Методические указания МУК 4.1.1132-02 "Определение остаточных количеств 2,4-Д в воде, зерне, соломе зерновых культур и зерне кукурузы методом газожидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ)

Методические указания МУК 4.1.1132-02
"Определение остаточных количеств 2,4-Д в воде, зерне, соломе зерновых культур и зерне кукурузы методом газожидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ)

Дата введения: 1 января 2003 г.

2. Методика определения остаточных количеств 2,4-Д в зерне, соломе зерновых колосовых культур и зерне кукурузы методом газожидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении 2,4-Д в виде бутилового эфира с помощью газожидкостной хроматографии с электронозахватным детектором после экстракции ее водно-спиртовым раствором щелочи, процесса высаливания в водной фазе, перераспределения в органический растворитель и очистке на концентрирующем патроне Диапак Амин. Идентификация проводится по времени удерживания. Количественное определение - методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 и 2.

Таблица 1

Анализируемый объект	Метрологические параметры, р = 0,95 n = 20
	предел обнаружения 2,4-Д, мг/кг	диапазон определяемых концентраций, мг/кг	среднее значение определения, %	стандартное отклонение, S	доверительный интервал среднего результата; %,
Вода	0,0001	0,0001-0,01	92,4	3,2
Зерно пшеницы	0,005	0,05-0,005	81,7	2,6
Солома пшеницы	0,02	0,2-0,02	84,3	2,30
Зерно кукурузы	0,005	0,05-0,005	82,5	2,32

Таблица 2

Доверительный интервал и полнота определения 2,4-Д в зерне и соломе яровой пшеницы, зерне кукурузы

Анализируемый объект	Добавлено 2,4-Д, мг/кг (л)	Обнаружено 2,4-Д, мг/кг (л)	Доверительный интервал,	Полнота определения, %
1	2	3	4	5
Вода	0,0001	0,000098	0,000007	98,5
	0,0005	0,00048	0,00005	95,6
	0,001	0,00083	0,000003	83,2
Зерно яр. пшеницы	0,005	0,0042	0,0002	83,6
	0,01	0,0081	0,0004	81
	0,025	0,0201	0,0008	80,6
	0,05	0,0408	0,0009	81,5
Солома яр. пшеницы	0,02	0,0172	0,0003	86,3
	0,05	0,0422	0,0011	84,4
	0,1	0,0832	0,0033	83,2
	0,2	0,1706	0,0056	83,1
Зерно кукурузы	0,005	0,0042	0,0002	83,2
	0,01	0,0083	0,0001	82,6
	0,025	0,0210	0,0008	83,8
	0,05	0,0404	0,0012	80,7

2.1.3. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в технологии выращивания сельскохозяйственных культур (хлор- и фосфорорганические пестициды, симм-триазины, амиды, синтетические пиретроиды, фенилмочевины, тио- и дитиокарбаматы).

2.2. Реактивы, оборудование и приборы

2.2.1. Реактивы, растворы и материалы

Аналитический стандарт 2,4-Д, с содержанием д.в. 99,8%
Азот, осч	ГОСТ 9293-74
Ацетон, хч	ТУ 6-09-3513-86
н-Бутанол, хч, свежеперегнанный	ГОСТ 6006-78
Вода дистиллированная	ГОСТ 7602-72
н-Гексан, ч	ТУ 6-09-3375-78
Гелий, очищенный марки "А"	ТУ 51-940-80
Кислота серная концентрированная, ч
, 2% в бутаноле (бутилирующая смесь)	ГОСТ 4204-77
Кислота серная, 4н водный раствор
Кислота соляная концентрированная, хч	ГОСТ 3118-77
Кислота соляная, 2М раствор водный
Натрий серно-кислый, безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Натрия гидроокись, хч	ГОСТ 4328-77
Натрия гидроокись, 20%-ный водный раствор
Патроны концентрирующие
Диапак Амин (0,6 г), фирма БиоХимМак, МГУ	ТУ 4215-002-05451931-94
Спирт этиловый, ректифицированный	ТУ 6-09-1710-77
Шприц медицинский с разъемом типа Люер, объемом не менее 10 мл
Эфир диэтиловый для наркоза	Фармакопея СССР

