проведенных опытов по табл. 5.4., в которой указаны номера опытов, результаты которых учитывают в качестве граничных значений доверительного результата медианы.

Таблица 5.4.

Граничные значения доверительного интервала медианы

Число опытов	Нижняя граница	Верхняя граница	Число опытов	Нижняя граница	Верхняя граница
7	-	-	27	7	21
8	1	8	28	7	22
9	1	9	29	8	22
10	1	10	30	8	23
11	1	11	31	8	24
12	2	11	32	9	24
13	2	12	33	9	25
14	2	13	34	10	25
15	3	13	35	10	26
16	3	14	36	10	27
17	3	15	37	11	27
18	4	15	38	11	28
19	4	16	39	12	28
20	4	17	40	12	29
21	5	17	41	12	30
22	5	18	42	13	30
23	5	19	43	13	31
24	6	19	44	14	31
25	6	20	45	14	32
26	7	20	46	14	33
			47	15	33
			48	15	34
			49	16	34
			50	16	35

Для пользования табл. 5.4. необходимо, чтобы результаты опытов были расположены и пронумерованы в порядке возрастания их величин.

Показателем эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания воды, является 100% снижение обсемененности воды, контаминированной тест-микроорганизмами, т.е. отсутствие тест-микроорганизмов в 1 л обеззараженной воды.

Библиографические данные

1. Методические указания "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды" МУК 4.2.1018-01, Минздрав России, М., 2001.

2. Корнилова Н.М. Разработка таблицы НВЧ для определения индекса колифага в чистых водах методом обогащения. В кн.: Гигиенические аспекты изучения биологического загрязнения объектов окружающей среды. Материалы Х Всесоюзной конференции. М., 1988, с. 88-90.

5.2 Методы изучения и оценки туберкулоцидной активности дезинфицирующих средств

5.2.1 Общие положения

Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в мире в настоящее время остается напряженной, кроме того, она усугубляется появлением и распространением суперустойчивых к химическим противотуберкулезным веществам форм возбудителя. Такие микобактерии зачастую характеризуются более высокой сохраняемостью во внешней среде, что приводит к возникновению внутрибольничных вспышек нозокомиального туберкулеза. Кроме того, все чаще стали регистрироваться случаи заболеваний, вызванных нетуберкулезными видами микобактерий (НТМБ), которые обладают естественной резистентностью к воздействию негативных факторов окружающей среды. НТМБ являются возбудителями микобактериозов человека и наиболее опасны для больных с иммунодефицитными состояниями, т.к. существенно сокращают сроки их жизни.

В такой неблагоприятной эпидемической ситуации по туберкулезу и микобактериозам возрастает роль неспецифических противоэпидемических мероприятий, среди которых ведущую роль занимает химическая дезинфекция, направленная на уничтожение возбудителей на объектах внешней среды, имеющих значение в передаче инфекции.

Как известно, успех проведения химической дезинфекции напрямую зависит от соблюдения рекомендаций Инструкций по применению дезинфицирующих средств, правильного выбора эффективного режима (концентрация, экспозиция, способ обработки). Помимо этого дезинфекционные мероприятия будут эффективны лишь в том случае, когда режимы дезинфекции отработаны на адекватном по устойчивости реальным возбудителям тест-микроорганизме.

В нашей стране для разработки туберкулоцидных режимов применения ДС используют сапрофитный штамм [23, 66], который изначально был предложен как тест-микроорганизм для оценки качества проведения камерной дезинфекции в очагах туберкулеза, поскольку обладал естественной резинстентностью к температурному фактору. Более того, результаты исследований по сравнительной оценке устойчивости микобактерий к химическим веществам, проведенные в 50-60 гг прошлого столетия, свидетельствуют о меньшей устойчивости по сравнению с вирулентными штаммами микобактерий. Обоснованных экспериментальных данных по выбору для оценки туберкулоцидной активности химических средств дезинфекции в открытой литературе не найдено.

За рубежом для разработки туберкулоцидных режимов применения ДС используют такие штаммы как M.Terrae и M.avium [3]. Насколько чувствительность к ДС всех перечисленных тест-микобактерий адекватна реальным возбудителям туберкулеза и микобактериозов сказать трудно, поскольку такие сведения в литературе отсутствуют.

В связи с вышесказанным, представлялось актуальной задачей для дезинфектологии и фтизиатрической практики проведение экспериментов по сравнительной оценке чувствительности тест-микобактерий к воздействию ДС разных химических групп.

Исследования, проведенные в НИИД и на базе лаборатории микробиологии и ПЦР диагностики Уральского НИИ фтизиопульмонологии, г. Екатеринбург, показали, что является самым чувствительным видом микобактерий к воздействию большинства ДС. Наиболее устойчивыми оказались M.Terrae, M.Avium-intracellulara и M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.

Тест-микроорганизм M.Terrae является наиболее подходящей моделью для изучения и оценки туберкулоцидной активности ДС, поскольку в наибольшей степени соответствует устойчивости патогенных микобактерий.

На основании этих данных, а также учитывая, что сапрофитные микроорганизмы более удобны и безопасны в работе, чем патогенные виды микобактерий, наиболее адекватной моделью для тестирования химических ДС является M. Terrae. При оценке туберкулоцидной эффективности физических (температурных) методов дезинфекции в качестве тест-микроорганизмов рекомендуется использовать .

Данные методические указания регламентируют методы и технологию изучения, а также оценки туберкулоцидной активности субстанций для производства ДС, туберкулоцидной активности и эффективности химических, физических и комбинированных ДС при обеззараживании различных объектов, контаминированных наиболее устойчивым видом микобактерий с учетом максимально возможного уровня контаминации объектов возбудителем туберкулеза в практических условиях.

Исследования туберкулоцидной активности субстанций, ДС и эффективности режимов применения ДС включают:

- выбор и подготовку культур тест-микроорганизмов для изучения туберкулоцидной активности ДС и субстанций;

- обеспечение стандартности условий проведения исследований туберкулоцидной активности ДС и субстанций;

- методы исследований и оценки результатов туберкулоцидной активности ДС и субстанций in vitro (суспензионный метод, метод батистовых (бязевых) тест-объектов);

- методы исследований туберкулоцидной эффективности ДС с использованием искусственно контаминированных тест-микобактериями различных тест - объектов с целью разработки режимов обеззараживания тех или иных объектов в отношении возбудителя туберкулеза (поверхностей в помещениях, транспорта, санитарно-технического оборудования, мебели, посуды, белья, одежды, предметов ухода за больными, медицинских приборов, инструментов и других изделий медицинского назначения и т.д.);

- методы исследований туберкулоцидной эффективности ДС в практических условиях.

5.2.1.1 Тест-микроорганизмы для изучения туберкулоцидной активности дезинфицирующих средств и их субстанций. Требования к тест-микроорганизмам

К применению в отечественной медицинской практике для дезинфекции при туберкулезе предлагаются различные ДС как отечественного, так и зарубежного производства, имеющие туберкулоцидные режимы, разработанные с использованием наиболее устойчивых тест-микроорганизмов, что должно гарантировать их эффективность в отношении возбудителя.

Исследование и оценку туберкулоцидной и микобактерицидной (в отношении непатогенных микобактерий) активности ДС, предлагаемых для применения на территории России, проводят, используя в качестве тест-микроорганизмов:

- агаровую культуру для оценки эффективности и разработки туберкулоцидных режимов камерного обеззараживания различных объектов;

- агаровую культуру Mycobacterium terrae (DSM 43227) для оценки активности ДС и разработки режимов их применения при обеззараживании объектов в отношении возбудителя туберкулеза и микобактериозов;

- агаровую культуру Mycobacterium tuberculosis для подтверждения эффективности разработанных режимов применения ДС в отношении возбудителей туберкулеза и микобактериозов в практических условиях.

Требования к тест-микроорганизмам

Тест-микобактерии должны иметь типичные морфологические, культуральные, биохимические, тинкториальные и ферментативные свойства, присущие данному штамму (см. Приложение 1), и обладать стандартной устойчивостью к эталонным ДС и температуре. Культура должна быть устойчива к температуре 60°С в течение 60 мин. Показатели устойчивости, которым должна соответствовать культура Mycobacterium terrae приведены в таблице 5.5.

Таблица 5.5.

Устойчивость Mycobacterium terrae к эталонным ДС

ДС	Концентрация раствора, %	Время гибели Mycobacterium terrae, мин
Хлорамин Б (28,0% по активному хлору)	5,0*	120
Глутаровый альдегид	0,5	60
Перекись водорода	4,0	60

Примечание: * указана концентрация по препарату

Тест-микобактерии М.terrae могут быть приобретены в виде сухой культуры в ампулах (после лиофильной сушки) в Немецком музее микроорганизмов и клеточных культур (Deutcshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) под N DSM 43227. Тест-микобактерии штамма могут быть приобретены в коллекции музея микроорганизмов ФГУН Научно-исследовательского института дезинфектологии (ФГУН НИИД) Роспотребнадзора.

Получение и хранение исходной рабочей культуры тест-микобактерий

Для выращивания культур тест-микобактерий используют плотные питательные среды. Перечень и методика приготовления питательных сред для культивирования тест-микобактерий, предназначенных для изучения и оценки туберкулоцидной активности ДС и их субстанций, приведены в Приложении 2. В отличие от питательных сред, рекомендуемых в стандарте NEN-EN 14476 [48], использование приведенных в приложении питательных сред позволяет получать результат оценки туберкулоцидной активности ДС не на 21 сутки, а на 10-14 сутки.

Для получения культуры штамма тест-микобактерий ампулу с лиофилизированной музейной культурой этого штамма вскрывают в асептических условиях следующим образом: ватным тампоном, смоченным 70% этиловым спиртом, обрабатывают поверхность ампулы, затем нагревают ее запаянный конец в пламени горелки до образования на ампуле трещины. К накаленному концу ампулы прикладывают ватную пробку, смоченную стерильной водой. После этого ударом металлическим инструментом (скальпель, пинцет) по трещине откалывают конец ампулы. Стерильной пастеровской пипеткой в ампулу вливают 1,0 мл стерильной дистиллированной воды и оставляют в течение 30 мин при комнатной температуре для растворения лиофилизата и получения суспензии. Суспензию, приготовленную из музейной тест-культуры, рассевают по 0,1 мл в пробирки со скошенной питательной средой Левенштейна-Йенсена или "Новая" (всего 10 пробирок). Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 14-21 суток.

С выросшими культурами М.terrae на питательных средах далее работают следующим образом:

- полученную биомассу снимают платиновой лопаточкой или стеклянной палочкой с поверхности питательной среды Левенштейна-Йенсена или "Новая" со всех пробирок;

- помещают в пробирку с 10 мл бульона Миддлбрука 7Н9 с 10% ADC ростовой добавкой и гомогенизируют;

- доводят объем полученной суспензии до 100 мл бульоном Миддлбрука 7Н9 и по 0,5 мл суспензии вносят в микропробирки;

- подписывают на каждой пробирке наименование штамма и дату;

- замораживают при минус 70°С и оставляют в таком состоянии для длительного хранения.

Это самый эффективный способ длительного (десятилетиями) хранения культур с обеспечением сохранения биологических свойств тест-микобактерий. При отсутствии такой возможности, суспензию в микропробирках замораживают в бытовом холодильнике при минус 20°С. Срок хранения культуры в таких условиях - не более 5 лет.

Данная методика получения и хранения исходной рабочей культуры тест-микобактерий позволяет длительный период времени проводить испытания ДС с максимальным обеспечением стандартности свойств тест-микобактерий, в том числе по устойчивости к различным факторам, поскольку исключает необходимость многократного пересева, приводящего, как известно, к изменению биологических свойств микроорганизмов.

Полученная и хранящаяся таким образом культура тест-микобактерий используется для получения агаровой культуры тест-микобактерий (первый пассаж) и приготовления из нее рабочей суспензии тест - микобактерий, используемой для проведения испытаний ДС.

5.2.1.2. Методика приготовления суспензии тест-микроорганизмов. Определение биологической концентрации тест-микроорганизмов в суспензии

Для получения первого пассажа культуры тест-штамма микобактерий, используемой при оценке ДС, необходимое для исследования количество хранящихся при температуре минус 70°С или минус 20°С микропробирок (2 штуки на 1 исследование) с данным штаммом микобактерий размораживают при комнатной температуре, переносят по 0,1 мл содержимого в пробирки со скошенной питательной средой Левенштейна-Йенсена или "Новая" и инкубируют в термостате при 37°С в течение 14-21 суток. Выросшую на плотной питательной среде в пробирках культуру используют для приготовления рабочей суспензии тест-микобактерий данного штамма.

Одна или несколько пробирок может быть использована для получения второго пассажа культуры тест-микобактерий этого штамма. Для этого культуру первого пассажа в пробирке снимают платиновой лопаточкой или стеклянной палочкой с плотной питательной среды, помещают в толстостенную стеклянную пробирку и тщательно растирают, постепенно добавляя по каплям стерильную дистиллированную воду. Полученную суспензию рассевают на плотную питательную среду тем же способом, который использовался для получения первого пассажа.

Культуры тест-микроорганизмов подвергают контролю их качества. В частности, непосредственно перед использованием культур для исследовательских целей необходимо убедиться в том, что тест-штаммы, выросшие на питательной среде, не загрязнены посторонней микрофлорой. Для оценки роста культур микобактерий тест-штаммов визуально просматривают каждую пробирку и учитывают характер и массивность роста, изменение цвета питательной среды. Проводят микроскопию мазка выросших культур методом окраски по Циль-Нильсену (M.terrae представляют собой короткие прямые палочки малиново-красного цвета, располагающиеся в мазке параллельно друг другу, наподобие частокола. Размер клеток микобактерий 0,2-0,6 х 1-10 мкм).

Рабочую суспензию культуры тест-микобактерий готовят из тест-штамма первого и/или второго пассажей, выросших на плотной питательной среде. Дальнейшее субкультивирование недопустимо!

Для приготовления рабочей суспензии культуру микобактерий снимают платиновой лопаточкой или стеклянной палочкой с плотной питательной среды и помещают в толстостенную стеклянную пробирку. Микробную биомассу тщательно гомогенизируют, постепенно добавляя по каплям стерильную дистиллированную воду. Густую исходную бактериальную суспензию оставляют на 15 минут для осаждения негомогенизированных конгломератов и частиц. Полученную надосадочную жидкость отбирают пастеровской пипеткой, переносят в стерильную пробирку, диаметр которой соответствует диаметру пробирки с оптическим стандартом мутности (ФГУН Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора) и стандартизуют по оптическому стандарту мутности N 10 (он соответствует микробных тел в 1 мл), добавляя стерильную дистиллированную воду.

Суспензия, содержащая такое количество живых микробов, при контаминации ею бязевых (батистовых) тест-объектов, тест-поверхностей и др. обеспечивает требуемые (порядка  ) уровни их обсеменения живыми клетками тест-микроба.

Однако в связи с тем, что микобактерии могут отмирать в результате хранения или по иным причинам, а мертвые микроорганизмы, присутствующие в суспензии, будут, как и живые, давать помутнение суспензии, необходимо осуществлять бактериологический контроль фактического количества живых клеток в приготовленной суспензии, чтобы, при необходимости, внести коррективы и обеспечить требуемые уровни контаминации тест-объектов жизнеспособными микобактериями.

Определение биологической концентрации тест-микроба в рабочей суспензии

Из суспензии, приготовленной по оптическому стандарту мутности N 10 ( КОЕ/мл), делают, как показано на схеме 5.2., разведения с 10-кратным шагом до микробных клеток в 1 мл (посев 0,1 мл суспензии из этого разведения на плотную питательную среду позволяет произвести достаточно точный подсчет выросших на среде колоний микобактерий, количество которых будет находиться в пределах 100 единиц).

Схема 5.2.

Проведение эксперимента по контролю количества живых микобактерий в рабочей суспензии тест-микобактерий, используемой для оценки туберкулоцидной активности ДС

Первое разведение соответствует  КОЕ/мл, а шестое -  КОЕ/мл. Из этого разведения производят посев по 0,1 мл на 5 пробирок со средой Левенштейна-Йенсена или "Новая", инкубируют в термостате при 37°С в течение 14-21 суток. Подсчитывают количество выросших колоний на среде в пробирке, рассчитывают среднее значение из 5 и делают пересчет количества жизнеспособных клеток в исходной суспензии, учитывая коэффициент разведения. Количество жизнеспособных клеток в рабочей суспензии должно быть  КОЕ/мл.

Посев суспензии в пробирки со скошенной плотной питательной средой позволяет существенно экономить расход среды и избежать пересыхания и растрескивания среды, наблюдаемого при использовании чашек Петри с плотной питательной средой.

Расчет количества жизнеспособных бактериальных клеток в приготовленной исходной суспензии осуществляют по следующей формуле:

, где

Х - количество жизнеспособных бактериальных клеток в 1 мл приготовленной суспензии;

А - среднее количество колонии образующих единиц (КОЕ), выросших на 5 чашках Петри;

- коэффициент пересчета, учитывающий степень разведения суспензии () и объем, использованный для посева (0,1 мл).

Например: получен рост микобактерий в первой пробе - 70 КОЕ, во 2-ой - 130 КОЕ, в 3-ей - 99 КОЕ, в 4-ой - 115 КОЕ, в 5-ой - 97 КОЕ, тогда среднее количество колонии образующих единиц (КОЕ), выросших на 5 пробирках будет равно: А=(70+130+99+115+97):5=102

микробных тел в 1 мл, что соответствует оптическому стандарту мутности N 10 (1 млрд. микробных тел () в 1 мл.

5.2.1.3. Определение устойчивости тест-микроорганизмов к эталонным ДС

Определение устойчивости тест-микобактерий к воздействию температуры.

В стерильный стеклянный стакан объемом 100 мл наливают 50 мл стерильной дистиллированной воды и помещают в водяную баню. Рядом с ним в водяной бане помещают стеклянный стакан объемом 100 мл с 50 мл дистиллированной воды и с помещенным в нее термометром, позволяющим измерять температуру до 100°С. Включают водяную баню, доводят температуру воды в стакане до 60°С и поддерживают эту температуру на протяжении всего эксперимента.

В стерильные пробирки разливают по 5 мл стерильной дистиллированной воды комнатной температуры (количество пробирок соответствует количеству отбираемых в опыте проб). Исходя из количества проб, готовят пробирки со скошенной плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена или "Новая". Готовят и контаминируют тест-микроорганизмами батистовые тест-объекты (п. 5.1.2.2.). Если в опытах используют ранее приготовленные и хранящиеся в холодильнике контаминированные микобактериями тест-объекты, то их заранее извлекают из холодильника, чтобы они приобрели комнатную температуру (18-20°С).

Отсчитывают в чашке Петри необходимое для опыта количество батистовых тест-объектов (по 2 на каждую экспозицию), контаминированных тест-микобактериями, захватывают тест-объекты стерильным пинцетом все сразу и опускают их в стакан со стерильной дистиллированной водой, нагретой в водяной бане до 60°С. Легким покачиванием емкости добиваются полного смачивания тест-объектов. В момент смачивания всех тест-объектов отмечают время.

Через каждые 15 минут стерильным пинцетом извлекают по 2 тест-объекта и опускают их в пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды при температуре °С для нейтрализации действия температурного фактора. Через 5 минут каждый тест-объект помещают на поверхность скошенной в пробирке плотной питательной среды.

Для контроля два контаминированных тест-микобактерией тест-объекта погружают в стерильную дистиллированную воду при температуре °С на максимальный срок экспозиции, затем (как и опытные тест-объекты) их помещают на поверхность скошенной в пробирке плотной питательной среды.

Посевы опытные и контрольные ставят в термостат при температуре 37°С; наличие роста тест-культур проверяют через 10-14 суток.

Опыт повторяют не менее 3 раз. Тест-микобактерии должны быть устойчивы к нагреванию при 60°С не менее 1 часа.

Определение устойчивости тест-микобактерий к эталонным ДС

Для определения устойчивости микобактерий в качестве эталонных ДС используют монохлорамин Б, глутаровый альдегид и перекись водорода медицинскую.

Методом йодометрического титрования определяют процент активного хлора в монохлорамине Б. В опытах используют препарат, содержащий 26,0-28,0% активного хлора, растворяя который в дистиллированной воде в соотношении 1 : 20 готовят рабочий раствор (5,0% по препарату).

Глутаровый альдегид (зарегистрированный в России как субстанция) разводят дистиллированной водой до концентрации рабочего раствора 0,5% (по глутаровому альдегиду).

Массовую долю перекиси водорода медицинской определяют методом перманганатометрического титрования в соответствии с ГОСТ 177-88. Готовят 4,0% раствор (по перекиси водорода).

Предварительно готовят и разливают в пробирки по 5 мл стерильный раствор нейтрализатора (п. 5.2.1.4.); стерильную питьевую воду; пробирки со скошенной плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена или "Новая". Готовят и контаминируют тест-микобактериями батистовые тест-объекты (см. п. 5.2.2.2.). Если в опытах используют ранее приготовленные и хранящиеся в холодильнике контаминированные тест-микробом тест-объекты, то их заранее извлекают из холодильника, чтобы они приобрели комнатную температуру (18-20°С).

Перед постановкой опыта контролируют содержание ДВ в рабочем растворе ДС.

При проведении экспериментов в стеклянную емкость объемом 50-100 мл пипеткой наливают требуемый объем раствора эталонного ДС, из расчета 0,5 мл на каждый тест-объект и помещают в водяную баню с температурой 20°С на весь период опыта. Отсчитывают в чашке Петри необходимое для опыта количество бязевых (батистовых) тест-объектов (по 2 на каждую экспозицию), контаминированных тест-микобактериями, захватывают стерильным пинцетом тест-объекты все сразу и опускают их в емкость с раствором ДС; легким покачиванием емкости добиваются полного смачивания тест-объектов. В момент смачивания всех тест-объектов отмечают время.

Через каждые 30 минут стерильным пинцетом извлекают по 2 тест-объекта из раствора ДС и опускают их в пробирку с 5 мл 1,0% стерильного раствора тиосульфата натрия для нейтрализации остаточного действия ДС. Пробирку с нейтрализатором и тестами не подвергают встряхиванию. Через 5-10 минут тест-объекты переносят в пробирку с 5 мл стерильной питьевой воды. Еще через 10-15 минут каждый тест-объект помещают на поверхность скошенной в пробирке плотной питательной среды.

Для контроля два контаминированных тест-микобактериями тест-объекта погружают в стерильную дистиллированную воду (вместо раствора ДС) на максимальный срок экспозиции, затем (как и опытные тест-объекты) их переносят в раствор нейтрализатора (тиосульфат натрия) и помещают на поверхность скошенной в пробирке плотной питательной среды.

Посевы опытные и контрольные ставят в термостат при температуре 37°С; наличие роста тест-культур проверяют через 14-21 сутки.

Опыт повторяют не менее 3 раз. Тест-микобактерии должны быть устойчивы к 5,0% раствору монохлорамина не менее 2 часов; к 0,5% раствору глутарового альдегида - не менее 60 мин; к 4,0% раствору перекиси водорода - не менее 60 мин.

В процессе испытаний контролируют температуру раствора ДС в опыте, исходный и остаточный уровень контаминации тест-микобактериями тест-объекта (КОЕ на ), время выдержки тест-объектов в испытуемом дезинфицирующем растворе.

5.2.1.4. Обеспечение стандартности условий проведения исследований активности ДС и их субстанций

Для обеспечения стандартности условий постановки экспериментов необходимо провести химико-аналитический контроль исследуемых ДС и их субстанций. До проведения исследования туберкулоцидной активности ДС и их субстанций необходимо ознакомиться с рецептурой средства и техническими условиями на отечественные или спецификацией на зарубежные средства, провести химико-аналитические исследования по определению концентрации действующих веществ в средствах и определить соответствие рецептуры и других показателей, регламентированным вышеуказанными документами. При этом используют химико-аналитические методы контроля и применяют условия хранения средства и меры безопасности при работе с ним, предложенные производителем средства.

Так как для дезинфекции при туберкулезе применяют средства, обладающие действием, убивающим микобактерии, а не задерживающие их рост, при определении туберкулоцидной активности и эффективности ДС необходимо разграничить туберкулоцидное действие препарата от туберкулостатического. Для этого применяют нейтрализторы, исключающие остаточное бактерицидное действие.

Для нейтрализации антимикробного действия дезинфицирующих средств из различных химических групп применяют следующие нейтрализаторы:

- для галоидактивных (хлор-, бром- и йодактивные) и кислородактивных (перекись водорода, ее комплексы с солями, надуксусная кислота, озон) - 0,1-1,0% растворы тиосульфата натрия;

- для четвертичных аммониевых солей (алкилдиметилбензиламмоний хлорид, дидецилдиметиламмоний хлорид и др.), производные гуанидина (полигексаметиленгуанидин гидрохлорид, хлоргексидин биглюконат и др.) - 0,1-1,0% растворы лаурилсульфата натрия (сульфонол), растворы лаурилсульфата натрия с 10% обезжиренного молока или универсальный нейтрализатор (см. ниже);

- для альдегидов (глутаровый альдегид, глиоксаль, формальдегид, ортофталевый альдегид) - 1,0% раствор пиросульфита (метабисульфита) натрия или универсальный нейтрализатор (см. ниже);

- для кислот - щелочи в эквивалентном количестве;

- для щелочей - кислоты в эквивалентном количестве;

- для спиртов - разведение в воде до не действующей концентрации;

- для композиционных средств - универсальный нейтрализатор, содержащий Твин 80 (3%), сапонин (0,3-3%), гистидин (0,1%), цистеин (0,1%). Если в состав композиции входят окислители, в нейтрализатор дополнительно вводят тиосульфат натрия. Универсальным нейтрализатором является также нейтрализующий бульон по Ди-Ингли (фирма-производитель "HIMEDIA"). В его состав входят такие ингредиенты, как гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глюкоза, натрия тиосульфат, натрия тиогликолят, натрия бисульфит, лецитин, Твин-80 и др.

Растворы нейтрализаторов готовят в асептических условиях, применяя для этого только стерильную дистиллированную воду.

При невозможности соблюдения асептических условий приготовления нейтрализаторов, допускается стерилизация готовых растворов автоклавированием при 1,1 атм. (121°С) в течение 15 мин.

Температура растворов нейтрализаторов должна быть +20°С, независимо от температуры окружающей среды.

Готовые растворы должны использоваться в день приготовления. Допускается хранение готовых растворов при температуре +4°С в течение 48 часов.

Контроль полноты нейтрализации остаточного действия испытываемого ДС.

Несмотря на существующие рекомендации по применению нейтрализаторов для различных действующих веществ (ДВ), многие современные ДС содержат несколько ДВ и другие вспомогательные вещества, обладающие бактериостатическим действием, и существующие (рекомендуемые) нейтрализаторы могут не обеспечивать эффективной нейтрализации остаточного действия ДС в пробе. В этой связи, результаты оценки эффективности ДС могут быть необъективными.

Поэтому каждый случай проведения испытания ДС должен предварительно сопровождаться экспериментальным контролем эффективности нейтрализации остаточного действия ДС на микробную клетку.

Для контроля эффективности нейтрализатора и полноты нейтрализации ДС используют суспензионный метод, предусматривающий проведение исследования, основные операции которого и их назначение приведены на схеме 5.3 и в таблице 5.6.

Схема 5.3.

Проведение эксперимента по контролю эффективности нейтрализации действия ДС на микобактерии используемым нейтрализатором

Таблица 5.6.

Назначение операций эксперимента по оценке эффективности нейтрализации остаточного действия ДС

N пробы	Назначение операции исследования	Процедура выполнения операции исследования	Ожидаемый результат
1.	Контроль губительного действия ДС	к 9 мл суспензии тест-штамма ( КОЕ/мл) на дист. воде +1 мл раствора ДС	Рост микроорганизмов должен отсутствовать
2.	Контроль полноты нейтрализации ДС	к 9 мл суспензии тест-штамма ( КОЕ/мл) на нейтрализаторе +1 мл раствора дезсредства	Примерно одинаковое количество колоний в посевах проб (по 0,1 мл) на плотной питательной среде
3.	Контроль отсутствия антимикробного эффекта у нейтрализатора	к 9 мл суспензии тест-штамма ( КОЕ/мл) на нейтрализаторе +1 мл раствора нейтрализатора
4.	Референс - контроль количества микобактерий	к 9 мл суспензии тест-штамма ( КОЕ/мл) на дист. воде +1 мл дист. воды
Примечание: спустя 5 минут после постановки опыта, из каждой из четырех проб производят посев смеси по 0,1 мл, как минимум, на 3 пробирки со скошенной питательной средой, которые инкубируют в термостате при 37°С, по истечении 14-21 суток учитывают результаты исследований.

5.2.2. Методы исследований и оценки результатов активности ДС и их субстанций in vitro

5.2.2.1. Суспензионный метод

Суспензионный метод оценки туберкулоцидной активности ДС и их субстанций используют для получения первичной информации о концентрационных и временных параметрах эффективного (отсутствие жизнеспособных микобактерий) туберкулоцидного действия ДС. Методология выполнения эксперимента по оценке туберкулоцидной активности ДС суспензионным методом приведена на схеме рисунка 5.4.

Как видно из схемы 5.4, для проведения опыта по оценке туберкулоцидных свойств дезинфицирующего средства суспензионным методом необходимо приготовить:

- рабочую суспензию штамма тест-микобактерий с концентрацией не менее  КОЕ/мл (это обеспечивает возможность создания в смеси дезинфектанта с суспензией (обоснованной и применяемой для этого метода оценки ДС) концентрации микроорганизмов порядка  КОЕ/мл;

- пробирки со стерильной дистиллированной водой для проведения контроля реальной биологической концентрации (БК) тест-микроорганизма в суспензии, используемой в опыте;

- пробирки или флакон с раствором ДС в испытываемой концентрации в количестве, необходимом для обеспечения отбора всех проб;

- необходимое количество пробирок (в зависимости от количества проб, отбираемых для определения времени, обеспечивающего полную гибель тест-микроба), содержащих по 9 мл нейтрализатора, проверенного предварительно на эффективность нейтрализации остаточного действия испытываемого ДС (п. 5.1.2.3.);

- пробирки со скошенной стерильной плотной питательной средой в количестве, необходимом для посева пробы контроля исходной суспензии и проб контроля эффективности действия ДС на тест-микроб.

Схема 5.4.

Проведение эксперимента по оценке туберкулоцидной активности ДС суспензионным методом

Методика проведения самого опыта включает, как видно из схемы, последовательное выполнение следующих операций:

- тщательное перемешивание хранимой в пробирке или во флаконе рабочей суспензии тест-микроорганизма путем встряхивания ее в течение 2-3 минут;

- помещение испытываемого рабочего раствора ДС в водяную баню с заданной температурой; если задачей эксперимента не предусмотрено изучения влияния воздействия температуры на эффективность средства, то оценка эффективности раствора испытываемого средства осуществляется при температуре 18-20°С;

- проведение контроля реальной на момент проведения опыта биологической концентрации (БК) тест-микроорганизма в суспензии;

- внесение в испытываемый дезинфицирующий раствор рабочей суспензии тест-микроорганизма с обеспечением соотношения ДС и суспензии тест-микроорганизма 9 : 1;

- перемешивание смеси и отсчет по секундомеру времени начала воздействия ДС на тест-микроорганизм;

- по окончании каждой заданной экспозиции проведение отбора пробы в количестве 3 мл, которую по 1 мл вносят в 3 пробирки, содержащих по 9 мл стерильного раствора нейтрализатора остаточного действия дезинфекционного средства на тест-микроорганизм;

- перемешивание пробы путем встряхивания вручную в течение 1-2 минут (или в течение 5 минут на шейкере) и посев из них стерильно на поверхность плотной питательной среды в чашках Петри или в пробирках (по 0,1 мл на каждую чашку или пробирку, но не менее чем на три из каждой пробы).

- инкубирование посевов проб при температуре °С в течение 14-21 суток и учет результатов.

Эффективной экспозицией для рабочего раствора испытанной концентрации считается вторая экспозиция из показавших отсутствие жизнеспособных клеток в посевах соответствующих им проб.

Количество и интервал (шаг) экспозиций, при которых осуществляется отбор проб на эффективность ДС, выбирают на основе учета данных о составе и эффективности входящих в средство действующих веществ.

Средство, растворы которого обеспечивают при комнатной температуре в течение 60 минут полную гибель микобактерий, рассматривают как перспективное туберкулоцидное средство для дальнейшего изучения: оценки факторов, влияющих на туберкулоцидную активность ДС, отработки режимов эффективного применения и др.

5.2.2.2. Метод батистовых тест-объектов

Как суспензионный метод оценки туберкулоцидной активности ДС и их субстанций, так и метод батистовых тест-объектов используют для получения информации о концентрационных и временных параметрах эффективного туберкулоцидного действия ДС. В принципиальном плане методология выполнения эксперимента по оценке (тестированию) туберкулоцидной эффективности ДС методом батистовых тест- объектов приведена на схеме 5.5.

Как видно из схемы 5.5., методика эксперимента предусматривает проведение контаминации микобактериями батистовых тест-объектов, контроля исходного уровня обсеменения тест-объектов, обработки (замачивания) тест-объектов в испытываемом дезинфицирующем растворе, нейтрализации ДС после заданной экспозиции воздействия, инкубирование нейтрализованных тест-объектов на плотной питательной среде.

Схема 5.5.

Выполнение эксперимента по оценке туберкулоцидной активности дезсредства методом батистовых тест-объектов

Приготовление и контаминация батистовых тест-объектов

Батистовую ткань погружают на 24 часа в холодную питьевую воду для удаления аппрета. Затем ткань тщательно стирают с мылом, прополаскивают в холодной воде, кипятят, сушат и гладят горячим утюгом. С помощью иглы в приготовленном куске батистовой ткани выдергивают нитки в продольном направлении на расстоянии 10 мм друг от друга и в поперечном - на расстоянии 0,5 см. По этим линиям ткань разрезают ножницами на отдельные тест-объекты; раскладывают по 50 штук в чашки Петри, которые завертывают в бумагу и автоклавируют в паровом стерилизаторе 20 минут при 132°С (1,1 ).

Приготавливают рабочую суспензию тест-микобактерий (п. 5.2.1.2.) в количестве, достаточном для контаминации используемых в опыте тест-объектов (из расчета 0,2 мл на тест).

Стерильные батистовые тест-объекты (в количестве 50-100 штук) в чашке Петри заливают 10-20 мл рабочей суспензии тест-микобактерий, содержащей  КОЕ/мл, и равномерно смачивая, оставляют тест-объекты в суспензии в закрытой чашке Петри. Через 30 минут тест-объекты, контаминированные бактериальной суспензией, стерильным пинцетом с соблюдением асептики переносят в стерильную чашку Петри на поверхность двухслойной стерильной фильтровальной бумаги, покрывают их сверху стерильной фильтровальной бумагой и закрывают чашку. Оставляют на 10 минут с целью удаления избытка жидкости. Для фиксации микроорганизмов на батистовых тест-объектах, последние переносят на поверхность сухой стерильной фильтровальной бумаги в чашке Петри и сверху прикрывают стерильным листом фильтровальной бумаги, подсушивают в термостате при 37°С в течение 20 минут с приоткрытыми крышками.

Хранение контаминированных тест-объектов возможно в холодильнике при температуре °С в течение суток.

Контроль исходного количества живых тест-микобактерий на тест-объекте

Для контроля количества жизнеспособных микобактериальных клеток на тест-объектах, тест-объект погружают в колбу со 100 мл стерильной дистиллированной воды. Колбу устанавливают на шейкер и встряхивают в течение 30 минут для отмывания бактериальных клеток с бязевого (батистового) тест-объекта. Из полученной суспензии производят посев по 0,1 мл на 5 пробирок (5 повторностей) со средой Левенштейна-Йенсена или "Новая", инкубируют в термостате при 37°С в течение 14-21 суток. Выросшие колонии на поверхности питательной среды подсчитывают, определяют среднее значение, производят пересчет с учетом разведения. Количество жизнеспособных бактериальных клеток в приготовленной суспензии на тест-объекте должно составлять 105-106 микробных тел (если рост микобактерий отсутствует, при посеве суспензии объемом 0,1 мл, можно увеличить объем до 0,2-0,3 мл и соответственно учесть его при расчете бактериальной концентрации на тест-объекте).

Расчет концентрации живых микобактерий на тест-объекте осуществляют по следующей формуле:

, где

X - концентрация живых микобактерий на тест-объекте;

А - среднее количество колонии образующих единиц (КОЕ), выросших на 5 пробирках;

1000 - коэффициент, полученный от соотношения 100 мл (общий объем пробы в колбе) к 0,1 мл (объем пробы, использованный для посева).

Например: получен рост микобактерий в первой пробе - 50 КОЕ, во 2-ой - 110 КОЕ, в 3-ей - 98 КОЕ, в 4-ой - 150 КОЕ, в 5-ой - 100 КОЕ, тогда среднее количество колонне образующих единиц (КОЕ), выросших на 5 пробирках будет равно:

А=(50+110+98+150+100):5=102

X = 102 x 1000 = 1020000, что соответствует 1 млн. живых микробных клеток на тест-объекте.

Проведение обработки тест-объектов раствором испытуемого ДС и контроль эффективности обеззараживания

Стерильным пинцетом погружают необходимое для проведения эксперимента количество контаминированных тест-штаммом микобактерий тест-объектов в пробирку или чашку Петри с раствором ДС (объем ДС должен рассчитываться с учетом соотношения 1,0 мл раствора на 1 тест-объект), обеспечивая полное смачивание (погружение) тест-объектов, фиксируют время начала экспозиции и следят за соблюдением температурного режима (°С).

По истечении заданного времени экспозиции, стерильным пинцетом извлекают тест-объект из раствора ДС и погружают его на 1-2 мин в пробирку со стерильным раствором нейтрализатора при температуре °С (пробирку с раствором нейтрализатора и погруженным в него тестом не встряхивают).

Затем при помощи пинцета размещают тест-объект на скошенную поверхность питательной среды Левенштейна-Йенсена или "Новая" (на скошенную площадку питательной среды в пробирке можно разместить 3 тест-объекта, что позволяет увеличить без дополнительных затрат количество проб на каждую экспозицию, а значит, и достоверность результатов оценки эффективности средства). Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками, помещают в термостат в наклонном положении под углом 30° таким образом, чтобы стекающий с теста посевной материал тоже равномерно распределился по поверхности питательной среды, и инкубируют при 37°С в течение 10-21 дня с ежедневным просмотром.

Учет и анализ результатов эксперимента

Учет результатов посевов проводят визуально путем подсчета выросших колоний на самом тест-объекте и на поверхности питательной среды. Колонии M.terrae на среде Левенштейна-Йенсена представляют собой шероховатые и матовые выпуклые округлые образования, на среде "Новая" - гладкие и блестящие или с молочным или желтоватым оттенком.

Наличие роста колоний тест-микобактерий на тест-объекте и на поверхности питательной среды показывает, что тестируемое ДС в данном режиме применения (концентрация раствора и экспозиция воздействия) не обеспечивает надежного туберкулоцидного эффекта.

Отсутствие роста колоний тест-микобактерий на тест-объекте и на поверхности питательной среды свидетельствует о наличии у средства в данном режиме (концентрация раствора и экспозиция воздействия) туберкулоцидной эффективности, отвечающей предъявляемым требованиям к ДС для практического их использования (обеспечение снижения уровня обсемененности объекта на  ).

Эффективной экспозицией для рабочего раствора испытанной концентрации считается вторая экспозиция из показавших отсутствие в посевах соответствующих им проб жизнеспособных микобактерий.

Количество и интервал (шаг) экспозиций, при которых осуществляется отбор проб на эффективность ДС, выбирают на основе данных о составе и эффективности входящих в средство действующих веществ.

Средство, растворы которого обеспечивают при температуре °С в течение 60 минут полную гибель микобактерий тест-микроорганизма, может рассматриваться как перспективное туберкулоцидное ДС для дальнейшего изучения: оценки факторов, влияющих на туберкулоцидную активность ДС, отработки режимов эффективного применения и др.

5.2.2.3. Методы изучения факторов, влияющих на туберкулоцидную активность ДС и их субстанций

Для определения условий применения и направлений дальнейших исследований необходимо изучить зависимость туберкулоцидного действия ДС от температуры раствора ДС, величины pH и присутствия белковых загрязнений.

Исследования проводят методом батистовых тест-объектов (п. 5.2.2.2.).

На основании полученных данных определяют целесообразность и направления дальнейших исследований препарата для применения в качестве ДС.

Определение влияния температуры на туберкулоцидную активность ДС и их субстанций проводят с целью выявления возможности использования подогретых растворов ДС для сокращения времени обеззараживания объектов в отношении микобактерий туберкулеза, а также для оценки эффективности туберкулоцидных свойств при пониженных температурах окружающей среды, обеззараживаемого объекта и самого раствора ДС.