2.2.2. Приборы и оборудование

Хроматограф газожидкостный "Цвет 500М" с детектором постоянной скорости рекомбинации ионов (ДПР)
Колонка газохроматографическая стеклянная длиной 2 м, с внутренним диаметром 3 мм, неподвижная фаза OV-17,5% на Хроматоне-N-супер (0,12-0,16 мм)
Хроматограф газовый "Кристалл 2000М" с электронозахватным детектором (ЭЗД) или другой с аналогичными или улучшенными характеристиками
Колонка капиллярная кварцевая НР-5, (Crosslinked 5% фенилсиликсана и 95% метилсилоксана), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм
Алонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами Диапак)
Банки центрифужные полипропиленовые с крышками объемом 250 мл, Nalgene, cat. N 3120-0250
Баня песчаная
Блок нагревательный для виал, Dri-Block DB-3, Tecam.
Бумага индикаторная, универсальная
Вакуумный насос масляный, тип ВН-461-М
Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные	ГОСТ 34104-80Е
Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности г	ГОСТ 19491-74
Виалы с тефлоновыми прокладками, Aldrich, cat. N Z27,702-9
Воронки делительные 250 мл,	ГОСТ 25336-82Е
Воронки для фильтрования стеклянные	ГОСТ 8613-75

ГАРАНТ:

См. ГОСТ 25336-82 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры", утвержденный постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670

Встряхиватель механический	ТУ 64-1-1081-73
Испаритель ротационный МР-1М	ТУ 25-11-917-74
Колбы конические плоскодонные на 100 мл	ГОСТ 10394-72

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 10394-72 постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670 с 1 января 1984 г. введен в действие ГОСТ 25336-82 в части типов, основных параметров и размеров

Колбы мерные на 25, 50 и 100 мл	ГОСТ 1770-74
Концентраторы грушевидные (конические) 250 мл	ГОСТ 10394-72
Микрошприц для газового хроматографа на 1-10 мкл
Насос водоструйный	ГОСТ 10696-75

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 10696-75 постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670 с 1 января 1984 г. введен в действие ГОСТ 25336-82 в части типов, основных параметров и размеров

Пипетки мерные на 1; 2,0; 5,0; 10 мл

ГОСТ 20292-74

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 20292-74 постановлением Госстандарта СССР от 27 декабря 1991 г. N 2234 с 1 января 1994 г. введен в действие ГОСТ 29227-91 в части общих требований к градуированным пипеткам

Стаканы стеклянные на 100 мл	ГОСТ 6236-72
Фильтры бумажные "красная лента"	ТУ 6-09-2678-77
Центрифуга	МРТУ 42-219-69

2.3. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Отобранные пробы зерна и соломы зерновых культур доводятся до стандартной влажности и хранятся в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов. Зерно размалывают на лабораторной мельнице. Солому нарезают ножницами и также измельчают в мельнице.

2.4. Подготовка к определению

2.4.1. Приготовление стандартных растворов

Взвешивают 50 мг 2,4-Д кислоты в мерной колбе на 50 мл, растворяют навеску в этаноле и доводят объем до метки этанолом (стандартный раствор N 1, концентрация 1 мг/мл). Стандартный раствор N 1 можно хранить в холодильнике в течение 1 месяца. Методом последовательного разбавления готовят стандартный раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/мл. Стандартный раствор N 2 используют для проверки хроматографического поведения 2,4-Д на патроне Диапак Амин (п. 2.4.2.1).

Для построения калибровочного графика, при определении остаточных количеств 2,4-Д в зерне и соломе зерновых культур, отбирают 1 мл стандартного раствора N 2 в виал, удаляют растворитель током теплого воздуха и проводят бутилирование, как указано в разделе 2.4.5. Получают стандартный раствор N 3 бутилового эфира 2,4-Д с концентрацией 0,1 мкг/мл. Из него последовательным разбавлением готовят растворы с концентрациями: 0,05; 0,025; 0,01 мкг/мл. Вводят в хроматограф по 1 мкл каждого из полученных четырех растворов и после интегрирования хроматограммы строят график зависимости отклика детектора (площади пика) от концентрации 2,4-Д (мкг/мл).

2.4.2. Подготовка концентрирующих патронов Диапак Амин для очистки экстракта

Все процедуры проводят с использованием вакуума.

При работе с концентрирующими патронами Диапак используется вода бидистиллят.

2.4.2.1. Кондиционирование патрона. Патрон Диапак Амин устанавливают на алонж с отводом для вакуума, вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют как емкость для элюентов).

Пропускают через патрон Диапак Амин 20 мл ацетона со скоростью не более 2 мл/мин и высушивают 5 минут. Элюат отбрасывают.

2.4.2.2. Проверка хроматографического поведения 2,4-Д на патроне Диапак Амин. Упаривают 1 мл аналитического стандарта N 2 2,4-Д в концентраторе на ротационном вакуумном испарителе. Сухой остаток разводят в 1 мл ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, добавляют 1 мл воды, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор наносят на подготовленный патрон Диапак Амин (п. 2.4.2.1). Патрон промывают 5 мл ацетона со скоростью не более 2 мл/мин, элюат отбрасывают. Затем, с патрона последовательно собирают в отдельные концентраторы две фракции по 5 мл 0,2 М соляной кислоты и упаривают их досуха при температуре бани не выше 35°С. Сухой остаток каждой фракции переносят тремя порциями по 2 мл диэтилового эфира в виал и высушивают током теплого воздуха. Проводят бутилирование, как указано в п. 2.4.5.

Газохроматографическим методом определяют содержание 2,4-Д в каждой фракции элюата. Фракции, содержащие 2,4-Д, объединяют, упаривают досуха, вновь растворяют в 5 мл гексана и вводят в хроматограф 1 мкл пробы.

Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смыва 2,4-Д с патрона Диапак Амин и необходимый объем элюирующей смеси.

Примечание: хроматографическое поведение 2,4-Д на патроне обязательно проверяют при отработке методики и при использовании новой партии патронов.

2.4.3. Приготовление водноспиртового раствора щелочи для гидролиза

В мерную колбу объемом 100 мл наливают 50 мл 20%-ного водного раствора едкого натра и доводят объем до метки этиловым спиртом. Раствор тщательно перемешивают и хранят при комнатной температуре в течение одного месяца.

2.4.4. Приготовление раствора для бутилирования

Раствор для бутилирования готовят под тягой, строго соблюдая технику безопасности.

В мерную колбу объемом 100 мл осторожно приливают 2 мл концентрированной серной кислоты к н-бутанолу. Перемешивают раствор и доводят объем до метки бутанолом. Бутилирующую смесь хранят под тягой в течение одного месяца.

2.4.5. Бутилирование

К сухому остатку в виал добавляют 1 мл 2%-ного раствора концентрированной серной кислоты в бутаноле. Плотно закрывают виал крышкой и помещают в блок для виал, нагретый до 100°С. Бутилирование проводят в течение 60 мин. Далее виал охлаждают до комнатной температуры, добавляют 5 мл (для соломы 10 мл) гексана, 20-25 мл дистиллированной воды. Смесь интенсивно встряхивают и после разделения фаз из верхнего гексанового слоя аликвоту 1 мкл вводят в хроматограф.

Примечание: При отсутствии виал и нагревательного блока можно использовать концентраторы с притертыми пробками и водяные или песчаные бани. При этом следует внимательно следить за герметичностью сосудов.

2.4.6. Подготовка и кондиционирование колонки

Капиллярную кварцевую колонку НР-5 длиной 30 м или другую аналогичную по характеристикам одним концом подсоединяют к инжектору. Проверяют утечку газа, устанавливают необходимую скорость потока газа (18-20 см/с). Кондиционируют колонку при температуре термостата 270°С в течение 6-8 ч. Далее колонку подсоединяют к детектору и выставляют рабочие режимы.

2.5. Описание определения

2.5.1. Определение остаточных количеств 2,4-Д в зерне и соломе зерновых культур, зерне кукурузы

2.5.1.1. Экстракция и предварительная очистка. Из измельченного на лабораторной мельнице среднего образца зерна (соломы) взвешивают аналитическую пробу 10 г (5 г) в центрифужные полипропиленовые банки. Добавляют 50 мл (для соломы 100 мл) водноспиртового раствора щелочи и встряхивают пробу на встряхивателе в течение 1 ч, оставляют на ночь. После выстаивания пробу встряхивают 15 мин, и экстракт фильтруют методом декантации через фильтр "красная лента" в концентратор.