Для изучения влияния температуры рабочие растворы испытуемых ДС готовят в день опыта, наливают в стеклянные колбы (пробирки) из расчета по 0,5 мл на каждый тест-объект.

Исследование влияния положительных температур раствора ДС на его туберкулоцидную активность проводят с использованием водяной бани, в которой нагревают емкость с дезинфицирующим раствором до °С, °С, °С, после чего погружают в него зараженные тест-объекты и поддерживают эти температуры в процессе всего опыта.

Опыты по оценке влияния пониженной температуры на активность ДС проводят с использованием криостата или солевых низкозамерзающих растворов, в которых охлаждают емкость с дезинфицирующим раствором до °С, °С, минус °С и поддержания их в процессе опыта. После достижения указанной температуры в раствор ДС погружают батистовые тест-объекты, контаминированные культурой тест-микроорганизма из расчета 2 тест-объекта на каждую экспозицию.

Через определенные промежутки времени из каждой колбы извлекают по 2 тест-объекта и помещают их при температуре °С в пробирки с соответствующим нейтрализатором на 5 минут, затем во вторую пробирку со стерильной водой на 5 минут и только после этого каждый тест-объект переносят в пробирку со скошенной плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена или "Новая" и укладывают его на поверхность среды. Посевы инкубируют в течение 14-21 суток при °С. Контролем служат по 2 тест-объекта при каждой исследованной температуре, не подвергавшиеся действию испытуемого ДС, но погруженные в пробирки со стерильной питьевой водой на срок, равный действию испытуемого ДС.

Определение влияния величины pH на туберкулоцидную активность ДС и их субстанций начинают с приготовления рабочих растворов ДС, имеющих различную величину pH (5,6-6,0; 7,0; 8,5-9,0). Для подкисления раствора используют децинормальный раствор соляной или другой кислоты, а для подщелачивания - децинормальный раствор щелочи. В подготовленные растворы погружают контаминированные микобактериями батистовые тест-объекты. Исследование зависимости туберкулоцидной активности ДС и их субстанций от величины pH проводят по методике, описанной выше, только при нейтрализации действия действующих веществ одновременно понижают или повышают и величину pH, добавляя соответственно кислоту или щелочь.

Определение влияния белковых загрязнений на туберкулоцидную активность ДС проводят с целью выявления возможности влияния (или установления его отсутствия) белковых загрязнений на обеззараживаемом объекте на туберкулоцидную активность ДС.

Исследование проводят методом батистовых тест-объектов (п. 5.2.2.2.), только для контаминации тест-объектов используют суспензию тест-микобактерий, содержащую 20,0% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота или дефибринированной крови, которые добавляют в суспензию при ее приготовлении. Инактивацию нормальной сыворотки крупного рогатого скота проводят дробным трехкратным прогреванием на водяной бане при температуре °С в течение 30 минут. Если активность препарата не снижается в присутствии 20,0% белка, концентрацию инактивированной сыворотки крупного рогатого скота или дефибринированной крови в суспензии тест-микроорганизма увеличивают до 40,0%. Отсутствие снижения туберкулоцидной активности ДС при добавлении 40,0% сыворотки позволяет считать ДС не реагирующим на присутствие белковых загрязнений.

5.2.3 Методы исследований туберкулоцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания объектов внешней среды, контаминированных тест-микроорганизмами

Многообразие факторов передачи туберкулеза и длительная выживаемость вобудителей туберкулеза и микобактериозов во внешней среде обосновывает необходимость обеззараживания большого перечня объектов, которые могут быть контаминированы возбудителями в инфекционном очаге на дому, в лечебно-профилактических учреждениях, в специализированных бактериологических лабораториях, работающих с этими возбудителями.

Учитывая вышесказанное, перечень тест-объектов, моделирующих объекты, подлежащие дезинфекции, включает: поверхности помещений, мебели, аппаратов, приборов, санитарно-технического оборудования, транспортных средств и др.; изделия медицинского назначения, в т.ч. эндоскопы; предметы ухода за больными, игрушки; посуду, включая лабораторную и из-под выделений; белье, одежду, спецодежду и другие объекты из тканей; изделия из резины, в т.ч. перчатки, сапоги, фартуки и др.; обувь; руки в резиновых перчатках; остатки пищи; выделения: фекалии, мочу, кровь, мокроту; воду; воздух; медицинские отходы.

5.2.3.1 Исследование туберкулоцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания поверхностей помещений, мебели, аппаратов, приборов, санитарно-технического оборудования, транспортных средств и других объектов

В исследованиях используют тест-поверхности (10 x 10 см) из различных материалов: дерева (неокрашенного, окрашенного масляной, клеевой или другими красками, оклеенного обоями), линолеума, пластика, кафеля, фаянса, плитки, металлов, стекла.

Тест-поверхности из различных материалов (за исключением деревянных тест-поверхностей, окрашенных клеевой краской и оклеенных обоями) тщательно моют водой с мылом и щеткой, стерилизуют в паровом стерилизаторе (при температуре °С в течение 30 минут). Тест-поверхности, окрашенные клеевой краской и оклеенные обоями, протирают несколько раз стерильной марлевой салфеткой, увлажненной стерильной питьевой водой. Готовят суспензию тест-микобактерий, содержащую  КОЕ/мл. При разработке режимов обеззараживания раковин, ванн и других загрязненных объектов для имитации органического загрязнения к суспензии добавляют 40,0% лошадиной сыворотки, инактивированной при 56°С в течение 30 минут (к 6 мл 2-х миллиардной суспензии прибавляют 4 мл сыворотки).

После подсыхания тест-поверхности располагают горизонтально и на них с помощью одноканального механического дозатора или стеклянной пипетки наносят 0,5 мл суспензии тест-микроорганизма. Суспензию равномерно распределяют по тест-поверхности (100 ) стерильным стеклянным шпателем. Если суспензия тест-микроорганизма не распределяется равномерно, а собирается в каплю, растирание шпателем по тест-поверхности осуществляют неоднократно (3-5 раз). Контаминированные тест-поверхности подсушивают при комнатной температуре до полного высыхания (30-120 минут). Обеззараживание тест-поверхностей осуществляют способами протирания, орошения дезинфицирующим раствором.

При обеззараживании тест-поверхности из дерева (окрашенные клеевой и другими красками, оклеенные обоями), из стекла, кафеля и др. располагают вертикально; поверхности из линолеума, метлахской плитки и других покрытий для пола располагают горизонтально. Тест-поверхности обеззараживают путем их орошения, протирания (однократного или двукратного) дезинфицирующим раствором.

В зависимости от вида обрабатываемой поверхности и наличия загрязнений на ней, норма расхода ДС на одну обработку способом протирания составляет 100-150 мл на (1-1,5 мл на 100 ); способом орошения - 150 мл на (1,5 мл на 100 ) при обработке распылителем типа "Квазар" и 300 мл на (3 мл на 100 ) - при обработке распылителем типа "Автомакс" или гидропультом.

При необходимости обработку способом протирания или орошения повторяют через 5-15 минут.

Для контроля эффективности обеззараживания через определенные промежутки времени (15-30-60 и т.д. до 120 минут) с тест-поверхностей делают смывы путем тщательного протирания поверхности стерильной марлевой салфеткой (5 ), увлажненной нейтрализатором. После протирания на тест-поверхности не должно оставаться излишней влаги. Салфетки погружают на 5 минут в пробирки (емкости) с соответствующим нейтрализатором (10 мл), а затем в стерильную питьевую воду с бусами и встряхивают на шейкере в течение 10 мин. Полученную смывную жидкость вносят по 0,1 мл в 3-5 пробирок со скошенной плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена или "Новая", тщательно распределяя ее по всей поверхности. Посевы инкубируют в термостате при температуре °С в течение 10-21 суток.

В контрольных опытах для обработки аналогично контаминированных тест-поверхностей вместо раствора ДС используют стерильную питьевую воду из того же расчета, что и опытные. Жидкость, в которую помещают стерильную марлевую салфетку после взятия смыва с контрольных поверхностей, перед посевом разводят в 100 раз и вносят по 0,1 мл на скошенную поверхность плотной питательной среды Левенштейна-Йенсена или "Новая" 3-5 пробирок. Посевы инкубируют в термостате при температуре ()°С. Учитывают результаты через 10-21 суток.

Оценку результатов проводят по посеву того разведения, в котором число колоний на чашке Петри или в пробирке составляет от 30 до 300.

После выдерживания посевов в термостате подсчитывают число колоний на чашках или пробирках с плотной питательной средой, рассчитывают остаточную плотность контаминации на 100  тест-поверхности и высчитывают эффективность обеззараживания, принимая количество тест-микроорганизмов, снятых с контрольных тест-объектов (тест-поверхностей), за 100%.

Например: на 100  контрольной тест-поверхности по результатам бактериологического контроля онаружено 148000 микробных клеток, а на аналогичного вида опытной тест-поверхности - 20 микробных клеток.

148000 - 100%             х=20х100:148000=2:148=0,013%

20 - х

Эффективность обеззараживания опытной тест-поверхности составляет

100 - 0,013 = 99,987%.

Критерий эффективности ДС при обеззараживании тест-поверхностей из различных материалов, контаминированных тест-микроорганизмом равна не менее 99,99%.

5.2.3.2. Исследование туберкулоцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания предметов ухода за больными и игрушек из различных материалов (кроме мягких)

В исследованиях используют тест-объекты (100 ) и предметы ухода за больными из различных материалов: резин на основе натурального и силиконового каучука (медицинская клеенка, грелка, груша); стекла (поильник; плевательница; градусник); пластмасс (грелка, лоток; наконечник для клизм); металлов (таз, стакан для термометра); игрушки (кроме мягких) из резин и пластмасс.

Тест-объекты, предметы ухода за больными и игрушки из различных материалов тщательно моют водой с мылом и щеткой. Тест-объекты стерилизуют паровым или воздушным методом.

Готовят суспензию тест-микобактерий, содержащую  . К суспензии добавляют 40,0% лошадиной сыворотки, инактивированной при 56°С в течение 30 минут (к 6 мл 2-х миллиардной суспензии прибавляют 4 мл сыворотки).

С помощью одноканального механического дозатора или стеклянной пипетки на поверхность тест-объекта наносят 0,5 мл суспензии тест-микроорганизма. Суспензию равномерно распределяют по поверхности (100 ) стерильным стеклянным шпателем. Каналы и полости предмета ухода за больными, игрушек заполняют с помощью шприца. Мелкие игрушки полностью погружают в суспензию. Контаминированные тест-объекты, предметы ухода за больными и игрушки подсушивают при комнатной температуре до полного высыхания (30-120 минут).

Растворы ДС готовят на водопроводной воде температуры °С. Обеззараживание осуществляют способом погружения, протирания, орошения. После подсушивания контаминированные тест-объекты, предметы ухода за больными, игрушки, в том числе имеющие каналы и полости, погружают в раствор испытуемого дезинфицирующего средства или протирают салфеткой, смоченной им. Мелкие игрушки полностью погружают в емкость с раствором ДС, препятствуя их всплытию; крупные игрушки обеззараживают способом орошения. Норма расхода ДС способом протирания из расчета 100-150 мл на при однократной обработке и 200-300 мл на при двукратной; способом орошения - 150 мл на при обработке распылителем типа "Квазар" и 300 мл на - при обработке распылителем типа "Автомакс" или гидропультом. При необходимости обработку способом протирания или орошения повторяют через 5-15 минут.

Для контроля эффективности обеззараживания через определенные промежутки времени после обработки (30-60-120 минут) тест-объекты, предметы ухода за больными и игрушки извлекают из раствора, делают смывы стерильной марлевой салфеткой (5 ), увлажненной нейтрализатором. Салфетки погружают в стерильный раствор нейтрализатора на 5 минут, затем переносят в пробирки (емкости) с бусами и стерильной питьевой водой (10 мл) и встряхивают на шейкере в течение 10 минут. Каналы и полости промывают нейтрализатором (10 мл), который собирают в стерильные пробирки (емкости) и оставляют на 5 минут для нейтрализации.

Полученную смывную жидкость и смывную жидкость из каналов вносят по 0,1 мл на скошенную поверхность плотной питательной среды Левенштейна-Йенсена или "Новая" 3-5 пробирок. В контрольных опытах вместо раствора ДС используют стерильную питьевую воду.

Посевы инкубируют в термостате при температуре °С.

Результаты учитывают через 10-21 сутки инкубирования.

Эффективности ДС при обеззараживании тест-объектов, предметов ухода за больными и игрушек из различных материалов (кроме мягких), контаминированных тест-микроорганизмом должна быть не менее 100%.

5.2.3.3. Исследование туберкулоцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания посуды столовой, лабораторной и из-под выделений

Для определения туберкулоцидной активности ДС, предназначенных для обеззараживания посуды, используют в качестве тест-объектов набор столовой и чайной посуды: тарелки, стаканы, кружки из различного материала (фарфор, фаянс, алюминий, стекло, пластик, посуда, покрытая эмалью); столовые приборы: ножи, вилки, ложки из различного материала (нержавеющая сталь, алюминий, пластик), посуду одноразового использования и набор лабораторной посуды, представляющий тест-объекты из стекла и пластмасс: предметные и покровные стекла, пипетки, чашки Петри, планшеты для иммунологического анализа и другое; посуда из-под выделений (мочеприемники, подкладные судна). Перед экспериментом посуду и столовые приборы моют водой с мылом и щеткой и высушивают.

На посуду (площадь в 100 ) пипеткой наносят суспензию тест-микроорганизма из расчета 0,5 мл суспензии, содержащей  КОЕ в 1 мл. Суспензию тест-микроорганизма равномерно распределяют по поверхности посуды стеклянным шпателем. Столовые приборы для контаминации погружают в бактериальную суспензию на 1-2 мин, оставляя незараженными их ручки. Контаминированную посуду подсушивают (до полного высыхания) при комнатной температуре (30-120 мин) и относительной влажности воздуха 50-60%.

Для разработки режимов обеззараживания посуды с остатками пищи при контаминации используют суспензию тест-микроорганизма, смешанную с овсяной, манной или другой кашей, сваренной на молоке со сливочным маслом (к 10 г каши добавляют 1 мл 2-х миллиардной микробной взвеси). Для имитации загрязнения чайной посуды используют кисель (к 10 г киселя добавляют 1 мл 2-х миллиардной микробной взвеси), лабораторной посуды - 40,0% инактивированной сыворотки, посуды из-под выделений - 20,0% эмульсию фекалий, предварительно растертую в ступке.

Обработку столовой, чайной, лабораторной посуды, столовых приборов проводят способом погружения в дезинфицирующий раствор. Растворы готовят на питьевой воде. Температура испытуемого раствора 18-20°С. При необходимости изучают эффективность растворов ДС при температуре 50°С.

Дезинфицирующий раствор должен полностью заполнять и с избытком покрыть всю посуду и приборы (из расчета не менее 2 л на 1 комплект).

Время обеззараживания посуды - от 15 до 240 минут, в зависимости от вида ДС и наличия загрязнения.

Через определенные интервалы времени (например, 15, 30, 60 минут и т.д.) извлекают по одному предмету разных наименований (например, тарелка, стакан, предметное стекло, нож и т.д.) из дезинфицирующего раствора и стерильной марлевой салфеткой (5 ), смоченной в растворе нейтрализатора, соответствующего данному ДС, тщательно протирают зараженную часть каждого предмета и погружают в 10 мл этого же нейтрализатора на 5 минут, затем салфетку переносят в пробирку со стерильной питьевой водой и бусами. Время отмыва марлевой салфетки - 10 минут при постоянном встряхивании на шейкере. После отмыва смывную жидкость по 0,1 мл высевают в 3-5 пробирки со скошенной поверхностью плотной питательной среды Левенштейна-Йенсена или "Новая" (по 0,1 мл в каждую). Посевы помещают в термостат при температуре 37°С. Предварительный учет результатов проводят через 10-14 суток, окончательный - через 21 сутки.

Контролем служит аналогично контаминированная посуда, которая погружается не в дезинфицирующий раствор, а в такой же объем стерильной питьевой воды.

Критерий эффективности обеззараживания посуды: гибель тест-микроорганизма не менее 100%.

5.2.3.4. Исследование туберкулоцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания изделий медицинского назначения (ИМН), включая эндоскопы

5.2.3.4.1. Исследование туберкулоцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания ИМН (кроме эндоскопов)

В качестве тест-изделий используют стерильные инструменты и другие ИМН, в том числе однократного применения, из различных материалов (металлов, резин, стекла, пластмасс) или имитирующие их тест-объекты. Перечень инструментов, должен включать разнообразные по форме, характеру поверхности и используемому материалу изделия (гладкие изделия простой конфигурации; изделия, имеющие замковые части, каналы и полости, имеющие насечки и напыления, изделия извитой формы; изделия, изготовленные из нескольких видов материалов и т.д.).

На рабочую поверхность тест-изделия (у замковых изделий - также в область замка, а при наличии каналов и полостей - также в канал изделия) наносят 0,1 мл суспензии, содержащей  КОЕ/мл тест-микроорганизма, содержащей 40% инактивированной лошадиной сыворотки. Мелкие тест-изделия для контаминации погружают в эту суспензию на 15 мин. Контаминированные тест-изделия подсушивают в термостате в течение 20-25 мин. Дезинфицирующие растворы готовят на питьевой воде комнатной температуры или подогретой до ()°С.

После подсушивания контаминированные изделия погружают в раствор испытываемого средства, заполняя им все каналы и полости изделий, избегая образования воздушных пробок. Инструменты, имеющие замковые части, погружают раскрытыми, предварительно сделав ими в растворе ДС несколько рабочих движений для лучшего проникновения раствора в труднодоступные участки изделия в области замка. Толщина слоя раствора средства над изделиями должна быть не менее 1 см. Параллельно контаминированные контрольные изделия погружают в воду.

Через определенное время (от 15 до 120 мин) изделия извлекают из раствора и марлевой салфеткой размером 5 x 5 см, пропитанной нейтрализатором, с поверхности изделия делают смывы, салфетку помещают в пробирку с 10 мл того же нейтрализатора на 5 мин, затем переносят ее в пробирку со стерильной питьевой водой и встряхивают с бусами в течение 5-10 мин. Для контроля эффективности обеззараживания делают посев смывной жидкости по 0,1 мл на поверхность агаровой питательной среды, а салфетку помещают в бульон. Канал изделия промывают нейтрализатором, и смывную жидкость засевают по 0,1 мл на скошенную плотную питательную среду в 3-5 пробирках. Посевы выдерживают в термостате при температуре ()°С в течение 21 суток. Учет предварительных результатов проводят через 10-14 суток и окончательных - через 21 сутки.

Кратность постановки эксперимента должна быть достаточной для получения статистически достоверных результатов.

Эффективным считают режим (концентрация-время-температура), обеспечивающий 100% гибель тест-микроорганизмов на всех изделиях. При наличии положительных проб эксперимент повторяют, увеличивая концентрацию или время воздействия.

5.2.3.4.2. Исследование туберкулоцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания эндоскопов [16, 68]

В качестве тест-объектов используют фрагменты эндоскопа или эндоскоп (гибкий - гастроскоп, жесткий - цистоскоп). По 0,1 мл суспензии, содержащей  КОЕ/мл тест-микроорганизмов, наносят с помощью пипетки на наружную поверхность и в канал эндоскопа, подсушивают в течение 20 мин. Затем контаминированное изделие погружают в раствор ДС, заполняя полости и каналы эндоскопа. Через определенное время (от 15 до 60 мин) изделие извлекают из раствора и делают смыв с наружной поверхности марлевой салфеткой (5 x 5 см), смоченной в растворе нейтрализатора; салфетку помещают в пробирку с 10 мл того же стерильного раствора нейтрализатора на 5 мин, а затем переносят ее в пробирку со стерильной питьевой воды, и встряхивают с бусами в течение 5-10 мин. Канал изделия промывают раствором нейтрализатора и смывную жидкость засевают на питательный агар. Проводят также контроль микробной обсемененности использованных для отмыва проб раствора нейтрализатора и питьевой воды. Кратность постановки эксперимента должна быть достаточной для получения статистически достоверных результатов.

Эффективным считают режим (концентрация-время-температура), обеспечивающий гибель тест-микроорганизма на всех тест-изделиях и отсутствие тест-микроорганизмов в растворе нейтрализатора. При наличии положительных проб эксперимент повторяют, увеличивая время воздействия, но не более чем до 60 мин.

Положительной считается проба, показывающая характерный рост тест-микроорганизма на плотных питательных средах или обнаружение тест-микроорганизма в растворе применявшегося нейтрализатора.

Режим обеззараживания, разработанный на имитаторах канала эндоскопа, проверяют при обеззараживании эндоскопа, контаминированного тест-микрорганизмом. При необходимости эффективность разработанного режима проверяют в практических условиях.

Критерием эффективности ДС (режим применения ДС) при обеззараживании ИМН (включая эндоскопы) является 100% гибель тест-микроорганизма.

Исследование туберкулоцидной эффективности ДС при дезинфекции высокого уровня (ДВУ) эндоскопов

Данная методика предназначена для разработки режимов ДВУ эндоскопов при проведении "нестерильных" диагностических и лечебных манипуляций [16, 73].

Для исследования выбирают ДС, обладающее спороцидным действием, и испытания его проводят при тех же условиях (концентрация, температура), которые обеспечивают гибель спор бацилл, определяя необходимое время дезинфекционной выдержки для достижения гибели наиболее устойчивого к изучаемому ДС микроорганизма.

При определении эффективности средств для ДВУ эндоскопов в качестве тест-объектов используют фрагменты канала гибкого эндоскопа или его имитаторы в виде трубок из пластика длиной 2 см, диаметром 2 мм.

Стерильные тест-объекты искусственно контаминируют, нанося с помощью дозатора/микропипетки в центральную часть канала и на поверхность каждой трубки суспензию тест-микроорганизма из расчета: микробных клеток тест-микобактерий на каждое изделие. Для имитации органического загрязнения к суспензии микроорганизмов перед контаминацией объекта добавляют 2% инактивированной лошадиной сыворотки.

Контаминированные тест-объекты подсушивают при комнатной температуре 18-22°С в течение 20 мин.

Дезинфицирующий раствор готовят на стерильной водопроводной (питьевой) воде. Обработку исследуемым ДС осуществляют способом погружения в испытуемый дезинфицирующий раствор. Через определенные интервалы времени, зависящие от химического состава средства, в промежутке от 5 до 60 мин, тест-изделия извлекают из дезинфицирующего раствора, помещают на 5-10 мин в раствор соответствующего нейтрализатора. После отмыва смывную жидкость по 0,1 мл высевают в 3-5 пробирок со скошенной питательной средой для проверки эффективности обеззараживания.

Посевы выдерживают в термостате при температуре и времени, оптимальных для роста использованного тест-микроорганизма: для тест-микобактерий - 37°С 21 сутки, после чего проводят учет результатов эксперимента.

В качестве контроля используют тест-объекты, контаминированные как указано выше и помещенные в воду на время дезинфекционной выдержки.

Кратность постановки эксперимента должна быть достаточной для получения статистически достоверных результатов.

Эффективным считают режим (концентрация-время-температура), обеспечивающий гибель тест-микроорганизма на всех тест-изделиях при отсутствии его роста в питательной среде. Положительной считается проба с характерным ростом микроорганизма на плотной питательной среде, или обнаружение микроорганизмов в растворе применявшегося нейтрализатора. При наличии положительных проб эксперимент повторяют, увеличивая время воздействия, но не более чем до 60 мин.

При необходимости эффективность разработанного режима проверяется в практических условиях.

Критерий эффективности обеззараживания - 100% гибель тест-микроорганизма.

Время обеззараживания - не более 60 мин.

5.2.3.5. Исследование туберкулоцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания белья, одежды, спецодежды и других объектов из ткани

Исследования с ДС проводят в целях оценки эффективности его для обеззараживания белья и других объектов из ткани, чистых и загрязненных кровью или выделениями (фекалии, моча, мокрота).

Оценку эффективности ДС для обеззараживания белья, одежды, спецодежды и других объектов из ткани осуществляют с помощью стерильных тест-объектов, представляющих собой кусочки бязи размером 2 x 2 см. Бязь предварительно готовят и обеззараживают также как батист. Контаминируют стерильные тест-объекты суспензией тест-микроорганизмов, содержащей  КОЕ/мл, из расчета 20 мл на 10 тест-объектов и подсушивают в течение 30 мин. Затем тест-объекты закладывают в бязевые мешочки размером 5 x 8 см (по 2 шт. в каждый), которые закрывают в виде конверта.

Раствор испытываемого ДС на питьевой воде комнатной температуры или подогретой до ()°С готовят из расчета 5 л на 1 кг белья. Ветошь, имитирующую белье, поштучно погружают в емкость с раствором испытываемого ДС так, чтобы между слоями ткани не образовывалось воздушных прослоек, препятствующих процессу обеззараживания. Одновременно между слоями белья распределяют (сверху, в середине и внизу) мешочки с контаминированными тест-объектами. Через заданное время мешочки извлекают одновременно из трех слоев. Тест-объекты вынимают из мешочка стерильным пинцетом, помещают на 5 мин в емкость с раствором соответствующего нейтрализатора, затем переносят в стерильную питьевую воду и высевают на питательный агар. Посевы инкубируют при ()°С. Предварительный учет результатов проводят через 10-14 суток, а окончательный - через 21 сутки. В контрольных опытах белье погружают в стерильную питьевую воду. Мешочки с тестами закладывают так же, как и в опыте. При получении 100% гибели тест-микроорганизма в опытах по обеззараживанию белья без белковых загрязнений переходят к опытам по обеззараживанию белья, загрязненного выделениями.

Для определения эффективности ДС при обеззараживании белья, одежды, спецодежды и других объектов из ткани, загрязненных кровью, выделениями (фекалии, мокрота, моча и др.), в лабораторных условиях используют бязевые тест-объекты, которые контаминируют суспензией тест-микобактерий с добавлением 40% инактивированной сыворотки (6 мл суспензии, содержащей  КОЕ/мл тест-микроорганизма смешивают с 4 мл инактивированной сыворотки) или 40% фекальной эмульсии (6 мл суспензии тест-микроорганизма смешивают с 4 мл 40% фекальной эмульсии) исходя из расчета 30 мл суспензии на 10 тест-объектов. Для приготовления фекальной эмульсии 8 г фекалий растирают в ступке с 20 мл воды. Количество суспензии тест-микроорганизма, содержащей сыворотку или фекалии, готовят из расчета 30 мл на 10 тест-объектов. Контаминированные тест-объекты подсушивают в термостате при ()°С в течение 20-25 мин или 1,5-2 ч при комнатной температуре до полного высыхания. Методика проведения эксперимента аналогична опытам с чистым бельем.

Критерием эффективности ДС при обеззараживании белья, одежды, спецодежды и других объектов из тканей является 100% гибель тест-микроорганизмов на тест-объектах. При изучении эффективности обеззараживания изделий из синтетических тканей (капрон, ацетат, лавсан и др.) используют тест-объекты из этих тканей размером 5 x 5 см, т.к. микроорганизмы не проникают в структуру этих тканей и смываемость их в 2 раза больше, чем с бязевых тест-объектов.

5.2.3.6. Исследование туберкулоцидной эффективности камерного метода обеззараживания

Камерный метод используют для обеззараживания одежды, обуви, постельных принадлежностей, мягких игрушек и др.

В качестве тест-микроорганизма используют в виде суспензии, содержащей  КОЕ в 1 мл, которой контаминируют тест-объекты из батиста, бязи и других материалов, соответствующих обеззараживаемым объектам. Тест-объекты закладывают в стерильные конверты из хлопчатобумажной ткани (по 2 тест-объекта в конверт). Пронумерованные тест-объекты помещают в хлопчатобумажные мешочки с максимальными термометрами и размещают в толще объектов в контрольные точки камеры на трех уровнях.

После обеззараживания мешочки извлекают из камеры и записывают показания максимальных термометров. Тест-объекты помещают в пробирки с 5 мл картофельно-глицеринового бульона.

Инкубирование посевов с тест-объектами проводят при температуре ()°С в течение 5-7 суток. Отсутствие помутнения питательной среды указывает на гибель микобактерий в тест-объектах. При наличии роста проводят сравнение выделенной культуры с тест-микобактерией.

В качестве контроля используют тест-объекты, которые не помещали в камеру, и питательную среду, которую применяли для культивирования тест-микроорганизма после обработки. Контрольные тест-объекты и среду проверяют аналогично тест-объектам, которые обрабатывали в камере. Для установления эффективности обработки проводят не менее трех экспериментов на каждое время обработки.

Эффективность обеззараживания вещей в дезинфекционных камерах должна быть равна 100% гибели на использованных тест-объектах.

5.2.3.7. Исследование туберкулоцидной эффективности ДС при обеззараживании рук в резиновых перчатках

В качестве тест-микроорганизма используют суспензию M. terrae, содержащую КОЕ/мл, которую разводят до содержания , и  КОЕ/мл.

Для устранения посторонней микрофлоры руки, включая запястья и предплечья, испытатели тщательно моют с мылом в теплой проточной воде, затем протирают стерильной марлевой салфеткой и надевают резиновые перчатки.

Поверхность резиновых перчаток, надетых на руки испытателей-добровольцев, контаминируют путем тщательного растирания 1 мл суспензии тремя вышеуказанными разведениями (каждое разведение на одного испытателя). После подсыхания микробной взвеси для контроля исходной обсемененности с поверхности резиновой перчатки тыльной стороны кисти делают смыв стерильной марлевой салфеткой размером 5 x 5 см, смоченной стерильной питьевой водой. Затем салфетку помещают в пробирку с 10 мл стерильной питьевой воды с бусами и встряхивают 10 мин. Полученный смыв высевают по 0,5 мл на скошенную поверхность питательной среды в пробирке.

Для обеззараживания поверхности перчаток в сжатую ладонь руки в перчатке испытателю-добровольцу наносят 2,5 мл исследуемого ДС. Затем он в течение 10-15 сек протирает этой порцией дезинфицирующего раствора поверхность перчаток обеих рук, совершая движения рук, которые выполняют при обработке кожи рук антисептиком. После этого такую же операцию проводят, нанося 2,5 мл дезинфицирующего раствора на ладонь второй руки и засекают по секундомеру начало экспозиции.

Через 5 мин (экспозиция) делают смыв марлевой салфеткой (5 x 5 см), смоченной соответствующим нейтрализатором, предварительно проверенным на эффективность нейтрализации и статического действия. Салфетку помещают в пробирку с 10 мл стерильного нейтрализатора на 10 мин. Затем салфетку переносят стерильным пинцетом в пробирку с 10 мл стерильной питьевой воды с бусами, встряхивают пробирку 10 мин в шейкере. Из полученного смыва делают посев по 0,5 мл на твердые питательные среды в пробирках (не менее 3 пробирок на пробу).

Эффективными считают режим применения ДС, обеспечивающий 100% гибель тест-микроорганизма на резиновых перчатках, защищающих кожу рук.

5.2.3.8. Исследование туберкулоцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания выделений (моча, кал, мокрота) и крови

Обеззараживание мочи. Мочу разливают в колбы или пробирки по 8 мл, добавляют 1 мл суспензии, содержащей  КОЕ/мл M.terrae, и 1 мл инактивированной лошадиной сыворотки.

Растворы испытываемого ДС готовят в концентрациях, обеспечивающих туберкулоцидный эффект при испытании его на батистовых тест-объектах с белковой защитой.

Испытуемые растворы ДС добавляют к моче в равном или двойном объеме. Отмечают время контакта и через интервалы 15, 30, 60 мин смесь в количестве 1 мл пипеткой переносят в пробирки с 5 мл соответствующего нейтрализатора. После тщательного смешивания 1 мл жидкости из первой пробирки переносят во вторую пробирку с 5 мл нейтрализатора и затем засевают по 0,1 мл в пробирки на скошенную поверхность питательной среды, как из первой, так и из второй пробирки. Посевы инкубируют в термостате при ()°С.

Контролем служат аналогично поставленные опыты только с добавлением к моче не дезинфицирующего раствора, а воды.

Ориентировочный учет результатов проводят через 10-14 суток, окончательный - 21 сутки. Результаты опытов учитывают по отношению к контролю, который принимают за 100%. Окончательное заключение об эффективности ДС делают на основании не менее трех опытов с совпадающими результатами.

Эффективным считают средство и режим его применения, обеспечивающие 100% гибель тест-микроорганизмов.

Обеззараживание кала. При разработке режимов обеззараживания кала учитывают соотношение ДС к обеззараживаемой массе, время обработки, температуру, консистенцию обеззараживаемых выделений, степень гомогенизации в процессе обеззараживания.

Исследования проводят в два этапа. На первом этапе в качестве тест-объекта используют 20% эмульсию фекалий, на втором - оформленные фекалии.

Для приготовления 20% эмульсии 20 г кала растирают в ступке и добавляют 80 мл воды; полученную эмульсию фильтруют через двойной слой марли, стерилизуют в автоклаве, разливают пипеткой в пробирки по 9 мл и добавляют по 1 мл  КОЕ/мл суспензии M.terrae. Опыты начинают ставить с концентрации, вызывающей гибель тест-микроорганизма в моче с белком через 30 минут. Приготовленную эмульсию фекалий заливают равным или двойным объемом дезинфицирующего раствора и дальше производят высевы так же, как и при обеззараживании мочи. Результаты учитывают через 21 сутки.

При положительных результатах проводят опыты с большим количеством оформленных фекалий (200-250 г). Для этого помещают их в сосуд, заливают дезинфицирующим раствором или засыпают сухими ДС в равном или двойном количестве по отношению к весу фекалий, определяют происходит ли гомогенизация фекалий. Затем небольшую часть каловых масс размешивают стеклянной палочкой с жидкостью, а остальную массу оставляют в виде небольших комочков. Через определенные промежутки времени (например, 30, 60 мин) проводят посев.

Посев жидкой части фекалий производят так же, как в опытах с мочой. Плотные же части (комочки) забирают бактериологической петлей и помещают в 5 мл соответствующего нейтрализатора, растерев их о края пробирки и тщательно перемешав. Затем стерильной пипеткой переносят из этой пробирки 1 мл смеси во вторую пробирку, тоже содержащую нейтрализатор. Как из первой, так и из второй пробирки производят посев по 0,1 мл на скошенную поверхность питательной среды в пробирках (не менее чем в три пробирки). Предварительный результат учитывают через 10-14 суток, а окончательный - через 21 сутки.

Контролем служат аналогично поставленные опыты с добавлением вместо дезинфицирующего раствора воды. Результаты опытов учитывают по отношению к контролю, который принимают за 100%. Судят об эффективности исследуемого средства на основании не менее трех опытов с совпадающими результатами. Эффективным считают средство и режим его применения, обеспечивающий 100% гибель тест-микроорганизмов в обеззараживаемом материале.

Обеззараживание крови и мокроты. В качестве тест-объектов при оценке туберкулоцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания крови, используют кровь, а мокроты - куриный белок. Для контаминации тест-объектов тест-микроорганизмом к 9 мл 40% крови или 50% куриного белка добавляют по 1 мл суспензии тест-микроорганизма, содержащей  КОЕ/мл, перемешивают и разливают по 1 мл в стерильные флаконы. Затем во флаконы засыпают или наливают исследуемое ДС в объемных (5%, 10% и т.д.) соотношениях к исследуемому материалу. Через определенные промежутки времени (1 час, 2 часа и т.д.) с помощью стерильной бактериологической петли производят отбор пробы смеси и переносят ее в 5 мл нейтрализатора для нейтрализации остаточного действия ДС на тест-микроорганизм. По истечении 5 мин из этой пробирки с помощью пипетки производят высев по 0,2 мл исследуемой пробы на скошенную поверхность питательной среды в пробирках. Пробирки с посевами инкубируют при ()°С.

Предварительный результат роста тест-микроорганизмов на чашках учитывают через 10-14 суток, а окончательный - через 21 сутки.

Эффективным считают средство, обеспечивающее 100% гибель тест-микроорганизма в обеззараживаемом материале.

5.2.3.9. Исследование туберкулоцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания медицинских отходов

При изучении туберкулоцидной активности ДС с целью разработки режимов обеззараживания медицинских отходов используют тест-объекты из резин, пластмасс, текстильных материалов, стекла, металлов [19]. Для приготовления тест-объектов стерильные одноразовые изделия медицинского назначения (бинты, ватные тампоны, фрагменты систем для переливания крови и лекарственных препаратов, катетеры, шпатели, шприцы, иглы перчатки, одноразовое белье, салфетки, пипетки, трубки и пр.) измельчают и погружают в суспензию тест-микроорганизма, содержащую  КОЕ/мл с добавлением 80% инактивированной лошадиной сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота. После достаточного пропитывания объекты извлекают в сухую стерильную емкость и подсушивают в термостате при 37°С в течение 20 мин или при комнатной температуре 18-20°С и относительной влажности воздуха 50-60% в течение 1 ч.

Контаминированные тест-объекты погружают в емкость с испытуемым дезинфицирующим раствором так, чтобы он полностью закрывал их. Контроль эффективности обеззараживания объектов проводят через каждые 15-30 мин в течение времени до 360 мин. Для этого тесты из различных материалов (по два каждого наименования) извлекают из дезинфицирующего раствора, промывают в растворе соответствующего нейтрализатора, из полученных смывов производят посев по 0,1 мл на поверхность твердой питательной среды. Контрольные тест-объекты погружают в стерильную водопроводную воду на срок максимальной экспозиции, а затем высевают на скошенную поверхность питательной среды. Пробирки с посевами помещают в термостат при температуре ()°С. Окончательный учет результатов проводят на 21 сутки.

Критерий эффективности обеззараживания медицинских отходов - 100% гибель M.terrae на тест-объектах, обработанных ДС.

5.2.3.10. Методы определения туберкулоцидной активности ДС при обеззараживании воздуха

Химические ДС применяют для обеззараживания воздуха в помещениях в виде аэрозолей или паров растворов ДС, а также газов.

При исследовании эффективности обеззараживания воздуха химическими ДС с целью разработки режима его применения при туберкулезе в качестве тест-микроорганизмов используют M.terrae.

Исследования проводят в испытательных камерах объемом 1 или 2 . Предварительно внутреннюю поверхность камеры моют раствором моющего средства, остатки которого затем смывают водопроводной водой и включают бактерицидный УФ-облучатель. В центре камеры располагают продезинфицированный вентилятор, производительностью 15-25 , назначение которого - предотвращение быстрого оседания микроорганизмов.

Для определения эффективности обеззараживания воздуха используют аспирационный метод.

В камере распыляют суспензию тест-микроорганизма в количестве, достаточном для создания в воздухе камеры концентрации микроорганизмов   (определяется опытным путем).

Аэрозоль дезинфицирующего средства создают с помощью распыливающей аппаратуры, которая обеспечивает образование в воздухе не менее 80% частиц с дисперсностью 10-15 мкм, и включают вентилятор. Затем в камере распыляют раствор исследуемого средства и через определенные промежутки времени проверяют обсемененность воздуха.

Аспирационный метод основан на аспирации воздуха через жидкость. При использовании аспирационного метода для оценки эффективности обеззараживания воздуха необходимо следующее оборудование:

- воздуходувка с производительностью 15-25 л/мин;

- стерильные склянки Дрекселя с 50 мл стерильной водопроводной воды из расчета 2 шт. на 1 пробу. Предварительно в стерильную воду вносят нейтрализатор, соответствующий испытуемому ДС.

- трубка диаметром 8-10 мм, длиной 50-60 см, которая вводится в камеру для забора проб воздуха в центре камеры;

- стерильные резиновые шланги, соединяющие склянки Дрекселя (последовательно одну за другой) и далее с воздуходувкой.

Подготовка камеры к эксперименту осуществляется, как указано выше. На исследование отбирается 50 л воздуха (объем пробы).

Последовательность отбора проб следующая:

1 - проведение контроля обсемененности воздуха до начала распыления суспензии тест-микроорганизмов;

2 - проведение контроля обсемененности воздуха после распыления суспензии тест-культуры;

3 - проведение контроля эффективности обеззараживания воздуха - отбор проб через каждые 5-10 мин в зависимости от предполагаемой эффективности ДС.

После отбора проб жидкость из 2-х склянок Дрекселя смешивают и по 1мл вносят в пробирки со скошенной питательной средой. Посевы помещают в термостат. Предварительный учет результатов проводят через 10-14 суток, окончательный - через 21 сутки. Критерий эффективности обеззараживания воздуха - 100%.

5.2.4. Методы исследования и оценки туберкулоцидной активности ДС в практических условиях

Практические испытания проводят в тех случаях, когда ДС содержит новое действующее вещество и требуется подтверждение эффективности разработанных в лабораторных условиях режимов в отношении возбудителей туберкулеза и микобактериозов.

Испытания проводят в соответствии с Инструкцией по испытанию ДС, оценивая туберкулоцидную эффективность, безопасность применения и надежность рекомендованных мер предосторожности, физико-химические качества ДС: растворимость, запах, наличие моющего действия и пр.

При оценке эффективности ДС предварительно оценивают обсемененность объектов окружающей среды, имеющих эпидемиологическое значение при туберкулезе, до проведения дезинфекции (фон) и сравнивают ее с обсемененностью этих объектов после обработки рабочим раствором ДС.

Эффективным считают средство, после обработки которым в соответствии с режимом, указанным в Инструкции, на объектах не обнаруживают возбудителей туберкулеза, микобактериозов и S.aureus.

По завершении испытаний оформляется акт испытаний, в котором отражаются указанные выше параметры и другие отмеченные свойства.

5.2.5. Приложения

Приложение 1
(справочное)

Характеристика тест-микобактерий по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам.

представляют собой полиморфные, неподвижные, неспорообразующие палочки, размером 0,2-0,6 х 1-10 мкм (как и другие виды микобактерий). - грамположительные, аэробы, растут на элективных питательных средах на яичной основе (реакция среды почти нейтральная (рН 6,8-7,2)): Петраньяни, Левенштейна-Йенсена, "Новая" и др. при оптимальной температуре 37°С, хотя могут расти при температуре 25-38°С. Колонии на плотных питательных средах представляют собой шероховатые, матовые, выпуклые образования ярко оранжево-желтого цвета. Оранжево-желтая окраска колоний обусловлена пигментом, который образуется при культивировании в темноте. Длительность роста на питательных средах составляет от 5-х до 7-ти суток. На элективных синтетических питательных средах (например, Миддлбрука 7Н9 с 10% ростовой добавки ADC, 7Н10 с 10% ростовой добавки OADC) растет плохо или вообще не растет.

В мазках из молодых культур имеют вид коротких, толстых палочек, расположенных поодиночке. В старых культурах имеют овоидную, колбовидную или веретенообразную форму. Окрашиваются по Циль-Нильсену в малиново-красный цвет.

проявляют более выраженную каталазную активность, чем вирулентные виды микобактерий, и в большей степени, чем последние, разлагают перекись водорода. Пероксидаза более устойчива к температурным воздействиям, чем таковая вирулентных микобактерий. не свертывают молоко, не разжижают желатины.

По классификации патогенных для человека микроорганизмов , как и все микобактерии, относятся к IV группе опасности, являются непатогенными микроорганизмами.

используют для оценки эффективности камерного обеззараживания вещей, одежды и других объектов как наиболее адекватную модель возбудителя туберкулеза к температурному воздействию.

Тест-микроорганизм хранится в музее ФГУН "Научно-исследовательский институт дезинфектологии" Роспотребнадзора (117246, Москва, Научный проезд, д. 18).

Mycobacterium terrae (АТСС 15755, DSM 43227) представляют собой короткие прямые палочки малиново-красного цвета, располагающиеся в мазке параллельно друг другу, наподобие частокола. Микобактерии M.terrae неподвижные, грамположительные, не образующие спор и капсул. В связи с высоким содержанием миколовых кислот плохо окрашиваются обычными методами, но хорошо окрашиваются по Циль-Нильсену в малиново-красный цвет.

Микобактерии M.terrae - аэробы, температурные границы роста - от 25°С до 37°С, оптимальная температура - 37°С.

M. terrae требовательны к питательным средам, растут на элективных средах (реакция среды почти нейтральная (рН 6,4-7,0): Левенштейна-Йенсена, "Новая", Миддлбрука 7Н9 с 10% ростовой добавки ADC, 7Н10 с 10% ростовой добавки ОADC и др. Колонии M. terrae на среде Левенштейна-Йенсена - шероховатые и матовые выпуклые округлые образования, на среде "Новая" - гладкие и блестящие или с молочным или желтоватым оттенком. Длительность роста M.terrae на питательных средах зависит от состава среды. При оптимальной температуре икубирования на "богатых" питательных средах Левенштейна-Йенсена и "Новая" рост M.terrae может появиться на 5-7 сутки. На "голодных" питательных средах инкубация M. terrae составляет до 8 недель.

M.terrae гидролизуют Твин 80 (т.к. продуцируют липазы), имеют высокоактивную каталазу и проявляют активность. Восстанавливают теллурит калия до металлического теллура в течение 9 дней.

По классификации патогенных для человека микроорганизмов относится к IV группе опасности, является непатогенным микроорганизмом.

Приложение 2
(рекомендуемое)

Методики приготовления питательных сред для культивирования тест-микобактерий, предназначенных для изучения и оценки туберкулоцидной активности ДС и их субстанций

Методика приготовления среды Петраньяни

В рецептуру питательной среды входят следующие компоненты:

1) Пептон - 2 г

Крахмал - 12 г

Молоко - 300 мл

Яйца - 10 шт.

Картофель - 2 шт.

Малахитовый зеленый - 2 г

Глицерин - 24 мл

Вода - 100 мл

2). В стерильную колбу (1 л) помещают 12 г крахмала и 2 г пептона. Затем добавляют 2 шт. мелко нарезанного картофеля (картофель предварительно моют с мылом и щеткой, чистят). Доливают в колбу 300 мл свежего цельного молока и подогревают на водяной бане в течение часа (с момента начала свертывания молока) при постоянном помешивании. В другую стерильную колбу разбивают 8 диетических яиц и 2 желтка. Свежие диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 суток без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла, затем оставляют на 30 минут в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70% этиловый спирт на 30 минут. Перед тем, как начать работу с чистыми и сухими яйцами, рекомендуется тщательно вымыть руки с мылом и щеткой. Яйца тщательно взбивают до однородной массы и переливают в колбу со смесью крахмала, пептона, картофеля и молока. Сюда же добавляют 24 мл глицерина и 16 мл 2% раствора малахитовой зелени. Полученную смесь тщательно перемешивают, фильтруют через стерильную марлевый фильтр в стерильную колбу. Для свертывания среды используют специальные аппараты-свертыватели типа "АСПС". Пробирки с разлитой в них средой помещают в специальные штативы с подобранным углом наклона для формирования скошенной поверхности среды высотой 8-10 см. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 85°С в течение 45 минут.

3). Приготовление раствора малахитового зеленого:

Малахитовый зеленый - 2 г

Стерильная дистиллированная вода - 100 мл

Взвешенный порошок малахитового зеленого растворяют в стерильной теплой дистиллированной воде и помещают раствор в термостат на 1-2-2,5 часа для большего растворения. Затем фильтруют раствор через бумажный фильтр, разливают по флаконам или небольшим колбам и стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (121°С) в течение 30 минут. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению, и при появлении осадка или изменении окраски его заменяют свежим раствором.

Методика приготовления картофельно-глицеринового бульона

Готовят картофельный отвар. На 1 л питьевой воды берут 200 г очищенного (картофель предварительно моют с мылом и щеткой, чистят) картофеля, отваривают в течение 30 мин с момента закипания, остужают и отстаивают. Затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр и доводят водой до первоначального объема, добавляют 10 мл глицерина. рН картофельного бульона 7,0-7,2. Бульон стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (121°С) в течение 30 минут.

Методика приготовления картофельно-глицеринового агара

В рецептуру питательной среды входят следующие компоненты:

Картофельно-глицериновый бульон

Пептон - 5 г

Мел - 1 г

Агар-агар - 20 г

Вода - 1 л

К картофельно-глицериновому бульону добавляют 5 г пептона, 20 г агар-агара, 1 г мела, устанавливают рН 7,0-7,2. Агар расплавляют и разливают в пробирки или колбы. Стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (121°С) в течение 30 минут.

Методика приготовления среды Миддлбрука 7 H 9 (бульон) с 10% ADC ростовой добавкой (MADC-бульон для хранения замороженных культур при минус 70°С)

Миддлбрук 7H9 порошок бульона	4,7 г
Глицерин ()	100,0 мл
Вода (стерильная, дистиллированная)	750,0 мл

Ингредиенты соединить, перемешать, стерилизовать в паровом стерилизаторе при 1,1 атм. (121°С) в течение 10 минут, охладить до 45°C. Добавить в асептических условиях 100 мл ростовой добавки ADC и стерильной дистиллированной воды до 1000,0 мл.

pH среды будет эквивалентен в бульоне, остывшем до 25°C.

Методика приготовления среды Левенштейна-Йенсена

Среда Левенштейна-Йенсена - международная среда, широко используемая в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности.

Это плотная яичная среда, на которой видимый рост M.terrae получают приблизительно на 7-10-й день после посева. Для чистоты эксперимента желательно использовать готовую питательную среду в стандартных пробирках с завинчивающимися крышками. При невозможности приобретения готовой среды, ее можно приготовить самостоятельно.

В состав среды Левенштейна-Йенсена входят следующие компоненты:

1). Раствор минеральных солей:

Калий однозамещенный фосфорнокислый	2,4 г
Магний лимоннокислый	0,6 г
Магний сернокислый	0,24 г
L-аспарагин	3,6 г
Глицерин	12,0 мл
Вода дистиллированная	600 мл

Вышеперечисленные ингредиенты растворяют в теплой дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане. L-аспарагин рекомендуется растворять отдельно и вносить последним. Затем солевой раствор стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (121°С) в течение 20-30 минут. Срок хранения раствора составляет 3-4 недели при комнатной температуре.

2). Раствор малахитового зеленого:

Малахитовый зеленый - 2 г

Стерильная дистиллированная вода - 100 мл

Взвешенный порошок малахитового зеленого растворяют в стерильной теплой дистиллированной воде и помещают раствор в термостат на 1-2-2,5 часа для большего растворения. Затем фильтруют раствор через бумажный фильтр, разливают по флаконам или небольшим колбам и стерилизуют при 1 атм. (121°С) в течение 30 минут. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению, и при появлении осадка или изменении окраски его заменяют свежим раствором.

3). Яичная масса

Свежие диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 суток без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла, затем оставляют на 30 минут в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70% этиловый спирт на 30 минут. Перед тем, как начать работу с чистыми и сухими яйцами, рекомендуется тщательно вымыть руки с мылом и щеткой. Затем в стерильном боксе разбивают яйца стерильным ножом в стерильную посуду, доводя общий объем яичной массы до 1 л (для этого требуется в среднем 20-25 яиц, в зависимости от их величины). Тщательно взбивают яичную массу стерильным венчиком или в стерильном миксере при минимальной скорости.

Приготовление среды.

В большую стерильную емкость, соблюдая правила асептики, помещают следующие растворы:

Раствор минеральных солей - 600 мл

Гомогенизированная яичная масса - 1000 мл

Смесь тщательно перемешивают и фильтруют через 4-х слойный стерильный марлевый фильтр. Добавляют 20 мл раствора малахитового зеленого, тщательно перемешивают, избегая образования пены, и в течение не более 15 минут разливают в пробирки приблизительно по 5 мл, следя за тем, чтобы в растворе не сформировался осадок.

Коагуляция (свертывание) среды.

Для свертывания среды используют специальные аппараты-свертыватели типа "АСПС". Пробирки с разлитой в них средой помещают в специальные штативы с подобранным углом наклона для формирования скошенной поверхности среды высотой 8-10 см. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 85°С в течение 45 минут.

Хранение среды.

Готовую питательную среду проверяют на стерильность, помещая 10 пробирок из вновь приготовленной партии в термостат при 37°С на 3 суток. По истечении времени инкубации в пробирках на питательной среде должен отсутствовать микробный рост. В случае наличия роста приготовленная партия среды подлежит уничтожению. Приготовленная партия среды должна иметь этикетку с датой изготовления и сохраняться в холодильнике при 4°С с тщательно закрытыми пробками для предотвращения высыхания. Срок хранения среды не должен превышать 4 недели.

Методика приготовления среды "Новая"

Среда "Новая" - это плотная яичная среда, на которой хороший рост колоний M. terrae получают приблизительно на 5-7-й день после посева материала (проб).

В рецептуру питательной среды "Новая" входят следующие компоненты (в весовых %):

Калий фосфорнокислый одноосновной	0,05
Натрий лимоннокислый	0,05
Магний сернокислый	0,05
Натрий пировинограднокислый (гликокол)	0,2
Глицерин	3,6
Малахитовая зелень	0,036
Желтки яиц	50,0
Дистиллированная вода	до 100,0

Способ получения концентрированной питательной среды заключается в смешивании сухих навесок ингредиентов солей (кроме бактерицидного красителя) с желточной массой, стерилизации ингредиентов 70% этиловым спиртом, растворении бактерицидного красителя в глицерине и соединении всех компонентов среды.

Для получения 1 литра концентрированной питательной среды необходимо:

- сделать навески: однозамещенного фосфорно-кислого калия - 1 г, лимоннокислого натрия - 1 г, сернокислого магния - 1 г, натрия пировинограднокислого (гликокола) - 4 г и каждую навеску поместить в стерильную фарфоровую ступку.

- обеззаразить навески путем смачивания каждой навески 1 мл 70% этилового спирта. Затем поместить ступки с навесками в термостат при температуре 37°С и высушить при периодическом помешивании в течение 45 минут.

- приготовить 1 литр желточной массы. 50 штук куриных яиц обработать снаружи с целью обеззараживания 70° спиртом. Затем отделить белок от желтка. Перенести желточную массу в мерную колбу и тщательно гомогенизировать.

Приготовить желточно-солевую смесь. К 1 литру желточной массы добавить обеззараженные навески и перемешать.

Приготовить раствор бактерицидного красителя. Навеску 700 мг малахитовой зелени смочить 1 мл 700 спирта и соединить с 70 мл глицерина (это соответствует 1% раствору малахитового зеленого в глицерине).

Получение концентрированной питательной смеси. Производят соединение 1 л желточно-солевой смеси с 70 мл 1% раствора малахитового зеленого в глицерине и тщательно гомогенизируют. Полученную концентрированную питательную смесь (среду) выдерживают в течение суток при комнатной температуре и разливают среду во флаконы емкостью 250 мл, которые герметично упаковывают и маркируют. Укупоренные флаконы с концентрированной питательной средой хранят в холодильнике при 3-5°С в течение 3-4 недель.

Приготовление рабочей (используемой при тестировании ДС) плотной питательной среды в пробирках. К концентрированной питательной среде добавляют равный объем стерильной дистиллированной воды (1 : 1), гомогенизируют, разливают по 5 мл в пробирки. Для образования скоса питательной среды пробирки укладывают в наклонном положении в свертыватель, предварительно нагретый до 90°С. Среду коагулируют 20 минут при температуре 82-83°С. Контроль приготовленной партии среды на стерильность осуществляют также, как описано для среды Левенштейна-Йенсена.

Пробирки с питательной средой могут храниться в холодильнике при температуре 5°С в течение 4 недель. При длительном хранении необходимо пробирки герметично укупорить и поместить в полиэтиленовые пакеты, чтобы предотвратить высыхание среды.

Приложение 3
(рекомендуемое)

Материалы и оборудование, необходимые для изучения туберкулоцидной активности ДС

Химические вещества:

Магний сернокислый - ГОСТ 4523-77;

Натрий лимоннокислый - ГОСТ 22280-86;

Калий фосфорнокислый однозамещенный - ТУ-6-09-5324-87;

Натрий пировинограднокислый - ТУ 6-09-08-990-83;

Глицерин - ГОСТ 6259-75;

Малахитовый зеленый - ТУ-6-09-1557-77;

Вода дистиллированная - ГОСТ 6709-77;

Желтки куриных яиц;

Магний лимоннокислый - ТУ-6-09-1770-77;

L- аспарагин - импортный реактив;

Миддлбрук 7Н9 порошок бульона - импортная среда;

10% ADC ростовая добавка - импортный реактив;

нейтрализующий бульон Ди-Ингли - фирма HIMEDIA;

спирт этиловый, ректификационный технический, ГОСТ 18300-72;

стерильная дистиллированная вода;

Оборудование:

Весы лабораторные (например, весы для химических реактивов с точностью до 0,01 г, ГОСТ 24104-80, рекомендованные к применению приказом МЗ РФ N 109). Аппарат для свертывания питательных сред (например, АСПС - "Торгмаш", рег. N 29/07020401/3573-02).

Термостат на 37°С (например, термостат суховоздушный ТВ-80-"ПК-К", рег. N 98/219-151).

Низкотемпературная морозильная камера для хранения тест-культур микроорганизмов (например, морозильник сверхнизких температур MDF - 4086S, рег. N 60202380).

Камера на 1 или 2  с необходимыми приспособлениями для изучения обеззараживания воздуха.

Микроскоп.

Аэрозольный генератор.

Гидропульт, автомакс, "Квазар".

Шейкер (например, шейкер лабораторный S-3.02, рег.N 14413 ГОСТ 12.2.05.).

Бытовой холодильник (например, холодильник-морозильник STINOL 256Q сер.N 103410881041).

Плита электрическая бытовая, ГОСТ 14919-83.

Штативы лабораторные химические, ТУ 48-0534-8-87.

Тест-объекты: ткань бязевая и батистовая; поверхности размером 10х10см из различных материалов; предметы ухода за больными; игрушки мелкие и крупные из различных материалов; медицинские инструменты разнообразные по форме, характеру поверхности и материалу; жесткий и гибкий эндоскопы; набор резиновых и пластиковых трубок; столовая посуда и приборы; лабораторная посуда и посуда из-под выделений; бинты, вата.

Секундомер механический, ГОСТ 8.423-81;

Термометры, ГОСТ 215-73;

Карандаш по стеклу, ТУ 46-22-904-78;

Лабораторная посуда:

Пипетки вместимостью 1,0 и 10,0  2-го класса точности, ГОСТ 20292-74;

Пробирки химические, ГОСТ 10515-6;

Чашки Петри, ГОСТ 25336-82;

Спиртовка лабораторная, ГОСТ 25336-82 или газовая горелка;

Цилиндры вместимостью 100,0 и 250,0 , ГОСТ 1770-74;

Колбы вместимостью 100,0; 250,0 и 1000,0 ГОСТ 25 336-82;

Склянки Дрекселя.

5.3. Методы изучения и оценки фунгицидной активности дезинфицирующих средств

5.3.1. Общие положения

5.3.1.1. Тест-микроорганизмы для изучения фунгицидной активности ДС и их субстанций. Требования к тест-грибам

При изучении фунгицидной активности ДС и их субстанций в качестве тест-микроорганизмов используют культуры грибов: Candida albicans (штамм 15) - для оценки фунгицидной активности в отношении возбудителей кандидозов, Тrichophyton gypseum (муз. штамм НИИД) - для оценки фунгицидной активности в отношении возбудителей дерматофитий, Aspergillus niger (муз. штамм НИИД) для оценки фунгицидной активности в отношении плесневых грибов рода Aspergillus.

При сертификационных испытаниях [66] и экспертной оценке ранее зарегистрированных ДС набор тест-микроорганизмов может быть ограничен наиболее устойчивыми представителями каждой группы.

Условия культивирования тест-грибов. Тест-микроорганизмы культивируют на следующих питательных средах:

C.albicans - на бульоне Сабуро, агаре Сабуро при температуре плюс 27°C в течение 2-10 суток;

T.gypseum - на бульоне Сабуро, агаре Сабуро при температуре плюс 27°C в течение 28 суток.

A.niger - на бульоне Сабуро, агаре Сабуро при температуре 37°C в течение 2 суток, а затем выдерживают 3-5 суток при температуре плюс °C в темном месте.

Музейные культуры указанных выше микроорганизмов хранят при температуре плюс °C в ампулах (после лиофильной сушки) или на плотных питательных средах (посев уколом) под слоем стерильного вазелинового масла (толщина слоя 1,5-3 мм), а рабочие культуры - на скошенном агаре или в бульоне.

Тест-микроорганизмы должны иметь типичные биохимические, морфологические, тинкториальные, культуральные и ферментативные свойства, присущие данному виду и обладать стандартной устойчивостью к эталонным ДС: растворам хлорамина, перекиси водорода, Катамина АБ - алкилдиметилбензиламмония хлорида (АДБАХ), глутарового альдегида (таблица 5.7.).

Таблица 5.7

Устойчивость тест-микроорганизмов к дезинфицирующим средствам

Дезинфицирующее средство	Концентрация раствора по ДВ, %	Время гибели тест-грибов, мин не менее
		C.albicans	T.gypseum	A.niger
Хлорамин	1,0*	35	50	-
АДБАХ	0,5	5	25	-
Глутаровый альдегид	1,0 2,0 2,5	15 - -	- 30 -	- - 60
Перекись водорода	4,0 6,0	- >60	50 -	- 60

Примечание - Знак (*) обозначает, что концентрация раствора указана по препарату.

Методы приготовления суспензии тест-микроорганизмов. Определение биологической концентрации тест-грибов в суспензии. Культуры тест-грибов подвергают контролю их качества. В частности, непосредственно перед использованием культур для исследовательских целей необходимо убедиться в том, что тест-штаммы, выросшие на питательной среде, не загрязнены посторонней микрофлорой. Для оценки роста культур тест-грибов визуально просматривают каждую пробирку и учитывают характер и массивность роста, изменение цвета питательной среды.

Рабочие суспензии тест-грибов готовят из культуры данного тест-штамма, выращенного на питательной среде.

Культуру T.gypseum, выращенную на бульоне Сабуро при температуре плюс 27°C в течение 28 суток, извлекают петлей из пробирки, помещают в фарфоровую ступку и растирают с небольшим количеством стерильного физиологического раствора до гомогенной взвеси с минимальным размером частиц. Полученную суспензию фильтруют через стерильный ватно-марлевый фильтр и доводят с помощью физиологического раствора по оптическому стандарту мутности (ФГУН Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора) N 20 до концентрации  КОЕ/мл.

Культуру C.albicans выращивают на агаре Сабуро в течение 2 суток при температуре плюс 27°C в течение 48 часов. Затем ее смывают с питательной среды небольшим количеством стерильного физиологического раствора и тщательно перемешивают. Полученную суспензию фильтруют и разводят так же, как и культуру T.gypseum.

Культуру A.niger, выращенную на бульоне Сабуро в течение 2 суток и выдержанную в течение 3-5 суток в темном месте, извлекают петлей из пробирки, помещают в фарфоровую ступку и растирают с небольшим количеством стерильного физиологического раствора до гомогенной суспензии с минимальным размером частиц. Полученную взвесь фильтруют через стерильный ватно-марлевый фильтр и доводят до концентрации  КОЕ/мл по оптическому стандарту мутности.

В связи с тем, что суспензия может содержать наряду с живыми мертвые микроорганизмы, необходимо определять биологическую концентрацию тест-грибов. Для этого проводят десятикратные разведения суспензии тест-гриба в стерильной дистиллированной воде с последующим высевом суспензии в чашки Петри с плотной питательной средой (агар Сабуро). После определенного времени инкубации при соответствующей температуре подсчитывают количество выросших колониеобразующих единиц (КОЕ) и определяют количество жизнеспособных клеток в одном мл суспензии.

Устойчивость тест-грибов к растворам эталонных ДС определяют методом батистовых тест-объектов (п. 5.3.2.2). Проверку устойчивости проводят не реже 1 раза в месяц. При снижении резистентности культур делают их пересевы на обогащенные питательные среды до восстановления устойчивости.

Приготовление рабочих растворов ДС и их субстанций проводят в соответствии с п. 5.1.1.2.

5.3.2. Методы исследований и оценки результатов фунгицидной активности ДС и их субстанций in vitro

Целью исследований является определение уровня и спектра фунгицидной активности ДС и их субстанций.

Субстанции (действующие вещества), предназначенные для производства ДС должны соответствовать следующим требованиям:

хорошо растворяться в воде или других растворителях;

обладать фунгицидным действием, т.е. убивать грибы, а не задерживать их рост;

иметь удовлетворительные органолептические (по цвету, запаху) и физико-химические (по растворимости, биоразлагаемости и стабильности при хранении и др.) свойства.

Фунгицидную активность ДС и их субстанций определяют суспензионным методом или методом батистовых тест-объектов.

5.3.2.1. Суспензионный метод

Для приготовления растворов ДС в различных концентрациях ДВ средства разводят или растворяют в стерильной питьевой воде и по 4,5 мл разливают в стерильные пробирки. Добавляют по 0,5 мл суспензии тест-гриба (см. п. 5.3.1.1.), содержащей  КОЕ/мл, и тщательно перемешивают. Через определенные интервалы времени (15 мин) по 0,5 мл взвеси "тест-микроорганизм +ДВ" добавляют к 4,5 мл соответствующего нейтрализатора. Тщательно перемешивают и оставляют на 5 мин. Затем по 0,5 мл вносят в пробирку с 4,5 мл стерильной питьевой воды, после чего 0,1 мл из этой пробы вносят в пробирки с 5 мл жидкой и на поверхность твердой питательной среды. В контрольных опытах вместо ДВ используют стерильную питьевую воду, а посевы делают в среду без нейтрализатора и с нейтрализатором.

Температура инкубирования посевов в термостате и сроки учета результатов опыта зависят от вида микроорганизма (п. 5.3.1.1). Для подтверждения снятия биоцидного действия ДВ из пробирок, в которых отсутствовал рост тест-грибов, ежедневно делают пересев по 0,5 мл в 4,5 мл новой питательной среды.

Результаты опыта оценивают по наличию или отсутствию роста грибов в жидкой и на твердой питательной среде. Сравнение проводят с контролем опыта, которым является посев тест-грибов в питательную среду без добавления действующего вещества.

Эффективной считают концентрацию средства, при которой трижды повторенный опыт при определенном времени воздействия дает отрицательный результат (отсутствие роста грибов) при наличии типичного роста тест-гриба в контроле.

5.3.2.2. Метод батистовых тест-объектов

Приготовление суспензии грибов проводят в соответствии с п. 5.3.1.1. Подготовку батистовых тест-объектов, их контаминацию и постановку эксперимента осуществляют так, как указано в п. 5.1.2.2.

Хранят контаминированные тест-объекты в чашках Петри в холодильнике при температуре плюс 4°C.

Срок хранения тест-объектов, контаминированных C.albicans - 4 суток, T.gypseum и A.niger - 30 суток.

Критерием активности ДВ (субстанции) является 100% гибель тест-грибов (отсутствие роста в опытных пробах) при времени дезинфекционной выдержки: C.albicans, T.gypseum, A.niger - не более 60 мин.

5.3.2.3. Методы исключения фунгистатического действия действующих веществ

Для определения фунгицидного и исключения фунгистатического действия ДВ по истечении экспозиции необходимо прекратить воздействие ДВ на тест-культуру. Это достигается путем использования следующих методов:

- применения химического нейтрализатора;

- посева в большой объем питательной среды;

- ежедневного пересева на новые питательные среды.

Применение химического нейтрализатора ДВ, контроль его эффективности и полноты нейтрализации ДВ при воздействии на культуры грибов проводят в соответствии с п. 5.1.2.3.

Критерии отбора действующих веществ (субстанций). Критерием отбора действующего вещества в качестве субстанции для создания ДС, предназначенных для обеззараживания объектов, контаминированных тест-грибами, является наличие у него фунгицидной активности.

Гибель тест-микроорганизмов должна составлять 100% при времени действия (мин) ДС в минимальной концентрации в отношении:

- грибов C.albicans, T.gypseum - не более 60 мин.

- A.niger - не более 120 мин.

5.3.2.4. Методы изучения факторов, влияющих на фунгицидную активность ДС и их субстанций

Исследования включают определение спектра фунгицидного действия ДС, а при проведении углубленного изучения дополнительно определяют влияние различных факторов (рН, температура, органические вещества) на фунгицидную активность растворов ДС.

Изучение спектра фунгицидной активности и влияние на активность различных факторов проводят методом батистовых тест-объектов, контаминированных тест-культурами C.albicans, T.gypseum, A.niger.

Изучение зависимости активности ДС от присутствия органических веществ и рН, а также изучение влияния температуры на активность исследуемого ДС проводят в соответствии с п. 5.1.2.4.

Критерии оценки фунгицидной активности ДС. Для ДС, предназначенных для обеззараживания различных объектов, гибель тест-грибов должна составлять 100% при времени действия (мин) дезинфицирующего раствора в минимальной концентрации ДВ в отношении:

грибов C.albicans, T.gypseum - не более 60 мин;

A.niger - не более 120 мин.

Влияние факторов среды на активность ДС учитывается при разработке оптимальных режимов и применении ДС в практике.

5.3.3. Методы исследования фунгицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания различных объектов внешней среды, контаминированных тест-грибами

Цель исследования - разработка режимов применения ДС с учетом условий их дальнейшего применения в практике для обеззараживании ИМН, предметов ухода за больными, игрушек, белья, поверхностей, посуды, выделений и пр., в зависимости от вида контаминации, концентрации действующего вещества, времени воздействия, нормы расхода, характера объекта, наличия на нем органического загрязнения и его специфики, температуры, способа и кратности обработки.

5.3.3.1. Исследование фунгицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания ИМН

При выборе ДС для изучения с целью последующей рекомендации для обеззараживания изделий медицинского назначения (ИМН) следует учитывать:

назначение и кратность применения изделия (многократного или однократного применения);

наличие у средства негативных свойств, например, корродирующего или фиксирующего действия и др., ограничивающих возможности его использования или требующих индивидуального методического подхода при исследовании;

материал (материалы) из которого изготовлено изделие;

функциональные особенности изделия и условия его эксплуатации, обуславливающие особенности методики проведения эксперимента и последующих рекомендаций по технологии их обеззараживания.

Определения эффективности ДС при обработке ИМН из различных материалов (кроме эндоскопов). В качестве тест-изделий используют стерильные инструменты и изделия медицинского назначения (катетеры, микропипетки, пластмассовые шпатели и др.) из различных материалов (металлов, резин, стекла, пластмасс) или имитирующие их тест-объекты. Перечень инструментов, взятых в эксперимент, должен включать не менее трех инструментов, имеющих замковые части (щипцы, ножницы, корнцанг) и не менее двух, не имеющих замковых частей (пинцеты, шпатели), а также стоматологические, в том числе вращающиеся, инструменты (не менее 4) - бор, бурав корневой, зеркало, диск шлифовальный. В качестве тест-изделий из резин, стекла, пластмасс используют фрагменты изделий (катетеров, микропипеток, шпателей и пр.).

В качестве тест-грибов используют суспензии культур C.albicans, T.gypseum. На поверхность тест-изделия (у замковых изделий - в область замка, а при наличии каналов и полостей - также в канал изделия) с помощью пипетки наносят по 0,1 мл 1 млрд суспензии того или иного вида тест-микроорганизмов, содержащей 40% инактивированной лошадиной сыворотки. Тест-изделия подсушивают до полного высыхания. Мелкие тест-изделия погружают в указанную суспензию грибов на 15 мин, затем их извлекают и подсушивают (до полного высыхания). Дезинфицирующие растворы готовят на стерильной питьевой воде.

После подсушивания контаминированные изделия полностью погружают в раствор испытываемого ДС, заполняя им все каналы и полости изделий, избегая образования воздушных пробок. Инструменты, имеющие замковые части, погружают раскрытыми, предварительно сделав ими в растворе ДС несколько рабочих движений для лучшего проникновения раствора в труднодоступные участки изделий в области замка. Толщина слоя раствора ДС над изделиями должна быть не менее 1 см. Параллельно для контроля изделия погружают в воду.

Через определенное время (от 5 до 120 мин) изделия извлекают из раствора и марлевой салфеткой размером 5 х 5 , пропитанной нейтрализатором, с поверхности изделия делают смывы, затем салфетку помещают в пробирку с 10 мл того же нейтрализатора и встряхивают с бусами в течение 5-10 мин. Канал изделия промывают раствором нейтрализатора. Мелкие изделия погружают в раствор нейтрализатора на 5 мин, а затем переносят в пробирки с жидкой питательной средой. Для контроля эффективности обеззараживания смывную жидкость с поверхности изделия и из канала засевают на соответствующие питательные среды (п. 5.3.1.1.). Посевы выдерживают в термостате при температуре и времени, оптимальных для роста использованного тест-микроорганизма.

Кратность постановки эксперимента должна быть достаточной для получения статистически достоверных результатов.

Эффективным считают режим (концентрация-время-температура), обеспечивающий гибель тест-грибов на всех изделиях. При наличии положительных проб эксперимент повторяют, увеличивая концентрацию или время воздействия.

Критерий эффективности обеззараживания - 100% гибель C.albicans, T.gypseum.

Время обеззараживания изделий, контаминированных C.albicans, T.gypseum - не более 120 мин.

5.3.3.2. Исследование фунгицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания эндоскопов, включая дезинфекцию высокого уровня (ДВУ)

Для определения эффективности ДС при обеззараживании эндоскопов в качестве тест-объектов используют стерильные фрагменты эндоскопа или эндоскоп (гибкий - гастроскоп, жесткий - цистоскоп), а в качестве тест-гриба - C.albicans.

На наружную поверхность тест-объекта наносят по 0,1 мл 1 млрд. суспензии C.albicans, содержащей 5% сыворотки; через канал эндоскопа с помощью пипетки пропускают не менее 5 мл такой же суспензии. После этого эндоскоп подсушивают в течение 20 мин. Затем контаминированное изделие погружают в раствор ДС, заполняя полости и каналы эндоскопа. Через определенные интервалы времени в течение 5-60 мин изделие извлекают из раствора и делают смыв с наружной поверхности марлевой салфеткой, смоченной в растворе нейтрализатора. Канал изделия промывают нейтрализатором. Смывную жидкость засевают на соответствующие питательные среды.

Критерий эффективности обеззараживания эндоскопов - 100% гибель C.albicans не более чем через 60 мин.

Определение эффективности ДС при дезинфекции высокого уровня (ДВУ) эндоскопов. Данная методика предназначена для разработки режимов дезинфекции высокого уровня (ДВУ) эндоскопов при проведении "нестерильных" диагностических и лечебных манипуляций.

ДС, предназначенное для ДВУ эндоскопов должно обеспечивать гибель на эндоскопах C.albicans.

Для исследования выбирают ДС, эффективное для стерилизации эндоскопов, и испытания его проводят при тех же условиях (концентрация, температура), что и при стерилизации эндоскопов, определяя необходимое время дезинфекционной выдержки для достижения гибели тест-микроорганизма. При определении эффективности средств для ДВУ эндоскопов в качестве тест-объектов используют фрагменты канала гибкого эндоскопа или его имитаторы в виде трубок из пластика длиной 2 см, диаметром 2 мм.

Стерильные тест-объекты искусственно контаминируют, нанося с помощью дозатора/микропипетки в центральную часть канала и на поверхность каждой трубки суспензию C.albicans из расчета клеток C.albicans на каждое изделие. Для имитации органического загрязнения к суспензии микроорганизмов перед контаминацией объекта добавляют 2% инактивированной лошадиной сыворотки.

Контаминированные тест-объекты подсушивают при комнатной температуре (плюс 18-22°C) в течение 20 мин.

Дезинфицирующий раствор готовят на стерильной питьевой воде согласно п. 1.2. Обработку исследуемым ДС осуществляют способом погружения в испытуемый дезинфицирующий раствор. Через определенные интервалы времени, зависящие от химического состава средства, в промежутке от 5 до 60 мин, тест-изделия извлекают из дезинфицирующего раствора, помещают на 5-10 мин в раствор соответствующего нейтрализатора.

Затем тест-изделия помещают в пробирки с питательной средой для проверки эффективности обеззараживания: для С.albicans - бульон Сабуро.

Посевы выдерживают в термостате при температуре и времени, оптимальных для роста использованного тест-микроорганизма: для С.albicans - плюс 27°C 7 суток, после чего проводят учет результатов эксперимента.

В качестве контроля используют тест-объекты, контаминированные как указано выше и помещенные в воду на время дезинфекционной выдержки.

Кратность постановки эксперимента должна быть достаточной для получения статистически достоверных результатов.

Эффективным считают режим (концентрация-время-температура), обеспечивающий гибель тест-микроорганизма на всех тест-изделиях при отсутствии его роста в питательной среде. Положительной считается проба с характерным ростом микроорганизма, дающая изменение питательной среды (помутнение, осадок, хлопья и т.д.) или положительный результат (характерный рост микроорганизма) при пересеве на плотную питательную среду, или обнаружение микроорганизмов в растворе применявшегося нейтрализатора. При наличии положительных проб эксперимент повторяют, увеличивая время воздействия, но не более чем до 60 мин.

При необходимости эффективность разработанного режима проверяется в практических условиях.

Критерий эффективности обеззараживания - 100% гибель C.albicans.

Время обеззараживания - не более 60 мин.

Примечание: средство должно обладать стерилизующим действием [16, 73].

5.3.3.3. Исследование фунгицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания стоматологических оттисков

При разработке режимов обеззараживания стоматологических оттисков в качестве тест-микроорганизма используют C.albicans. В качестве тест-объектов используют оттиски из альгинатных, силиконовых или других материалов. Для изготовления оттисков слепочную массу, полученную в соответствии с рекомендациями изготовителя, помещают в пластмассовую или металлическую ложку и делают оттиск с пластмассовых зубных протезов с моделированной десной. На оттиски наносят по 0,1 мл 1 мрлд суспензии C.albicans (с добавлением 40% инактивированной сыворотки), подсушивают их в течение 2-3 мин, затем полностью погружают в раствор ДС. При установленном фиксирующем действии ДС оттиски перед погружением в дезинфицирующий раствор промывают проточной питьевой водой. Параллельно для контроля контаминированные оттиски погружают в воду. Через определенное время (5-30 мин) оттиски извлекают из раствора и марлевой салфеткой, пропитанной нейтрализатором, делают смывы. Салфетки помещают в стерильные пробирки с бусами, содержащие 10 мл нейтрализатора, и встряхивают в течение 10 мин. Затем делают посев смывной жидкости на питательные среды для контроля эффективности обеззараживания.

Критерий эффективности обеззараживания - 100% гибель C. albicans при времени обеззараживания не более 60 мин.

5.3.3.4. Исследование фунгицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания предметов ухода за больными, игрушек

При изучении эффективности ДС используют тест-объекты, имитирующие предметы ухода за больными, или непосредственно предметы ухода (подкладные клеенки, резиновые грелки, судна, объекты из стекла и пластмасс: термометры, пластмассовые наконечники для клизм и др.), игрушки (пластмассовые, металлические, деревянные, резиновые, кроме мягких).

В качестве тест-микроорганизмов используют C.albicans и T.gypseum. Для имитации загрязнения используется 40% инактивированной лошадиной сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота. Для этого перед контаминацией объектов к суспензии тест-грибов добавляют необходимое количество сыворотки.

Перед контаминацией тест-грибами тест-объекты подвергают механической очистке - моют водой с мылом и щеткой.

После подсушивания контаминированные тест-объекты располагают горизонтально и на них пипеткой наносят суспензию тест-грибов из расчета 0,5 мл 2 миллиардной взвеси на площадь в 100 . Суспензию равномерно распределяют по поверхности тест-объектов стеклянным шпателем, подсушивают (до полного высыхания) при комнатной температуре плюс 18-20°C и относительной влажности воздуха 50-60%, затем обрабатывают дезинфицирующим раствором.

Обработку предметов ухода за больными и игрушек проводят способами протирания, погружения и для крупных игрушек - орошения (капельное).

Норму расхода дезинфицирующего раствора при обеззараживании способами протирания или орошения определяют в зависимости от способа обработки аналогично опытам по обеззараживанию поверхностей (п. 5.3.3.6.). Двукратное протирание или орошение проводят через 5-15 мин после первого.

При обработке способом погружения в дезинфицирующий раствор предметов ухода за больными и мелких игрушек последний должен полностью и с избытком покрывать все объекты. При погружении мелких игрушек необходимо препятствовать их всплытию.

Время обеззараживания объектов определяют в интервале от 15 до 120 мин в зависимости от вида тест-гриба и наличия органического загрязнения.

Контрольные тест-объекты обрабатывают стерильной питьевой водой из того же расчета, что и опытные.

Контроль эффективности обеззараживания тест-объектов проводят следующим образом: марлевой салфеткой (размером 5 х 5 ), смоченной в растворе нейтрализатора соответствующего для данного ДС, тщательно протирают тест-объект и погружают ее в 10 мл этого же нейтрализатора, находящегося в пробирках с бусами. Время отмыва марлевой салфетки 10 мин при постоянном встряхивании. Отмывную жидкость сеют на 2-3 чашки по 0,2-0,5 мл в каждую на твердые питательные среды.

Посевы помещают в термостат при температурах плюс 28°C или плюс 37°C и учитывают результаты через 2-28 суток в зависимости от вида тест-микроорганизма.

Критерий эффективности обеззараживания - не менее 100% гибели тест-грибов.

Время обеззараживания объектов, контаминированных C.albicans, T.gypseum - не более 120 мин.

5.3.3.5. Исследование фунгицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания белья

Эффективность обеззараживания белья ДС определяют с помощью тест-объектов, представляющих собой кусочки ткани из бязи размером 2 х 2 см. В качестве тест-культур используют грибы C.albicans и T.gypseum. Стерильные тест-объекты пропитывают 2-х млрд суспензией тест-грибов из расчета 20 мл на 10 тест-объектов и подсушивают в термостате. Далее контаминированные тест-объекты помещают в стерильные бязевые мешочки размером 5 х 8 см по 2 штуки в каждый.

При разработке режима обеззараживания загрязненного белья к суспензии грибов перед контаминацией тест-объектов добавляют 40% инактивированной сыворотки (6 мл 2-х млрд взвеси C.albicans или T.gypseum смешивают с 4 мл инактивированной сыворотки) или 40% фекальной эмульсии (6 мл 2-х млрд взвеси C.albicans смешивают с 4 мл фекальной эмульсии). Для приготовления фекальной эмульсии 8 г фекалий растирают в ступке с 20 мл воды. Контаминированные тест-объекты подсушивают в термостате при плюс 37°C в течение 20-25 мин или 1,5-2 часа при комнатной температуре до полного высыхания.

При разработке режимов обеззараживания белья, не загрязненного выделениями, белье погружают в емкость с дезинфицирующим раствором из расчета 4 л раствора на 1 кг сухого белья. При разработке режимов обеззараживания белья, загрязненного выделениями, его погружают в емкость с дезинфицирующим раствором из расчета 5 л раствора на 1 кг сухого белья. Белье погружают в раствор последовательно, одну вещь за другой, следя за тем, чтобы между вещами не образовывалось воздушных полостей, препятствующих процессу дезинфекции. Мешочки с контаминированными тест-объектами распределяют между слоями белья (сверху, в середине, внизу). Через заданное время воздействия дезинфектанта (например, 15, 30, 60 мин) извлекают по 1 мешочку с каждого уровня, стерильным пинцетом вынимают тест-объекты, переносят их в раствор нейтрализатора на 5 мин, затем промывают 5 мин в стерильной питьевой воде, затем помещают в жидкие питательные среды. В контрольных опытах вместо дезинфицирующего раствора используют стерильную питьевую воду.

Критерий эффективности - 100% гибель тест-грибов.

Время обеззараживания (мин) белья без видимых загрязнений, контаминированного C.albicans, T.gypseum - не более 240.

Время обеззараживания (мин) белья, загрязненного выделениями и контаминированного C.albicans, T.gypseum - не более 240.

5.3.3.6. Исследование фунгицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания поверхностей

Исследования проводят в зависимости от вида поверхностей, их положения (горизонтальное, вертикальное), способа и кратности обработки.

При разработке режимов обеззараживания поверхностей используют поверхности размером 10 х 10  из различных материалов: гладкие, шероховатые, впитывающие и не впитывающие (деревянные, оштукатуренные, поверхности, окрашенные масляной, силикатной, водоэмульсионной или клеевой краской; оклеенные обоями, поверхности из линолеумных покрытий, поверхности из окрашенного или неокрашенного металла - нержавеющая хром - никелевая кислотостойкая сталь, пластика, стекла, искусственной или натуральной кожи, поверхности из облицовочной плитки - кафельной и метлахской, фаянса и др.), но не менее 5 видов поверхностей. В качестве тест-культур используют C.albicans, T.gypseum; A.niger используют для разработки режимов обеззараживания поверхностей с целью профилактики и борьбы с плесенью. Для имитации загрязнения поверхностей санитарно-технического оборудования при контаминации C.albicans, T.gypseum используют белковое загрязнение в виде 40% инактивированной лошадиной сыворотки; Для имитации загрязнения поверхностей унитазов при контаминации C.albicans используют загрязнение в виде 40% фекальной эмульсии. Для этого перед контаминацией объектов к суспензии грибов C.albicans, T.gypseum добавляют необходимое количество сыворотки и к суспензии C.albicans - необходимое количество фекальной эмульсии.

Перед контаминацией культурой грибов поверхности подвергают механической очистке - моют водой с мылом и щеткой (за исключением поверхностей, оклеенных обоями и окрашенных клеевой краской). Последние протирают несколько раз стерильной салфеткой, увлажненной стерильной водопроводной водой.

Высушенные поверхности располагают горизонтально и на них пипеткой наносят взвесь тест-грибов из расчета 0,5 мл 2 миллиардной микробной взвеси на площадь в 100 . Культуру равномерно распределяют по поверхности стеклянным шпателем. Поверхности подсушивают (до полного высыхания) при комнатной температуре 18-20°C и относительной влажности воздуха 50-60%, затем обрабатывают дезинфицирующим раствором.

При изучении эффективности обеззараживания линолеум, плитку метлахскую, искусственную или натуральную кожу, стекло располагают горизонтально, а дерево, окрашенное масляной, силикатной, водоэмульсионной или клеевой красками, поверхности, оклеенные обоями, пластик, кафельную и фаянсовую плитки - вертикально.

Обработку поверхностей проводят способами протирания или орошения (крупнокапельное и аэрозольное).

Для определения нормы расхода при однократной обработке дезинфицирующий раствор наносят с помощью пипетки на поверхность размером 10 х 10 см при применении способа протирания в количестве 1,0, 1,5 или 2,0 мл, а при крупнокапельном орошении наносят с помощью дозатора 1,5-3,0 мл. При аэрозольном методе обработки изучают эффективность обеззараживания при норме расхода 30-50-100  (в зависимости от вида аэрозольного генератора и применяемой аэрозольной насадки). Многократное протирание или орошение проводят с интервалом между обработками 5-15-30 мин.

Время обеззараживания поверхностей определяют в интервале от 5 до 120 мин. Выбор экспозиции зависит от назначения и рекомендуемых условий применения средства.

Контрольные поверхности обрабатывают стерильной питьевой водой также и из того же расчета, что и опытные.

Исследования проводят при комнатной температуре. При необходимости оценивают эффективность обеззараживания поверхностей при повышенной до 50°С или пониженной до -30°C температуре (исследования проводят в термо- или холодильной камере).

Для контроля эффективности обеззараживания тест-поверхностей марлевой салфеткой (размером 5 х 5 ), смоченной в растворе соответствующего для данного дезинфицирующего средства нейтрализатора, тщательно протирают тест-поверхность, затем ее погружают в 10 мл этого же нейтрализатора, находящегося в пробирках с бусами. Время отмыва марлевой салфетки 10 мин при постоянном встряхивании. Отмывную жидкость сеют (на 2-3 чашки по 0,1-0,2 мл в каждую) на твердые дифференциально-диагностические питательные среды.

Посевы выращивают в термостате при температуре плюс 28°C. Учет результатов проводят в течение 2-7 суток (C.albicans, A.niger) и 21-28 суток (T.gypseum) путем подсчета количества выросших колоний, затем рассчитывают плотность контаминации 100  поверхности и % обеззараживания, принимая количество колоний, снятых с контрольных поверхностей, за 100%.

Критерий эффективности обеззараживания поверхностей - не менее 99,99% гибели тест-грибов; время обеззараживания (мин) при контаминации C.albicans, T.gypseum - не более 240, A.niger - не более 360.

5.3.3.7. Исследование фунгицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживании посуды

В зависимости от назначения ДС исследования проводят при обеззараживании посуды столовой и кухонной, лабораторной и из-под выделений.

В качестве тест-объектов при разработке режимов обеззараживания столовой и кухонной посуды используют тарелки, стаканы, кружки из различных материалов (фарфор, фаянс, алюминий, стекло, пластик, посуда, покрытая эмалью); столовые приборы - ножи, вилки, ложки из различных материалов (нержавеющая сталь, алюминий, пластик); лабораторной посуды - предметные и покровные стекла, пипетки, чашки Петри, планшеты для иммунологического анализа и др.; посуды из-под выделений - подкладные судна, мочеприемники, горшки, плевательницы и др. или тест-объекты их имитирующие. В качестве тест-микроорганизмов при контаминации столовой посуды используют C.albicans, лабораторной - C.albicans, T.gypseum.

При разработке режимов обеззараживания посуды с остатками пищи суспензию C.albicans смешивают с овсяной, манной или другой кашей, сваренной на молоке со сливочным маслом (к 10 г каши добавляют 1 мл 2-х миллиардной микробной взвеси).

Для имитации загрязнения чайной посуды используют кисель (к 10 г киселя добавляют 1 мл 2-х миллиардной суспензии C.albicans), лабораторной посуды - 40% инактивированной сыворотки (6 мл 2-х млрд суспензии C.albicans или T.gypseum смешивают с 4 мл инактивированной сыворотки), а посуды из-под выделений - 40% фекальную эмульсию, контаминированную C.albicans (на 10 мл - 1 мл суспензии).

Перед контаминацией тест-грибами посуду (столовую и лабораторную) и столовые приборы подвергают механической очистке - моют водой с мылом и щеткой. Посуду располагают горизонтально и на нее пипеткой наносят взвесь тест-грибов из расчета 0,5 мл 2-х миллиардной суспензии на площадь в 100 . Культуру равномерно распределяют по поверхности посуды стеклянным шпателем. Столовые приборы для контаминации погружают в бактериальную суспензию на 1-2 мин, оставляя незараженными их ручки.

Посуду подсушивают (до полного высыхания) при комнатной температуре 18-20°C и относительной влажности воздуха 50-60%, затем обрабатывают дезинфицирующим раствором.

Обработку столовой, чайной, лабораторной посуды и столовых приборов проводят способом погружения в дезинфицирующий раствор. Растворы готовят на питьевой воде. Температура испытуемого раствора 18-20°C. При необходимости изучают эффективность растворов, имеющих температуру 50°C.

Контролем служит аналогично контаминированная посуда, которая погружается в такой же объем стерильной питьевой воды.

Дезинфицирующий раствор должен полностью и с избытком покрыть всю посуду (столовую и лабораторную) и столовые приборы (из расчета не менее 2 л на 1 комплект).

Через определенные интервалы времени (например, 15, 30, 60 мин и т.д.) извлекают из дезинфицирующего раствора по одному предмету (например, тарелка, стакан, предметное стекло, нож и т.д.) и стерильной марлевой салфеткой (размер 5 х 5 ), смоченной в растворе нейтрализатора, соответствующего данному ДС; тщательно протирают контаминированную часть каждого предмета, погружают салфетку в 10 мл этого же нейтрализатора, находящегося в пробирках с бусами. Время отмыва марлевой салфетки 10 мин при постоянном встряхивании. После отмыва марлевую салфетку погружают в соответствующую жидкую питательную среду. Отмывную жидкость сеют на 2-3 чашки по 0,2-0,5 мл в каждую на твердые питательные среды.

Посевы помещают в термостат при температуре 28°C и учитывают результат через 2-7 суток (C.albicans) и 21-28 суток (T.gypseum).

Время обеззараживания посуды определяют в интервале от 15 до 240 мин в зависимости от вида тест-микроорганизма и наличия загрязнения.

Критерий эффективности обеззараживания - не менее 100% гибель тест-грибов.

Время обеззараживания столовой посуды без остатков пищи, контаминированной C.albicans - не более 60 мин.

Время обеззараживания посуды с остатками пищи, контаминированной C.albicans- не более 120 мин.

Время обеззараживания лабораторной посуды, контаминированной C.albicans, T.gypseum - не более 120 мин.

Время обеззараживания посуды из-под выделений, контаминированной C.albicans - не более 120 мин.

5.3.3.8. Исследование фунгицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания выделений

ДС, предназначенные для обеззараживания выделений, должны обладать способностью гомогенизировать органический субстрат (фекалии, мокрота). Препараты, не обладающие этим свойством, для обеззараживания выделений не пригодны.

Изучение активности дезинфицирующих средств при обработке выделений проводят с учетом их консистенции и соотношения с дезинфицирующим раствором или сухим препаратом.

В качестве тест-микроорганизмов при разработке режимов обеззараживания выделений используют C.albicans.

Определение эффективности обеззараживания мочи проводят следующим образом: берут несколько пробирок, наливают в них по 9 мл мочи, прибавляют по 1 мл суспензии C.albicans, содержащей  мк/мл. Неразведенное ДС или его растворы добавляют к моче в различных соотношениях (равном, двойном и т.д.). По истечении времени воздействия (15, 30, 60, 90, 120 мин) пипеткой берут 1 мл опытной смеси и переносят в нейтрализатор объемом 9 мл, а затем из нее 1 мл смеси в пробирку с 5 мл бульона. После тщательного перемешивания 1 мл переносят во вторую пробирку с бульоном, а затем делают посевы по 0,1 мл на твердые питательные среды, как из первой, так и из второй пробирок. Чашки Петри с посевами ставят в термостат.

Контролем служат аналогично поставленные опыты с добавлением к моче не дезинфицирующего раствора, а стерильной питьевой воды.

Эффективным считают ДС, обеспечивающее 100% гибель C.albicans в 6-8 опытах с совпадающими результатами.

Определение эффективности обеззараживания фекалий: 20 г фекалий растирают в ступке и добавляют 80 мл стерильной воды. Полученную эмульсию фильтруют через двойной слой марли, разливают в пробирки по 9 мл и добавляют по 1 мл суспензии культуры C.albicans, содержащей  мк/мл.

Приготовленную эмульсию фекалий заливают равным или двойным количеством дезинфицирующего раствора или вносят различное количество сухого препарата. После контакта с ДС производят высевы так же, как и при обеззараживании мочи. Результаты учитывают через двое суток.

При положительных результатах проводят опыты с большим количеством оформленных фекалий (200-250 г). Для этого помещают их в сосуд и заливают дезинфицирующим раствором в равном или двойном количестве по отношению к весу фекалий или засыпают сухим препаратом. Затем небольшую часть фекальных масс стеклянной палочкой перемешивают с жидкостью, а остальную массу оставляют в виде небольших комочков. Через определенные промежутки времени (30, 60, 90 и 120 мин) проводят раздельные высевы жидкой части и комочков.

Жидкую часть фекальных масс набирают пипеткой и производят посев так же, как мочи. Плотные части фекалий забирают петлей и опускают в 5 мл питательной среды, растерев их о край пробирки и тщательно перемешав с бульоном; затем переносят из этой пробирки 1 мл смеси во вторую пробирку, также содержащую 5 мл бульона. Как из первой, так и из второй пробирки производят посев по 0,1 мл на чашки Петри с плотной питательной средой.

Контролем служат аналогично поставленные опыты с добавлением к фекальной эмульсии стерильной воды вместо ДС.

Об эффективности исследуемого ДС судят на основании 6-8 опытов с совпадающими результатами. Эффективным считают средство, обеспечивающее 100% гибель C.albicans в обеззараживаемом материале.

Критерий эффективности обеззараживания выделений - 100% гибель тест-гриба. Время обеззараживания выделений, контаминированных C.albicans - не более 6 часов.

5.4. Методы определения активности антимикробных материалов (тканей, лакокрасочных покрытий)

Определение активности антимикробных материалов проводят комплексно с использованием методов: "агаровых пластин" и капельного нанесения тест-микроорганизмов на тест-образцы из антимикробных материалов [21].

Оценка активности антимикробных тканей. Определение антимикробной активности текстильных материалов проводят с использованием метода "агаровых пластин". При оценке активности тканей контролем служат образцы тканей тех же артикулов, не содержащие антимикробных веществ.

Для определения антимикробной активности тканей в зависимости от целевого назначения используют следующие тест-микроорганизмы: S.aureus, E.coli, , T.gypseum.

Метод "агаровых пластин" дает качественную оценку антимикробной активности исследуемых образцов, т.к. он позволяет определить наличие или отсутствие антимикробного эффекта. Методически он может быть выполнен 2-мя способами:

Способ N 1. Растопленный на водяной бане и охлажденный до плюс 45°C питательный агар (100 мл) смешивают с 1 мл взвеси тест-микроорганизма, содержащей КОЕ/мл, и разливают в чашки Петри по 20 мл. На поверхность застывшего агара накладывают тест-образцы испытываемой ткани размером 2 х 2 см. Чашки помещают в термостат при плюс 28°C или плюс 37°C в зависимости от тест-микроорганизма. Учет результатов антимикробной активности в отношении S.aureus и E.coli проводят через 24-48 часов, в отношении - через 5 суток, в отношении T.gypseum - через 21-28 суток определяя величину зон задержки роста микроорганизмов путем измерения расстояния от края тест-образца до границы роста микроорганизмов вокруг теста.

Способ N 2. К 16 часовой бульонной культуре E.coli или S.aureus добавляют 0,9% раствор поваренной соли в соотношении 1 : 2. В стерильные чашки Петри наливают 12 мл питательного агара; после застывания на его поверхности равномерно распределяют шпателем 0,1 мл приготовленной взвеси тест-культур; затем сверху помещают тест-образцы ткани размером 2 х 2. Выращивание тест-культур и учет результатов проводят как в первом способе.

Критерии лабораторной оценки эффективности антимикробных тканей.

Антимикробные ткани, исследованные методом "агаровых пластин", считают эффективными, если зона задержки роста тест-микроорганизмов не менее 4 мм.

Антимикробная активность тканей не должна снижаться при многократных (не менее 10) стирках более чем на 15%.

Оценка антимикробной активности лакокрасочных покрытий. Определение антимикробной активности лакокрасочных покрытий проводят с использованием капельного нанесения тест-микроорганизмов. В качестве тест-микроорганизмов используют E.coli и S.aureus. В зависимости от предполагаемой области применения антимикробных покрытий перечень тест-микроорганизмов может быть расширен (, C.albicans, A.niger).

На тест-поверхность размером 10 х 10 , окрашенную антимикробной краской или покрытую антимикробным лаком, стерильной пипеткой наносят 0,5 мл суспензии тест-микроорганизма, содержащей  КОЕ/мл. После необходимой дезинфекционной выдержки в течение определенного промежутка времени в период от 30 мин до 24 часов с поверхности берут смыв стерильной марлевой салфеткой, смоченной стерильным раствором нейтрализатора. Салфетки помещают в пробирки с бусами, содержащие 10 мл нейтрализатора и в течение 5-10 мин встряхивают. Затем проводят посевы смывной жидкости на плотные питательные среды. Посевы выдерживают в термостате при температуре и времени, оптимальным для роста использованного тест-микроорганизма. В качестве контроля используют поверхности, окрашенные краской или покрытые лаком, не содержащими антимикробных веществ. Активность лакокрасочных материалов оценивают путем расчета процента снижения микробной обсемененности опытного образца по сравнению с контрольным.

Критерий антимикробной активности лакокрасочных покрытий - снижение обсемененности не менее чем на 90% через 24 часа после нанесения тест-микроорганизмов, указанных выше.

Изучение пролонгированного действия лакокрасочных материалов. Изучение пролонгированного действия лакокрасочных покрытий проводят на тест-поверхностях с дополнительной искусственной контаминацией тест-микроорганизмами.

На тест-поверхности регулярно 1 раз в неделю в течение 6 месяцев наносят по 0,5 мл суспензии тест-микроорганизмов, содержащей  КОЕ/мл. Эффективность обеззараживания оценивают 1-2 раза в месяц.

Критерий антимикробной активности ЛКМ - снижение обсемененности не менее, чем на 90% через 24 часа после нанесения тест-микроорганизмов и пролонгированное антимикробное действие не менее 6 мес.

5.5. Методы определения эффективности кожных антисептиков

5.5.1. Общие положения

По назначению кожные антисептики подразделяются на 5 групп для:

1) гигиенической обработки рук [52, 66];

2) обработки рук хирургов (и других лиц, участвующих в оперативных вмешательствах и приеме родов);

3) обработки кожи операционного поля и локтевых сгибов доноров;

4) обработки кожи инъекционного поля;

5) санитарной (общей или частичной) обработки кожных покровов.

Кожные антисептики должны [23]:

- обладать широким спектром антимикробного действия за короткое время;

- убивать транзиторную микрофлору и снижать количество резидентной микрофлоры;

- обеспечивать обеззараживание кожных покровов в течение от 30 сек до 5 мин (в зависимости от назначения);

- обладать пролонгированным антимикробным (остаточным) действием в пределах от 1 до 3 часов;

- быть безопасными в рекомендованных режимах применения при многократном использовании;

- выпускаться в виде готовых к применению растворов, концентратов, дезинфицирующих салфеток, пропитанных кожным антисептиком, аэрозолей (беспропеллентных аэрозольных упаковок), гелей, кремов антисептических, мыл (жидких и твердых).

Целью изучения кожных антисептиков является разработка эффективных режимов обеззараживания кожных покровов в зависимости от концентрации активно-действующих веществ, времени воздействия, а также способа и кратности обработки.

До изучения эффективности антисептиков при обработке кожных покровов определяют спектр антимикробного действия их, используя батистовые тест-объекты, контаминированные следующими тест-микроорганизмами: для оценки бактерицидной активности - Е.соli (шт. 1257), S.аureus (шт. 906), Р.aeruginosa (шт. АТСС 27853); туберкулоцидной активности - ; фунгицидной активности - С.аlbicans (шт. 15); вирулицидной активности - вирус полиомиелита 1 типа (вакцинный штамм LSc 2ab) [23].

5.5.2. Определение эффективности кожных антисептиков, предназначенных для гигиенической обработки рук

Методы изучения эффективности кожных антисептиков для гигиенической обработки рук включают определение эффективности кожного антисептика в отношении естественной микрофлоры кожи рук и при искусственной контаминации их тест-микроорганизмом [52, 66].

Изучение эффективности кожных антисептиков в отношении общей микрофлоры кожи рук. С контрольной руки до обработки кожным антисептиком делают смыв стерильной марлевой салфеткой, смоченной стерильным раствором нейтрализатора.

Затем обе руки обрабатывают кожным антисептиком, после чего с опытной руки делают смыв стерильной марлевой салфеткой размером 5 х 5 см, смоченной в стерильном растворе нейтрализатора (п. 2.3). Марлевые салфетки помещают в отдельные широкогорлые пробирки со стеклянными бусами и 10 мл стерильного физиологического раствора и отмывают в течение 10 мин. Затем смывную жидкость вносят по 0,5 мл в чашку Петри и заливают казеиновым агаром, по 0,2 мл на среду Эндо и желточно-солевой агар. Посевы инкубируют в термостате при 37°C в течение 48 часов, после чего считают выросшие колонии.

Критерий эффективности антисептика [23] - снижение общей микробной обсемененности кожи не менее, чем на 95%.

Изучение эффективности кожных антисептиков в отношении искусственно контаминированной кожи рук тест-микроорганизмом. Для искусственной контаминации кожи рук испытателей используют суспензию 18-20 часовой бульонной культуры E.coli (штамм 1257), выращенной в термостате при температуре 37°C.

На ладонь наносят 1 мл суспензии, содержащей  КОЕ/мл и равномерно распределяют ее по поверхности кисти рук. После подсыхания микробной взвеси в течение 2-3 мин с контрольной руки делают смыв стерильной марлевой салфеткой, смоченной стерильным раствором нейтрализатора. После смыва руку осушают стерильным ватным тампоном для удаления остатков жидкости.

Затем обе руки обрабатывают кожным антисептиком, после чего с опытной руки также делают смыв, как с контрольной.

Смывы с кожи рук и посев их на питательную среду Эндо делают так, как указано выше.

Критерий эффективности антисептика - снижение обсемененности кожи тест-микроорганизмом Е.соli не менее, чем на 99,99% [23].

Пролонгированное антимикробное действие кожных антисептиков оценивают на руках испытателей в отношении общей микрофлоры кожи.

Руки испытателей обрабатывают кожным антисептиком в течение 30 сек - 1 мин. Затем с одной (контрольной) руки у каждого испытателя делают смыв стерильной марлевой салфеткой, смоченной стерильным раствором нейтрализатора, после чего испытатели выполняют работу на своем рабочем месте, но в течение всего эксперимента (от 30 мин до 3-х часов) не моют руки водой и туалетным мылом. Смывы с другой (опытной) руки делают стерильной марлевой салфеткой, смоченной в стерильном растворе нейтрализатора, через каждый час от начала эксперимента (от 30 мин до 3-х часов). Каждый час смывы делают у разных испытателей. Марлевые салфетки после взятия смывов помещают в отдельные широкогорлые пробирки со стерильным физиологическим раствором (по 10 мл в каждой) и стеклянными бусами, встряхивают в течение 10 мин. Затем производят посев смывной жидкости из опытных и контрольных пробирок на казеиновый агар как указано выше. Посевы инкубируют в термостате при 37°C в течение 48 часов, после чего подсчитывают выросшие колонии.

Если, кожный антисептик обладает пролонгированным антимикробным действием, то на протяжении нескольких часов после обработки рук антисептиком количество микроорганизмов, обнаруживаемое в смывах, остается минимальным (по сравнению с тем количеством, которое обнаруживается сразу после обработки рук антисептиком).

5.5.3. Определение эффективности кожных антисептиков, предназначенных для обработки рук хирургов

Изучение эффективности кожных антисептиков для обработки рук хирургов проводят в два этапа [66]:

1 этап обработки рук проводится с целью удаления загрязнений и снижения количества общей микрофлоры. При этом руки испытателей, включая запястья и предплечья, обрабатывают следующим способом.

Перед применением антисептика кисти рук и предплечий (до локтевого сгиба) моют теплой проточной водой и туалетным (но не с антимикробными добавками) мылом в течение двух минут. После этого под водой смывают мыло с каждой руки и предплечья (поочередно). При этом кисти рук должны быть выше положения локтей, а не наоборот. Затем кисти рук и предплечья высушивают стерильной марлевой салфеткой.

До обработки кожным антисептиком (далее антисептик), с одной руки (контрольной) делают смыв стерильной марлевой салфеткой, смоченной физиологическим раствором.

2 этап обработки рук. На сухие кисти обеих рук испытателей наносят от 3 мл до 5 мл изучаемого антисептика и равномерно распределяют его по тыльной и ладонной поверхности кожи обеих рук, постепенно переходя на предплечья. При этом втирают антисептик путем последовательных движений рук вверх-вниз (не доходя до локтевого сгиба). При обработке кожным антисептиком необходимо поддерживать руки во влажном состоянии в течение подбираемого времени обеззараживания для конкретного кожного антисептика (не более 5 мин) и следить за тем, чтобы кисти рук были выше положения локтей. Последнюю порцию антисептика втирают до его высыхания.

По истечении времени обработки (не более 5 мин) марлевой салфеткой, смоченной нейтрализатором, делают смыв с кожи рук испытателей и его посев.

Критерий эффективности антисептика [23] - снижение общей микробной обсемененности кожи рук испытателей на 100%.

Определение остаточного (антимикробного) действия кожного антисептика (средства) на коже после обработки рук испытателей в режиме применения, рекомендованном для обработки рук хирургов, проводят на естественно обсемененной коже рук испытателей.

После предварительного мытья кистей рук и предплечий испытателей (до локтевого сгиба) теплой проточной водой и туалетным (но не с антимикробными добавками) мылом в течение двух минут, с каждой руки и предплечья (поочередно) смывают мыло водой. При этом кисти рук должны быть выше положения локтей, а не наоборот. Затем кисти рук и предплечья высушивают стерильной марлевой салфеткой.

На руки наносят испытуемое средство и проводят им обработку (обеззараживание) рук.

Испытатели надевают на руки стерильные хирургическиt перчатки и выполняют в них обычную работу на протяжении трех часов.

Через каждый час испытатели снимают перчатки, не выворачивая их. В каждую перчатку наливают по 10 мл стерильного раствора нейтрализатора или физиологического раствора, омывая внутренние поверхности перчаток этим раствором в течение 5 минут. После этого делают посев смывной жидкости в количестве 0,5 мл на чашки Петри и заливают растопленным и остуженным до 40-45°C питательным агаром.

Учет результатов проводят через 48 часов инкубирования посевов в термостате при плюс 37°C, определяя наличие или отсутствие роста микроорганизмов.

О наличии остаточного действия у изучаемого средства судят по количеству стерильных проб (отсутствие роста микроорганизмов), которое должно составлять более 50% от числа проб, отобранных у испытателей, обработавших руки средством.

5.5.4. Определение эффективности кожных антисептиков, предназначенных для обработки кожи операционного и инъекционного полей и локтевых сгибов доноров

Изучение эффективности кожных антисептиков для обработки кожи операционного поля и локтевых сгибов доноров проводят в отношении естественной микрофлоры кожи и при искусственном обсеменении кожи тест-микроорганизмом - Еsсherichia coli (шт. 1257), а инъекционного поля - только естественной микрофлоры кожи [66].

До обработки кожным антисептиком с кожи внутренней поверхности предплечья делают смыв.

Для оценки эффективности антисептика для обработки кожи операционного поля и локтевых сгибов доноров в отношении естественной микрофлоры участок кожи внутренней поверхности предплечья размером 5 х 13 см последовательно протирают в одном направлении двумя раздельными стерильными марлевыми тампонами, смоченными антисептиком, для обработки инъекционного поля - одним. Через определенное время марлевой салфеткой, смоченной нейтрализатором, с этого же участка кожи предплечья делают смыв, салфетку встряхивают в течение 10 минут в пробирке со стеклянными бусами в нейтрализаторе. Затем смывную жидкость засевают в чашки Петри в толщу казеинового агара по 0,5 мл, в чашки Петри со средой Эндо и желточно-солевым агаром по 0,2 мл. Чашки Петри с посевами инкубируют в термостате при 37°C в течение 48 часов, после чего подсчитывают колонии выросшие на поверхности среды.

Критерий эффективности антисептика, предназначенного для обработки кожи операционного поля и локтевых сгибов доноров - снижение общей микробной обсемененности кожи предплечья рук испытателей на 100%.

Критерий эффективности антисептика, предназначенного для обработки кожи инъекционного поля - снижение общей микробной обсемененности кожи предплечья рук испытателей не менее, чем на 95%.

Для оценки эффективности антисептика при искусственной контаминации на участок кожи внутренней поверхности предплечья размером 5 х 13 см наносят 0,2 мл бульонной суточной культуры Е.coli (шт. 1257), содержащий  КОЕ/мл. Затем, после ее подсыхания, наносят 0,2 мл антисептика и растирают стерильным шпателем. Через определенное время (2-3 мин) марлевой салфеткой, смоченной нейтрализатором, делают смыв с кожи предплечья, встряхивают салфетку в течение 10 минут в пробирке с бусами в нейтрализаторе. Затем делают посевы на поверхность среды Эндо. Посевы помещают в термостат; учитывают результаты через 48 часов.

Критерий эффективности антисептика - отсутствие роста тест-культуры в смывах с контаминированной кожи предплечья рук испытателей [23].

5.5.5. Определение эффективности кожных антисептиков, предназначенных для санитарной обработки кожных покровов

Оценка эффективности "кожных антисептиков - дезинфицирующих средств" для санитарной обработки кожных покровов проводится на коже предплечий рук испытателей при искусственной контаминации культурой тест-микроорганизма - E.coli (штамм 1257) [52].

На внутреннюю поверхность кожи предплечий рук наносят и равномерно распределяют по 1 мл суспензии суточной бульонной культуры E.сoli (штамм 1257), выращенной в термостате при 37°C и содержащей  КОЕ/мл.

После подсыхания тест-культуры (2-3 мин) с кожи контаминированного участка предплечья берут контрольный смыв стерильной марлевой салфеткой. Затем этот участок предплечья обрабатывают кожным антисептиком и через определенное время снова делают смыв марлевой салфеткой, смоченной в нейтрализаторе. Далее делают посев смывной жидкости и учет результатов.

Критерий эффективности антисептика [23] - снижение обсемененности кожи не менее, чем на 99,99%.

5.5.6. Определение эффективности "кожных антисептиков - моющих средств", предназначенных для гигиенической обработки рук, санитарной обработки кожных покровов

Оценка эффективности "кожных антисептиков - моющих средств" в различных формах применения, предназначенных для гигиенической обработки рук и санитарной обработки кожных покровов проводится на руках испытателей по снижению общей микробной обсемененности кожи.

До обработки кожным антисептиком с контрольной руки делают смыв. Затем руки обрабатывают антисептиком в течение 1-2 мин, после чего с опытной руки делают смыв марлевой салфеткой, смоченной в нейтрализаторе. Далее делают посев смывной жидкости и учет результатов.

Критерий эффективности антисептика - снижение общей микробной обсемененности кожи не менее, чем на 60%.

5.6. Методы определения эффективности ДС и кожных антисептиков в практических условиях

5.6.1. Общие положения

Изучение эффективности ДС в практических условиях является заключительным этапом исследования, по результатам которого даются рекомендации для его промышленного производства и применения в практике медицинской дезинфекции [52]. Практические испытания проводятся в тех случаях, когда ДС содержит новое действующее вещество и требуется подтверждение эффективности разработанных режимов.

Целью практических испытаний является уточнение целевого назначения, условий применения, дается оценка эффективности и безопасности разработанных режимов обеззараживания, надежности рекомендованных мер предосторожности, влияния на фактуру и функциональные свойства обрабатываемых объектов, выявления преимуществ и недостатков по сравнению с используемыми аналогами.

Испытания проводят в ЛПУ и/или инфекционных очагах в соответствии с Программой и Методическими указаниями по испытанию ДС, которые составляются на основании результатов ранее проведенных исследований по физико-химическим свойствам, антимикробной и дезинфицирующей активности, а также токсичности в лабораторных условиях.

В Программе должны быть указаны сроки (длительность), место проведения и цель испытаний, перечень объектов обработки, контроль параметров, объем (количество смывов).

Методические указания по проведению испытаний должны содержать конкретные сведения о назначении ДС, его характеристику (описание, физико-химические и антимикробные свойства, токсичность), способы приготовления рабочих растворов, условия и режимы применения, правила по технике безопасности и оказанию первой помощи при отравлениях.

Испытания ДС в практических условиях проводят сотрудники ЛПУ или государственного учреждения дезинфекционного профиля, или Центров гигиены и эпидемиологии, или государственные унитарные предприятия, или дезинфекционной станции. Текущую дезинфекцию проводят в одном или двух многопрофильных ЛПУ, а заключительную - не менее чем в 10 инфекционных очагах.

Перед проведением испытаний проводят входной химический контроль на соответствие опытной партии ДС требованиям Технических условий, и инструктаж медицинского персонала, проводящего испытания.

5.6.2 Определение эффективности ДС при обеззараживании различных объектов (поверхностей, белья, посуды и др.)

Оценку эффективности ДС проводят на основании обнаружения санитарно-показательных и патогенных микроорганизмов в смывах, взятых с объектов до и после проведения обеззараживания.

При испытании ДС в очагах бактериальных инфекций контроль эффективности осуществляют по обнаружению E.coli - при кишечных инфекциях; S.aureus - при инфекциях дыхательных путей; S.aureus и M.tuberculosis - при туберкулезе (M.tuberculosis определяют только в очагах с обильным бацилловыделением у пациентов или при оценке эффективности обеззараживания мокроты). При вирусных и грибковых инфекциях контроль качества дезинфекции проводят на основании обнаружения санитарно-показательных микроорганизмов - E.coli и S.aureus.

В ЛПУ об эффективности дезинфицирующего средства судят по обнаружению санитарно-показательной микрофлоры (E.coli и S.aureus), а также возбудителей внутрибольничных инфекций (P.aeruginosa, P.vulgaris, C.albicans, A.niger и других) в зависимости от профиля стационара и наличия внутрибольничной инфекции.

Для оценки эффективности ДС в практических условиях берут не менее 50 смывов (по 25 до и после дезинфекции). Пробы после дезинфекции отбирают сразу после окончания экспозиции и доставляют для анализа в лабораторию не позднее 2-х часов с момента их отбора. Пробы отбирают с объектов, имеющих эпидемиологическое значение, возможность повторной контаминации которых исключается спецификой их использования.

При ограниченных практических испытаниях, проводимых с участием исследователей ДС, из-за сложности выделения и культивирования некоторых возбудителей допускается использование тест-объектов, искусственно контаминированных микроорганизмами в лаборатории (например, при обеззараживании белья при туберкулезе, используют тесты, обсемененные , а при грибковых заболеваниях - T.gypsem).

Учет эффективности обеззараживания проводят качественным и количественным методами.

При качественном методе оценки эффективности пробы, взятые с объектов до и после дезинфекции, засевают на дифференциально-диагностические среды и проводят учет по наличию специфического роста микроорганизмов, определяя процент обнаружения микроорганизмов до и после дезинфекции. При количественном методе отобранные пробы засевают на твердые питательные среды, подсчитывают число КОЕ и определяют не только процент положительных проб, но и плотность контаминации единицы поверхности.

После обеззараживания поверхностей в помещениях, мебели, санитарно-технического оборудования, посуды, игрушек пробы отбирают путем протирания поверхностей перечисленных объектов площадью 100  увлажненными в растворе нейтрализатора стерильными марлевыми салфетками размером 5 х 5 см или ватными тампонами.

При качественном методе оценки эффективности пробы, взятые с объектов до и после дезинфекции, засевают на дифференциально-диагностические среды и проводят учет по наличию специфического роста микроорганизмов, определяя процент обнаружения микроорганизмов до и после дезинфекции. При количественном методе отобранные пробы засевают на твердые питательные среды, подсчитывают число КОЕ и определяют не только процент положительных проб, но и плотность контаминации единицы поверхности.

При контроле эффективности обеззараживания мелких предметов смыв берут со всей поверхности (или полностью объект погружают в питательную среду), а объектов большой площади - с 2-3-х участков, общей площадью 100 .

Эффективность средства при обеззараживании объектов в практических условиях оценивают, сравнивая контаминацию объектов до и после обработки.

Критерий эффективности при проведении заключительной дезинфекции - высев микроорганизмов не более 0,5%, при текущей дезинфекции на дому - не более 3%, при текущей дезинфекции в лечебно-профилактических учреждениях - высев непатогенной микрофлоры не более 2% отобранных смывов.

5.6.3. Определение эффективности ДС при обеззараживании ИМН

Изделия медицинского назначения после использования у пациента делят на 2 группы. С изделий 1-oй группы берут смыв для определения микробного фона при испытаниях. Изделия медицинского назначения (включая эндоскопы) из 2-oй группы обеззараживают в соответствии с режимами и при условиях, рекомендованных в Методических указаниях (Инструкциях) по испытанию конкретного средства.

Контроль качества дезинфекции изделий медицинского назначения осуществляют методом смывов. Взятие смывов производят стерильными марлевыми салфетками размером 5 х 5 см, простерилизованными в бумажных пакетах или чашки Петри.

Контролю подлежит 1% одновременно обработанных изделий одного наименования, но не менее 3-5 единиц.

Перед взятием смывов с объектов в широкогорлые пробирки со стеклянными бусами стерильной пипеткой разливают по 10 мл стерильного нейтрализатора, соответствующего применяемому дезинфицирующему средству. Увлажненной стерильной салфеткой протирают поверхность изделия, после чего салфетку помещают в пробирку с раствором нейтрализатора и 5 мин встряхивают.

У изделий, имеющих каналы, рабочий конец изделия опускают в пробирку со стерильным нейтрализатором и с помощью стерильного шприца или пипетки 1-2 раза промывают канал этим раствором. После этого из смывной жидкости производят высев на дифференциально-диагностические среды.

Контроль обеззараживания эндоскопов осуществляют методом взятия смывов с участков эндоскопа, труднодоступных для очистки и дезинфекции, например, дистальный конец эндоскопа, а также путем микробиологического контроля смывной жидкости, в первую очередь, из инструментального канала эндоскопа, а также других каналов, полостей и поверхностей.

О качестве дезинфекции после ее проведения судят по отсутствию на изделиях медицинского назначения золотистого стафилококка, синегнойной палочки и бактерий группы кишечной палочки.

Для обнаружения микроорганизмов в смывной жидкости ее пропускают через мембранный фильтр и затем его помещают на поверхность плотной дифференциально-диагностической среды. При отсутствии фильтрующего устройства смывную жидкость по 0,1 мл засевают на поверхность желточно-солевого, кровяного агара и среду Эндо. Посевы выдерживают в термостате при плюс 37°С в течение 48 часов.

При наличии роста микроорганизмов на агаре их идентификацию проводят в соответствии с действующими методическими документами.

5.6.4. Определение активности изделий из антимикробных тканей

Оценку эффективности изделий из антимикробных тканей проводят в лечебно-профилактических учреждениях и на промышленных предприятиях, где условия труда способствуют развитию заболеваний кожных покровов микробной этиологии, или на которых требуется обеспечение незначительного количества микроорганизмов в воздухе и на поверхностях.

Набор изделий из антимикробной ткани, подлежащих испытанию, определяют конкретно для каждого учреждения. Обычно в ЛПУ и на предприятиях это нательное и постельное белье, спецодежда персонала.

Во всех учреждениях, наряду с изделиями из испытываемой ткани /опытная группа/, исследуется группа аналогичных изделий из обычной ткани /контрольная группа/, желательно того же артикула, что и опытная группа.

Микробную обсемененность изделий из антимикробных тканей изучают методом отпечатков. Предметные стекла, разрезанные пополам, раскладывают стерильным пинцетом в стерильные чашки Петри /три половинки предметного стекла/. Питательную среду (в зависимости от тест-микроорганизма - казеиновый или мясопептонный агар, агар Сабуро, картофельно-глицериновый агар) растапливают на водяной бане и при помощи пипетки, соблюдая правила асептики, наливают на поверхность каждого стекла до его полного покрытия /1,5-2,0 мл/. Чашки с пластинками после застывания среды можно сохранять до 3-х суток в холодильнике.

Взятие посевов-отпечатков проводят следующим образом: приоткрыв чашку с пластинками, берут пальцами пластинку за края, не касаясь питательной среды. Извлекают пластинку из чашки и плотно прикладывают питательной средой к испытываемой поверхности на 2-3 секунды. После соприкосновения с поверхностью пластинки с питательной средой отпечатком кверху помещает в чашку Петри. Чашку закрывают крышкой и ставят в термостат при плюс 37°C на 48 часов, после чего производят подсчет выросших колоний. В посеве-отпечатке сохраняется естественное расположение микробных клеток.

При определении обсемененности белья пробы отбирают методом отпечатков с внутренней поверхности нательного белья в области спины /верхний край лопатки/, средней линии живота между пупком и грудиной, груди /область грудных желез, над грудными сосками. Пробы отбирают симметрично с левой и правой стороны. С наружной поверхности нательного белья пробы берут в подмышечной области и в области плечевого шва.

С наволочек, полотенец отбирают пробы в трех точках. С пододеяльников, простыней, мягкого инвентаря /шторы, ширмы, мешки для белья/ отбирают по 3-5 проб по углам и в середине.

Антимикробная активность тканей не должна снижаться при многократных (не менее 30) стирках более чем на 15%.

Критерий эффективности - отсутствие роста микроорганизмов в отобранных пробах.

5.6.5. Определение антимикробной активности лакокрасочных покрытий

Определение антимикробной активности лакокрасочных материалов в практических условиях является заключительным этапом исследования, по результатам которого даются рекомендации для применения в практике медицинской дезинфекции.

В соответствии с назначением ЛКМ поверхности в помещении окрашивают краской или покрывают лаком. Контролем служат поверхности других аналогичных помещений, обработанных ЛКМ, не содержащими биодобавок.

Оценку антимикробной активности лакокрасочных покрытий проводят на основании обнаружения санитарно-показательных и патогенных микроорганизмов в смывах, взятых с поверхностей, окрашенных испытуемой краской или покрытых лаком. В качестве контроля используют поверхности, окрашенные краской или покрытые лаком, не содержащими биодобавок.

Оценку антимикробной активности ЛКМ проводят количественным методом: отобранные пробы засевают на твердые питательные среды, подсчитывают число КОЕ и определяют процент снижения микробной обсемененности по сравнению с контролем.

Антимикробное покрытие считают эффективным при обеспечении снижения обсемененности по сравнению с контрольными поверхностями через 24 часа не менее, чем на 90% и длительности антимикробного действия не менее 6 мес.

5.6.6. Определение эффективности кожных антисептиков

Методика определения эффективности обеззараживающего действия антисептиков, предназначенных для гигиенической обработки рук. Оценку эффективности обеззараживающего действия антисептиков для гигиенической обработки рук осуществляют методом смыва. Для оценки эффективности антисептиков в практических условиях берут не менее 100 смывов (по 50 до и после обработки рук антисептиком). Смывы после обработки отбирают сразу после окончания необходимой экспозиции и доставляют для анализа в лабораторию не позднее 2-х часов с момента их отбора.

С одной руки (контрольной) до обработки рук антисептиком берут смыв стерильной марлевой салфеткой размером 5 х 5 см, смоченной в 1% растворе пептонной воды. Затем руки обрабатывают антисептиком и по истечении времени обработки с другой руки (опытной) берут смыв стерильной марлевой салфеткой размером 5 х 5 см, смоченной в нейтрализаторе. Марлевые салфетки после взятия смывов помещают в пробирки с 1% раствором пептонной воды. Пробирки инкубируют в термостате при плюс 37°C в течение 18-20 часов, после чего из них делают посевы на среду Эндо для выявления энтеробактерий и синегнойной палочки. Для выявления золотистого стафилококка делают посев на желточно-солевой агар.

Показатель эффективности обеззараживающего действия антисептика - отсутствие роста золотистого стафилококка, энтеробактерий и синегнойной палочки в отобранных смывах.

Определение эффективности обеззараживающего действия кожных антисептиков, предназначенных для обработки рук хирургов осуществляют методом смыва. Для оценки эффективности обработки рук хирургов кожными антисептиками в практических условиях, берут не менее 100 смывов (по 50 смывов до и после обработки рук антисептиком).

Смывы берут стерильной марлевой салфеткой сразу после окончания времени, необходимого для обработки рук хирургов кожным антисептиком.

До обработки рук антисептиком с одной руки (контрольной) берут смыв стерильной марлевой салфеткой (5 х 5 см), смоченной физиологическим раствором. После этого проводят обработку рук, для чего на кисти обеих рук наносят определенное количество антисептика и проводят обработку рук путем втирания антисептика в кожу кистей рук, между пальцами, а также запястий и предплечий рук в режиме обработки, рекомендованном для конкретного кожного антисептика. После окончания обработки рук хирургов, стерильной марлевой салфеткой, увлажненной стерильным раствором нейтрализатора, берут смыв с кожи рук, тщательно протирая ладони, околоногтевые пространства обеих рук. Салфетки помещают в пробирки с жидкой питательной средой. Посевы помещают в термостат и выдерживают при температуре плюс 37°С в течение 48 часов, после чего производят учет результатов.

Критерий эффективности обработки рук кожным антисептиком - снижение общей микробной обсемененности кожи рук на 100% (отсутствие роста микроорганизмов на жидкой питательной среде).

Определение эффективности обеззараживающего действия кожных антисептиков, предназначенных для обработки кожи операционного поля (локтевых сгибов доноров) осуществляют методом смыва. Для оценки эффективности обработки кожи операционного поля кожными антисептиками в практических условиях, берут не менее 100 смывов (по 50 смывов до и после обработки рук антисептиком).

Смывы берут стерильной марлевой салфеткой сразу после окончания времени, необходимого для обработки кожи операционного поля кожным антисептиком.

До обработки кожи операционного поля антисептиком берут смыв стерильной марлевой салфеткой (5 х 5 см), смоченной физиологическим раствором. После этого проводят обработку кожи операционного поля в режиме применения, рекомендованном для конкретного кожного антисептика. После окончания обработки кожи операционного поля, стерильной марлевой салфеткой, увлажненной стерильным раствором нейтрализатора, берут смыв с обработанной кожи. Салфетки помещают в пробирки с жидкой питательной средой. Посевы помещают в термостат и выдерживают при температуре плюс 37°C в течение 48 час, после чего производят учет результатов.

Критерий эффективности обработки операционного поля (локтевых сгибов доноров) кожным антисептиком - снижение общей микробной обсемененности кожи на 100% (отсутствие роста микроорганизмов на жидкой питательной среде).

5.7. Методы изучения и оценки вирулицидной активности дезинфицирующих средств

5.7.1. Общие положения

Методы изучения и оценки вирулицидной активности ДС гармонизированы с Европейским стандартом 14476. "Химические дезинфектанты и антисептики. - Вируцидный количественный суспензионный тест для химических дезинфектантов и антисептиков, используемых в медицине - Тест-методы и требования (фаза 2/ступень 1)", 2005 г.; "Протоколом тестирования эффективности дезинфектантов, используемых для инактивации вируса гепатита В уток и поддержания соответствующего уровня требований", ЕРА 2000 г., США; "Комиссии по антивирусной дезинфекции Немецкого Объединения по борьбе с вирусными заболеваниями (DVV)", 2004.

Вирусы обладают разной устойчивостью к действию физических и химических факторов, в том числе ДС и субстанций. Устойчивость вирусов к ДС определяется их структурой и химическим составом. Более устойчивы к действию ДС вирусы без липидсодержащей оболочки, например, пикорнавирусы, парвовирусы. Вирусы с липидсодержащей оболочкой, например, вирусы гриппа, герпеса, ВИЧ относительно легко инактивируются. Механизм действия ДС на вирусы различен и зависит от химического состава. Они могут избирательно повреждать нуклеиновую кислоту вируса, белки нуклеокапсида или липопротеины суперкапсидной оболочки. Возможно синхронное воздействие на эти структурные элементы, дезинтеграция вирусной частицы или блокировка рецепторов на ее поверхности за счет накопления амфотерных веществ дезинфектанта. Для оценки вирулицидной активности следует использовать несколько тест-вирусов с различной устойчивостью, что позволяет оценить активность ДС в отношении широкого спектра вирусов [60].

Результаты исследований вирулицидной активности ДС зависят также от характера используемого вируссодержащего материала, метода индикации вируса, метода определения вирулицидных свойств ДС, состава испытываемого ДС (действующие вещества - ДВ и другие компоненты) [75].

При изучении вирулицидной активности ДС необходимо иметь его подробную характеристику с указанием рецептуры, физико-химических свойств (включая растворимость и стабильность), подтвержденных результатами входного химического контроля.

ДС, принимаемые для исследований, должны отвечать следующим требованиям: обладать хорошей растворимостью в воде, сохранять свою активность в присутствии органических веществ (кровь и др. биологические субстраты), быть нетоксичными или мало токсичными для людей (и животных), не иметь неприятного запаха, не портить обеззараживаемых предметов [75].

Непременным условием при исследованиях вирулицидной активности ДС является использование нейтрализатора.

5.7.2. Тест-вирусы, модельные системы, критерии оценки и основные условия, которые необходимо соблюдать при исследованиях вирулицидной активности ДС и их субстанций. Применение нейтрализатора

Тест-вирусы. Модельные системы для исследований ДС и субстанций. При исследованиях вирулицидной активности ДС необходимо использовать как РНК-, так и ДНК-содержащие тест-вирусы (Приложение 1). При этом следует учитывать наличие лабораторной модели, безопасность для лиц, работающих с вирусом.

Обязательным для всех ДС является испытание на двух тест-вирусах: вирусе полиомиелита 1 типа (вакцинном штамме Sabin (LSc-2ab) [далее "полиовирус"] и аденовирусе 5 типа (штамм Аденоид 75) [далее "аденовирус"] [75].

Средство, показавшее способность инактивировать полио- и аденовирус, включают в группу ДС с вирулицидной активностью. ДС с вирулицидной активностью могут быть использованы для дезинфекции при любой вирусной (включая особо опасные) инфекции, имеющей значение в инфекционной патологии человека.

Для ДС, применяемых при повышенной (до +60°C) температуре растворов (например, для обеззараживания белья), в качестве тест-вируса используют бычий парвовирус (штамм Хаден) [75].

В связи с эпидемиологической и социальной значимостью гепатита А, для дезинфекции в инфекционных очагах проводят также исследования с вирусом гепатита А. Для изучения и оценки активности ДС в отношении вируса гепатита А используют вирус гепатита А человека (штамм HAS-15). ДС, инактивирующие вирус гепатита А, входит в группу средств с вирулицидной активностью [75].

Для изучения вирулицидной активности ДС в отношении вируса гепатита В применяют суррогатный вирус - вирус гепатита В уток (ВГВУ), в отношении вируса гепатита С - суррогатный вирус - вирус диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота ВД-БС (штамм ВК-1В1-N 28) или вирус гепатита С человека (штамм Д1) [75].

Спектр тест-вирусов может быть расширен, в таком случае дают дополнительную информацию о результатах исследований на конкретном вирусе.

Модельные системы для исследований ДС и субстанций. Исследования in vitro в культуре клеток. В экспериментах используют культуры клеток, чувствительные к тест-вирусу.

Исследования in vivo. В экспериментах используют чувствительных лабораторных животных (белые мыши), уток и др. (Приложение 1).

Критерии оценки вирулицидной активности ДС и субстанций. Вирулицидное ДС (субстанция) должно подавлять инфекционность обязательных для испытаний тест-вирусов - полиовируса и аденовируса на исследуемых объектах не менее, чем на 4 (то есть степень инактивации должна быть не менее 99,99%) [7, 75].

Критерием вирулицидной активности ДС (субстанций) для других тест-вирусов (включая вирусы - возбудители особо опасных инфекций) является отсутствие инфекционности, определяемое современными методами индикации.

Степень инактивации тест-вируса определяют в чувствительных модельных системах по подавлению инфекционной, цитопатической или бляшкообразующей активности вируса в культуре клеток, или по отсутствию маркеров инфицирования, или по специфической гибели лабораторных животных (белые мыши) и др. Для получения более точных результатов тест-вирус следует использовать с максимальным титром.

Показателем вирулицидной активности ДС (субстанций) является скорость инактивации, которая представляет собой соотношение концентрации тест-вируса, выраженное в десятичных логарифмах, до и после воздействия ДС за определенный промежуток времени (экспозиция). Степень снижения вирусной инфекционности вычисляется в десятичных логарифмах по разнице титров вируса до и после обработки ДС [75].

Основные условия, которые следует соблюдать при исследованиях вирулицидной активности ДС и субстанций [66, 75].

- исследуемые ДС до, во время и после исследований (испытаний) должны храниться в соответствии с требованиями технических условий (ТУ). При отсутствии ТУ необходимо соблюдать общие требования: избегать попадания прямых солнечных лучей и влаги, воздействия высоких температур и замораживания;

- при проведении сертификационных испытаний ДС хранят в соответствии с правилами сертификации;

- растворы ДС готовить на стерильной водопроводной дехлорированной воде;

- поддерживать температуру растворов исследуемых ДС в течение всего эксперимента в пределах 20°°C (если по условиям эксперимента не рекомендована другая температура), независимо от температуры окружающей среды;

- использовать рабочие растворы ДС, производимых в форме гранул, порошков, таблеток и др. только после полного их растворения;

- кратность постановки экспериментов должна быть не менее трех (при условии получения одинаковых результатов);

- при отсутствии цитопатического эффекта пробы подвергают необходимой обработке с целью проведения второго, а при необходимости и третьего слепого пассажа для определения полноты ингибирования тест-вируса;

- эксперименты должны сопровождаться всеми необходимыми контролями, в том числе контролем полноты нейтрализации дезинфектанта, жизнеспособности тест-вируса, контаминации тест-объекта тест-вирусом, культуры клеток или лабораторных животных (мыши), утки и др.;

- использовать нейтрализатор, подобранный к конкретному ДС (или дезинфицирующей субстанции, далее в этом разделе - "ДС");

- при исследованиях ДС следует строго соблюдать рекомендуемые меры индивидуальной защиты (перчатки, очки, респираторы и др.).

Применение нейтрализатора ДС и субстанции. Для нейтрализации ДС (субстанции) используют вещество - нейтрализатор (или комплекс из нескольких веществ), останавливающее действие ДС. Нейтрализатор либо добавляют непосредственно в питательную среду, либо промывают им тест-объекты после воздействия ДС (субстанции, исследуемого вещества) для того, чтобы остановить его действие на тест-вирус через заданное время (экспозицию).

Для нейтрализации ДС в виде монопрепарата на основе окислителей (хлор-, йод-, кислородсодержащие средства) применяют 0,1-1,0% растворы тиосульфата натрия;

- для галоидактивных (хлор-, бром- и йодактивные) и кислородактивных (перекись водорода, ее комплексы с солями, надуксусная кислота, озон) - 0,1-1,0% растворы тиосульфата натрия;

- для четвертичных аммониевых солей (алкилдиметилбензиламмоний хлорид, дидецилдиметиламмоний хлорид и др.), производные гуанидина (полигексаметиленгуанидин гидрохлорид, хлоргексидин биглюконат и др.) - 0,1-1,0% растворы лаурилсульфата натрия (сульфонол) или растворы лаурилсульфата натрия с 10% обезжиренного молока или комплексный нейтрализатор (см. ниже);

- для альдегидов (глутаровый альдегид, глиоксаль, формальдегид, ортофталевый альдегид) - 1,0% раствор пиросульфита (метабисульфита) натрия или комплексный нейтрализатор (см. ниже);

- для кислот - щелочи в эквивалентном количестве;

- для щелочей - кислоты в эквивалентном количестве;

- для спиртов - разведение в воде до не действующей концентрации;

- для композиционных средств - "комплексный" нейтрализатор, например, содержащий Твин 80 (3%), сапонин (0,3-3%), гистидин (0,1%), цистеин (0,1%). Если в состав ДС входят окислители, в нейтрализатор дополнительно вводят тиосульфат натрия. Следует иметь ввиду, что комплексный нейтрализатор обладает выраженным цитотоксическим действием на клеточные культуры.

Если не удается подобрать какой-либо из перечисленных нейтрализаторов, что проявляется в неспецифической дегенерации культуры клеток (или гибели мышей, уток), то используют 60% - 80% сыворотки (без консерванта) крупного рогатого скота (СКРС), инактивированной при 56°С в течение 30 мин. СКРС нейтрализует большой перечень ДВ и наиболее близка к комплексному нейтрализатору.

При невозможности нейтрализовать токсическое действие ДС следует применять дополнительные методы удаления ДС - диализ смеси вирус-дезинфектант, например, с использованием сефадекса LH-20, G-75; осаждения вируса методом высокоскоростного центрифугирования или фильтрацией через мембранные фильтры.

5.7.3. Основные этапы и методы изучения вирулицидной активности ДС и субстанций [75]

Исследование вирулицидной активности ДС осуществляется в два этапа:

1) Первый этап исследований - определение наличия вирулицидной активности. Проводится in vitro суспензионным методом или методом батистовых тест-объектов.

2) Второй этап исследований - изучение вирулицидной эффективности ДС при обработке ими различных тест-объектов, воздуха, контаминированных тест-вирусом.

В качестве тест-объектов следует использовать различные изделия медицинского назначения; предметы ухода за больными и игрушки; белье, спецодежду и др. изделия из тканей; посуду, в том числе лабораторную; различные поверхности в помещениях (жесткой мебели, разных предметов, оборудования, в том числе санитарно-технического и др.); кровь; выделения (моча, фекалии, мокрота).

Объем исследований и перечень объектов обеззараживания зависит от назначения ДС, их состава, токсикологической характеристики, формы выпуска средства и др.

Проводятся также исследования вирулицидной активности кожных антисептиков, антимикробных тканей и лакокрасочных материалов.

5.7.3.1. Суспензионный метод [66, 75].

К вирусной суспензии (ВС), в качестве которой может быть использована культуральная жидкость после удаления клеточных остатков, или ВС органов или тканей, или сыворотка крови, добавляют испытуемое средство в объеме 1 : 9 (1 объем вируса и 9 объемов средства) в различных концентрациях.

Суспензионный тест проводят в двух вариантах: без белковой нагрузки и с белковой нагрузкой. В последнем случае к вирусной суспензии добавляется инактивированная сыворотка КРС из расчета 40% ее концентрации в смеси вирус - дезинфектант.

Полученную смесь (как с сывороткой, так и без нее) выдерживают при комнатной температуре (°C) в течение 15-30-60 минут, нейтрализуют (в соотношении 1 : 1, т.е. 1 объем смеси и 1 объем нейтрализатора), встряхивая в течение 5-10 мин, и используют для определения тест-вируса в чувствительной культуре клеток (или на мышах, или на утках).

Методика определения инфекционного вируса после воздействия ДС (субстанции): исследуемый материал (смесь вируса, ДС и нейтрализатора) вносят (или исследуемым материалом заражают мышей или уток) в лунки планшет (пробирки) с выращенным монослоем клеток или в суспензию клеток (в случае применения суспензионной культуры клеток), через 30-60 мин удаляют смесь, заменяют ее культуральной средой. Культуру клеток инкубируют в термостате при температуре, необходимой для репродукции вируса в течение срока наблюдения.

О вирулицидной активности средства судят по наличию или отсутствию цитопатогенного действия, вызываемого вирусом, или по другим проявлениям, указывающим на репродукцию вируса.

Все эксперименты сопровождаются контролями культуры клеток, вируса, полноты нейтрализации.

Эффективным считают средство (субстанцию), обеспечивающее инактивацию вируса при времени воздействия не более 60 мин.

5.7.3.2. Метод батистовых тест-объектов [66, 75].

Исследования вирулицидной активности ДС (субстанций) этим методом проводят на тест-вирусах, фиксированных на батистовых тест-объектах. При использовании данного метода происходит некоторая потеря (1-2 lоg ) вирусных частиц во время погружения контаминированных тест-объектов в раствор ДС, нейтрализатор и при последующем отмывании от остатков ДС. Однако этот метод более приемлем для изучения ДС, продукты нейтрализации которых токсичны для культуры клеток и вызывают в них неспецифические дегенеративные изменения.

Подготовка эксперимента. Вирусной суспензией контаминируют батистовые тест-объекты (далее "тесты").

В качестве тестов используют кусочки батиста размером 1 х 0,5 см, предварительно простиранного (т.е. освобожденного от крахмала) и проглаженного. Тесты помещают в стерильную чашку Петри и заливают ВС из расчета 0,05-0,1 мл жидкости на один тест (без сыворотки или с добавлением 40 процентов СКРС). Тесты подсушивают при комнатной температуре не менее 60 мин. Контаминированные ВС тесты используют в опытах. Тесты не следует заготавливать впрок, их контаминируют ВС ex tempore.

При исследовании вирулицидной активности готовят 3-5 концентраций раствора ДС на стерильной дехлорированной водопроводной воде из расчета 1,0 мл раствора на каждый тест.

Постановка эксперимента. В исследуемые растворы погружают контаминированные ВС тесты по 5 штук на каждую экспозицию.

Момент смачивания тестов раствором ДС является началом опыта и с этого момента отсчитывают экспозицию. Через 5-15-30-45-60 минут стерильным охлажденным пинцетом или петлей извлекают по 5 тестов, помещают их в пробирку с бусами (из стекла, пластика) с 5 мл стерильного раствора нейтрализатора, помещают в шуттель-аппарат на 10 мин.

По истечении каждой экспозиции смывной жидкостью заражают культуру клеток (мышей, уток). Культуру клеток, отмытую от ростовой среды, оставляют на контакт на 30-60 мин для адсорбции вируса. Затем клетки промывают раствором Хенкса и заливают поддерживающей средой с сывороткой. Клетки инкубируют в термостате при оптимальной для конкретного вируса температуре.

Критерием вирулицидной активности ДС является снижение количества вируса не менее, чем на 4 при времени дезинфекционной выдержки не более, чем 60 мин.

Контроль культуры клеток. С этой целью оставляют незараженными пробирки с культурой клеток и наблюдают в течение максимального срока опыта. При работе с культурой клеток в контрольных пробирках также, как и в опытных, при необходимости меняют поддерживающую среду в зависимости от изменения рН.

Контроль вируса. С этой целью 5 штук тестов, контаминированных вирусом, помещают в пробирку с 5 мл раствора Хенкса, выдерживают максимальную экспозицию, используемую в эксперименте; переносят в пробирки с 5 мл нейтрализатора и бусами, встряхивают в шуттель-аппарате в течение 10 мин и заражают культуру клеток (или другой чувствительный биологический объект) соответствующей дозой (0,2 мл или менее) жидкости, отмытой с тестов. Для выяснения количества жизнеспособного вируса проводят титрование.

Неспецифический цитопатический эффект (ЦПЭ) может быть при неполной нейтрализации дезинфектанта или цитотоксическом эффекте смеси "дезинфектант + нейтрализатор". Исключить неспецифический цитотоксический эффект в некоторых случаях удается путем дополнительного отмыва монослоя раствором Хенкса после контакта клеток с внесенной пробой с нейтрализатором в течение 60 мин для адсорбции вируса на поверхности клеток. По истечению этого времени добавляют поддерживающую среду. Избежать неполной нейтрализации можно путем тщательной отработки условий нейтрализации или поиска другого нейтрализатора.

Контроль контаминации вирусом тестов. С этой целью 5 штук тестов, контаминированных вирусом помещают в пробирку с бусами и с 5 мл физиологического раствора, отмывают в шуттель-аппарате в течение 10 минут и соответствующей дозой (0,2 мл или менее, как в опыте) жидкости, отмытой с тестов, заражают культуру клеток (или другой биологический объект). Для определения степени контаминации тестов вирусом проводят титрование.

Контроль полноты нейтрализации ДС. С этой целью 5 штук тестов (без вируса) помещают на максимальную экспозицию, используемую в эксперименте, в 5 мл раствора максимальной концентрации ДС. После этого тесты переносят на 5 минут в 5 мл раствора нейтрализатора, отмывают с бусами в течение 10 минут и вносят (по 0,2 мл или менее) смыв, с тестов в культуру клеток (или другой биологический объект).

Исследования вирулицидной активности субстанции завершаются первым этапом.

Исследования вирулицидной активности ДС, предназначенных для дезинфекции при особо опасных вирусных инфекциях завершаются первым этапом, если возбудитель по устойчивости к конкретному ДС не превышает полиовирус и аденовирус.

После получения данных о наличии у ДС вирулицидной активности исследования продолжаются на втором этапе - изучении эффективности при обеззараживании различных объектов.

Эффективным считают средство (субстанцию), обеспечивающее инактивацию вируса при времени воздействия не более 60 мин.

5.7.4. Методы изучения и оценки вирулицидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания различных объектов, контаминированных тест-вирусами [15, 66, 75]

Исследования эффективности ДС при обеззараживании различных объектов (изделия медицинского назначения, включая эндоскопы, посуда, белье, поверхности, выделения и др.), имеющих эпидемиологическое значение в распространении инфекционных заболеваний вирусной этиологии, проводят с целью разработки эффективных режимов дезинфекции. Полученные положительные результаты в опытах на тест-вирусах уточняют (при необходимости) на вирусах - возбудителях той инфекции, при которой они будут использованы, учитывая их специфику и механизм передачи инфекции. Объем исследований ДС зависит от их предполагаемого назначения и может включать все или некоторые из приведенных ниже объектов.

5.7.4.1. Определение вирулицидной активности ДС, предназначенных для обеззараживания ИМН [16, 68, 73]

5.7.4.1.1. Определение вирулицидной активности ДС, предназначенных для обеззараживания ИМН (кроме эндоскопов) из различных материалов

В качестве тест-изделий используют стерильные инструменты и др. ИМН (в том числе однократного применения): имеющие замковые части (щипцы, ножницы, корнцанг), не имеющие, замковых частей (пинцеты, шпатели); стоматологические, в том числе вращающиеся, инструменты (боры, буравы корневые, зеркала, диски шлифовальные) из различных материалов (металлов, резин, стекла, пластмасс) или имитирующие их тест-объекты.

Контаминация изделий тест-вирусом. Простерилизованные или продезинфицированные (способом кипячения) тест-изделия контаминируют ВС с добавлением 40 процентов инактивированной (без консерванта) СКРС в качестве органической нагрузки (например, к 6 мл ВС добавляют 4 мл неразведенной сыворотки), перемешивают. Если средство обладает фиксирующими свойствами, то сыворотку в качестве белковой нагрузки добавляют в количестве 5%.

Приготовленной смесью контаминируют изделия, полностью погружая в нее мелкие, а на крупные наносят пипеткой, следя за равномерным смачиванием всей поверхности. Каналы изделий заполняют с помощью шприца или другого приспособления, избегая образования пузырьков воздуха.

Разъемные изделия погружают в смесь и, опуская в нее, делают несколько рабочих движений. Инструменты, имеющие замковые части, погружают раскрытыми, предварительно сделав ими несколько рабочих движений для лучшего проникновения вируса в труднодоступные участки изделия в области замка. Избыток смеси удаляют любым способом (промокают с помощью стерильной фильтровальной бумаги, марлевой салфетки), но не протирают!! изделия. Тест-изделия подсушивают при температуре °C в течение 60-90 мин.

Определение активной концентрации средства и времени вирулицидного действия. Контаминированные вирусом изделия погружают в дезинфектант на время дезинфекционной выдержки (5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120 мин) или, при необходимости на более длительное время, например, 240 мин - для изделий однократного применения перед утилизацией.

По истечении времени дезинфекционной выдержки изделия извлекают из дезинфектанта. Каналы промывают нейтрализатором, с поверхностей берут смывы салфетками размером 5 х 5 см, смоченными нейтрализатором. Салфетки, мелкие изделия погружают в пробирки с бусами и с нейтрализатором (объем - 5 мл), которые помещают в шуттель-аппарат на 10 мин.

Полученную смывную жидкость вносят в пробирки или лунки планшет с культурой клеток или вводят в организм лабораторного животного (или уток).

Оптимальное время обеззараживания - не более 60 мин, для изделий однократного применения - не более 240 мин.

5.7.4.1.2. Определение вирулицидной активности ДС, предназначенных для обеззараживания эндоскопов, включая ДВУ [16, 66, 73, 75].

В качестве исследуемых объектов используют гибкий (гастроскоп), жесткий (цистоскоп) эндоскопы или фрагменты гибкого эндоскопа (гастроскопа) - его каналов и наружной поверхности.

С помощью пипетки ВС контаминируют поверхность и каналы эндоскопа (или его фрагменты), затем их погружают в раствор ДС, заполняя им каналы изделия. Для имитации минимального органического загрязнения к ВС перед контаминацией тест-изделия добавляют 5% инактивированной сыворотки. Через 5-60 мин тест-изделие извлекают из раствора и берут смыв с его поверхности стерильной марлевой салфеткой, смоченной нейтрализатором. Канал изделия промывают раствором нейтрализатора и оставляют на 10 мин. Салфетки помещают в пробирки с нейтрализатором и стеклянными бусами, отмывают в шуттель-аппарате в течение 10 мин. Промывную - из каналов и смывную - с салфеток жидкости вносят в культуру клеток (или заражают другой биологический объект), отмытую от ростовой среды, оставляют на контакт на 30-60 мин для адсорбции вируса и добавляют поддерживающую среду. При необходимости для снятия цитотоксического действия ДС клетки промывают раствором Хенкса и заливают поддерживающей средой с сывороткой. Клетки инкубируют в термостате при необходимой для конкретного вируса температуре.

Оптимальное время обеззараживания - не более 60 мин.

При разработке режима ДВУ в качестве органической нагрузки используют 5% инактивированной СКРС. ДС используют в концентрации, обеспечивающей стерилизацию, и исследует только время ДВУ.

Оптимальное время ДВУ - не более 30 мин.

5.7.4.1.3. Определение вирулицидной активности ДС, предназначенных для обеззараживания стоматологических оттисков [75].

В качестве тест-объектов используют оттиски из альгинатных, силиконовых или других материалов. Для изготовления оттисков слепочную массу, полученную в соответствии с рекомендациями изготовителя, помещают в пластмассовую или металлическую ложку и делают оттиск с пластмассовых зубных протезов с моделированной десной.

На оттиски наносят ВС, подсушивают в течение 2-3 мин, промывают стерильной водой и погружают полностью в раствор ДС. Контрольные контаминированные ВС оттиски погружают в стерильную водопроводную воду (вместо раствора ДС) на максимальное время, взятое в эксперименте.

Через 5-30 мин оттиски извлекают из раствора ДС (контрольные - из воды) и делают смывы марлевой салфеткой, смоченной в 5 мл нейтрализатора, приготовленного на поддерживающей среде.

Салфетки помещают в пробирки с нейтрализатором и стеклянными бусами, отмывают в шуттель-аппарате в течение 10 мин. Смывной жидкостью заражают культуру клеток (или другой биологический объект). Культуру клеток отмытую от ростовой среды, оставляют на контакт на 30-60 мин для адсорбции вируса. Затем клетки промывают раствором Хенкса и заливают поддерживающей средой с сывороткой. Клетки инкубируют в термостате при оптимальной для конкретного вируса температуре.

Оптимальное время обеззараживания - не более 30 мин.

5.7.4.1.4. Особенности постановки экспериментов по изучению вирулицидной активности ДС, предназначенных для обеззараживания ИМН в установках (моюще-дезинфицирующие машины и др.) [75].

Одним из самых значимых условий постановки экспериментов по разработке (для отечественных) или экспертной оценке (для зарубежных) режимов обеззараживания ИМН в установках, например, ультразвуковых, моюще-дезинфицирующих машинах, является создание условий эксперимента, максимально приближенных к условиям практического применения (в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по эксплуатации).

Принципиальными являются следующие характеристики: скорость движения (циркуляции) дезинфицирующего раствора; температура раствора, количество (объем) раствора, диаметр канала (каналов) по которым циркулирует раствор. Повышенная температура растворов ДС и принудительная циркуляция повышают их активность, в несколько раз сокращая время обеззараживания ИМН.

5.7.4.2. Определение вирулицидной активности ДС, предназначенных для обеззараживания предметов ухода за больными и игрушек [66, 75]

Определение вирулицидной активности ДС при обеззараживании предметов ухода за больными. Предметы ухода за больными можно поделить на 2 группы в зависимости от возможного загрязнения биосубстратами и степени контаминации вирусами:

- наконечники к клизмам соприкасаются при их использовании со слизистой оболочкой прямой кишки, поэтому требования к их обработке и критерии эффективности ДС такие же, как к ИМН. Органическая нагрузка в экспериментах должна составлять 40% сыворотки, а способ обеззараживания - путем погружения в раствор ДС.

- подкладные клеенки могут быть загрязнены любыми выделениями, поэтому органическая нагрузка должна быть такая же, как и в экспериментах с ИМН - 40%, а способ обеззараживания путем - погружения в раствор или одно-, при необходимости - двукратного протирания.

- пузыри для льда и грелки соприкасаются только с кожей, они, как правило, не загрязнены выделениями, однако могут быть контаминированы вирусами. При разработке режимов их обеззараживания органическая нагрузка на тест-объектах не обязательна, а способ обработки - одно- или двукратное протирание.

В качестве тест-объектов, имитирующих предметы ухода за больными, используют тест-поверхности размером 10 х 10 , изготовленные из резиновых грелок, пузырей для льда, медицинской клеенки, а также наконечники к клизмам и др., из разных материалов. Их контаминируют смесью ВС с 40 процентами инактивированной сыворотки. Наконечники к клизмам контаминируют вирусом по такой же методике, что и ИМН, имеющие каналы, затем подсушивают до полного высыхания при температуре °C.

Подготовленные тест-объекты протирают однократно или двукратно с интервалом 15 мин салфеткой, смоченной раствором ДС. Кроме того, тест-объекты, изготовленные из медицинской клеенки, погружают в дезинфицирующий раствор.

Мелкие предметы (наконечники к клизмам и др.) погружают в раствор ДС, заполняя им полости и каналы, избегая образования пузырьков воздуха.

Через 30, 60, 90, 120 мин смывы берут марлевыми салфетками размером 5 х 5 см, смоченными в нейтрализаторе. Предметы ухода, имеющие каналы, промывают нейтрализатором (не более 5 мл), который собирают в стерильные пробирки и оставляют на 10 мин для нейтрализации. Марлевые салфетки погружают в широкогорлые пробирки с бусами (с 5 мл нейтрализатора, приготовленного на поддерживающей среде), которые отмывают в шуттель-аппарате в течение 10 мин. Далее - как в п. 6.1.1.4.

Оптимальное время обеззараживания предметов ухода за больными - не более 120 мин.

Определение вирулицидной активности ДС при обеззараживании игрушек. При обеззараживании игрушек (мелких и средних) определение вирулицидной активности ДС проводят при обработке способами протирания, погружения в раствор ДС или орошения (для крупных игрушек).

С этой целью игрушки (без отверстий) контаминируют ВС из расчета 0,5 мл на 100 , но так, чтобы вся их поверхность была ею покрыта. Мелкие игрушки погружают полностью в ВС. Затем их подсушивают при температуре 18-20°C до полного высыхания.

Поверхность игрушек протирают салфеткой, смоченной раствором ДС (в контроле - стерильной водой), мелкие игрушки погружают в раствор ДС, препятствуя их всплытию; крупные игрушки орошают раствором ДС. Норма расхода раствора ДС способом протирания 100-150  при однократной обработке, способом орошения - 150  при обработке распылителем типа "Квазар" и 300  - обработке распылителем типа "Автомакс" или гидропультом. При необходимости обработку способом протирания или орошения повторяют через 5-15 мин.

Через определенные интервалы времени (от 15 до 120 мин) с помощью марлевой салфетки (5 х 5 см), смоченной нейтрализатором, приготовленном на поддерживающей среде или физрастворе, с игрушек берут смывы. Салфетки погружают в пробирки со стеклянными бусами и нейтрализатором. Далее - как в п. 6.1.1.4.

Оптимальное время обеззараживания - не более 120 мин.

5.7.4.3. Определение вирулицидной активности ДС, предназначенных для обеззараживания белья, спецодежды и др. изделий из тканей [66, 75]

При определении вирулицидной активности ДС при обеззараживании белья учитывают соотношение раствора ДС и белья: при особо опасных инфекциях расход раствора составляет 5 л на 1 кг сухого белья, при прочих - 4 л раствора на 1 кг сухого белья; температуру раствора, степень и характер загрязнения белья.

Определение эффективности ДС при обеззараживании белья без видимых загрязнений. Исследования проводят с помощью батистовых тестов. Контаминированные вирусом тесты подсушивают при комнатной температуре, затем их закладывают (по 5 штук в каждый) в бязевые стерильные мешочки размером 5 х 8 см с пришитой к углу каждого из них прочной нитки длиной около 0,5 м. Мешочки закрывают в виде конверта.

Белье (старые бязевые халаты, полотенца и др.) погружают в емкость с раствором ДС, последовательно замачивая одну вещь за другой, следя за тем, чтобы между вещами не образовывалось воздушных прослоек, препятствующих процессу дезинфекции. Одновременно между слоями белья распределяют (сверху, в середине и внизу) мешочки с контаминированными вирусом тестами.

Через определенные промежутки времени (15-30-60 и более минут) мешочки с тестами извлекают одновременно из трех слоев.

Тесты вынимают из мешочка стерильным пинцетом, погружают в широкогорлые пробирки с нейтрализатором и бусами, далее - как в п. 5.7.4.1.4.

Определение вирулицидной активности ДС при обеззараживании белья, загрязненного кровью, фекалиями. С целью изучения эффективности средства при обеззараживании белья, загрязненного кровью (имитация в виде 40 процентов сыворотки), медицинских отходов из тканей, марли, ваты (одноразовое хирургическое белье и акушерские комплекты, перевязочный материал, марлевые салфетки, ватные тампоны и др.) к 6 мл вируссодержащей жидкости прибавляют 4 мл инактивированной СКРС, смешивают и заливают тесты, подсушивают их и используют в опыте (п. 5.7.4.1.3.).

Оптимальное время обеззараживания белья - не более 120 мин, медицинских отходов - не более 240 мин.

Для имитации загрязнения белья и медицинских отходов из тканей и др. фекалиями в экспериментах с тест-вирусом используют фекальную эмульсию. Фекальную эмульсию готовят следующим образом: к 6 мл 10% ВС добавляют 4 мл 40% эмульсии фекалий. Для этого 8 г простерилизованных фекалий (1,5 атм в течение 30 мин) растирают в ступке с 20 мл стерильной воды. В качестве органической нагрузки можно использовать также 80% инактивированной СКРС из расчета: 8 мл сыворотки и 2 мл ВС, тщательно перемешивают и этой смесью заливают тесты. Избыток жидкости через 15 мин удаляют с помощью пипетки, тесты подсушивают при комнатной температуре. Далее эксперимент проводят по схеме для незагрязненного белья (п. 5.7.4.1.3.).

Оптимальное время обеззараживания белья и медицинских отходов, загрязненных фекалиями - не более 240 мин.

5.7.4.4. Определение вирулицидной активности ДС, предназначенных для обеззараживания посуды, в том числе лабораторной [66, 75]

Методика обеззараживания посуды без остатков пищи, а также без других видимых загрязнений. При обеззараживании посуды без остатков пищи, лабораторной посуды без видимых загрязнений в качестве тест-объектов используют тарелки, стаканы, эмалированные кружки; столовые приборы - ножи, вилки, ложки; лабораторной посуды - пипетки, в т.ч. микропипетки, наконечники к ним, предметные стекла, пробирки.

Чистую посуду контаминируют ВС, которую наносят пипеткой из расчета 0,5 мл на 100  и равномерно распределяют по поверхности стерильным стеклянным шпателем. Вилки, ложки и ножи погружают в ВС на 10-15 минут (за исключением ручек), каналы пипеток контаминируют вирусом.

Посуду, столовые приборы подсушивают при комнатной температуре. После полного высыхания погружают в раствор ДС, полностью их покрывая (расход раствора составляет примерно 2 л на комплект посуды: чашка, блюдце, 2 тарелки, ложка, вилка, нож) раствором.

Через определенные интервалы времени (15, 30, 60, 90, 120 минут) посуду извлекают из раствора ДС. Для оценки эффективности обеззараживания стерильными марлевыми салфетками размером 5 х 5 см (вначале увлажненной нейтрализатором, затем сухой) тщательно протирают контаминированные вирусом части каждого предмета. Салфетки помещают в стерильную широкую пробирку с бусами и с 5 мл стерильного нейтрализатора (п. 5.7.4.1.4.).

Оптимальное время обеззараживания - не более 60 мин.

Контролем служит аналогичным способом контаминированная вирусом посуда, погруженная на максимальную экспозицию в стерильную или прокипяченную водопроводную воду.

Методика обеззараживания посуды с остатками пищи, а также загрязненной лабораторной посуды. Для изучения эффективности ДС при обеззараживании посуды с остатками пищи, загрязненной лабораторной посуды многократного использования и однократного применения (перед утилизацией) к ВС добавляют 80% инактивированной СКРС из расчета: 20% ВС и 80% сыворотки, смесь наносят равномерно на посуду, подсушивают. Далее - как в п. 6.4.1.

Оптимальное время обеззараживания - не более 120 мин для посуды многократного использования и не более 240 мин - для посуды однократного применения (перед утилизацией).

5.7.4.5. Определение вирулицидной активности ДС, предназначенных для обеззараживания поверхностей [66, 75]

Определение вирулицидной активности ДС при обеззараживании тест-поверхностей изучают двумя способами: способом протирания (одно- или двукратного) или способом орошения.

В экспериментах используют тест-поверхности размером 10 х 10 см, гладкие, шероховатые, впитывающие и невпитывающие ДС из различных материалов: деревянные, оштукатуренные, окрашенные масляной или клеевой и др. красками, оклеенные обоями, а также из линолеума, пластика, стекла, кафеля, метлахской плитки, фаянса, искусственной или натуральной кожи и др. Набор тест-поверхностей (далее "поверхностей") определяется назначением средства.

Перед экспериментом поверхности подвергают механической очистке - моют водой с мылом и щеткой, за исключением поверхностей, оклеенных обоями и окрашенных клеевой краской. Последние протирают несколько раз стерильной салфеткой, увлажненной стерильной водопроводной водой. После подсыхания поверхности располагают горизонтально и пипеткой наносят ВС из расчета - 0,5 мл с добавлением 5 процентов инктивированной СКРС на площадь в 100 , равномерно распределяют по поверхности стеклянным шпателем. Контаминированные вирусом поверхности подсушивают до полного высыхания при температуре 20°С°C и относительной влажности воздуха 50-60%, затем обрабатывают раствором ДС.

При обеззараживании контаминированных ВС поверхностей некоторых видов - оштукатуренные, окрашенные клеевой и др. красками, оклеенные обоями, из стекла, фаянса, дерева, окрашенного масляной краской, из кафеля, располагают вертикально и проводят обработку в этом положении (способ орошения). Остальные поверхности обрабатывают как в горизонтальном (способ однократного или двукратного протирания), так и в вертикальном положениях. Раствор ДС наносят на поверхность путем орошения из пульверизатора, точно следя за количеством израсходованной жидкости. Норма расхода - от 80 до 500 мл раствора на 1  обрабатываемой площади.

Для имитации органического загрязнения используют 40% инактивированной сыворотки при разработке режимов обеззараживания раковин, ванн или при разработке режимов обеззараживания унитазов - 80%. Возможно также использование вируссодержащей фекальной эмульсии, которую наносят на поверхности из кафеля или фаянса в экспериментах с вирусами, выделяющимися из организма с фекалиями.

Контроль эффективности обеззараживания осуществляют через 15-30-60 минут. Пробы отбирают путем тщательного протирания орошенных раствором ДС поверхностей слегка увлажненной нейтрализатором в физиологическом растворе или растворе Хенкса с антибиотиками стерильной марлевой салфеткой (5 х 5 см), а затем сухой. Салфетки помещают в широкогорлые пробирки с бусами с 5 мл нейтрализатора (п. 5.7.4.1.4.).

Оптимальное время обеззараживания поверхностей - не более 60 мин.

В контроле вируса контаминированные ВС поверхности протирают или орошают стерильной или прокипяченной водопроводной водой при той же норме расхода воды, что и ДС в опыте. Забор проб и их обработку проводят аналогично опытным. Для определения плотности контаминации проводят титрование смывов с поверхностей.

При работе с вирусом гепатита А опыт моделируется с меньшим количеством белья, ДС и ВС.

5.7.4.6. Определение вирулицидной активности ДС, предназначенных для обеззараживания выделений (моча, фекалии, мокрота) и крови [66, 75]

При определении вирулицидной активности ДС для обеззараживании мочи подбирают концентрацию ДС и время обработки. Растворы ДС добавляют к продезинфицированной способом кипячения моче в равном или двойном объеме. Через 15, 30, 60 минут указанную смесь в количестве 1 мл переносят в пробирки с 5 мл нейтрализатора, перемешивают, оставляют на 10 мин для нейтрализации, затем заражают культуру клеток (или другой биологический объект). Культуру клеток, отмытую от ростовой среды, оставляют на контакт на 30-60 мин для адсорбции вируса. Затем клетки промывают раствором Хенкса и заливают поддерживающей средой с сывороткой. Клетки инкубируют в термостате при оптимальной для конкретного вируса температуре.

В контроле к моче добавляют не дезинфицирующий раствор, а стерильную воду. Результаты опытов учитывают в сравнении с контролем. Количество вируса в моче в контроле определяют титрованием.

Оптимальное время обеззараживания - не более 120 мин.

При разработке режимов обеззараживания фекалий учитывают соотношение ДС и обеззараживаемой массы фекалий, время обработки, консистенцию обеззараживаемых выделений, степень гомогенизации в процессе обеззараживания.

С этой целью 20 г простерилизованных фекалий растирают в ступке с добавлением 80 мл воды до получения гомогенной эмульсии. Эмульсию разливают по 9 мл в пробирки и добавляют по 1 мл вируссодержащей жидкости.

Приготовленную эмульсию фекалий заливают равным или двойным количеством раствора ДС и в дальнейшем берут пробы так же, как и при обеззараживании мочи. Взятые пробы центрифугируют при 2500-3000 об/мин в течение 20 минут, после чего надосадочной жидкостью заражают культуру клеток, внося ее в пробирки/лунки с клетками, или в организм чувствительного животного, уток.

В контроле вместо раствора ДС используют стерильную воду. Результаты учитывают в сравнении с контролем.

Оптимальное время обеззараживания - не более 240 мин.

При разработке режимов обеззараживания крови (без сгустков) используют цитратную (или дефибринированную) кровь, контаминированную тест-вирусом (соотношение объема крови и вирусной суспензии 1 : 1). Можно также использовать эритроцитарную массу (бараньи эритроциты), которая готовится путем добавления к 3 мл отмытой эритроцитарной массы 97 мл 3,0% раствора альбумина на фосфатном буфере. Аликвоты этой смеси контаминируют тест-вирусом. Подбирают оптимальное соотношение ДС и обеззараживаемой крови, концентрацию ДС, время обработки, нейтрализуют (1 : 1, т.е. 1 объем смеси крови и ДС и 1 объем нейтрализатора) выдерживают 5-10 мин (перемешивая или встряхивая) и используют для определения инфекционности тест-вируса. Для обеззараживания крови со сгустками эффективным является только термический метод обработки (в паровом стерилизаторе).

Оптимальное время обеззараживания - не более 240 мин.

При разработке режимов обеззараживания мокроты используют мокроту волонтеров, подбирают оптимальное соотношение ДС и обеззараживаемой мокроты, время обработки, концентрацию ДС, нейтрализатор.

Оптимальное время обеззараживания - не более 240 мин.

5.7.4.7. Определение вирулицидной активности аэрозолей ДС, предназначенных для обеззараживания воздуха в помещениях [75]

Для определения вирулицидной активности аэрозолей ДС при обеззараживании воздуха в помещениях (инфекционные очаги, ЛПУ и др.) применяют аспирационный метод.

В качестве тест-вирусов используют полиовирус и/или аденовирус. ВС распыляют в камере в количестве, достаточном для получения в воздухе камеры концентрации вируса . Аэрозоль создают с помощью распыливающей аппаратуры, которая обеспечивает образование в воздухе не менее 80% частиц с дисперсностью 20+5 мкм, затем включают вентилятор для предотвращения оседания аэрозоля ДС.

В склянки Дрекселя вместо 50 мл стерильной водопроводной воды наливают 5 мл раствора Хенкса или поддерживающей питательной среды с нейтрализатором и антибиотиками.

Для контроля исходной контаминации воздуха вирусом перед началом эксперимента через склянки Дрекселя, соединенные последовательно одна с другой, а также в процессе эксперимента пропускают по 50 л воздуха (объем пробы для исследования). После отбора проб через каждые 5, 10 или 15 мин, в зависимости от предполагаемой эффективности ДС и с учетом чувствительности вируса к ДВ, жидкость из двух склянок Дрекселя соединяют, перемешивают и по 2 мл вносят в пробирки/лунки с культурой клеток (или в организм лабораторного животного, уток). Клетки оставляют на 1 час для контакта, затем сливают. После этого во все пробирки вносят поддерживающую среду в количестве 2 мл и помещают в термостат.

При определении эффективности аэрозоля ДС исследования проводят при трех показателях относительной влажности воздуха: 20-25%, 50-55% и 80-85% и температуре воздуха °С. Во время эксперимента в камере должен постоянно работать вентилятор для перемешивания компонентов исследуемой системы - вируса, воздуха, аэрозоля ДС.

Об инактивации вируса судят по утрате им инфекционной активности.

Вирулицидная активность ДС в форме аэрозоля зависит от концентрации вируса в воздухе, расхода смеси аэрозоля на единицу объема, концентрации раствора ДС в аэрозольной смеси, экспозиции, относительной влажности воздуха и температуры в камере.

В контроле используют аэрозольные смеси, содержащие вместо раствора ДС стерильную воду, которые распыляют в камере в тех же количествах, при этом размер аэрозольных частиц должен быть одинаковым с размером частиц аэрозоля средства.

5.7.4.8. Определение вирулицидной активности ДС, предназначенных для обеззараживания медицинских отходов [75]

Методики определения вирулицидной активности ДС при обеззараживании медицинских отходов разного происхождения приведены в соответствующих разделах - изделий медицинского назначения однократного применения (п. 5.7.4.1.1.); отходов из тканей (медицинская защитная одежда и белье, перевязочный материал, марлевые салфетки, ватные тампоны и др.) (п. 5.7.4.3.); посуды, в том числе лабораторной однократного использования (п. 5.7.4.4.); крови и др. (п. 5.7.4.6.).

5.7.5. Определение вирулицидной активности кожных антисептиков

Для изучения вирулицидной активности кожных антисептиков используют суспензионный метод (п. 5.7.3.1.) или метод батистовых тест-объектов (п. 5.7.3.2.). С этой целью используют полиовирус, аденовирус, а также ВГВУ в количестве (), или вирус диареи крупного рогатого скота (ВД-БС). Время дезинфекционной выдержки не должно превышать 4 мин. Эффективность - снижение титра вируса не менее, чем на 4 .

5.7.6. Определение вирулицидной активности антимикробных тканей, лакокрасочных материалов [75]

При определении вирулицидной активности антимикробных тканей выбор тест-вируса и тест-объекта зависит назначения и сферы применения, например, марлевые повязки для защиты верхних дыхательных путей профессионального контингента (медицинские работники, продавцы в супермаркетах и др.) или изготовление спецодежды и пр.

С этой целью на тест-объекты (по два на каждое разведение) из исследуемой ткани размером 2 х 2 см капельно наносят по 0,05 мл ВС. Через 30 сек, 1, 3, 5, 10, 15, 30, 60 мин тест-объекты переносят в широкогорлые пробирки с бусами и с 5 мл нейтрализатора, отмывают в шуттель-аппарате в течение 10 мин. Смывной жидкостью заражают культуру клеток (или другой биологический объект). Культуру клеток, отмытую от ростовой среды, оставляют на контакт на 30-60 мин для адсорбции вируса. Затем клетки промывают раствором Хенкса и заливают поддерживающей средой с сывороткой. Клетки инкубируют в термостате при оптимальной для конкретного вируса температуре. В контроле используют тест-объекты из ткани того же артикула, но не содержащей противовирусных веществ.

Критерии вирулицидной активности - снижение титра вируса не менее, чем на 4 .

Определение вирулицидной активности лакокрасочных материалов. При определении вирулицидной активности лакокрасочных материалов (антимикробные лаки, краски) ВС в дозе наносят в количестве 0,5 мл на исследуемую тест-поверхность (размер 10 х 10 ). После необходимой экспозиции (от 30 мин до 24 часов) с поверхности берут смыв стерильной марлевой салфеткой, смоченной нейтрализатором. Салфетки погружают в широкогорлые пробирки с 5 мл нейтрализатора и бусами, отмывают в течение 10 мин в шуттель-аппарате (п. 5.7.4.1.4.).

В качестве контроля используют тест-поверхности, окрашенные краской или покрытые лаком, не содержащими вирулицидных веществ.

Определение пролонгированного вирулицидного действия лакокрасочных материалов проводят на тест-поверхностях без дополнительной и с дополнительной искусственной контаминацией испытуемым тест-вирусом.

Критерии вирулицидной активности лакокрасочного покрытия - снижение количества вируса не менее, чем на 4 через 24 часа после нанесения его на поверхность; наблюдение может продолжаться в течение 6 месяцев и более.

5.7.7. Библиографические данные

1. Disinfection, sterilization, and preservation. Seymour S. Block. Fifth Edition, by Lippincott Williams S Wilkins, Philadelphia, PA 19106 USA. - 2001. - 1481 с.

2. Handbuch der viruswirksamen Desinfektionen. F. v. Rheinbaben, M.H. Wolf. Springer-Verlad, Berlin. - 2002. - 509 c.

3. EN 14476. Chemical disinfectants and antiseptics- Virucidal quantitative suspension test for chemical disinfectants and antiseptics used in human medicine - Test methods and requirements (phase 2/step 1) ICS 11.080.20, april 2005+А1:2006.

4. Prufung und Deklaration der Wirksamkeit von Desinfections-mitteln gegen Viren. Stellungnahme des Arbeitskreises Viruzidie beim Robert Koch-Institut (RKI) sowie des Fachausschusses "Virusdesinfektion" der Deutschen Gesellschaft zur der Viruskrankheiten (DVV) und der Desinfektionsmittel-kommission der Deutschen Gesellschaft fur Hygiene und Mikrobiologie (DGHM). Bundesgesundheitsbl-Gesundheitsforsch-Gesundheitsschutz. - 2004. - N 47.-С. 62-66.

5. Методические рекомендации по определению вирулицидной активности препаратов. N 1119-73 от 06.09.73, М., 1974. - 16 с.

6. Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита. ВОЗ, Женева.-М., 1998. - 114 с.

7. Комплексная оценка вирулицидной активности дезинфектантов на вирус гепатита А. Н.А. Замятина, Р.М. Элбакян, В.Ф. Полещук, М.И. Михайлов. / Тр. Ин-та полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова. Медицинская вирусология. М., 2006. - Т.XXIII. - С. 137-141.

8. Вирус гепатита В уток как суррогатная модель для изучения вируса гепатита В человека./Т.А. Тетерина, К.К. Кюрегян, О.В. Исаева, О.Е. Попова, В.П. Князев, К.Н. Груздев, М.И. Михайлов/Тр. Ин-та полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова. Медицинская вирусология. М., 2006 г. - Т.XXIII. - С. 152-160.

9. Protocol for testing the efficacy of disinfectants used to inactivate duck hepatitis B virus and to support corresponding label claims. Developed by MicroBioTest, Inc. and Submitted to the Environmental Protection Agency. 2000. - P. 1-12.

10. Дерябин П.Г., Львов Д.К. высокопродуктивный вариант вируса гепатита С. Выделение, характеристика, идентификация//Доклады Академии наук РФ. - 1998. - Т.358. - 5. - С. 688-691.

11. Дерябин П.Г., Исаева Е.И., Гренкова Е.П., Сухно А.С. и др. Цитопатогенные варианты вируса гепатита С (ВГС), пригодные для разработки вакцины//Аллергия, астма и клиническая иммунология. - 2001. - Т.1. - С. 28-30.

5.7.8. Приложения

Приложение 1
(рекомендуемое)

1. Тест-вирусы и методы их культивирования

1.1. Тест-вирусы

Тест-вирусы получают из национальных или из международных коллекций вирусов:

1.1.1. Вирус полиомиелита 1 типа (вакцинный штамм Sabin (LSc-2ab), РНК- содержащий вирус, не имеющий оболочки, из семейства пикорнавирусов;

1.1.2. Аденовирус, тип 5, штамм Аденоид 75 (АТСС VR-5), ДНК - содержащий вирус, не имеющий оболочки, из семейства аденовирусов;

1.1.3. Бычий парвовирус, штамм Хаден (АТСС VR-767);

1.1.4 Вирус гепатита А, штамм HAS-15, РНК- содержащий вирус, не имеющий оболочки, из семейства пикорнавирусов.

1.1.5 Вирус гепатита В уток (ВГВУ), штамм "УФА-04", ДНК-содержащий, из семейства гепаднавирусов.

1.1.6. Вирус гепатита С человека, штамм Д1.

1.1.7 Вирус бычьей диареи (ВД-БС), РНК - содержащий вирус диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, из семейства пестивирусов, штамм ВК-1В1-N 28.

1.2. Культивирование вирусов

1.2.1. Исходный вирус - это вирус, полученный из референс центров (из национальных или международных коллекций вирусов), размноженный в объемах, достаточных для длительной работы с данным пассажем, при минимальных количествах пассажей. Хранится в малых объемах при - 70°C или в жидком азоте (Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита, ВОЗ, Женева, М., 1998).

1.2.2. Тест-вирусная суспензия - вирусная суспензия, полученная из исходного вируса и используемая для определения вирулицидных свойств дезинфектанта.

1.2.3. Исходный вирус размножают в чувствительных клетках (лабораторных животных, утках и др.), продуцирующих вирус в высоких титрах. Клеточный детрит удаляют цетрифугированием при низких оборотах (1000 об/5 мин). Этот материал называют "тест-вирусной суспензией". Ее используют не разведенной.

Предполагается, что минимальный титр вирусной суспензии по крайней мере . В любом случае он должен быть достаточно высоким, чтобы можно было получить снижение титра на 4,0 .

Полиовирус размножают в перевиваемой культуре клеток RD и HEp-2 или в других чувствительных клеточных культурах (4647, Vero и т.д.). Для получения ВС культуру клеток, инфицированную вирусом полиомиелита на стадии 100% поражения монослоя, вызванного цитопатическим действием вируса, трехкратно замораживают и оттаивают. После удаления разрушенных клеток центрифугированием, полученную суспензию используют в экспериментах.

Аденовирус размножают в перевиваемой клеточной культуре HEp-2, 4647 и в других чувствительных клеточных культурах. Методика получения ВС аналогична вышеописанной, за исключением того, что перед процедурой разрушения клеток методом замораживания- оттаивания, проводят замену культуральной среды на не содержащую сыворотки и добавляют ее в меньшем объеме.

Вирус гепатита А размножают в перевиваемой культуре клеток 4647. Для получения ВС флаконы инкубируют при 37°C в течение 21-28 дней с еженедельной сменой среды. По окончании инкубации из флаконов удаляют среду поддержания, монослой промывают раствором Хенкса, добавляют подогретый до 37°C раствор Версена, монослой обмывают диспергентом, раствор Версена сливают и добавляют 0,1 М фосфатно-солевой буфер, рН 7,6.

Зараженные клетки ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере, суспензию клеток пятикратно замораживают (-70°C) и оттаивают при комнатной температуре. Полученный клеточный лизат, содержащий 6,5-7,0 ВГА гомогенизируют и осветляют центрифугированием (3000 об/5 мин), затем используют в качестве тест-вируса.

Супернатант аттестовывают на содержание антигена вирусного гепатита А методом ИФА. Оптическая плотность () испытуемых образцов, обработанных ДС, должна соответствовать контрольных образцов, не содержащих ВГА.

Методика определения инфекционного титра основана на выявлении антигена ВГА при титровании методом конечного разведения. Готовят 10-кратные разведения анализируемого материала на среде Игла МЕМ х 2. Каждым разведением вируса, начиная заражают не менее 4 одинаковых емкостей с плотным монослоем культуры клеток 4647. После инкубации в течение 21-28 дней. Супернатант аттестуют на содержание вирусного антигена методом ИФА. Инфекционные титры вычисляют по методу Рида и Менча или по методу Спермана-Кербера (Приложение 3).

Вирус гепатита В уток Метод моделирования инфекции ВГВУ in vivo. Источником вируса при моделировании инфекции является сыворотка крови домашней утки, инфицированной ВГВУ in vivo при экспериментальном заражении вирусом с известными инфекционными свойствами. Для тест-вируса ВГВУ, используемого в каждом опыте по оценке ДС, должен быть определен инфекционный титр.

Важным моментом при подготовке опыта по испытанию ДС с помощью моделирования ВГВУ-инфекции домашних уток является определение численности опытных групп. По причине довольно широкой распространенности естественной ВГВУ-инфекции и отсутствия скрининга на ВГВУ в хозяйствах - поставщиках эмбрионов и утят на территории Российской Федерации перед закладкой опыта необходимо предварительное тестирование на ДНК ВГВУ для отвода от участия в опыте уток с естественной инфекцией. Ввиду максимальной восприимчивости к инфицированию ВГВУ утят в возрасте 1-3 дней целесообразно работать с утятами именно этого возраста, однако предварительный скрининг может привести к задержке эксперимента, и, как следствие, к снижению числа восприимчивых к инфицированию особей. Поэтому рекомендуется увеличение опытных групп до 10-15 голов каждая с учетом потенциального числа утят с естественной ВГВУ-инфекцией, взятие крови у всех утят непосредственно перед введением опытного материала, определение ДНК ВГВУ в течение ближайшего времени и выведение из опыта утят с выявленной естественной ВГВУ-инфекцией.

После определения числа опытных групп проводят непосредственно обработку вируса ДС. Обработка ДС должна проводиться непосредственно перед введением материала уткам, при необходимости обработанный ДС вирусный препарат может храниться не более суток при +4°С без снижения потенциальных инфекционных свойств.

Обработка вируса ДС проводится по стандартной методике, с использованием суспензионного метода или метода батистовых тест-объектов.

Затем проводят нейтрализацию ДС по стандартной методике. Трехдневных утят размещают по 10 голов в изолированных клетках по числу групп эксперимента. Затем у всех утят берут кровь, и используют для последующего ПЦР-анализа. После взятия крови уткам внутрибрюшинно вводят материал, полученный в результате обработки ВГВУ ДС. Показано, что внутрибрюшинное инфицирование ВГВУ так же эффективно, как и внутривенное, но при этом менее травматично для животных. Каждой утке вводят 200 мкл материала, в каждой опытной группе используют соответствующий материал, обработанный выбранной концентрацией ДС. В позитивной и негативной группах таким же образом вводят соответствующий контрольный материал.

После получения данных по выявлению естественной ВГВУ-инфекции среди задействованных в эксперименте уток, позитивных по ВГВУ особей удаляют. У всех участвующих в эксперименте уток проводят взятие крови через 3 недели после инфицирования. Взятие крови и отделение сыворотки крови проводят таким же образом, как и при предварительном тестировании на естественную ВГВУ-инфекцию. В отобранных образцах проводят определение ВГВУ-инфекции в ПЦР. Оценка результатов эксперимента проводится по системе "да/нет", т.е. появление даже одного случая ВГВУ-инфекции в опытной группе рассматривается как инфицирование ВГВУ, и, как следствие, указывает на недостаточные вирулицидные свойства анализируемой концентрации ДС.

Вирус диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота размножают в клетках КСТ - перевиваемой культуре клеток коронарных сосудов сердца плода коровы. Вирус имеется в музее ГУ "Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко".

Вирус гепатита С человека размножают в культуре клеток по методике, разработанной в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Приложение 2
(справочное)

Статистическая обработка результатов

А. Определение 50% дозы по методу Рида и Менча и по методу Спермана-Кербера

Титрование вируса в пробирочных культурах и на животных предусматривает определение дозы, при которой действие вируса (цитопатогенный эффект или гибель животных) проявляется в 50% тест-объектов (пробирочных культур или животных), так называемых ТЦИД50 или LD50. Поскольку в большинстве случаев по данным титрования сразу не удается определить 50% дозу, возникает необходимость в статистической обработке результатов. Результаты могут считаться статистически достоверными при соблюдении следующих условий:

1. Количество тест-объектов, зараженных одним разведением вируса, должно быть не менее 4;

2. В титрование должны быть включены два разведения вируса ниже 50% дозы и два разведения вируса выше этой дозы.

Среди различных методов подсчета или наибольшее распространение получили метод полных кумулятивов Рида и Менча и метод определения "центральной величины" Кербера.

1. Метод Рида и Менча

(Reed L.J., Muench H.A. A simple method of estimating 50% endpoints. Am. J. Hyd., 1938, 27, 493-497. Упрощенный вариант по книге Ворошиловой М.К., Жевандеровой В.И., Балаяна М.С. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. М., Медицина, 1964. - с. 127-129. Статистическая обработка результатов).

Метод основан на логической предпосылке, что тканевая культура или животное, погибшие при заражении их каким-либо разведением вируса, погибнут и при заражении любым более низким разведением.

Пример подсчета показан в табл. 1.

Таблица 1

Подсчет 50% дозы () по методу Рида и Менча

Разведение вируса	Количество тест-объектов	Исходные данные		Кумулятивные данные			Процент гибели
		погибло	выжило	погибло выжило
	4	4	0		7	0	100
	4	2	2		3	2	60
	4	1	3		1	5	17
	4	0	4		0	9	0

Из табл. 1 видно, что 50% доза находится между разведениями вируса и .

Далее расчет величины X, которую необходимо прибавить к разведению непосредственно ниже 50% дозы (в ), производится по следующей формуле:

, (1)

где: А - процент гибели при разведении, непосредственно ниже искомой 50% дозы (в данном случае 60%);

В - процент гибели при разведении непосредственно выше искомой 50% дозы (в данном случае 17%).

Подставляя полученные значения в формулу 1, находим:

откуда титр вируса (в обратных ) равен 6+0,23=6,23; другими словами, одна или соответствует разведению вируса .

Если в титрование были взяты разведения вируса с интервалом 0,5 , то величину X в формуле 1 следует умножить на 0,5.

Поскольку при титровании вируса в пробирочных культурах обычно получаются четкие результаты и культуры со 100% дегенерацией отделены от культур с полным отсутствием дегенерации всего одним разведением вируса, удобно пользоваться при подсчете титров по Риду и Менчу упрощенной схемой:

Количество пробирочных культур, зараженных разведением	Количество культур с ЦПЭ	Процент культур с ЦПЭ	Титр вируса в
4	1	25	(n-1), 66
4	2	50	n, 0
4	3	75	n, 33
4	4	100	n, 50

Для вычисления (количества цитопатогенных доз) вируса в 1 мл исследуемой жидкости к показателю величины титра вируса в прибавляют в зависимости от количества вируссодержащего материала, взятого для заражения одной культуры, соответствующие величины поправок:

Объем материала в миллилитрах, взятого для заражения одной культуры	Величина поправки в единицах логарифма
0,2	0,7
0,25	0,6
0,3	0,52
0,4	0,4
0,5	0,3
0,6	0,22
0,7	0,16
0,8	0,1

Например, если во всех пробирочных культурах, зараженных по 0,2 мл материалом в разведении , наблюдается цитопатогенный эффект, а в культурах, инокулированных разведением , цитопатогенного эффекта не наблюдается (при инокуляции же разведением цитопатогенный эффект отмечен в одной из четырех пробирок), то титр вируса в будет равен . Содержание же его в 1 мл будет равно

2. Определение вируса по методу Спермана-Кербера

представляет собой отрицательный десятичный логарифм наибольшей использованной концентрации вируса, умноженной на логарифм разведения, то есть (сумма % пораженных клеток в каждом разведении/ 100-0,5) x  разведения.

Таблица 2

Пример результата титрования

Разведения, -	Результаты по ЦПД*	Процент (%) культур с наличием ЦПД
- 4	4, 4, 4, 4, 4, 4	100
- 5	4, 4, 3, 4, 4, 4	100
- 6	4, 4, 3, 3, 0, 0	66,7
- 7	4, 2, 0, 0, 0, 0	33,3
- 8	0, 0, 0, 0, 0, 0	0
Сумма% с ЦПД		300

Примечание: * - от 1 до 4 - плюсовая система %-го выражения гибели клеточных культур (1+ = 25%, 2+ =50%, 3+ = 75% и 4+ = 100%), 0 = отсутствие ЦПД.

Формула расчета по этим данным:

-4-[{(100+100+66,7+33,3+0)/100}-0,5]x1=-4-[300/100-0,5]x1=-4-2,5=6,5 .

Таким образом, будет равно или 6,5

3. Метод бляшек

Для расчета среднего значения количества бляшек используется следующая формула:

Где:

t - объем, добавляемый в лунку при каждом шаге разведения

- число БОЕ во всех лунках наименьшего разведении, при котором возможен учет (уже не сливные бляшки)

- число БОЕ во всех лунках следующего разведения

- число БОЕ во всех лунках последнего разведения

- количество всех лунок наименьшего разведения с не сливными бляшками (соответствует )

- число всех лунок второго разведения с не сливными бляшками ()

- фактор разведения между (например, и , то )

- количество всех лунок последнего разведения, при котором имеется бляшки ()

- фактор разведения между и (например, и , то )

d - шаг разведения

Вычисления проводятся с целыми числами, если последнее число меньше 5, то оно остается неизменным; если оно больше 5, то округляется до следующего целого числа.

Пример.

Если объем, добавляемый при разведении, равен 0,2 мл, то

5.8. Методы изучения и оценки спороцидной активности дезинфицирующих и стерилизующих средств

5.8.1. Общие положения

Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" [1] и Федеральный закон "Об охране окружающей среды" [2], регламентируют проведение специфической и неспецифической профилактики инфекционных заболеваний. В комплекс неспецифических профилактических мероприятий входят дезинфекция и стерилизация [12] с использованием ДС и СС, обладающих спороцидной активностью, т.е. убивающих споры микроорганизмов при регламентированных параметрах технологии (режимах обработки) [10, 47, 68].

ДС, обладающие спороцидной активностью, необходимы для обеззараживания различных объектов при сибирской язве, газовой гангрене, столбняке, дезинфекции высокого уровня (ДВУ) эндоскопов; стерилизующие средства - для стерилизации изделий медицинского назначения (ИМН), включая эндоскопы, и для ДВУ эндоскопов [7-11].

Данное руководство регламентирует методологию и технологию изучения и оценки спороцидной активности субстанций для производства ДС и СС, спороцидной активности и эффективности химических и физических ДС для обеззараживания различных объектов, а также СС для стерилизации ИМН, обсемененных наиболее устойчивыми микроорганизмами в споровой форме с учетом максимально возможного уровня контаминации ими объектов [10, 74].

Исследования спороцидной активности субстанций, ДС, СС и эффективности режимов их применения включают [74]:

- выбор и подготовку тест-микроорганизмов в споровой форме для изучения спороцидной активности ДС, СС и их субстанций;

- обеспечение стандартности условий проведения исследований спороцидной активности ДС, СС и их субстанций;

- методы исследований и оценку результатов спороцидной активности ДС, СС и их субстанций in vitro (суспензионный метод, метод батистовых тест-объектов) и спектра спороцидной активности;

- методы исследований и оценку спороцидной эффективности ДС при разработке режимов обеззараживания объектов внешней среды, контаминированных тест-микроорганизмами в споровой форме;

- методы исследований спороцидной эффективности СС при разработке режимов стерилизации ИМН, включая эндоскопы;

- методы исследований спороцидной активности СС, предназначенных для ДВУ эндоскопов.

Для применения спороцидных ДС в очагах искусственного происхождения (биотерроризм) разработанные режимы (дезинфектологические технологии) должны корректироваться в специальных лабораториях, изучающих возможные споровые биологические рецептуры и связанные с этим специфические особенности дезинфекции в очагах заражения.

Организации, проводящие исследования спороцидной активности и эффективности химических ДС, СС и их субстанций, в отчетной документации, представляемой для регистрации и сертификации средств, должны представлять конкретные результаты оценки стандартности использованных в исследованиях спор тест-микроорганизмов, а также эффективности нейтрализации ДВ использованного нейтрализатора [7, 8, 9, 10, 11].

5.8.1.1. Тест-микроорганизмы для изучения и оценки спороцидной активности ДС, СС и их субстанций. Требования к тест-микроорганизмам

При изучении спороцидной активности ДС и их субстанций в качестве тест-микроорганизмов используют [74]:

- Bacillus cereus, штаммамм 96;

- Bacillus subtilis, штаммамм 7;

- сибиреязвенная живая сухая вакцина СТИ-1 для людей;

- Bacillus anthracis, штаммамм 81/1 (, ), или штаммамм 27 (, ).

При изучении спороцидной активности СС и их субстанций в качестве тест-микроорганизмов используют:

- Bacillus cereus, штаммамм 96;

- Bacillus subtilis, штаммамм 7;

- Bacillus licheniformis, штаммамм G BKM B-1711D;

- Geobacillis stearothermophilius, штаммамм ВКМ В-718.

Тест-микроорганизмы выбирают в зависимости от действующего вещества (ДВ) и от назначения спороцидного ДС, СС и его субстанции.

Требования к тест-микроорганизмам. Тест-микроорганизмы должны иметь типичные морфологические, культуральные, биохимические свойства, присущие данному виду (см. Приложение 1), и обладать стандартной устойчивостью к эталонным ДС и СС [10]: хлорамину 10%, перекиси водорода 6%, глутаровому альдегиду 2,5% (рН 7,2), сухому горячему воздуху при ()°C, водяному текучему пару при 100°C, водяному насыщенному пару под избыточным давлением при ()°C.

Показатели устойчивости тест-микроорганизмов к вышеперечисленным средствам приведены в таблице 5.8.

Музейные штаммаммы тест-микроорганизмов хранят в холодильнике при температуре ()°C в виде сухой культуры в ампулах (после лиофильной сушки) не более 2-х лет [66, 74].

Тест-микроорганизмы, не обладающие указанной устойчивостью, подлежат замене.

Спороцидную активность ДС, СС и их субстанций определяют, используя тест-микроорганизмы в споровой форме [74].

Таблица 5.8.

Устойчивость спор тест-микроорганизмов к эталонным дезинфицирующим и стерилизующим средствам

Тест-культура		Время гибели тест-микроорганизмов, не менее (мин), при действии
Название и штаммамм	к-во спор в тест-объекте	хлорамина 10%	перекиси водорода 6%	глутарового альдегида 2,5%	сухого горячего воздуха ()°C)	водяного текучего пара (100°C)	водяного насыщенного пара под избыточным давлением ()°C)
Тест-микроорганизмы для изучения и оценки дезинфицирующих средств и их субстанций
Bacillus cereus, штамм. 96		360	60	60	-	6-7	-
Bacillus subtilis, штамм. 7		360	60	180		6-7	-
Сибиреязвенная живая сухая вакцина СТИ-1 для людей		360	60	60	-	6-7	-
Bacillus anthracis, штамм. 81/1 или 27		360	60	60	-	6-7	-
Тест-микроорганизмы для изучения и оценки стерилизующих средств и их субстанций
Bacillus cereus, штамм. 96		360	60	60	-	6-7	-
Bacillus subtilis, штамм. 7		360	60	180	-	6-7	-
Bacillus licheniformis G BKM B-1711D		-	-	-	30	-	-
Geobacillis stearothermophilius, штамм. ВКМ В-718		-	-	-	-	-	15

Использование B.cereus и B. subtilis в качестве тест-микроорганизмов при изучении спороцидной активности дезинфицирующих и стерилизующих средств гармонизировано с Европейским стандартом. Руководствуясь данными таблицы 5.8. дальнейшие исследования проводят с использованием наиболее устойчивого тест-микроорганизма к проверяемому средству.

5.8.1.2. Методика приготовления суспензии спор тест-микроорганизмов

Для получения тест-микроорганизмов в споровой форме их выращивают на питательных средах, приведенных в таблице 5.9.

Таблица 5.9.

Питательные среды для выращивания тест-микроорганизмов в споровой форме

NN п/п	Тест-культуры	Питательные среды
1.	Bacillus cereus, штамм. 96	Пшеничный агар
2.	Bacillus subtilis, штамм. 7
3.	Bacillus anthracis, штамм. 81/1, 27	Пшеничный агар или агар Хоттингера с аминным азотом 120
4.	Bacillus licheniformis, G ВКМ В-1711D	Пшеничный агар или картофельно-пептонный агар
5.	Geobacillis stearothermophilius, штамм. ВКМ В-718

Перечень компонентов и методика приготовления питательных сред для культивирования тест-микроорганизмов, предназначенных для изучения и оценки спороцидной активности ДС, СС и их субстанций, приведены в Приложении 2.

Процесс приготовления суспензии спор тест-микроорганизма, используемого при исследовании и оценке спороцидной активности ДС, СС и их субстанций, включает три последовательных этапа [74]:

- получение бульонной культуры из музейной лиофилизированной или агаровой культуры тест-микроорганизма;

- получение споровой агаровой культуры тест-микроорганизма;

- приготовление суспензии спор тест-микроорганизма и оценка соответствия ее требованиям.

При использовании лиофилизированной споровой культуры B.cereus и B. subtilis ампулы с этими тест-микроорганизмами вскрывают в асептических условиях следующим образом: тампоном ваты, смоченным этиловым спиртом, обрабатывают поверхность ампулы, затем нагревают ее запаянный конец над пламенем. К накаленному концу ампулы прикладывают ватную пробку, смоченную стерильной водой, чтобы на ампуле образовалась трещина. Металлическим инструментом (скальпель, пинцет) откалывают по трещине конец ампулы. После этого стерильной пастеровской пипеткой в ампулу вливают 0,2 мл стерильной питьевой воды, накрывают стерильной марлевой салфеткой и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Для получения суспензии спор содержимое ампулы перемешивают с помощью стерильной бактериологической петли.

Полученную таким образом в ампуле суспензию спор тест-микроорганизма отсасывают стерильной пастеровской пипеткой и переносят по 1-2 капли в две пробирки с 5 мл питательного бульона (бульон Хоттингера, сухой питательный бульон - СПБ, мясо-пептонный бульон МПБ), содержащего 0,5% глюкозы.

При работе с возбудителем сибирской язвы для приготовления суспензии спор ампулы с высушенными культурами вскрывают в помещении музея (коллекции) живых культур. Манипуляции проводят в боксе биологической безопасности. При этом оттянутый конец ампулы нагревают над пламенем газовой горелки; затем влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины. Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.

После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение одной - двух мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезинфицирующий раствор. Вскрытую ампулу накрывают стерильным марлевым тампоном на 1-2 мин. Затем в ампулу вносят 0,2 мл стерильной питьевой воды для приготовления суспензии спор, которую далее высевают в жидкие питательные среды, как указано выше.

Посевы G.stearothermophilius инкубируют при температуре ()°C, а B.cereus, B.subtilis, B.anthracis и B.licheniformis - при температуре ()°C в течение 24-48 ч.

Бульонные культуры тест-микроорганизмов бактериологической петлей или пастеровской пипеткой (по 1-2 капли) пересевают в пробирки на скошенную питательную среду (сухой питательный агар - СПА, мясо-пептонный агар - МПА). Посевы инкубируют в течение 24-48 часов, как указано выше.

Для получения спор культур B.licheniformis, G.stearothermophilius в пробирки с посевом необходимого для проведения исследования тест-микроорганизма добавляют 5 мл стерильной дистиллированной воды и смывают культуру, выросшую на твердой питательной среде. Полученную взвесь переносят во флаконы или емкости до 250/500 мл, содержащие соответственно 100/200 мл соответствующего для данного тест-микроорганизма скошенной твердой (агаровой) питательной среды (см. табл. 5.9.).

На поверхность питательной среды в каждый флакон (матрац), в зависимости от их вместимости (250/500 мл), вносят суспензию, смытую с 1-2 пробирок с посевами. Взвесь покачиванием флакона (матраца) равномерно распределяют по поверхности среды, закрывают ватно-марлевыми пробками и бумажными колпачками и инкубируют при температуре ()°C (G. stearothermophilus) или ()°C (В.licheniformis) в течение 10-12 суток в наклонном положении (под углом 45°C) агаром вверх. Для создания достаточной влажности в термостат, работающий при температуре ()°C, помещают открытые емкости с водой (до 2 л на термостат вместимостью 80 л).

Тест-микроорганизмы B.cereus, B.subtilis и B.anthracis для получения споровой формы засевают на скошенный пшеничный агар или агар Хоттингера с аминным азотом 120 мг% и выращивают при температуре ()°C двое суток в термостате, а затем еще 7-12 суток при температуре ()°C в темном месте. На 7 и 9 сутки культуры проверяют на интенсивность спорообразования. Для этого выборочно с 2-3 флаконов (матрацев) культуру забирают петлей с верхнего, среднего и нижнего участков агара; все три пробы растирают вместе на одном предметном стекле, распределяя тонким слоем. Мазок фиксируют над пламенем горелки, окрашивают по Граму или генцианвиолетом (по Синеву). Окрашенные препараты промывают питьевой водой, подсушивают и микроскопируют с иммерсионной системой - споры имеют вид неокрашенных пустот, находящихся внутри клеток.

При работе с B.anthracis для фиксации мазков используют 90° этиловый спирт или смесь Никифорова (равное количество спирта и эфира), время фиксации 30 мин. Затем мазок окрашивают при нагревании 1-2 мин карболовым фуксином Циля, промывают водой и обесцвечивают, погружая в 2% раствор азотной кислоты в спирте или в 1% раствор серной кислоты, так, чтобы на препарате не было видно следов красителя.

Исследуют 10 полей зрения, подсчитывают количество спор, выражая в процентах. Достаточным количеством считают не менее 90% спор в поле зрения от общего числа клеток.

После завершения спорообразования тест-микроорганизмы осторожно при помощи шпателя (из проволоки) или стерильных стеклянных бус смывают с поверхности агара 5-10 мл стерильной дистиллированной воды (в зависимости от вместимости флакона) и сливают в емкости (пробирки, флаконы), которые закрывают стерильными резиновыми пробками.

Для оценки качества полученной споровой суспензии тест-микроорганизма и принятия решения о возможности использования ее по назначению, из флакона (после тщательного перемешивания путем встряхивания) стерильно отбирают в пробирку 10 мл суспензии и определяют соответствие требованиям по биологической концентрации (БК) спор тест-микроорганизма в суспензии и их устойчивости к эталонным физическим и химическим дезинфицирующим и стерилизующим средствам, представленным в табл. 5.8.

В случае загрязнения исходного штаммамма тест-микроорганизма посторонней микрофлорой выделяют чистую культуру его принятыми методами (прогревания, промывания, центрифугирования и др.). Выделенную культуру тест-микроорганизма идентифицируют и проверяют устойчивость его к эталонным дезинфицирующим и стерилизующим средствам.

5.8.1.3. Определение биологической концентрации тест-микроорганизма в споровой суспензии [74]

Определение выполняют методом последовательных десятикратных разведений суспензии тест-микроорганизма в стерильной дистиллированной воде с последующим высевом суспензии в чашки Петри с плотной питательной средой (агар Хоттингера, СПА, МПА). После определенного времени инкубации при соответствующей температуре проводят подсчет выросших колониеобразующих единиц (КОЕ) и определяют количество жизнеспособных спор в одном мл суспензии (БК).

Для проведения испытания необходимы материалы и оборудование, приведенные в Приложении 3.

При выполнении испытания соблюдают следующие условия:

- используют дозаторы переменного объема не менее 2-го класса точности;

- в процессе выполнения опыта соблюдают асептические условия;

- контролируют температуру термостата и срок инкубации посевов.

До проведения испытания выполняют следующие подготовительные операции:

- расплавляют на кипящей водной бане плотную питательную среду (агар) и охлаждают ее до температуры ()°C;

- охлажденную питательную среду разливают по ()  в стерильные чашки Петри в пламени спиртовки (газовой горелки) и оставляют чашки на горизонтальной поверхности, пока не застынет агар;

- при необходимости подсушивают чашки с плотной питательной средой в термостате крышками вниз;

- разливают в стерильные пробирки с ватно-марлевыми пробками по 4,5  стерильной дистиллированной воды.

В работе используют только кондиционные партии питательных сред, для чего предварительно проверяют их качество путем высева эталонной культуры соответствующего штамма. Для кондиционной среды число выросших тест-микроорганизмов от их общего количества должно составлять не менее 50%.

При определении БК тест-микроорганизма в исходной суспензии спор агаровой культуры, последнюю разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации, соответствующей по бактериальному стандарту мутности 1 млрд микробных тел в 1 мл. Затем стерильной пипеткой отбирают 0,5 мл суспензии спор и переносят в пробирку, содержащую 4,5 мл стерильной дистиллированной воды. Полученное разведение () тщательно встряхивают. Аналогично, меняя пипетку, делают все последующие разведения до необходимого (), теоретически соответствующего концентрации спор в 1 мл. Из двух последовательных десятикратных разведений исходной суспензии производят высев по 0,1 мл на поверхность трех чашек Петри с агаром (агар Хоттингера, СПА, МПА). Чашки Петри инкубируют при температуре ()°C или ()°C в зависимости от вида культуры в течение 24-48 ч, после чего определяют число КОЕ. Количество жизнеспособных спор в исходной суспензии определяют как среднее арифметической число КОЕ с учетом разведения исходной суспензии и объема пробы для посева.

Пример расчетов. Предположим, что при посеве на три чашки Петри с агаром суспензии в разведении 1 : 100 000 подсчитано 140, 110 и 134 КОЕ. Аналогичные высевы из разведений 1 : 1 000 000 привели к образованию 12, 14 и 16 КОЕ.

Вычисляем общее число КОЕ, найденных во всех трех чашках Петри соответствующих разведений:

1:100 000	140+110+134=384
1:1 000 000	12+14+16=42

Среднее число КОЕ на чашках составит для разведения

1:100 000	384:3=128
1:1 000 000	42:3=14

Из расчета посевной дозы (0,1 мл на каждую чашку) вычисляем число жизнеспособных спор в 1 мл исходной суспензии с учетом разведений, далее находим среднее арифметическое числа КОЕ:

Таким образом, число жизнеспособных спор в исходной суспензии составит: спор/мл.

Или при посеве из одного последнего разведения по 0,1 мл на 5 чашек Петри расчет концентрации жизнеспособных микроорганизмов в 1 мл суспензии препарата осуществляют по формуле:

,

где - БК - концентрация жизнеспособных спор тест-микроорганизма, ;

- х - суммарное количество колоний, выросших на пяти чашках, КОЕ;

- p - разведения;

- 2 - коэффициент, приводящий измерение объема посеянной суспензии к 1 мл.

Например: общее количество колоний на 5 чашках Петри составило 540 КОЕ, тогда количество жизнеспособных спор в исходной суспензии равно: спор/мл.

Герметично закрытые стерильной пробкой флаконы (пробирки) с исходной суспензией спор хранят в холодильнике при температуре ()°C до 6 месяцев, если споры тест-микроорганизма соответствуют вышеуказанным требованиям (табл. 1). Для снижения негативного влияния на суспензию спор перепада температуры, неизбежного при извлечении флакона из холодильника для отбора части суспензии, необходимой для проведения исследования ДС, СС и их субстанций, суспензию спор тест-микроорганизма из флакона целесообразно расфасовывать в пробирки и использовать их по мере необходимости.

Чистоту культуры тест-микроорганизма на всех этапах культивирования контролируют путем посева ее на чашки Петри с агаром Хоттингера, СПА, МПА.

Сибиреязвенную живую сухую вакцину (СТИ-1) при изучении спороцидной активности и эффективности используют в виде суспензии, содержащей спор/мл, приготовленной разбавлением содержимого одной ампулы в 10 мл стерильной питьевой воды.

5.8.1.4. Методики определения устойчивости спор тест-микроорганизмов к эталонным ДС

5.8.1.4.1. Определение устойчивости спор к текучему пару, водяному насыщенному пару под избыточным давлением, сухому горячему воздуху [51, 52, 74].

Устойчивость к действию текучего пара спор B.cereus, В.subtilis, В.anthracis, сибиреязвенной вакцины СТИ-1 определяют в аппарате Ойль-Мюллера, используя батистовые тест-объекты, контаминированные вышеуказанными тест-микроорганизмами, с последующим посевом тест-объектов в жидкую питательную среду.

Аппарат Ойль-Мюллера может быть заменен устройством, доступным для изготовления практически в любой лаборатории, где необходимо провести такое исследование. Для этого берется стеклянная колба объемом 1-2 л с широким удлиненным горлом. Корковую пробку под него срезают на 1/3 по длине для обеспечения выхода пара. Это отверстие используется и для проведения измерения термометром температуры пара в месте размещения батистовых тест-объектов. Через трубку пропускают проволоку, имеющую на конце припаянную (или укрепленную другим способом) перпендикулярно к ней металлическую сеточку диаметром 3-3,5 см из нержавеющей стали, предназначенную для размещения батистовых тест-объектов, контаминированных спорами тест-микроорганизма.

Проволоку в пробке устанавливают так, чтобы сеточка находилась в месте перехода конуса колбы в горло. Это обеспечивает прохождение через сеточку практически всего объема выделяемого кипящей в колбе водой пара. Уровень воды должен находиться от сеточки на расстоянии 5-6 см.

В процессе испытаний контролируют следующие показатели:

- температуру текучего пара;

- исходную и остаточную контаминацию тест-микроорганизмами батистовых тест-объектов;

- время действия пара на контаминированные тест-объекты в аппарате Ойль-Мюллера (колбе).

Исследования проводят следующим образом: в колбу наливают дистиллированную воду и нагревают ее до кипения. При достижении температуры 100°C на термометре, находящемся под воздействием текучего пара, на предварительно простерилизованную автоклавированием вместе с пробкой или обожженную в пламени сеточку помещают 2 батистовых тест-объекта (1 х 0,5 см), контаминированных спорами тест-микроорганизма (методику приготовления тест-объектов см. в п. 5.1.2.2.). Тест-объекты размещают так, чтобы исключался контакт их со стенкой горла колбы при введении сеточки в колбу. Держась за пробку, сеточку с тест-объектами вносят в зону действия текучего пара и включают секундомер. По истечении 2 мин воздействия пара, держась за пробку, сеточку с тест-объектами извлекают из колбы, а тест-объекты сразу помещают (засевают) в две пробирки со стерильным питательным бульоном. Обжигают сеточку и кладут на нее 2 новых тест-объекта. Аналогично вышеописанному вносят их в зону действия пара на 2 мин, затем также извлекают и помещают в пробирки со стерильным питательным бульоном. Так операцию повторяют, увеличивая экспозицию на 1 мин до 10 мин. Посевы инкубируют при ()°C в течение 7 суток. Предварительный учет результатов проводят через 48 часов инкубирования, окончательный - на 7 сутки. Из пробирок с проросшим бульоном делают посев петлей на твердую среду для идентификации выросших тест-микроорганизмов.

При использовании аппарата Ойль-Мюллера необходимо не допускать случайного прикосновения к горлышку колбы сначала до обеззараживания тест-объектов, затем - после обеззараживания. Этих погрешностей, искажающих результаты опыта, можно избежать при использовании аппарата Ойль-Мюллера в модификации Л.А. Блиновой (рис. 2). В емкости для текучего пара имеется четыре отверстия. Первое отверстие (1) размещается вверху и предназначено для термометра, второе (2) справа в торце - для внесения зараженных тест-объектов, третье (3) - на лицевой стороне - для изъятия обеззараженных тест-объектов и четвертое (4) - слева в торце для выхода пара. При пользовании таким аппаратом тест-объекты накалывают на иглу, закрепленную в пробке, которую вставляют в отверстие 2. Отверстие 3 во время экспозиции закрыто стерильной пробкой. По окончании экспозиции его открывают и через него извлекают обожженным пинцетом снятые с иглы тест-объекты, которые сразу засевают в бульон.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо "рис. 2" имеется в виду "рис. 5.1."

Применяемый в аппарате термометр должен иметь шкалу с делениями на десятые доли градуса. Определение устойчивости спор бацилл к текучему пару проводят при атмосферном давлении близком к 760 мм. рт. ст. Учет этого фактора важен, поскольку существенно может влиять на результаты оценки. Так, при атмосферном давлении 745 мм. рт. ст. температура текучего пара составляет 99,4°C и резистентность при этой температуре B.cereus равна 6-7 мин., а при давлении 765 мм. рт. ст. температура пара - 100,8°C резистентность не превышает 3-4 мин.

Споры тест-микроорганизмов должны иметь устойчивость к текучему пару температурой 100°C не менее 7 - 9 мин.

Устойчивость тест-микроорганизма G.stearothermophilius к водяному насыщенному пару под избыточным давлением. В качестве тест-носителя применяют флаконы из нейтрального стекла, контаминированные суспензией спор тест-микроорганизма G.stearothermophilus.

Предварительно флаконы тщательно моют и стерилизуют паровым или воздушным методом. Из исходной суспензии спор готовят рабочую суспензию для контаминации тест-носителей.

Стерильные тест-носители контаминируют из расчета тест-микроорганизма G.stearothermophilus, что достигается внесением в каждый носитель с помощью дозатора переменного объема 0,02 мл суспензии спор с содержанием от до спор/мл.

Рисунок 5.1. Принципиальная схема устройства аппарата Ойль-Мюллера в модификации Л.А. Блиновой.

Контаминированные тест-носители высушивают в термостате при температуре ()°C в течение 24 часов и закладывают в бумажные пакеты, разрешенные к применению в качестве стерилизационных упаковочных материалов в Российской Федерации.

Устойчивость спор тест-микроорганизма G.stearothermophilius к водяному насыщенному пару под избыточным давлением определяют в паровом стерилизаторе объемом 75  с гравитационным способом предварительного удаления воздуха из стерилизационной камеры.

Упакованные тест-носители помещают в стерилизационной коробке в незагруженную камеру парового стерилизатора. После набора давления в водопаровой камере ()  проводят вытеснение воздуха паром из камеры парового стерилизатора (продувка парового стерилизатора) в течение 10 мин (при открытом спускном кране и давлении в стерилизационной камере от 0,1 до 0,2 ). После продувки доводят давление пара в стерилизационной камере до   ()°C и через 5 мин (время выживания спор тест-микроорганизма) с момента установления давления спускают пар. Для уменьшения времени воздействия пара до и после периода испытуемого воздействия (время воздействия при температуре ()°C подъем давления проводят максимум в течение 8 мин, спуск - в течение 3 мин. Контроль температуры осуществляют максимальными термометрами (СП-82).

Аналогичное исследование проводят с 15 минутным временем воздействия (время гибели спор тест-микроорганизма). При каждом из указанных периодов воздействия экспонируют не менее 10 тест-носителей. По окончании времени выдержки тест-носители вынимают из стерилизатора. Во флаконы вносят 1 мл питательной среды (бульон Хоттингера, МПБ, СПБ, цветная питательная среда с индикатором бромкрезоловым пурпуровым), закрывают стерильными резиновыми пробками (N7,5) и инкубируют при температуре ()°C в течение 7 суток при использовании питательного бульона (бульон Хоттингера, СПБ, МПБ) или в течение 48 ч при использовании цветной питательной среды с индикатором бромкрезоловым пурпуровым.

Учет результатов проводят путем визуального осмотра. Отсутствие помутнения/изменения цвета питательной среды с индикатором указывает на гибель спор. При наличии роста микроорганизмов проводят сравнение последних с тест-микроорганизмом.

В качестве контроля используют тест-носители, которые не подвергали действию стерилизующего средства. Посевы контрольных тест-носителей и питательную среду, а также инкубирование посевов осуществляют аналогично опытным тест-носителям, которые подвергали действию стерилизующего средства.

Время гибели спор G.stearothermophilius при действии водяного насыщенного пара под избыточным давлением () , температуре ()°C должно быть не менее 15 мин.

Устойчивость спор В.licheniformis к сухому горячему воздуху определяют в воздушном стерилизаторе объемом 80  с принудительной циркуляцией и скоростью движения воздуха более 1 м/с, которые обеспечивают допустимые предельные отклонения от номинального значения температуры.

В качестве тест-носителя применяют флаконы из нейтрального стекла, контаминированные спорами тест-микроорганизма В.licheniformis. Предварительно флаконы тщательно моют и стерилизуют паровым или воздушным методом. Из исходной суспензии спор готовят рабочую суспензию для контаминации тест-носителей из расчета спор в носителе.

Стерильные тест-носители контаминируют рабочей суспензией спор тест-микроорганизма В.licheniformis, что достигается внесением в каждый тест-носитель с помощью дозатора с переменным объемом 0,02 мл суспензии спор в дистиллированной воде с содержанием от до спор/мл.

Контаминированные тест-носители высушивают в термостате при температуре ()°C в течение 24 часов и закладывают в бумажные или полимерные пакеты, разрешенные к применению в качестве стерилизационных упаковочных материалов в Российской Федерации.

Упакованные тест-носители помещают на полку воздушного стерилизатора, предварительно прогретого до 140°C. Стерилизатор закрывают и после достижения температуры ()°C начинают отсчет времени выдержки. Через 4 мин (время выживания спор тест-микроорганизма) аппарат отключают. Контроль температуры осуществляют по наружному термометру.

Аналогичное исследование проводят с 30 минутным временем испытуемого воздействия (время гибели спор тест-микроорганизма). При каждом из указанных периодов испытуемого воздействия экспонируют не менее 10 тест-носителей.

По окончании времени выдержки тест-носители вынимают из стерилизатора. Во флаконы вносят 1 мл питательной среды (бульон Хоттингера, МПБ, СПБ, цветная питательная среда с индикатором бромтимоловым синим) и закрывают стерильными резиновыми пробками (N 7, 5) и инкубируют при температуре ()°C в течение 7 суток при использовании питательного бульона (бульон Хоттингера, СПБ, МПБ) или в течение 48 часов при использовании цветной питательной среды с индикатором бромтимоловым синим.

Учет результатов опытов и контроля проводят аналогично как при определении устойчивости спор к водяному насыщенному пару под давлением.

Время гибели спор тест-микроорганизма В.licheniformis при действии сухого горячего воздуха при температуре ()°C должно быть не менее 30 мин.

5.8.1.4.2. Определение устойчивости спор к хлорамину, перекиси водорода, глутаровому альдегиду.

Устойчивость к хлорамину, перекиси водорода, глутаровому альдегиду у спор B.cereus, В.subtilis, В.anthracis, живой сухой сибиреязвенной вакцины СТИ-1 определяют методом погружения батистовых тест-объектов, контаминированных споровой суспензией указанных культур (п. 5.1.2.2.) в 10% раствор хлорамина, 6% раствор перекиси водорода, 2.5% раствор глутарового альдегида с последующей нейтрализацией действующих веществ и посевом в жидкую питательную среду [74].

В процессе испытаний контролируют концентрацию действующего вещества в рабочем растворе ДС, температуру его в опыте, исходный и остаточный уровень контаминации спорами тест-микроорганизма тест-объекта, время выдержки тест-объектов в испытуемом дезинфицирующем растворе.

Определение устойчивости спор к хлорамину. Йодометрическим методом определяют процент активного хлора в хлорамине. В опытах используют препарат, содержащий 26-28% активного хлора, растворяя который в воде готовят 10% (по препарату) рабочий раствор. Готовят и разливают в пробирки по 5 мл стерильный раствор нейтрализатора (2% раствор тиосульфата натрия), стерильную питьевую воду, питательный бульон (МПБ). Готовят и контаминируют тест-микроорганизмом батистовые тест-объекты (см. п. 5.1.2.2.). Если в опытах используют ранее приготовленные и хранящиеся в холодильнике контаминированные спорами тест-микроорганизма тест-объекты, то их заранее извлекают из холодильника, чтобы они приобрели комнатную температуру (18-20°C).

При проведении экспериментов в стеклянную емкость объемом 50-100 мл пипеткой наливают требуемый объем 10% раствора хлорамина, из расчета 0,5 мл на каждый тест-объект и помещают в водяную баню с температурой 20°C на весь период опыта. Отсчитывают в чашке Петри необходимое для опыта количество контаминированных спорами тест-микроорганизмов батистовых тест-объектов (по 2 на каждую экспозицию), захватывают их стерильным пинцетом все сразу и опускают в емкость с раствором хлорамина; легким покачиванием емкости добиваются полного их смачивания. В момент смачивания всех тест-объектов отмечают время.

Через каждый час стерильной петлей извлекают по 2 тест-объекта из раствора хлорамина и опускают их в пробирку с 5 мл 2% стерильного раствора тиосульфата натрия для нейтрализации остаточного действия хлорамина. Через 5-10 минут тест-объекты переносят во вторую пробирку с 5 мл стерильной питьевой воды, а через 10-15 мин каждый тест-объект помещают в 5 мл питательного бульона.

Для контроля два контаминированных спорами тест-микроорганизма тест-объекта погружают в стерильную воду (вместо раствора хлорамина) на максимальный срок экспозиции, затем (как и опытные тест-объекты) их переносят последовательно в раствор нейтрализатора (тиосульфат натрия), стерильную питьевую воду и сеют в жидкий питательный бульон в пробирках. Полноту нейтрализации активного хлора контролируют путем погружения неконтаминированных тест-объектов в раствор 10% хлорамина на максимальную экспозицию, затем в раствор тиосульфата натрия, промывают в воде и помещают в бульон, куда вносят 0,1 мл суспензии, содержащей 20-30 жизнеспособных спор тест-микроорганизма. Рост культуры в бульоне свидетельствует об эффективной нейтрализации действия хлорамина.

Посевы опытные и контрольные ставят в термостат при температуре ()°C; наличие роста тест-микроорганизма проверяют через 48 часов. Из пробирок с ростом делают посев петлей на твердую питательную среду для идентификации тест-микроорганизмов. Окончательный учет результатов проводят через 7 суток.

Опыт повторяют не менее 3 раз. Споры тест-микроорганизмов: B.cereus (штамм. 96), B.subtilis (штамм. 7), B.anthracis (штамм. 81/1 и 27), живой сибиреязвенной вакцины СТИ-1 должны быть устойчивы к 10% раствору хлорамина не менее 360 мин.

Определение устойчивости спор к перекиси водорода. Иодометрическим методом определяют концентрацию перекиси водорода в средстве "Перекись водорода медицинская". В опытах используют средство, содержащее не менее 30% перекиси водорода, из которого путем разведения стерильной питьевой водой готовят раствор для исследований, содержащий 6% перекиси водорода. Для нейтрализации перекиси водорода используют стерильный 2,5% раствор тиосульфата натрия. Подготовку и определение устойчивости спор тест-микроорганизмов к 6% раствору перекиси водорода проводят по такой же методике, как и к хлорамину, только в качестве нейтрализатора используют 2,5% раствор тиосульфата натрия. Учитывая, что споры тест-микроорганизмов должны быть устойчивы к воздействию 6% раствора перекиси водорода в течении не менее 60 минут, испытание осуществляют в течение 90 мин с отбором проб (по 2 теста) через каждые 15 мин (обычно берут по 2 тест-объекта на 6 экспозиций). Аналогичные, как и при определении устойчивости спор к хлорамину, проводят посевы, учет результатов и контроль.

Споры тест-микроорганизмов: B.cereus (штамм. 96), B.subtilis (штамм. 7), B.anthracis (штамм. 81/1 и 27), живой сибиреязвенной вакцины СТИ-1 должны быть устойчивы к 6% раствору перекиси водорода не менее 60 мин.

Определение устойчивости спор B.subtilis (штамм. 7) к 2,5% раствору глутарового альдегида. Определяют концентрацию глутарового альдегида в исходном (концентрированном) растворе глутарового альдегида. В экспериментах используют средство, содержащее не менее 20% глутарового альдегида. Раствор для исследований, содержащий 2,5% глутарового альдегида, готовят путем разведения исходного раствора стерильной питьевой водой с последующим доведением рН приготовленного раствора до значений 7,5. Подготовку и определение устойчивости спор B.subtilis (штамм. 7) к 2,5% раствору глутарового альдегида проводят по такой же методике, как и к хлорамину, используя батистовые тест-объекты, контаминированные этим тест-микроорганизмом, только в качестве нейтрализатора используют или стерильный 1% раствор бисульфита натрия или стерильный универсальный нейтрализатор, содержащий Твин 80 (3%), сапонин (0,1%), гистидин (0,1%), цистеин (0,1%). Учитывая, что споры некоторых тест-микроорганизмов должны быть устойчивы к воздействию 2,5% раствора глутарового альдегида не менее чем в течение 3 ч, испытание осуществляют в течение 6 ч с отбором проб (по 2 тест-объекта) через каждые 30 мин. Посевы, учет результатов и постановку контроля осуществляют аналогично определению устойчивости спор к хлорамину.

Споры тест-микроорганизма B. subtilis, (штамм. 7) должны быть устойчивы к 2,5% раствору глутарового альдегида не менее 3 часов.

5.8.2. Обеспечение стандартности условий проведения исследований спороцидной активности ДС, СС и их субстанций

Химико-аналитический контроль ДС, СС и их субстанций [74]. До проведения исследования спороцидной активности ДС, СС и их субстанций необходимо проанализировать представленные производителем утвержденные рецептуры средства и технические условия на отечественные или спецификацию на зарубежные средства, провести химико-аналитические исследования по определению концентрации действующих веществ и определить соответствие ее и других показателей, регламентированных вышеуказанными документами. При этом используют химико-аналитические методы контроля и применяют условия хранения средства и меры безопасности при работе с ним, предложенные производителем средства.

Выбор, приготовление и контроль эффективности нейтрализаторов ДС с целью исключения остаточного спороцидного или споростатического действия ДС, СС и их субстанций на тест-микроорганизмы [74]. Для дезинфекции и стерилизации применяют средства, обладающие спороцидным действием, т.е. убивающие споры, но не задерживающие только их рост. Поэтому при определении спороцидного действия необходимо разграничить спороцидное действие средства от споростатического.

На основании накопленного опыта для нейтрализации антимикробного действия ДВ из различных химических групп (в зависимости от концентрации ДВ в растворе) применяют следующие нейтрализаторы:

- для средств из группы окислителей (хлор-, йод-, перекисьсодержащие средства; средства, содержащие надуксусную кислоту, озон) - 0,5-2,5% растворы тиосульфата натрия;

- для альдегид- и фенолсодержащих средств - универсальный нейтрализатор, содержащий 3% полисорбита 80% (твин-80), 3% сапонина, 0,1% гистидина и 0,1% цистеина; или 3% полисорбита 80%, 2% гистидина, 0,3% лецитина, 3% сапонина;

- для композиционных ДС - универсальный нейтрализатор, например, содержащий 3% полисорбита 80%, 3% сапонина, 0,1% гистидина и 0,1% цистеина или 3% полисорбита 80%, 3% сапонина, 0,3% лецитина и 0,15% цистеина, 0,15% тиосульфата натрия, или другие нейтрализаторы, рекомендуемые производителями.

Растворы нейтрализаторов готовят в асептических условиях, применяя только стерильную дистиллированную воду. При невозможности соблюдения асептических условий приготовления нейтрализаторов, допускается стерилизация готовых растворов автоклавированием при 1,1  (121°C) в течение 15 мин. Температура растворов нейтрализаторов должна быть +20°C, независимо от температуры окружающей среды. Готовые растворы необходимо использовать в день приготовления. Допускается хранение готовых растворов при температуре +4°C в течение 48 часов.

Контроль полноты нейтрализации остаточного действия испытываемого средства [74]. Существующие рекомендации по применению нейтрализаторов рассчитаны для различных монодействующих веществ (ДВ). Однако, многие современные ДС содержат несколько ДВ и другие вспомогательные вещества, которые могут обладать споростатическим действием. Поэтому существующие (рекомендуемые) нейтрализаторы могут не обеспечивать эффективную нейтрализацию остаточного действия таких ДС. В этой связи, результаты оценки эффективности ДС могут быть необъективными. Поэтому, каждый случай проведения испытаний, даже известного ДС, должен предварительно сопровождаться экспериментальным контролем эффективности нейтрализации остаточного действия ДС на тест-микроорганизм.

Для контроля эффективности нейтрализатора и полноты нейтрализации остаточного действия ДС используют суспензионный метод, как обеспечивающий наиболее жесткие условия действия нейтрализатора при проведении испытаний ДС. Последовательность и методология выполнения основных операций при проведении такого эксперимента и их назначение приведены на схеме рисунка 5.2. и в таблице 5.10.

Обеспечение техники безопасности при исследовании спороцидной активности ДС, СС и их субстанций. Споры тест-микроорганизмов обладают высокой устойчивостью, поэтому их гибель обеспечивают в большинстве случаев, высокие концентрации ДС, СС и их субстанций и по препарату, и по ДВ. Поэтому при хранении, взвешивании, приготовлении рабочих растворов, их химико-аналитических исследованиях и проведении экспериментов необходимо применять меры защиты, предусмотренные в технических условиях на отечественные средства или спецификации - на зарубежные, с учетом класса их опасности [74].

Рис. 5.2. Принципиальная схема проведения эксперимента по контролю эффективности нейтрализации действия ДС на споры тест-микроорганизма используемым нейтрализатором.

Таблица 5.10.

Назначение операций эксперимента по оценке эффективности нейтрализации остаточного действия ДС

N пробы	Назначение операции исследования	Процедура выполнения операции исследования	Ожидаемый результат
1.	Контроль губительного действия ДС	к 9 мл суспензии спор ( спор/мл) на дистиллированной воде +1 мл раствора ДС (перемешать встряхиванием пробирки)	Рост тест-микроорганизмов должен отсутствовать
2.	Контроль полноты нейтрализации ДС	к 9 мл суспензии спор ( спор/мл) с нейтрализатором +1 мл раствора ДС (сразу интенсивно перемешать встряхиванием пробирки)	Примерно одинаковое (или в пределах ошибки в 25%) КОЕ в посевах проб (по 0,1 мл) на плотной питательной среде
3.	Контроль отсутствия антимикробного действия у нейтрализатора	к 9 мл суспензии спор ( спор/мл) с нейтрализатором +1 мл раствора нейтрализатора (перемешать встряхиванием пробирки)
4.	Референс - контроль количества спор тест-микроорганизма	к 9 мл суспензии спор ( спор/мл) на дистиллированной воде +1 мл дистиллированной воды (перемешать встряхиванием пробирки)
Примечание: спустя 5 мин после постановки опыта, из каждой из четырех проб производят посев смеси по 0,1 мл, как минимум, на 3 чашки Петри с питательной средой, которые инкубируют в термостате при ()°С и через 2-4 суток. учитывают результаты исследований.

Все тест-микроорганизмы, кроме патогенных штаммаммов возбудителя сибирской язвы, относятся к III и IV группам патогенности (опасности), поэтому микробиологические исследования с ними следует проводить в асептических условиях при соблюдении правил техники безопасности, предусмотренных СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и возбудителями паразитарных болезней" [74].

Лабораторные исследования с использованием патогенных штаммаммов возбудителя сибирской язвы должны проводить специалисты, прошедшие подготовку на курсах по особо опасным инфекциям, в лицензированных лабораториях, имеющих допуск на работу с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности) при строгом соблюдении всех правил техники безопасности, предусмотренных СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)" [15].

5.8.3. Методы исследований и оценки результатов спороцидной активности ДС, СС и их субстанций in vitro

5.8.3.1. Суспензионный метод

Суспензионный метод оценки спороцидной активности ДС и их субстанций используют для получения первичной информации о концентрации и времени эффективного (отсутствие жизнеспособных спор) спороцидного действия ДС [51, 52, 74]. Методология выполнения эксперимента по оценке спороцидной активности ДС суспензионным методом приведена на схеме рисунка 5.3.

Как видно из схемы рисунка 5.3., для проведения опыта по оценке спороцидной активности ДС суспензионным методом необходимо приготовить:

- рабочую суспензию тест-микроорганизма с концентрацией спор не менее спор/мл (это обеспечивает возможность создания в смеси ДС с суспензией (обоснованной и применяемой для этого метода оценки ДС) концентрации спор порядка спор/мл;

- пробирки со стерильной питьевой водой для проведения контроля реальной биологической концентрации (БК) тест-микроорганизма в суспензии, используемой в опыте;

- пробирки или флакон с раствором ДС в испытываемой концентрации в количестве, необходимом для обеспечения отбора всех проб;

- необходимое количество пробирок (в зависимости от количества проб, отбираемых для определения времени, обеспечивающего полную гибель спор тест-микроорганизма), содержащих по 9 мл нейтрализатора, проверенного предварительно на эффективность нейтрализации остаточного действия испытываемого ДС на тест- микроорганизм (см. п. 5.8.2.);

- чашки Петри со стерильной плотной питательной средой в количестве, необходимом для посева пробы контроля исходной суспензии и проб контроля эффективности действия ДС на тест-микроорганизм.

Методика проведения самого опыта включает, как видно из схемы, последовательное выполнение следующих операций:

- тщательное перемешивание хранимой в пробирке или во флаконе рабочей суспензии тест-микроорганизма путем встряхивания в течение 2-3 мин;

- помещение испытываемого рабочего раствора ДС в водяную баню с заданной температурой; если задачей эксперимента не предусмотрено изучение влияния воздействия температуры на эффективность средства, то оценка эффективности раствора испытываемого средства осуществляется при температуре 18-20°C;

- проведение контроля реальной на момент проведения опыта биологической концентрации (БК) тест-микроорганизма в суспензии (см. п. 5.8.1.3.);

- внесение в испытываемый дезинфицирующий раствор рабочей суспензии тест-микроорганизма с обеспечением соотношения ДС и суспензии тест-микроорганизма 9:1;

- перемешивание смеси и отсчет по секундомеру времени начала действия ДС на тест-микроорганизм;

- по окончании каждой заданной экспозиции проводят отбор пробы в количестве 3 мл, которую по 1 мл вносят в 3 пробирки, содержащие по 9 мл стерильного раствора нейтрализатора;

- перемешивание пробы путем встряхивания в течение 1-2 мин (или в течение 5 мин на шейкере) и посев из них стерильно на поверхность плотной питательной среды в чашках Петри (по 0,1 мл на каждую чашку и не менее чем на 3 чашки из каждой пробы).

Рис. 5.3. Схема алгоритма проведения эксперимента по оценке спороцидной активности ДС суспензионным методом

В опытах с вирулентным тест-микроорганизмом возбудителя сибирской язвы, кроме посева на твердую питательную среду, пробу по 0,2 мл вводят внутрибрюшинно белым мышам весом по 10-12 г. Параллельно проводят контрольное заражение животных питательной средой с нейтрализатором и суспензией спор исходного тест-микроорганизма. Количество животных в контрольных группах - не менее 3. Наблюдают за животными в течение 48-96 час. Как павших, так и усыпленных эфиром мышей вскрывают, делают посев органов на элективные среды для выявления роста возбудителя сибирской язвы и его идентификации;

- инкубирование чашек Петри с посевами проб при температуре ()°C или ()°C в зависимости от тест- микроорганизма в течение 2-7 суток и учет результатов.

Эффективной экспозицией для рабочего раствора испытанной концентрации считается вторая экспозиция из показавших отсутствие жизнеспособных спор в посевах соответствующих им проб.

Количество и интервал (шаг) экспозиций, при которых осуществляют отбор проб на эффективность ДС, выбирают на основе учета данных о составе и эффективности входящих в средство действующих веществ.

Средство, растворы которого обеспечивают при комнатной температуре в течение 60 минут полную гибель спор одного из рекомендуемых споровых тест-микроорганизмов, рассматривают как перспективное спороцидное средство для дальнейшего изучения: определения спектра спороцидного действия, факторов, влияющих на спороцидную активность ДС и др.

5.8.3.2. Метод батистовых тест-объектов

Как и суспензионный метод оценки спороцидной активности ДС и их субстанций, так и метод батистовых тест-объектов используют для получения информации о концентрации и времени эффективной спороцидной активности ДС [51, 52, 74]. В принципиальном плане методология выполнения эксперимента по оценке спороцидной активности ДС методом батистовых тест-объектов приведена на схеме рисунка 5.4.

Как видно из схемы рисунка 5.4., для проведения опыта по оценке спороцидной активности ДС методом батистовых тест-объектов необходимо приготовить:

- стерильные батистовые тест-объекты размером  см путем погружения куска батиста на 24 часа в холодную питьевую воду для удаления апплитуры. Затем ткань тщательно стирают с мылом, прополаскивают в холодной воде, кипятят, сушат и гладят горячим утюгом. С помощью иглы в приготовленном куске ткани выдергивают нитки в продольном направлении на расстоянии 11 мм друг от друга, а в поперечном направлении - 6 мм. По этим линиям батист разрезают ножницами на отдельные тест-объекты; раскладывают по 50 штук в чашки Петри, упаковывают в бумагу и стерилизуют в паровом стерилизаторе;

- рабочую суспензию тест-микроорганизма с концентрацией не менее спор/мл для контаминации батистовых тест-объектов;

- пробирки со стерильной питьевой водой (10 мл) для контроля реальной биологической концентрации (БК) тест-микроорганизма на контаминированных тест-объектах;

- испытываемый раствор ДС в емкости (пробирка, колба или стакан) в количестве, достаточном для замачивания всех взятых в опыт тест-объектов, исходя из расчета 0,5 мл раствора на 1 тест-объект;

- необходимое количество пробирок (в зависимости от количества проб, отбираемых для определения времени полной гибели спор тест-микроорганизма под действием ДС), содержащих по 9 мл нейтрализатора, проверенного предварительно на эффективность нейтрализации остаточного действия испытываемого ДС на тест-микроорганизм (см. п. 5.8.2.);

- чашки Петри со стерильной плотной питательной средой для посева проб контроля БК тест- микроорганизма на тест-объекте и проб контроля эффективности действия ДС на тест-микроорганизм.

Методика проведения самого опыта по оценке спороцидной активности ДС предусматривает, как видно из схемы, последовательное выполнение следующих этапов (рис. 5.4.):

- тщательное перемешивание хранимой в пробирке или во флаконе при температуре ()°C исходной суспензии агаровой культуры тест-микроорганизма путем встряхивания пробирки (флакона) в течение 2-3 мин; приготовление из нее рабочей суспензии тест-микроорганизма в концентрации не менее спор/мл и в количестве, достаточном для контаминации используемых в опыте тест-объектов (из расчета 0,2 мл на тест-объект);

- контаминация батистовых тест-объектов тест микроорганизмом. Для этого помещают в чашку Петри необходимое для опыта количество стерильных батистовых тест-объектов; заливают их приготовленной рабочей суспензией спор тест-микроорганизма, обеспечивая их равномерное смачивание, и оставляют их в суспензии в закрытой чашке Петри на 20 мин. С соблюдением асептики контаминированные тест-объекты переносят на стерильную фильтровальную бумагу, уложенную в два слоя в стерильной чашке Петри, покрывают их листом такой же бумаги и закрывают чашку крышкой; через 10 минут перекладывают тест-объекты на сухую стерильную фильтровальную бумагу в стерильной чашке Петри и подсушивают в термостате при ()°C в течение 60 мин с приоткрытыми крышками. Высушенные тест-объекты, контаминированные спорами тест-микроорганизма, помещают в чашки Петри в холодильник и хранят при температуре ()°C, используя для проведения опытов в течение не более 3-4 суток;

- с целью контроля микробной контаминации тест-объектов определяют БК спор на них. Для этого контаминированные спорами батистовые тесты погружают в пробирки с 10 мл стерильной питьевой воды и встряхивают в течение 10-15 мин на шейкере для отмывания спор с тест-объекта. Затем делают 3 последовательных 10-кратных разведения, чтобы получить суспензию с концентрацией порядка спор/мл, из которой производят посев по 0,1 мл на 5 чашек с плотной питательной средой. Посевы инкубируют в термостате при ()°C или ()°C в течение 2-4 суток и подсчитывают общее количество выросших на чашках КОЕ. Используя формулу определения БК, приведенную в п. 5.8.1.3., рассчитывают количество жизнеспособных спор тест-микроорганизма на тест-объекте;

- приготовление испытываемого рабочего раствора ДС в соответствующей емкости из расчета 0,5-1,0 мл на тест-объект;

- помещение испытываемого рабочего раствора ДС на водяную баню с заданной температурой. Если задачей эксперимента не предусмотрено изучение влияния воздействия температуры на эффективность средства, то оценка эффективности раствора испытываемого средства осуществляется при температуре 18-20°C;

- замачивание необходимого для обеспечения отбора проб количества контаминированных тест-объектов в дезинфицирующем растворе с заданной температурой и отсчет по секундомеру времени начала воздействия ДС на тест-микроорганизм;

- отбор (по окончании каждой заданной экспозиции) стерильным пинцетом (петлей) тест-объектов (не менее 3 на экспозицию), которые помещают в пробирку с 10 мл заранее проверенного на эффективность нейтрализатора остаточного действия ДС на тест-микроорганизм.

Определение наличия жизнеспособных спор на тест-объекте. Если предусматривается только установление наличия на данную экспозицию оставшихся на тест-объекте жизнеспособных спор тест-микроорганизма, то проба не подвергается встряхиванию, а тесты стерильным пинцетом извлекают из нейтрализатора и помещают в пробирку со стерильным питательным бульоном. Если предусматривается количественное определение оставшихся на тест-объекте жизнеспособных спор тест-микроорганизма, то на стерильную плотную питательную среду в чашках Петри сеят по 0,1 мл стерильной пипеткой из нейтрализованной пробы (или из ее соответствующего разведения), полученной после интенсивного встряхивания тест-объектов вручную в течение 5-10 мин на шейкере;

Рис. 5.4. Схема алгоритма проведения эксперимента по оценке спороцидной активности ДС методом батистовых тест-объектов.

- инкубирование посевов в чашках Петри или пробирках проводят при температуре (°C) или (°C) в зависимости от вида тест-микроорганизма в течение 2-4 суток;

- учет и анализ результатов эксперимента (испытания).

Эффективной экспозицией для рабочего раствора испытанной концентрации считается вторая экспозиция из показавших отсутствие жизнеспособных спор в посевах соответствующих им проб.

Количество и интервал (шаг) экспозиций, при которых осуществляется отбор проб на эффективность ДС, выбирают на основе данных о составе и эффективности входящих в средство действующих веществ.

Средство, растворы которого обеспечивают при комнатной температуре в течение 60 мин полную гибель спор одного из рекомендуемых споровых тест-микроорганизмов, может рассматриваться как перспективное спороцидное ДС для дальнейшего изучения.

Исследование спектра спороцидной активности химических ДС, СС и их субстанций проводят с использованием следующих тест-микроорганизмов: B.cereus, В.subtilis, В.anthracis, сибиреязвенной сухой живой вакцины СТИ-1. Дальнейшие исследования проводят, используя наиболее устойчивый тест-микроорганизм.

5.8.3.3. Методы изучения факторов, влияющих на спороцидную активность ДС, СС и их субстанций

Для определения сферы применения и направлений дальнейших исследований необходимо изучить спектр спороцидной активности ДС, СС и их субстанций и зависимости его от температуры, величины pH и присутствия белковых загрязнений [51, 74].

Исследования проводят методом батистовых тест-объектов (п. 5.8.3.2.).

Определение спектра спороцидного действия ДС, СС и их субстанций используют споровые тест-микроорганизмы, рекомендуемые для изучения и оценки спороцидной активности (п. 5.8.1.1., табл. 5.8.).

На основании полученных данных определяют целесообразность дальнейших исследований для применения в качестве ДС, СС и их субстанций.

Определение влияния температуры на спороцидную активность ДС, СС и их субстанций проводят с целью выявления возможности использования подогретых растворов ДС для сокращения времени обеззараживания объектов в отношении спор тест-микроорганизмов, а также для оценки эффективности спороцидного действия при пониженных температурах окружающей среды, обеззараживаемого объекта и самого раствора ДС.

Для изучения влияния температуры рабочие растворы испытуемых ДС готовят в день опыта, наливают в стеклянные колбы (пробирки) из расчета по 0,5 мл на каждый тест-объект.

Исследование влияния положительных температур раствора ДС на его спороцидную активность проводят с использованием водяной бани, в которой нагревают емкость с дезинфицирующим раствором до ()°C, ()°C, ()°C, после чего погружают в него контаминированные тест-объекты и поддерживают эти температуры в процессе всего опыта.

Опыты по оценке влияния пониженной температуры на активность ДС проводят с использованием криостата или солевых низкозамерзающих растворов, в которых охлаждают емкость с дезинфицирующим раствором до ()°C, ()°C, ()°C и поддержания их в процессе опыта. После достижения указанной температуры в раствор ДС погружают батистовые тест-объекты, контаминированные тест-микроорганизмом из расчета 2 тест-объекта на каждую экспозицию.

Через определенные промежутки времени из каждой колбы извлекают по 2 тест-объекта и помещают их в пробирки с соответствующим нейтрализатором на 5 мин, затем во вторую пробирку со стерильной водопроводной водой на 5 мин и только после этого каждый тест-объект переносят в пробирку, заполненную 5 мл бульона Хоттингера (pH7,2). Посевы инкубируют в течение 48-72 часов при ()°C. Контролем служат по 2 тест-объекта при каждой исследованной температуре, не подвергавшиеся действию испытуемого ДС, но погруженные в пробирки со стерильной питьевой водой на срок, равный действию испытуемого ДС.

Определение влияния величины pH на спороцидную активность ДС, СС и их субстанций начинают с приготовления рабочих растворов ДС, имеющих различную величину pH (5,6-6,0; 7,0; 8,5-9,0). Для подкисления раствора используют децинормальный раствор соляной или другой кислоты, а для подщелачивания - децинормальный раствор щелочи. В подготовленные растворы погружают контаминированные спорами батистовые тест-объекты. Исследование зависимости спороцидной активности ДС, СС и их субстанций от величины pH проводят по методике, описанной выше, только при нейтрализации действия действующих веществ одновременно понижают и величину pH, добавляя соответственно кислоту или щелочь.

Определение влияния белковых загрязнений на спороцидную активность ДС проводят с целью выявления возможности влияния (или установления его отсутствия) белковых загрязнений на обеззараживаемом объекте на спороцидную активность ДС.

Исследование проводят методом батистовых тест-объектов (п. 5.8.3.2.), только для контаминации тест-объектов используют суспензию спор тест-микроорганизма, содержащую 20% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота или дефибринированной крови, которые добавляют в суспензию при ее приготовлении. Инактивацию нормальной сыворотки крупного рогатого скота проводят дробным трехкратным прогреванием на водяной бане при температуре ()°C в течение 30 мин. Если активность препарата не снижается в присутствии 20% белка, концентрацию инактивированной сыворотки крупного рогатого скота или дефибринированной крови в суспензии тест-микроорганизма, увеличивают до 40%. Отсутствие снижения спороцидной активности ДС при добавлении и 40% сыворотки позволяет считать ДС не реагирующим на присутствие белковых загрязнений.

5.8.4. Методы исследований спороцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания объектов внешней среды, контаминированных тест-микроорганизмами в споровой форме

Длительная выживаемость спор возбудителей сибирской язвы во внешней среде обосновывает необходимость обеззараживания большого перечня объектов, которые могут быть контаминированы возбудителем сибирской язвы при уходе за больными животными, захоронении их трупов, транспортировании, реализации, переработке и уничтожении продуктов и сырья, полученных от больных животных, в очаге на дому при выявлении лиц, больных сибирской язвой, в лечебно-профилактических учреждениях при оказании медицинской помощи больным сибирской язвой, в специализированных бактериологических лабораториях, работающих с этими возбудителями, на предприятиях по производству биопрепаратов на их основе, а также при биотеррористическом использовании возбудителя сибирской язвы [12, 14, 15].

Учитывая вышесказанное, перечень тест-объектов, моделирующих объекты, подлежащие дезинфекции, включает: поверхности помещений, мебели, аппаратов, приборов, санитарно-технического оборудования, транспортных средств и др.; изделия медицинского назначения, в т.ч. эндоскопы; предметы ухода за больными, игрушки; посуду столовую, лабораторную и из-под выделений; белье, одежду, спецодежду и другие объекты из тканей; изделия из резины, в т.ч. перчатки, сапоги, фартуки и др.; обувь; руки в резиновых перчатках; остатки пищи; выделения: фекалии, мочу, кровь, мокроту; воду; воздух; медицинские отходы.

5.8.4.1. Исследование спороцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания поверхностей помещений, мебели, аппаратов, приборов, санитарно-технического оборудования, транспортных средств и других объектов

В исследованиях используют тест-поверхности (10 х 10 см) из различных материалов: - дерева (окрашенные масляной или клеевой и другими красками; оклеенные обоями и неокрашенные), линолеума, пластика, кафеля, фаянса, плитки, металлов, стекла [51, 52, 66, 74].

Тест-поверхности из различных материалов (за исключением поверхностей окрашенных клеевой краской и оклеенных обоями) тщательно моют водой с мылом и щеткой, стерилизуют в паровом стерилизаторе. Тест-поверхности, окрашенные клеевой краской и оклеенные обоями, протирают несколько раз стерильной марлевой салфеткой, увлажненной стерильной питьевой водой. Готовят споровую суспензию тест-микроорганизма (B.cereus, сибиреязвенная живая сухая вакцина СТИ-1 для людей, B.anthracis), содержащую спор/мл, добавляют 40% лошадиной сыворотки, инактивированной при 56°C в течение 30 мин (к 6 мл суспензии, содержащей спор/мл, прибавляют 4 мл сыворотки).

После подсыхания тест-поверхности располагают горизонтально и на них с помощью одноканального механического дозатора или стеклянной пипетки наносят 0,5 мл суспензии спор тест-микроорганизма. Суспензию равномерно распределяют по всей тест-поверхности (100 ) стерильным стеклянным шпателем. Если суспензия тест-микроорганизма не распределяется равномерно, а собирается в каплю, растирание шпателем по тест-поверхности осуществляют неоднократно (3-5 раз). Контаминированные тест-поверхности подсушивают при комнатной температуре до полного высыхания (30-120 мин). Обеззараживание тест-поверхностей осуществляют способами протирания или орошения дезинфицирующим раствором (при работе с B.anthracis пременяют только орошение в боксе биологической защиты при предварительном подсушивании не более 20 мин).

При поведении экспериментов тест-поверхности, окрашенные клеевой и другими красками, или оклеенные обоями, располагают вертикально и обеззараживают путем орошения дезинфицирующим раствором. Остальные тест-поверхности обеззараживают как в горизонтальном, так и в вертикальном положениях путем орошения, однократного или двукратного протирания, или мытья дезинфицирующим раствором.

В зависимости от вида обрабатываемой поверхности и наличия загрязнений на ней норма расхода ДС способом протирания равна 100-150  (1-1,5 мл на 100 ); способом орошения - 150  (1,5 мл на 100 ) при обработке распылителем типа "Квазар" или его аналогами и 300-500  (3-5 мл на 100 ) при обработке распылителем типа "Автомакс" или гидропультом.

При необходимости обработку способом протирания или орошения повторяют через 15 мин.

Для контроля эффективности обеззараживания через определенные промежутки времени (15-30-60 мин) с тест-поверхностей делают смывы путем тщательного протирания тест-поверхности сначала в одном, а затем перпендикулярно ему направлении стерильной марлевой салфеткой (5 х 5 см), увлажненной нейтрализатором. После протирания на тест-поверхности не должно оставаться излишней влаги. Салфетки погружают на 5 мин в пробирки (емкости) с соответствующим для испытуемого ДС нейтрализатором (10 мл), а затем в стерильную питьевую воду с бусами и встряхивают на шейкере в течение 10 мин. Полученную смывную жидкость вносят по 0,1 мл на поверхность питательного агара двух чашек Петри, тщательно распределяя по всей поверхности. Посевы инкубируют в термостате при температуре ()°C в течение 48-72 часов.

В контрольных опытах для обработки аналогично контаминированных тест-поверхностей вместо раствора ДС используют стерильную питьевую воду из того же расчета, что и опытные. Жидкость, в которую помещают стерильную марлевую салфетку после взятия смыва с контрольных поверхностей, перед посевом разводят в 100 раз и вносят по 0,1 мл на поверхность питательного агара двух чашек Петри. Посевы инкубируют в термостате при температуре ()°C. Учитывают результаты через 48 часов (предварительные), а окончательные - через 21 сутки.

Оценку результатов контрольных опытов проводят по посеву того разведения, в котором число КОЕ на поверхности питательного агара в чашке Петри составляет от 30 до 300.

После выдерживания посевов в термостате подсчитывают число КОЕ на чашках с агаром, рассчитывают плотность контаминации на 100  и высчитывают эффективность обеззараживания, принимая количество тест-микроорганизмов, снятых с контрольных тест-объектов, за 100%.

Например: на посевах со 100  контрольной тест-поверхности обнаружено 148000 КОЕ, а с аналогичного вида опытной тест-поверхности - 20 КОЕ.

148000 - 100%              х=20х100:148000=2:148=0,013%

20 - х

Эффективность обеззараживания опытной тест-поверхности составляет

100-0,013=99,987%.

Критерий эффективности ДС при обеззараживании тест-поверхностей объектов, контаминированных тест-микроорганизмом в споровой форме, равен 100%. При необходимости отработанные в лабораторных условиях режимы обеззараживания подлежат апробации на натурных объектах.

5.8.4.2. Исследование спороцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания предметов ухода за больными и игрушек из различных материалов (кроме мягких)

В исследованиях используют тест-объекты (100 ) и предметы ухода за больными из различных материалов: резин на основе натурального и силиконового каучука (медицинская клеенка, грелка, груша); стекла (поильник, плевательница, градусник); пластмасс (грелка, лоток, наконечник для клизм); металлов (таз, стакан для термометра); игрушки (кроме мягких) из резин и пластмасс [66].

Тест-объекты, предметы ухода за больными и игрушки из различных материалов тщательно моют водой с мылом и щеткой. Тест-объекты стерилизуют паровым или воздушным методом.

Готовят суспензию тест-микроорганизма, содержащую спор/мл, к которой добавляют 40% лошадиной сыворотки, инактивированной при 56°C в течение 30 мин (к 6 мл суспензии прибавляют 4 мл сыворотки).

С помощью одноканального механического дозатора или стеклянной пипетки на поверхность тест-объекта, предмета ухода за больными, игрушки наносят 0,5 мл суспензии спор тест-микроорганизма. Равномерно ее распределяют по поверхности (100 ) стерильным стеклянным шпателем. Каналы и полости предмета ухода за больными, игрушек заполняют споровой суспензией с помощью шприца; мелкие игрушки полностью погружают в суспензию. Контаминированные тест-объекты, предметы ухода за больными и игрушки подсушивают при комнатной температуре до полного высыхания (60-120 мин).

Растворы ДС готовят на питьевой воде при комнатной температуре. Обеззараживание осуществляют способом погружения, протирания, орошения. После подсушивания контаминированные тест-объекты, предметы ухода за больными, игрушки, в том числе имеющие каналы и полости, погружают в раствор испытуемого ДС или протирают салфеткой, смоченной им. Мелкие игрушки полностью погружают в емкость с раствором ДС, препятствуя их всплытию; крупные игрушки дезинфицируют способом орошения. Норма расхода ДС способом протирания из расчета 100-150  при однократной обработке и 200-300  при двукратной; способом орошения - 150  при обработке распылителем типа "Квазар" и 300  - при обработке распылителем типа "Автомакс" или гидропультом. При необходимости обработку способом протирания или орошения повторяют через 5-15 мин.

Для контроля эффективности обеззараживания через определенные промежутки времени после дезинфекции (30-60-120 мин) тест-объекты, предметы ухода за больными и игрушки извлекают из раствора, делают смывы стерильной марлевой салфеткой (5 х 5 см), увлажненной нейтрализатором. Салфетки погружают в стерильный раствор нейтрализатора на 5 мин, затем переносят в пробирки (емкости) с бусами и стерильной питьевой водой (10 мл) и встряхивают на шейкере в течение 10 мин. Каналы и полости промывают нейтрализатором (10 мл), который собирают в стерильные пробирки (емкости) и оставляют на 10 мин для нейтрализации.

Полученную смывную жидкость и смывную жидкость из каналов вносят по 0,1 мл на поверхность питательного агара двух чашек Петри и равномерно распределяют стерильным шпателем по поверхности среды. В контрольных опытах вместо раствора ДС используют стерильную питьевую воду.

Посевы инкубируют в термостате при температуре ()°C. Предварительные результаты учитывают через 48 часов, а окончательные - через 21 сутки.

Критерием эффективности ДС при обеззараживании тест-объектов, предметов ухода за больными и игрушек из различных материалов (кроме мягких), контаминированных тест-микроорганизмом в споровой форме 100% гибель тест-микроорганизмов [23, 74].

5.8.4.3. Исследование спороцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания посуды столовой, лабораторной и из-под выделений

Для определения спороцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания посуды, в качестве тест-объектов используют набор столовой и чайной посуды: тарелки, стаканы, кружки из различного материала (фарфор, фаянс, алюминий, стекло, пластик, посуда, покрытая эмалью); столовые приборы: ножи, вилки, ложки из различного материала (нержавеющая сталь, алюминий, пластик), посуду одноразового использования и набор лабораторной посуды, представляющий тест-объекты из стекла и пластмасс: предметные и покровные стекла, пипетки, чашки Петри, планшеты для иммунологического анализа и другое; посуда из-под выделений (мочеприемники, подкладные судна). Перед экспериментом посуду и столовые приборы моют водой с мылом и щеткой, затем высушивают.

В качестве тест-микроорганизмов для контаминации посуды используют наиболее устойчивый к данному ДС вид спор.

На посуду (площадь 100 ) пипеткой наносят 0,5 мл споровой суспензии тест-микроорганизмов, содержащую спор/мл. Культуру равномерно распределяют по поверхности посуды стеклянным шпателем. Столовые приборы погружают в споровую суспензию на 1-2 мин, оставляя неконтаминированными их ручки. Контаминированную посуду подсушивают (до полного высыхания) при комнатной температуре (60-120 мин) и относительной влажности воздуха 50-60% (при работе с B.anthracis подсушивают посуду не более 20 мин).

Для разработки режимов обеззараживания посуды с остатками пищи при контаминации используют суспензию тест-микроорганизмов, смешанную с овсяной, манной или другой кашей, сваренной на молоке со сливочным маслом (к 10 г каши добавляют 1 мл 2-х миллиардной взвеси спор). Для имитации загрязнения чайной посуды используют кисель (к 10 г киселя добавляют 1 мл 2-х миллиардной взвеси спор), лабораторной посуды - 40% инактивированной сыворотки; посуды из-под выделений - 20% эмульсию кала, предварительно растертого в ступке.

Обработку столовой, чайной, лабораторной посуды, столовых приборов проводят способом погружения в дезинфицирующий раствор. Растворы готовят на питьевой воде. Температура испытуемого раствора 18-20°C. При необходимости изучают эффективность растворов ДС при температуре ()°C.

Дезинфицирующий раствор должен полностью заполнять и с избытком покрыть всю посуду и приборы (из расчета не менее 2 л на 1 комплект). Время обеззараживания посуды от 15 до 240 мин в зависимости от вида тест-микроорганизма и наличия загрязнения.

Через определенные интервалы времени (например, 15, 30, 60 мин и т.д.) извлекают по одному предмету разных наименований (например, тарелка, стакан, предметное стекло, нож и т.д.) из дезинфицирующего раствора и стерильной марлевой салфеткой (5 х 5 см), смоченной в растворе нейтрализатора, соответствующего данному ДС, тщательно протирают контаминированную часть каждого контаминированного объекта и погружают в 10 мл этого же нейтрализатора на 5 мин, затем салфетку переносят в пробирку со стерильной питьевой водой и бусами. Время отмыва марлевой салфетки - 10 мин при постоянном встряхивании. После отмыва марлевую салфетку погружают в питательный бульон. Смывную жидкость по 0,1 мл вносят на поверхность питательного агара в 2-3 чашки Петри (по 0,1 мл в каждую и распределяют стерильным шпателем по всей поверхности среды). Посевы помещают в термостат при температуре ()°C. Учет результатов проводят через 48 часов в течение 21 суток.

Контролем служит аналогично контаминированная посуда, которую погружают не в дезинфицирующий раствор, а в такой же объем стерильной питьевой воды.

Критерием эффективности обеззараживания контаминированной посуды является гибель спор тест-микроорганизмов на посуде не менее 100% [23, 74].

5.8.4.4. Исследование спороцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания изделий медицинского назначения (ИМН), включая эндоскопы

5.8.4.4.1. Исследование спороцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания ИМН из различных материалов (кроме эндоскопов)

В качестве тест-изделий используют стерильные инструменты и ИМН, в том числе однократного применения, из различных материалов (металлов, резин, стекла, пластмасс) или имитирующие их тест-объекты. Перечень инструментов, должен включать разнообразные по форме, характеру поверхности и используемому материалу изделия (гладкие изделия простой конфигурации; изделия, имеющие замковые части, каналы и полости, имеющие насечки и напыления, изделия извитой форма; изделия, изготовленные из нескольких видов материалов и т.д.) [74].

На рабочую поверхность тест-изделия (у замковых изделий - также в область замка, а при наличии каналов и полостей - также в канал изделия) наносят 0,1 мл суспензии, содержащей спор/мл тест-микроорганизма, содержащей 40% инактивированной лошадиной сыворотки. Мелкие тест-изделия для контаминации погружают в эту суспензию на 15 мин. Контаминированные тест-изделия подсушивают в термостате в течение 20-25 мин. При испытании средств, обладающих фиксирующими свойствами (например, альдегиды), сыворотку добавляют в количестве 5%.

Дезинфицирующие растворы готовят на питьевой воде комнатной температуры или подогретой до ()°C.

После подсушивания контаминированные изделия погружают в раствор испытываемого средства, заполняя им все каналы и полости изделий, избегая образования воздушных пробок. Инструменты, имеющие замковые части, погружают раскрытыми, предварительно сделав ими в растворе ДС несколько рабочих движений для лучшего проникновения раствора в труднодоступные участки изделия в области замка. Толщина слоя раствора средства над изделиями должна быть не менее 1 см. Параллельно контаминированные изделия погружают в воду.

Через определенное время (от 15 до 120 мин) изделия извлекают из раствора и марлевой салфеткой размером 5 х 5 см, пропитанной нейтрализатором, с поверхности изделия делают смывы, салфетку помещают в пробирку с 10 мл того же нейтрализатора на 5 мин, затем переносят ее в пробирку со стерильной питьевой водой и встряхивают с бусами в течение 5-10 мин. Для контроля эффективности обеззараживания делают посев смывной жидкости по 0,1 мл на поверхность соответствующего для тест-микроорганизма агаровой питательной среды, а салфетку помещают в бульон. Канал изделия промывают нейтрализатором, и смывную жидкость засевают по 0,1 мл на плотную питательную среду в чашках Петри. Посевы выдерживают в термостате при температуре ()°C в течение 21 суток. Учет предварительных результатов проводят через 48 ч и окончательных - через 21 сутки.

Кратность постановки эксперимента должна быть достаточной для получения статистически достоверных результатов.

Эффективным считают режим (концентрация-время-температура), обеспечивающий 100% гибель спор тест-микроорганизмов на всех изделиях. При наличии положительных проб эксперимент повторяют, увеличивая концентрацию или время воздействия [23, 74].

5.8.4.4.2. Исследование спороцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания эндоскопов

В качестве тест-объектов используют фрагменты эндоскопа или эндоскоп (гибкий - гастроскоп, жесткий - цистоскоп). По 0,1 мл суспензии, содержащей спор тест-микроорганизмов наносят с помощью пипетки на наружную поверхность и в канал эндоскопа, подсушивают в течение 20 мин. Затем контаминированное изделие погружают в раствор ДС, заполняя им полости и каналы эндоскопа. Через определенное время (от 15 до 60 мин) изделие извлекают из раствора и делают смыв с наружной поверхности марлевой салфеткой (5 х 5 см), смоченной в растворе нейтрализатора; салфетку помещают в пробирку с 10 мл того же стерильного раствора нейтрализатора на 5 мин, а затем переносят ее в пробирку со стерильной питьевой воды, и встряхивают с бусами в течение 5-10 мин. Канал изделия промывают раствором нейтрализатора и смывную жидкость засевают на питательный агар. Проводят также контроль микробной обсемененности использованных для отмыва проб раствора нейтрализатора и питьевой воды. Кратность постановки эксперимента должна быть достаточной для получения статистически достоверных результатов.

Эффективным считают режим (концентрация-время-температура), обеспечивающий гибель тест-микроорганизма на всех тест-изделиях и отсутствие тест-микроорганизмов в растворе нейтрализатора. При наличии положительных проб эксперимент повторяют, увеличивая время воздействия, но не более, чем до 60 мин.

Положительной считается проба, показывающая характерный рост тест-микроорганизма на питательных средах; изменение жидкой питательной среды (помутнение, осадок, хлопья и т.д.) и характерный рост при посеве и пересеве на плотную питательную среду, или обнаружение тест-микроорганизма в растворе применявшегося нейтрализатора.

Режим дезинфекции, разработанный на имитаторах канала эндоскопа, проверяют при обеззараживании эндоскопа, контаминированного тест-микрорганизмом. При необходимости эффективность разработанного режима проверяют в практических условиях.

Критерием эффективности ДС (режим применения ДС) при обеззараживании ИМН (включая эндоскопы) является 100% гибель спор тест-микроорганизма [16, 23, 66, 68].

5.8.4.5. Исследование спороцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания белья, одежды, спецодежды и других объектов из ткани

Исследования с ДС проводят в целях оценки эффективности его для обеззараживания белья и других объектов из ткани, чистых и загрязненных кровью или выделениями (фекалии, моча, мокрота) [51, 52].

Оценку эффективности ДС для обеззараживания белья, одежды, спецодежды и других объектов из ткани осуществляют с помощью стерильных тест-объектов, представляющих собой кусочки бязи размером 2 х 2 см. Бязь предварительно готовят и обеззараживают также, как батист. Контаминируют стерильные тест-объекты суспензией тест-микроорганизмов, содержащей спор/мл, из расчета 20 мл на 10 тест-объектов. Через 30 мин тест-объекты закладывают в бязевые мешочки размером 5 х 8 см (по 2 штамм. в каждый), которые закрывают в виде конверта.

Раствор испытываемого ДС на питьевой воде комнатной температуры или подогретой до ()°C готовят из расчета 5 л на 1 кг белья. Ветошь, имитирующую белье, поштучно погружают в емкость с раствором испытываемого ДС так, чтобы между слоями ткани не образовывалось воздушных прослоек, препятствующих процессу дезинфекции. Одновременно между слоями белья распределяют (сверху, в середине и внизу) мешочки с контаминированными тест-объектами. Через заданное время мешочки извлекают одновременно из трех слоев. Тест-объекты вынимают из мешочка стерильным пинцетом, помещают на 5 мин в емкость с раствором соответствующего нейтрализатора, затем переносят в стерильную питьевую воду и высевают в бульон Хоттингера (pH 7,2). Посевы инкубируют при ()°C в течение 48 часов. Предварительный учет результатов проводят через 48 часов, а окончательный - через 21 сутки. В контрольных опытах белье погружают в стерильную питьевую воду. Мешочки с тестами закладывают так же, как и в опыте. При получении 100% гибели тест-микроорганизма в опытах по обеззараживанию белья без белковых загрязнений переходят к опытам по обеззараживанию белья, загрязненного выделениями.

Для определения эффективности ДС при обеззараживании белья, одежды, спецодежды и других объектов из ткани, загрязненных кровью, выделениями (фекалии, мокрота, моча и др.), в лабораторных условиях используют бязевые тест-объекты, которые контаминируют из расчета 30 мл суспензии на 10 тест-объектов тестовой суспензией спор тест-микроорганизма с добавлением 40% инактивированной сыворотки (6 мл суспензии, содержащей спор тест-микроорганизма смешивают с 4 мл инактивированной сыворотки) или 40% фекальной эмульсии (6 мл суспензии спор тест-микроорганизма смешивают с 4 мл 40% фекальной эмульсии). Для приготовления фекальной эмульсии 8 г фекалий растирают в ступке с 20 мл воды. Количество суспензии спор тест-микроорганизма, содержащей сыворотку или фекалии, готовят из расчета 30 мл на 10 тест-объектов. Контаминированные тест-объекты подсушивают в термостате при ()°C в течение 20-25 мин или 1,5-2 часов при комнатной температуре до полного высыхания. Методика проведения эксперимента аналогична опытам с чистым бельем.

Критерием эффективности ДС при обеззараживании белья, одежды, спецодежды и других объектов из тканей является 100% гибель спор тест-микроорганизмов на тест-объектах.

При изучении эффективности обеззараживания изделий из синтетических тканей (капрон, ацетат, периацетат, лавсан и др.) используют тест-объекты из этих тканей размером 5 х 5 см, т.к. микроорганизмы не проникают в структуру этих тканей и смываемость их в 2 раза больше, чем с батистовых тест-объектов [23, 74].

5.8.4.5.1. Исследование спороцидной эффективности камерного метода обеззараживания.

Камерный метод используют для обеззараживания одежды, обуви, постельных принадлежностей, мягких игрушек и др. [74].

В качестве тест-микроорганизма используют B.cereus в виде суспензии, содержащей спор/мл, которой контаминируют тест-объекты из батиста, бязи и других материалов, соответствующих обеззараживаемым объектам. Контаминированные тест-объекты закладывают в стерильные конверты из хлопчатобумажной ткани (по 2 тест-объекта в конверт). Пронумерованные тест-объекты помещают в хлопчатобумажные мешочки с максимальными термометрами и размещают в толще объектов в контрольные точки камеры на трех уровнях.

После дезинфекции мешочки извлекают из камеры и записывают показания максимальных термометров, а тест-объекты помещают в пробирки с 5 мл питательного бульона.

Инкубирование посевов с тест-объектами проводят при температуре ()°C в течение 21 суток при использовании питательного бульона (бульон Хоттингера, СПБ, МПБ). Предварительный учет результатов проводят через 24-72 часа, окончательный - через 21 сутки. Для установления эффективности обработки проводят не менее трех экспериментов на каждое время обработки. При наличии роста микроорганизмов проводят сравнение выросшей культуры с тест-микроорганизмом.

В качестве контроля используют контаминированные тест-объекты, которые не помещали в камеру. Контрольные посевы выращивают с использованием тех же питательных сред, что и для опытных тест-образцов. Контрольные посевы и среду контролируют аналогично тест-объектам, которые обрабатывали в камере. Для установления эффективности обработки проводят не менее трех экспериментов на каждое время обработки.

Контролем эффективности режима обеззараживания вещей в испытуемых дезинфекционных камерах является 100% гибель спор тест-микроорганизмов [74].

5.8.4.6. Исследование спороцидной эффективности ДС при обеззараживание рук в резиновых перчатках

В качестве тест-микроорганизма используют лиофильно-высушенную сибиреязвенную сухую вакцину СТИ-1. Готовят споровую суспензию путем внесения в ампулу с сухой вакциной 2 мл стерильной дистиллированной воды. После растворения сухой вакцины получают суспензию, содержащую спор/мл, которую разводят до содержания , и спор/мл [74].

Для устранения посторонней микрофлоры руки, включая запястья и предплечья, испытатели тщательно моют с мылом в теплой проточной воде, затем протирают стерильной марлевой салфеткой и одевают резиновые перчатки.

Поверхность резиновых перчаток, надетых на руки испытателей-добровольцев, контаминируют путем тщательного растирания 1 мл споровой суспензии тремя вышеуказанными разведениями (каждое разведение на одного испытателя). После подсыхания микробной взвеси для контроля исходной обсемененности с поверхности резиновой перчатки тыльной стороны кисти делают смыв стерильной марлевой салфеткой размером 5 х 5 см, смоченной стерильной питьевой водой. Затем салфетку помещают в пробирку с 10 мл стерильной питьевой воды с бусами и встряхивают 10 мин. Полученный смыв высевают по 0,5 мл в селективную жидкую питательную среду (9,5 мл) в пробирке.

Для обеззараживания поверхности перчаток в сжатую ладонь руки в печатке испытателю-добровольцу наносят 2,5 мл исследуемого спороцидного ДС.

Затем он в течение 10-15 секунд протирает этой порцией дезинфицирующего раствора поверхность перчаток обеих рук, совершая движения рук, которые выполняют при обработке кожи рук антисептиком. После этого такую же операцию проводят, нанося 2.5 мл дезинфицирующего раствора на ладонь второй руки и засекают по секундомеру начало экспозиции.

После 5-мин экспозиции делают смыв марлевой салфеткой (5 х 5 см), смоченной соответствующим ДС нейтрализатором, предварительно проверенным на эффективность нейтрализации и статического действия на споры. Салфетку помещают в пробирку с 10 мл стерильного нейтрализатора на 10 мин. Затем салфетку переносят стерильным пинцетом в пробирку с 10 мл стерильной питьевой воды с бусами, встряхивают пробирку 10 мин в шейкере. Из полученного смыва делают посев по 0,5 мл на селективные жидкие питательные среды в пробирках (не менее 3 пробирок на пробу).

Эффективными считают режим применения ДС, обеспечивающий 100% гибель исследованного спор вакцины СТИ-1 на резиновых перчатках, защищающих кожу рук [74].

5.8.4.7. Исследование спороцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания воды

Методы распространяются на изучение спороцидной эффективности химических ДС при обеззараживании питьевой и природной воды, содержащей или подозрительной на содержание возбудителя сибирской язвы [74].

При определении спороцидной эффективности ДС в качестве тест-объектов используют водопроводную (дехлорированную), колодезную, речную и др. воды. Водопроводную воду дехлорируют нагреванием до температуры (50-60°C) с последующим выдерживанием в течение одних суток при комнатной температуре. Определяют физико-химические свойства питьевой дехлорированной воды и образцов природных вод. Кроме того, в последних определяют микробиологические показатели (общее микробное число и общее количество колиформных бактерий).

В качестве тест-микроорганизмов для контаминации исследуемых проб воды используют споровую культуру B.cereus (штамм. 96) или сибиреязвенную живую сухую вакцину СТИ-1 для людей. Вирулентную культуру возбудителя сибирской язвы в этих целях использовать не разрешается из-за сложности соблюдения противоэпидемических мероприятий.

Контаминацию изучаемых образцов воды проводят путем внесения споровой культуры B.cereus (штамм. 96) в виде суспензии, содержащей спор/мл, а сибиреязвенную живую сухую вакцину СТИ-1 - в виде суспензии, приготовленной разбавлением содержимого одной ампулы вакцины в 10 мл стерильного физиологического раствора или стерильной водопроводной воды до содержания спор/мл.

При постановке экспериментов исходную воду наливают в емкости с нижним тубусом объемом 5-10 л и вносят в воду вышеуказанные тест-микроорганизмы из расчета спор/л. После тщательного перемешивания определяют концентрацию исходной контаминации воды. Для этого из емкостей отбирают 1-3 пробы воды объемом 3-5 мл. Из каждой пробы делают по 3-4 последовательных десятикратных разведения стерильным физиологическим раствором или стерильной питьевой водой, в которых затем определяют количество тест-микроорганизма в 1 мл пробы воды методом мембранной фильтрации.

Метод основан на концентрировании микроорганизмов из определенного объема анализируемой воды путем фильтрования через мембранные фильтры, выращивании посевов при температуре ()°C на плотной питательной среде, и подсчете количества тест-микроорганизмов в единице объема воды.

Используют мембранные фильтры для микробиологических целей с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм или другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации, имеющие сертификат качества. Мембранные фильтры готовят к анализу в соответствии с указаниями производителя.

Фильтрование воды проводят с помощью прибора для мембранной фильтрации. Стакан (воронку) и столик прибора перед анализом воды завертывают в бумагу и стерилизуют в паровом или воздушном стерилизаторе. На нижнюю часть прибора (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр; прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой); закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора; при соблюдении правил стерильности наливают необходимый объем исследуемой воды и создают вакуум в приемном сосуде.

Фильтруют вначале меньшие, а затем большие количества воды через один фильтровальный прибор, каждый раз сменяя мембранный фильтр.

После окончания фильтрования определенного количества воды стакан (воронку) снимают, а фильтр осторожно приподнимают за край фламбированным пинцетом при сохранении вакуума для удаления излишней влаги на нижней стороне фильтра, а затем переносят его, не переворачивая, на поверхность казеинового или мясопептонного агара в чашках Петри, так чтобы между средой и фильтром не было пузырьков воздуха. Под каждым фильтром на обратной стороне дна чашки Петри делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, даты посева и номера пробы. Посевы инкубируют при температуре ()°C в течение 24-48 ч.

По окончании инкубации учитывают количество колоний тест-микроорганизма, выросших на фильтрах, и определяют их концентрацию в 1 л воды по формуле:

,

где C - количество спор, содержавшихся в 1 л воды

k - кратность разведения,

v - посеянный объем воды в мл,

N - среднее арифметическое числа колоний, выросших на мембранных фильтрах при посеве одинаковых разведений.

Результат анализа при определении числа спор в исходной воде выражается числом КОЕ в 1 л воды.

Для определения эффективности обеззараживания спороцидным ДС в емкость с водой, контаминированной спорами тест-микроорганизмов, вносят ДС в изучаемых концентрациях, воду тщательно перемешивают. Через заданные промежутки времени при соблюдении условий стерильности отбирают пробы воды объемом 1 л в стерильные флаконы с внесенным в них стерильным нейтрализатором, подобранным в концентрации, обеспечивающей нейтрализацию действующего агента изучаемого ДС.

В обеззараженной воде определяют число непогибших спор B.cereus или сибиреязвенной живой вакцины СТИ-1 для людей методом мембранной фильтрации. Пробы обеззараженной воды с нейтрализатором должны быть исследованы не позднее, чем через 1 ч после их отбора.

На начальных этапах изучения эффективности обеззараживания воды анализируют не менее двух проб, отличающихся по объему в 10 раз, и выбранных так, чтобы на одном фильтре выросло не более 300 колоний. На одну чашку Петри можно поместить 3-4 фильтра с условием, чтобы они не соприкасались друг с другом. При анализе обеззараженной воды на конечных этапах обеззараживания необходимо исследовать объем не менее 1 л, профильтровывая это количество не менее чем через 3-4 мембранных фильтра.

Посевы инкубируют как указано выше. Учитывают общее количество выросших колоний на фильтрах после фильтрования 1 л воды. Результат анализа выражают числом спор в 1 л обеззараженной воды.

Статистическая обработка результатов микробиологических анализов по оценке эффективности средств обеззараживания воды имеет целью исключить случайные ошибки, оценить отклонения результатов анализа от действительной величины и дать искомые результаты с заданной вероятностью.

В процессе статистической обработки результатов экспериментальных исследований рекомендуется использовать при определении концентрации контаминации исходной воды тест-микроорганизмами и на промежуточных этапах обработки среднюю арифметическую (), а при оценке эффективности обеззараживания на завершающем этапе - медианное значение (Me).

Количество проб n, необходимое для действительной оценки результатов микробиологических исследований, определяют по формуле

где - квадратичное отклонение;

- максимально допустимое отклонение от средней, оцениваемое с вероятностью p=0,99:

- коэффициент, зависящий от числа опытов (не менее 10), по которым определяется величина .

Если определяется по данным 16 опытов, то . Число проб для оценки содержания микроорганизмов в обеззараженной воде должно быть не менее 16.

Оценка результатов микробиологических анализов проводят для заданной вероятности 0,99, соответственно, для того же значения определяют и доверительный интервал средней арифметической и медианы.

Доверительный интервал средней арифметической определяют по данным величины квадратичного отклонения у и средней ошибки .

Величину квадратичного отклонения вычисляют по формуле:

где - сумма квадратов отклонений измерений от средней арифметической, а n - число отдельных измерений.

Среднюю ошибку вычисляется по формуле

Вероятности 0,99 отвечает доверительный интервал I, вычисляемый по формуле:

Тогда доверительное значение количества микроорганизмов в пробе с вероятностью 0,99 находится в интервале .

Доверительный интервал медианы для требуемого уровня вероятности 0,99 определяют в зависимости от числа проведенных опытов по таблице, в которой указаны номера опытов, результаты которых учитывают в качестве граничных значений доверительного интервала медианы.

Для пользования таблицей необходимо, чтобы результаты опытов были расположены и пронумерованы в порядке возрастания величин.

Критерием оценки эффективности ДС при обеззараживании воды является отсутствие тест-микроорганизмов в 1 л воды [23, 74].

Таблица 5.11.

Граничные значения доверительного интервала медиа

Число опытов	Нижняя граница	Верхняя граница		Число опытов	Нижняя граница	Верхняя граница
7	-	-		29	8	22
8	1	8		30	8	23
9	1	9		31	8	24
10	1	10		32	9	24
11	1	11		33	9	25
12	2	11		34	10	25
13	2	12		35	10	26
14	2	13		36	10	27
15	3	13		37	11	27
16	3	14		38	11	28
17	3	15		39	12	28
18	4	15		40	12	29
19	4	16		41	12	30
20	4	17		42	13	30
21	5	17		43	13	31
22	5	18		44	14	31
23	5	19		45	14	32
24	6	19		46	14	33
25	6	20