Экстракт упаривают досуха. Остаток в концентраторе растворяют в 100 мл воды, добавляют 10 г хлористого натра, перемешивают содержимое и фильтруют в делительную воронку. Водную фазу подкисляют 4Н серной кислотой до рН = 1, добавляют 30 мл диэтилового эфира. Делительную воронку встряхивают в течение двух минут (Осторожно, необходимо дегазировать смесь!) и после полного разделения слоев нижний водный слой собирают в плоскодонную колбу, а верхний эфирный слой собирают в концентратор, пропуская через безводный сульфат натрия. Водную фазу возвращают в делительную воронку и повторяют экстракцию два раза с тем же количеством эфира. Объединенный эфирный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35°С.

2.5.1.2. Очистка экстракта на патроне Диапак Амин. Сухой остаток в концентраторе разводят в 1 мл ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, добавляют 1 мл воды, смесь тщательно перемешивают, и полученный раствор наносят на подготовленный патрон Диапак Амин (п. 2.4.2.1). Патрон промывают 5 мл ацетона, элюат отбрасывают. Далее с патрона в концентратор элюируют 2,4-Д 10 мл 0,2 М соляной кислоты. Упаривают элюат досуха при температуре бани не выше 35°С. Сухой остаток переносят тремя порциями по 2 мл диэтилового эфира в виал и высушивают током теплого воздуха. Проводят бутилирование, как указано в пункте 2.4.5.

2.6. Условия хроматографирования и обработка результатов

2.6.1. Условия хроматографирования

2.6.1.1. Капиллярная хроматография. Хроматограф газовый "Кристалл 2000М" с электронозахватным детектором (ЭЗД). Капиллярная кварцевая колонка НР-5 (Crosslinked 5% PH ME Siloxane), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура детектора - 320°С, испарителя - 230°С.

Программированный нагрев колонки - с 120 до 200°С по 4 град./мин, с 200 до 240°С по 6 град./мин.

Газ 1: тип регулятора расхода газа РРГ 11, давление 84 кПа.

Газ 2 (гелий) - расход 0,5 мл/мин, сброс 1:80.

Режим Splitless, начало сброса 15 с, длительность сброса 5 мин, минимальный расход 20 мл/мин.

Газ 3 (азот, поддув детектора) - 60 мл/мин.

Продувка детектора и испарителя по 60 мл/мин в течение 2 мин при температуре колонки 240°С.

Абсолютное время удерживания бутилового эфира 2,4-Д - 20 мин 18 с, окно 1%.

Объем пробы, вводимый в испаритель - 1 мкл.

Образцы, дающие площадь пика больше, чем стандартный раствор с концентрацией 0,01 мкг/мл, разбавляют.

2.6.1.2. Альтернативные условия для анализа воды. Хроматограф газожидкостный "Цвет 500М" с детектором постоянной скорости рекомбинации ионов (ДПР) с пределом детектирования по Линдану не выше или другой аналогичного типа.

Неподвижная фаза OV-17,5% на Хроматоне-N-супер (0,12-0,16 мм).

Колонка стеклянная спиральная, длина 2 м, внутренний диаметр 3 мм.

Температура: термостата колонки - 240°С;

термостата испарителя - 280°С;

термостата детектора - 340°С.

Скорость газа-носителя - азота - 30 мл/мин.

Объем пробы, вводимой в испаритель, - 3 мкл.

Линейность детектирования - 0,03-0,6 нг.

Время удерживания - 1 мин 55 с.

Рабочая шкала электрометра - .

2.6.2. Обработка результатов анализов

Для обработки результатов анализов используется "Программа сбора и обработки хроматографической информации Хроматек Аналитик", версия 1.20.

Содержание 2,4-Д рассчитывают по формуле:

, где

X - содержание 2,4-Д в пробе, мг/кг;

- высота (площадь) пика стандарта, мВ;

- высота (площадь) пика образца, мВ;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m - масса анализируемого образца, г;

Р - содержание 2,4-Д в аналитическом стандарте, %.

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

4. Разработчики

Калинин В.А., профессор, к.с-х.н., Калинина Т.С., к.с-х.н., Рыбакова О.И.

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева. 127550, Москва, Тимирязевский пр., 2, кафедра химических средств защиты растений. Телефон: 976-02-20, факс 976-43-26. E-mail: tlmaa@online.ru.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко