Раздел 4. Лабораторная диагностика паразитозов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР-диагностика)

Раздел 4. Лабораторная диагностика паразитозов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР-диагностика)

Введение

В разделе приведено описание методов определения криптоспоридий, бластоцист, дирофилярий и лейшманий в различных биологических средах, разработанных в ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского. Методы основаны на идентификации их ДНК с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Описаны скрининговые методы, направленные на выявление регуляторных последовательностей. Идентификация этих регуляторных последовательностей позволяет проводить ДНК-диагностику паразитарных инвазий, но не может применяться при проведении количественного анализа содержания ДНК. Методы, применяемые при отборе проб, выделения ДНК для проведения анализов, проведения электрофореза, документирования и анализа получаемых данных, а также вопросы организации рабочего места являются обязательными к исполнению при проведении как скрининговых, так и идентификационных анализов.

Все представленные в настоящих методических указаниях методы являются качественными и состоят из следующих этапов: выделение ДНК, амплификация целевой ДНК с соответствующими праймерами, электрофорез продуктов амплификации в агарозном геле, документирование и анализ результатов.

Данная методика может быть выполнена на стандартном оборудовании с использованием стандартного набора реагентов в любой оборудованной ПЦР-лаборатории в учреждениях Роспотребнадзора, медицинских учреждениях Российской Федерации вне зависимости от ведомственной принадлежности, а также в лабораториях ПЦР-диагностики других ведомств.

ПЦР-диагностика токсоплазмоза и мочеполового трихомоноза проводится с использованием коммерческих ПЦР-тест-систем для определения Toxoplasma gondii и Trichomonas vaginalis, зарегистрированных в России в установленном порядке.

Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы

Аппаратура и инструменты

Амплификатор типа "Терцик МС-2" со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5°C/с
Прибор для горизонтального электрофореза типа "Sub Cell GT System" с комплектом кювет и гребенок
Источник напряжения типа "Power Pac 300" с диапазоном регулируемого напряжения 50-300 В
Видеосистема типа "Gel Doc ", предназначенная для ввода в компьютер, анализа и документирования изображений люминесцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием: диапазон излучения 300-400 нм, чувствительность - не менее 10 нг ДНК (по бромистому этидию)
Холодильник бытовой электрический	ГОСТ 26678
Камера морозильная, обеспечивающая температуру -20°C
Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф (частота вращения не менее 13000 )
Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 120°C, количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры - 0,2°C, разность температур между соседними ячейками - не более 0,5°C
Аппарат для встряхивания типа "Вортекс", скорость вращения 250-3000
Печь микроволновая (мощностью не менее 400 W)
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г	ГОСТ 24104
Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH = 0,01	ГОСТ 19881-74
Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные	ГОСТ 19569
Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды	ГОСТ 6709-72
Гомогенизатор перистальтического типа "Стомайкер" или других моделей
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов	ТУ 16-535-84
Дозаторы с переменным объемом дозирования: - 0,2-2,0 мкл с шагом 0,01 мкл, точностью = 1,2%; - 0,5-10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, точностью = 0,8%; - 2-20 мкл с шагом 0,01 мкл, точностью = 0,8%; - 20-200 мкл с шагом 0,1 мкл, точностью = 0,6%; - 100-1000 мкл с шагом 1 мкл, точностью = 3%; - 2-10 мл с шагом 0,1 мл, точностью = 0,5%
Пинцет медицинский	ГОСТ 21241-89

Примечание. Допускается использование другой аппаратуры и инструментов с техническими характеристиками, не хуже указанных выше, отечественного и зарубежного производства, разрешенных для применения в установленном порядке.

Лабораторная посуда и материалы

Бумага фильтровальная лабораторная	ГОСТ 12026-76
Воронки стеклянные	ГОСТ 25336-82
Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические вместимостью 25, 50, 100, 200, 1000 мл	ГОСТ 12738-77
Цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25, 100, 1000 мл	ГОСТ 1770-74
Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 мл
Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10, 20, 200, 1000 ; 10

Реактивы

Кислота соляная, х.ч.	ГОСТ 3118-77
Кислота борная, х.ч.	ГОСТ 9656-75
Натрия гидроокись, ч.д.а.	ГОСТ 4328-77
Натрий хлористый, х.ч.	ГОСТ 4233-77
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), х.ч.	ТУ 6-09-11-1721-83
Гексадецилтриметиламмоний бромид (СТАВ)	кат. N Н 5882
Трис (оксиметил) аминометан, х.ч.	ТУ 6-09-4292-76
Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА)	кат. N В 4287
Этидий бромистый, х.ч.	ТУ 6-09-13-452-75
Спирт этиловый ректификованный	ГОСТ Р 51652-2000
Спирт изопропиловый, х.ч.	ТУ 6-09-402-85
Масло вазелиновое медицинское	ГОСТ 3164-78
Хлороформ, х.ч.	ГОСТ 20015-88
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72
Вода деионизированная	ОСТ 11.029.003-80
2-меркаптоэтанол, х.ч.	ТУ 6-09-08-1024-81
Термостабильный фермент Taq-полимераза, оптимум работы в области 70-72°C	кат. N Д 1806
Буфер для ПЦР с	кат. N Р 2192
Агароза для электрофореза (тип П)	кат. N А 6877
Маркер молекулярной массы ДНК	кат. N Р 1473
Праймеры

Примечание. Допускается использование других реактивов с техническими характеристиками, не хуже указанных выше, препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000.

4.1. Подготовка к анализу

Приготовление растворов

1) Приготовление 1 М ТРИС - HCl (pH 7,5)

В мерной колбе на 100 мл растворить 12,11 г Трис (оксиметил) аминометана (молекулярная масса 121) в 80 мл дистиллированной воды, довести pH до 7,5 концентрированной соляной кислотой, затем довести объем раствора до метки деионизованной водой, перемешать, хранить при температуре -20°C не более года.

2) Приготовление 5 М NaCl

Растворить 29,22 г натрия хлористого (молекулярная масса 58,5) в 100 мл дистиллированной воды, перемешать, хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.

3) Приготовление 30%-го NaOH

Растворить 3 г натрия гидроокиси (молекулярная масса 40) в 7 мл дистиллированной воды.

4) Приготовление 0,5 М ЭДТА (pH 8,0)

В мерной колбе на 100 мл растворить 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярная масса 372,2) в 80 мл дистиллированной воды. Довести: 30%-м раствором натрия гидроокиси pH раствора до 8,0; дистиллированной водой - объем раствора до метки, перемешать. Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.

Приготовленные растворы автоклавировать при 1 атм., 121°C 15-20 мин или фильтровать через мембраны Millipore 0,4 мкм.

5) Приготовление хлороформа, насыщенного водой

Смешать 100 мл хлороформа с 20 мл деионизированной воды и оставить на 24 ч для насыщения. Срок хранения при температуре от 4 до 5°C - не более 6 месяцев.

6) Приготовление 70%-го раствора этилового ректификованного спирта

Смешать 70 мл 96%-го этилового спирта с 26 мл деионизированной воды. Срок хранения при температуре от 4 до 5°C - не более 2 месяцев.

7) Приготовление раствора БСА (20 мкг/мл)

Растворить 0,002 г сухого альбумина бычьего сывороточного в 1 мл деионизированной воды, 10 мкл полученного раствора смешать с 990 мкл деионизированной воды.

Срок хранения в морозильной камере при температуре -20°C - не более 6 месяцев.

8) Приготовление лизирующего буфера (2%-го раствора "СТАВ")

Растворить 0,5 г гексадецилтриметиламмония бромида в 10 мл деионизированной воды (при плохом растворении подогреть на водяной бане), добавить 2,5 мл 1 М Трис - HCl, 7 мл 5 М NaCl, 1 мл 0,5 М ЭДТА, доводят объем раствора деионизированной водой до 25 мл, перемешивают. Срок хранения при температуре от 4 до 5°C - не более 6 месяцев, допустимо образование осадка.

Перед использованием раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате при температуре 65°C до полного растворения осадка.

Непосредственно перед использованием в приготовленный лизирующий буфер вносят меркаптоэтанол из расчета 4 на 1 лизирующего буфера и перемешивают.

При проведении электрофореза использовать один из ниже перечисленных буферов.

1) Приготовление 1х TBE буфера для электрофореза

В мерной колбе на 1000 мл растворить 10,8 мг Трис (оксиметил) аминометана, 5,5 г борной кислоты и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, довести дистиллированной водой до метки, перемешать до полного растворения.

Срок хранения 1х раствора - 10 дней, обычно готовят 10х и перед употреблением разбавляют до 1х, используют максимум три раза.

2) Приготовление 1х TAE буфера для электрофореза

В мерную колбу вместимостью 1000 мл внести 242 г Трис-основания, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0,5 М ЭДТА, долить деионизованную воду до метки. Полученный 50х раствор перед употреблением развести в 50 раз.

Использовать для проведения электрофореза не более двух раз.

3) Приготовление раствора бромистого этидия - (10 мг/мл)

Растворить 1 г бромистого этидия в 100 мл дистиллированной воды.

Срок хранения в посуде темного стекла - обязательно при температуре от 4 до 5°C - не более 12 месяцев.

4) Приготовление 2%-го раствора агарозного геля

- Добавить 2 г агарозы к 100 мл буфера TAE (1х).

- Нагреть смесь в микроволновой печи (не доводя до кипения) до полного растворения агарозы.

- Охладить раствор агарозы до 50-55°C и добавить бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

- Залить раствор в специальную камеру для заливки агарозного геля и немедленно вставить гребенки для формирования лунок.

- Оставить гель до полного остывания при комнатной температуре (~30 мин).

Допускается хранение готового геля в 1х буфере для электрофореза в холодильнике при температуре от 4 до 5°C - не более 2 суток.

Отбор, хранение и транспортирование клинического материала

1) На обнаружение простейших кишечника

Кал в количестве 1 г забирается в стерильный флакон и в течение первых двух часов доставляется в бактериологическую лабораторию с оформленным направлением.

2) На обнаружение возбудителей дирофиляриозов

Кровь должна быть нативной (не свернувшейся). Для проведения исследований крови методом ПЦР момент забора крови не имеет значения. Кровь венозную собрать в стерильную пробирку (2-3 мл) с антикоагулянтом ЭДТА, аккуратно перемешать, плавно переворачивая пробирку, и поместить в холодильную камеру (4-8°C).

Внимание! Нельзя использовать гепарин в качестве антикоагулянта!

Образцы могут находиться при комнатной температуре не более 2 ч. При необходимости более длительного хранения пробы могут быть помещены в холодильник с температурой 2-8°C на срок не более суток. Более продолжительное хранение (до 2 недель) допустимо в замороженном виде в морозильной камере при температуре -20°C. Не допускается повторное замораживание-оттаивание проб.

Транспортирование клинических образцов должно осуществляться в термосах или термоконтейнерах с соблюдением правил хранения образцов и правил транспортирования инфекционных материалов.

В лабораторию следует доставлять промаркированные пробирки или предметные стекла, фильтровальную бумагу в индивидуальных конвертах, к ним прилагается документ с Ф.И.О. пациента, возрастом и кратким анамнезом.

4.1.1. Проведение анализа. Выделение ДНК. Метод выделения ДНК с помощью набора Diatom DNA Prep 100/200

1) Приготовление рабочего раствора солевого буфера. Содержимое флакона с 10-кратным солевым буфером, 10 мл, перенести в мерный цилиндр, довести бидистиллированной водой до метки 100 мл и 96%-м этиловым спиртом до метки 300 мл и перемешать. Готовый рабочий раствор солевого буфера хранить в герметично закрытой посуде при температуре 4°C.

2) В пробирку объемом 1,5 мл внести 100 мкл исследуемой пробы, добавить 400 мкл лизирующего реагента и перемешать содержимое пробирки переворачиванием (5-10 раз). Интенсивное встряхивание смеси не рекомендуется.

3) Термостатировать пробирку со смесью 5-7 мин при температуре 65°C. Если выделение ДНК проводится из твердого сухого мелкоизмельченного материала, то следует термостатировать 30-40 мин.

4) После термостатирования центрифугировать пробирку со смесью 10 с при 5000 об./мин в том случае, если смесь содержит несолюбилизированный клеточный дебрис или другой нерастворимый осадок. Прозрачный супернатант целиком перенести в чистую пробирку.

5) В пробирку с чистой смесью добавить 20 мкл суспензии сорбента (перед использованием следует интенсивно встряхнуть на вортексе).

6) Пробирку поместить на ротатор и перемешивать 10 мин (10-20 об./мин).

7) Цетрифугировать 10 с при 5000 об./мин.

8) Осторожно, не задевая осадок, удалить супернатант.

9) К осадку добавить 200 мкл лизирующего реагента, тщательно перемешать на вортексе до гомогенного состояния.

Примечание. Если суспендирование затруднено (при большой нагрузке ДНК из-за сильного слипания сорбента), то его необходимо вначале осторожно суспендировать пипетированием, а затем перемешать на вортексе.

10) Добавить в пробирку 1 мл рабочего раствора солевого буфера.

11) Перемешать содержимое пробирки переворачиванием пробирки 5-10 раз.

12) Центрифугировать 10-20 с при 2000 об./мин.

13) Осторожно, не задевая осадок, удалить супернатант.

14) Добавить в пробирку 1 мл солевого буфера, перемешать содержимое пробирки на вортексе, центрифугировать 10 с при 5000 об./мин и осторожно удалить супернатант с помощью насоса.

15) Повторить положение 14.

16) Посушить осадок при температуре 65°C в течение 4-5 мин.

17) В эту же пробирку внести 50-100 мкл (100 мкл, если выделение ДНК проводится из 200 мл цельной крови или другой, богатой ДНК, пробы).

Внимание! Экстра следует отбирать от общего объема при постоянном перемешивании!

18) Суспендировать содержимое пробирки на вортексе 5-10 с до получения гомогенной суспензии, затем термостатировать 4-5 мин при 65°C.

19) Еще раз суспендировать содержимое пробирки на вортексе перед центрифугированием.

20) Центрифугировать 1 мин при 10000 об./мин.

21) Перенести супернатант с ДНК в чистую пробирку. ДНК хранить при температуре -20°C.

Амплификация

Общие требования к постановке идентификационной ПЦР

При проведении идентификации обязательно готовят следующие пробы:

- ДНК-матрица положительного контроля с праймерами к соответствующим возбудителям;

- ДНК-матрица отрицательного контроля с праймерами к соответствующим возбудителям;

- ДНК-матрица отрицательного контроля с теми же праймерами;

- исследуемые образцы ДНК паразитов с праймерами.

Метод идентификации ДНК

Праймеры для идентификации B. hominis:

- Прямой праймер -5'-CAC TGT GTC GTC ATT GTT TTG-3';

- Обратный праймер -5'-AGG GTC GCA TAA TAG AGT GG-3'.

Праймеры для идентификации C. parvum:

- Прямой праймер 5'-CCG AGT TTG ATC CAA AAA GTT ACG AA-3';

- Обратный праймер 5'-CGT TAA CGG AAT TAA CCA GAC-3'.

Праймеры для идентификации Dirofilaria repens:

- Прямой праймер -5'-CCG GTA GAC CAT GGC ATT AT-3';

- Обратный праймер -5'-CGG TCT TGG ACG TTT GGT TA-3'.

Праймеры для идентификации Dirofilaria immitis:

- Прямой праймер -5'-TGA TTG GTG GTT TTG GTA A-3';

- Обратный праймер -5'-ATA AGT ACG AGT ATC AAT ATC-3'.

Реактивы, которые вносятся на холоде в пробирку типа Эппендорф, и реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлены в табл. 1.

Таблица 1

N п/п	Реактивы	Объем реакционной смеси, мкл
		30	50
1	Деионизированная вода	190	322
2	Буфер для полимеразной цепной реакции с (10х)	30	50
3	Смесь нуклеотидов	30	50
4	Праймер 1 (5 пМ/мкл)	20	30
5	Праймер 2 (5 пМ/мкл)	20	30
6	Taq-полимераза (5 ед./мкл)	10	18

Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.

Подготовка к проведению амплификации

Реакционную смесь разлить в каждую пробирку для проведения ПЦР - по 18 мкл.

В каждую пробирку с 18 мкл реакционной смеси добавить по 2 мкл раствора ДНК.

Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин).

При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.

Условия амплификации представлены в табл. 2.

Таблица 2

Стадия	Режим (град. °C - мин'); (град. °C - с'')
	В. hominis	С. parvum	D. repens	D. immitis
Начальная денатурация	95°C - 5'	95°C - 5'	94°C - 5'	94°C - 5'
Денатурация	95°C - 1'	95°C - 1'	94°C - 30''	94°C - 1'
Отжиг праймеров	48°C - 1'	45°C - 2'	50°C - 30''	50°C - 2'
Удлинение	72°C - 1'	72°C - 3'	72°C - 1'	72°C - 3'
Конечное удлинение	72°C - 5'	72°C - 4'	72°C - 5'	72°C - 5'
Количество циклов амплификации	35	35	30	30

После проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле.

4.1.2. Проведение электрофореза в агарозном геле

Приготовление агарозного геля

Для приготовления 2%-й агарозы необходимо к 1 г агарозы добавить 50 мл 1х буфера TBE и тщательно перемешать.

Полученный раствор поместить в микроволновую печь (на 2-5 мин в зависимости от мощности печи - следить за интенсивностью кипения суспензии!) или прокипятить на водяной бане 15 мин до полного растворения агарозы.

Расплавленную агарозу охладить до 56°C и добавить 5 мкл бромистого этидия (концентрация 10 мг/мл), тщательно перемешать.

Расплавленную агарозу с бромистым этидием разлить в подготовленную форму. Толщина геля 0,5-0,7 см.

Через 30-40 мин удалить гребенку. Готовый гель можно использовать сразу, можно хранить в 1х буфере в холодильнике при 4°C.

Проведение электрофореза

Смешать в отдельной пробирке 2 мкл буфера для нанесения и 10 мкл реакционной смеси. Внести смесь в лунки геля. (Можно использовать соотношение буфер: реакционная смесь - 2:8). В одну из лунок (чаще в крайнюю) внести маркер молекулярной массы (можно 1000 b.p.).

Поместить заполненный гель в камеру для электрофореза, заполненную буфером 1х TБE. Толщина слоя буфера над поверхностью геля примерно 2-3 мм.

В режиме постоянного напряжения 100 V электрофорез длится примерно 70-90 мин.

Гель (без формы) поместить на фильтр трансиллюминатора и посмотреть в проходящем ультрафиолетовом свете.

Документировать результат электрофореза - либо на фотопленку "Микрат Изопан" (изопанхроматическая фотопленка чувствительностью 3 ед. ГОСТ, фотографическая широта 10, разрешение - 300 линий/мм), либо при помощи гельдокументирующей системы на основе цифрового фотоаппарата или видеокамеры. Фотокопия геля должна быть приложена к отчету по идентификации (при цифровой съемке - распечатывается на принтере с разрешением не менее 300 dpi).

При оценке результата ПЦР ожидаемый размер продукта (относительно маркера) для B. hominis - 621 пара оснований (в.р.), для C. parvum - 451 в.р., для D. repens - 480 в.р., для D. immitis - 520 в.р.

4.2. Полимеразная цепная реакция и рестрикция (ПЦР) на идентификацию возбудителей лейшманиозов

Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы для ПЦР-исследования и рестрикции

Необходимое оборудование и инструментарий для ПЦР и рестрикции

Амплификатор типа "Терцик МС-2" со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5°C/с

Прибор для горизонтального электрофореза типа "Sub Cell GT System" с комплектом кювет и гребенок

Источник напряжения типа "Power Pac 300" с диапазоном регулируемого напряжения 50-300 В

Видеосистема типа "Gel Doc ", предназначенная для ввода в компьютер, анализа и документирования изображений люминесцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием: диапазон излучения 300-400 нм, чувствительность - не менее 10 нг ДНК (по бромистому этидию)

Холодильники бытовые или холодильные шкафы с морозильной камерой, обеспечивающей температуру -20°C

Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф (частота вращения не менее 13000 об./мин)

Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 120°C, количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры - 0,2°C, разность температур между соседними ячейками - не более 0,5°C

Аппарат для встряхивания типа "Вортекс", скорость вращения 250-3000 об./мин

Печь микроволновая (мощностью не менее 400 W)

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH = 0,01

Стерилизатор паровой медицинский

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды по ГОСТ 6709-72

Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов

Пипетки автоматические с переменным объемом дозирования:

- 0,2-2,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью = 1,2%;

- 0,5-10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью = 0,8%;

- 2-20 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью = 0,8%;

- 20-200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью = 0,6%;

- 100-1000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью = 3%

Пинцеты медицинские

Лиофильная сушка

Настольный кулер для пробирок

Лабораторная посуда и расходные материалы для ПЦР и рестрикции

Бумага фильтровальная лабораторная

Посуда химическая стеклянная: воронки, колбы мерные плоскодонные конические (25, 50, 100, 200, 1000 мл), цилиндры мерные (25, 100, 1000 мл), пестики

Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф (0,2; 0,5; 1,5 мл)

Наконечники полистироловые с фильтром для автоматических пипеток с переменным объемом дозирования до 10, 20, 200, 1000

Химические реактивы (х.ч.): кислота соляная, кислота борная, гидроокись натрия, хлористый натрий, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)

Трис (оксиметил) аминометан

Этидий бромистый, спирт этиловый, спирт изопропиловый, вода дистиллированная, вода деионизированная, бидистиллированная вода, фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1, v/v), хлороформ-изоаминовый спирт (24:1, v/v), протеиназа K, Тритон X-100, ацетат натрия, уксусная кислота, диметилсульфоксид (ДМСО)

Термостабильный фермент Taq-полимераза, оптимум работы в области 70-72°C

Буфер для ПЦР с

Смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов

Агароза для электрофореза (тип II)

Маркеры молекулярной массы ДНК (10-100 п.н. и 50-1000 п.н.)

Олигонуклеотиды (праймеры), заказывают в коммерческих лабораториях, специализирующихся на их синтезе

Рестриктаза Hae III с буфером

Минеральное масло для ПЦР

Раствор для внесения образцов в гель

Набор для выделения ДНК

Набор для очистки ДНК

Мембраны Millipore, размер пор 0,22 мкм

Примечание. Допускается использование реактивов других фирм с аналогичными характеристиками. Препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000.

Отбор, хранение и транспортирование клинического материала для ПЦР-исследования

1) Для диагностики висцерального лейшманиоза у людей и животных желательно использовать пунктат костного мозга, из которого на обезжиренном предметном стекле необходимо приготовить мазок. Также можно пунктировать лимфатический узел и селезенку. Возможно использование биоптатов других тканей (например, печень собак), которые следует поместить в стерильные пробирки.

2) При диагностике кожных лейшманиозов (ЗКЛ и АКЛ) необходимо приготовить мазки на обезжиренных предметных стеклах из содержимого кожных поражений: папул или язв у людей, ушных раковин у грызунов. У человека материал следует брать из периферии инфильтрата, избегая сильного травмирования язвы, что может привести к нежелательному попаданию в образец большого количества крови.

3) При широких эпидемиологических и эпизоотологических исследованиях допустимо использовать венозную кровь или кровь из пальца, которую можно собрать на предметное стекло (0,1 мл), стерильную фильтровальную бумагу (0,1 мл) или в стерильные пробирки (1 - 10 мл). В случае сбора крови в пробирки - использовать пробирки с цитратом натрия или ЭДТА. Недопустимо использовать пробирки с гепариновым антикоагулянтом! (гепарин ингибирует ПЦР).

4) Для исследования москитов на зараженность лейшманиями поместить их после сбора механическими ловушками или на липкие листы бумаги в чистые пробирки с 96%-м этиловым спиртом.

5) Стекла с мазками, пробирки с биоптатами, фильтровальную бумагу с кровью необходимо поместить в индивидуальный конверт, снабдить датой, а также сведениями о больном и иной необходимой информацией.

6) Образцы можно хранить при комнатной температуре (следует избегать прямых солнечных лучей) несколько суток. При необходимости более длительного хранения (2-3 недели) пробы необходимо поместить в холодильник с температурой 2-8°C, в морозильной камере с температурой -20°C пробы могут сохраняться до одного года.

Перевозка биологических образцов должна осуществляться в термосах или термоконтейнерах с соблюдением правил хранения образцов и правил транспортирования инфекционных материалов.

Приготовление необходимых растворов

1) Приготовление 1 М ТРИС - HCl (pH 7,5)

В мерной колбе на 100 мл растворить 12,11 г Трис (оксиметил) аминометана (молекулярный вес 121) в 80 мл дистилированной воды, довести pH до 7,5 концентрированной соляной кислотой, затем довести объем раствора до метки деионизованной водой, перемешать, хранить при комнатной температуре не более года.

Использовать для приготовления буфера Трис-ЭДТА и солевого буфера для фенол-хлороформного выделения.

2) Приготовление 30%-го раствора NaOH

Растворить 3 г натрия гидроокиси (молекулярный вес 40) в 7 мл дистиллированной воды. Раствор хранить при комнатной температуре в герметичном сосуде, блокирующем взаимодействие с .

Использовать в приготовлении 0,5 М ЭДТА (pH 8,0).

3) Приготовление 0,5 М ЭДТА (pH 8,0)

В мерной колбе на 100 мл растворить 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80 мл дистиллированной воды. Довести: 30%-м раствором натрия гидроокиси pH раствора до 8,0; дистиллированной водой - объем раствора до метки, перемешать. Хранить при комнатной температуре до 1 года.

Приготовленный раствор фильтровать через мембраны Millipore 0,22 мкм.

Использовать в приготовлении буфера Трис-ЭДТА, 1х TAE буфера для электрофореза, лизирующего буфера для выделения фенол-хлорофорным методом.

4) Приготовление 70%-го раствора этилового спирта

Смешать 70 мл 96%-го этилового спирта с 26 мл деионизированной воды. Срок хранения при температуре от 4 до 5°C - не более 2 месяцев.

Раствор использовать для преципитации ДНК.

5) Приготовление 1х TBE буфера для электрофореза

В мерной колбе на 1000 мл растворить 10,8 мг Трис (оксиметил) аминометана, 5,5 г борной кислоты и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, довести дистилированной водой до метки, перемешать до полного растворения. Полученный 10х раствор перед употреблением развести до 1х для приготовления агарозного геля и до 0,5х для приготовления буфера для электрофореза.

Используют 0,5х буфер максимум для проведения трех электрофорезов.

6) Приготовление 1х TAE буфера для электрофореза

В мерную колбу вместимостью 1000 мл внести 242 г Трис-основания, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0,5 М ЭДТА, долить деионизованной водой до метки. Полученный 50х раствор перед употреблением развести в 50 раз.

Использовать 1х буфер для проведения электрофореза не более трех раз.

Примечание. При проведении электрофореза использовать один из перечисленных буферов.

7) Приготовление раствора бромистого этидия - (10 мг/мл)

Растворить 1 г бромистого этидия в 100 мл дистиллированной воды. Срок хранения в посуде темного стекла (обязательно при температуре от 4 до 5°C) не более 12 месяцев.

Раствор необходим для приготовления агарозного геля.

Внимание! Проявлять особую осторожность! Сильный канцероген! Работать только в резиновых перчатках! Избегать попадания на кожу и слизистые!

При попадании тщательно промыть соответствующий участок водой!

8) Приготовление солевого буфера

Растворить 1,46 г натрия хлористого в 10 мл ЭДТА (0,5 М, pH 8,0), добавить 25 мл трис-HCl (1 М, pH 7,4), довести объем до 500 мл дистиллированной водой. Стерилизовать автоклавированием. Хранить при 4°C или комнатной температуре не более 6 месяцев.

Солевой буфер использовать для выделения ДНК фенол-хлороформным методом.

9) Приготовление 3 М ацетата натрия (pH 5,2)

Растворить 40,83 г ацетата натрия (с массовой долей 136,1) в 50-60 мл дистиллированной воды. Концентрированной уксусной кислотой довести pH до 5,2. Довести объем до 100 мл дистиллированной водой. Стерилизовать автоклавированием. Хранить при комнатной температуре не более 6 месяцев.

Использовать для выделения ДНК фенол-хлороформным методом.

10) Приготовление буфера Трис-ЭДТА (pH 8,0)

Смешать 2 мл 1 М Трис-HCl (pH 8,0) и 400 мкл 0,5 М ЭДТА (pH 8,0), добавить 170 мл дистиллированной воды, проверить pH. Если необходимо, 1 н HCl довести pH до 8,0. Довести объем до 200 мл. Стерилизовать автоклавированием. Хранить при комнатной температуре не более 6 месяцев.

Буфер Трис-ЭДТА использовать для выделения ДНК фенол-хлороформным методом.

4.2.1. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Выделение ДНК

Ниже приведены методы выделения ДНК:

1) Фенол-хлороформное выделение ДНК.

2) Выделение ДНК с помощью готовых к использованию коммерческих наборов реагентов.

Допускается применение любого из методов, указанных в настоящих МУК, по выбору исполнителя.

Для повышения точности анализа исследования должны выполняться не менее чем в двух повторах (исследовать от одного образца сразу две пробы).

Метод фенол-хлороформного выделения ДНК

1) Подписать пробирки.

2) Приготовить образец для выделения ДНК.

3) Костный мозг: смешать 1:1 с солевым буфером в стерильной микроцентрифужной пробирке.

4) Биоптат/материал тканей: измельчить ткань (по 10-20 мг) стерильным пестиком или скальпелем в стерильной микроцентрифужной пробирке, смешать с 1-2 мл солевого буфера, можно также добавить протеиназу K, концентрация которой должна составить 200 мг/мл.

5) Образцы свежей крови: 3-10 мл крови центрифугировать при 3000 об./мин, аккуратно удалить супернатант. К осадку добавить равный объем солевого буфера.

6) Образцы на фильтровальной бумаге: мелко нарезать ножницами фильтровальную бумагу с каплей крови в стерильную микроцентрифужную пробирку. Добавить 250 мкл солевого буфера.

7) Соскоб: добавить 100 мкл солевого буфера на материал, который находится на предметном стекле. Перемешать и скарифицировать, используя наконечник пипетки, затем перенести суспензию с поверхности предметного стекла в стерильную микроцентрифужную пробирку. Повторить процедуру, добавив 150 мкл лизирующего буфера. Общий объем лизирующего буфера должен составить 250 мкл.

8) Москиты: гомогенизировать москита (тело самки или его часть) стерильным пестиком в 1,5 мл микроцентрифужной пробирке, содержащей 250 мкл солевого буфера.

9) Добавить Тритон X-100, его конечная концентрация должна составить 1%.

10) Добавить протеиназу K, из расчета ее финальной концентрации 100-200 мкг/мл. Инкубировать всю ночь при 60°C.

11) Добавить смесь фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1, v/v) в равном объеме. Аккуратно встряхнуть в течение 2-3 мин, переворачивая пробирки. Не использовать аппарат "Вортекс".

12) Центрифугировать при 16000 g (максимальная скорость) 10 мин и аккуратно перенести водную (верхнюю) фазу в чистые подписанные 1,5 мл пробирки, остатки утилизировать. Если органическая и водная фазы не достаточно хорошо отделились, следует повторить центрифугирование, увеличив время.

13) Повторить шаги 5 и 6.

14) К водной фазе добавить равный объем смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1, v/v), мягко встряхнуть (не использовать аппарат "Вортекс"), центрифугировать 10 мин Перенести вновь образовавшуюся водную фазу в чистые пробирки и оценить объем.

15) Добавить 1/10 объема 3 М ацетата натрия (pH 5,2).

16) Преципитировать ДНК 2,0-2,5 объемами ледяного 96%-го этанола. Аккуратно смешать, переворачивая пробирку (не использовать аппарат "Вортекс"). Инкубировать в морозильной камере - ночь или 1 ч при -70°C.

17) Центрифугировать 30 мин при 16000 g, аккуратно слить супернатант, не потревожив осадок ДНК, который может быть невидимым.

18) Отмыть осадок ДНК 250 мкл 70%-го охлажденного этанола. Не встряхивать. Центрифугировать при 16000 g 15 мин при температуре 4°C. Аккуратно удалить супернатант.

19) Оставить пробирку открытой при комнатной температуре до полного высыхания. Также можно использовать вакуумную сушку при 30°C 10 мин.

20) Внести в каждую пробирку 100 мкл бидистиллированной воды или буфера Трис-ЭДТА. Оставить на 2 ч при комнатной температуре для полного растворения. Хранить при 4°C - ночь, при -20°C до использования.

21) Во избежание ингибирования ПЦР остатками фенольных соединений можно очистить выделенную ДНК, используя коммерческий набор подобно Extract 2 в 1 от Macherey-Nagel-Germany или Qiagen PCR purification kit. Очистку производить согласно протоколу производителя. На выходе получится 30 мкл ДНК в буфере комплекта.

22) Приготовленный вышеизложенным способом раствор ДНК использовать для постановки ПЦР.

4.2.2. Выделение ДНК коммерческим набором**

1) Подписать пробирки.

2) Приготовить образец для выделения ДНК.

3) Мазок костного мозга, селезенки, лимфатического узла, язвенных поражений, капля крови на предметном стекле: добавить 300 мкл раствора, лизирующего клетки ("Cell Lysis Solution"), на материал, который находится на предметном стекле. Перемешать и скарифицировать, используя наконечник пипетки, затем перенести суспензию с поверхности предметного стекла в стерильную микроцентрифужную пробирку. Мягко смешать, переворачивая пробирки, инкубировать смесь 10 мин при комнатной температуре.

4) Образцы свежей крови: к 300 мкл крови, находящейся в пробирке, добавить 300 мкл раствора, лизирующего клетки ("Cell Lysis Solution"). Мягко смешать, переворачивая пробирки, инкубировать смесь 10 мин при комнатной температуре.

5) Образцы на фильтровальной бумаге: мелко нарезать ножницами фильтровальную бумагу с каплей крови в стерильную микроцентрифужную пробирку. Добавить 300 мкл раствора, лизирующего клетки ("Cell Lysis Solution"), мягко смешать, переворачивая пробирки, инкубировать смесь 10 мин при комнатной температуре.

6) Москиты: гомогенизировать москита (тело самки или его часть) стерильным пестиком в 1,5 мл микроцентрифужной пробирке, содержащей 300 мкл раствора, лизирующего клетки ("Cell Lysis Solution"). Мягко смешать, переворачивая пробирки.

Центрифугировать при 13000-16000 g 2 мин при комнатной температуре.

Удалить как можно больше супернатанта, не потревожив осадок, некоторый супернатант может оставаться в пробирке. Повторить шаги 1-3.

Встряхните пробирки на аппарате "Вортекс" 10-15 с (частота колебаний 3000/мин), ресуспендируя содержимое пробирок до осветления осадка.

Добавить 100 мкл раствора, лизирующего ядро ("Nuclei Lysis Solution"), в пробирки, содержащие ресуспендированные клетки. Для разрушения лейкоцитов перемешать раствор пипеткой 5-6 раз. Раствор должен стать очень вязким.

7) Добавить 0,5 мкл раствора РНК-аз ("RNase Solution") для лизата ядра и перемешать образец переворачиванием пробирки 2-5 раз. Инкубировать смесь при 37°C 15 мин, а затем охладить до комнатной температуры.

8) Добавить 33 мкл раствора, преципитирующего белки ("Protein Precipitation Solution"), к нуклеиновому лизату и интенсивно встряхнуть на аппарате "Вортекс" 10-20 с. Центрифугировать при 13000-16000 g 3 мин при комнатной температуре.

9) Перенести супернатант в чистые 1,5 мл микроцентрифужные пробирки, содержащие 100 мкл изопропанола комнатной температуры.

10) Перемешать раствор, аккуратно встряхивая, до появления белых нитеобразных структур ДНК (иногда они могут быть не видны). Центрифугировать при 13000-16000 g 2 мин при комнатной температуре.

11) Удалить супернатант и добавить к ДНК 100 мкл 70%-го этанола комнатной температуры. Мягко встряхнуть пробирку несколько раз, отмывая осадок ДНК и стенки микроцентрифужной пробирки. Центрифугировать при 13000-16000 g 10 мин при комнатной температуре.

12) Осторожно удалить этанол, не задев ДНК. Перевернуть пробирку на чистую фильтровальную бумагу и высушить на воздухе осадок ДНК (ориентировочно 10-15 мин).

13) В пробирку добавить 20 мкл раствора, регидратирующего ДНК ("DNK Rehydration Solution"). Инкубировать при 65°C 1 ч, слегка постукивая по пробирке. Также можно регидратировать ДНК, инкубируя раствор всю ночь при комнатной температуре или при 4°C. ДНК можно использовать сразу или хранить при 2-8°C. Не более 5 суток.

14) Приготовленный вышеизложенным способом раствор ДНК использовать для постановки ПЦР.

Амплификация

Для амплификации фрагмента длиной 300-350 п.н. спейсера ITS1 (internal transcribed spacer) между генами 18S pРНК и 5,8S pРНК использовать следующие олигонуклеотиды (праймеры):

- LITSR: 5'-CTG GAT CAT TTT CCG ATG-3';

- L5,8S: 5'-TGA TAC CAC TTA TCG CAC TT-3'.

Концентрацию праймеров для постановки ПЦР следует привести к 10 пкмоль/мкл. Исходные расчетные данные обычно приведены в паспорте на синтетические олигонуклеотиды. В том случае, если известна только оптическая плотность, концентрацию рассчитать по формуле:

C (пмоль/мл) = C (оп. ед.) / (a х 0,01),

где a - кол-во пар оснований.

Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции представлена в табл. 3.

Таблица 3

Реакционная смесь для ПЦР

N п/п	Реактивы	Объем реакционной смеси, мкл
		50	30
1	Деионизированная вода	31,8	17,5
2	Буфер для полимеразной цепной реакции с (10х)	5	3
3	Смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (2,5 мМ)	4	2,4
4	Праймер 1 (LITSR)	2,5	1,5
5	Праймер 2 (L5,8S)	2,5	1,5
6	Taq-полимераза (5 Ед/мкл)	0,2	0,1

Примечание. Также можно добавить 2,7% ДМСО от финального объема реакционной смеси. В этом случае в равном объеме уменьшить количество вносимой деионизированной воды.

1) Для приготовления общей реакционной смеси реактивы в пробирку типа Эппендорф вносить на холоде (для этой цели целесообразно использовать настольный кулер для пробирок).

2) Реакционную смесь приготовить на необходимое количество проб, но не менее чем на 5 (оптимальный рабочий раствор для биологических образцов).

3) В пробирки для проведения ПЦР разлить из общей реакционной смеси по 46 мкл (или по 26 мкл в зависимости от выбора исполнителя).

4) В каждую пробирку для проведения ПЦР с реакционной смесью добавить 4 мкл раствора ДНК. Содержимое пробирки перемешать, центрифугировать для того, чтобы сбросить капли на дно пробирки (не более 30 с при 3000 об./мин).

5) При использовании амплификатора, не имеющего нагреваемую крышку, в каждую пробирку добавить каплю минерального масла (17-20 мкл).

6) На каждую партию (10-20 образцов) обязательно приготовить следующие пробы:

- отрицательный контроль - дистиллированная вода, для проверки качества амплификации;

- положительный контроль - использовать ДНК лейшмании, отличную от ожидаемой в анализе (если исследуются человеческие образцы, следует использовать ДНК не паразитирующих на человеке лейшманий, например L. turanica);

- контроль ингибирования - 2 мкл ДНК, использованной в положительном контроле, и 2 мкл ДНК исследуемого образца. Сравнение интенсивности полос позитивного контроля и контроля ингибирования укажет на ингибирование ПЦР или его отсутствие.

Исследуемые образцы

Условия амплификации представлены в табл. 4.

Таблица 4

Условия амплификации

Стадия	Температура, °C	Время	Число циклов
Начальная денатурация	95	2 мин	1
Денатурация	95	20 с
Отжиг праймеров	53	30 с	40
Удлинение	72	1 мин
Достройка	72	6 мин	1
Хранение	6		1

После проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле.

Проведение электрофореза в агарозном геле

Приготовление агарозного геля

1) Для приготовления 2%-й агарозы необходимо к 1 г агарозы добавить 50 мл 1х буфера TBE (или 1х буфера TAE) и тщательно перемешать (можно использовать магнитную мешалку).

2) Полученный раствор поместить в микроволновую печь на 2-5 мин (в зависимости от мощности печи), следить за интенсивностью кипения суспензии или прокипятить на водяной бане 15 мин до полного растворения агарозы.

3) Расплавленную агарозу охладить до 56°C и добавить 5 мкл бромистого этидия (концентрация 10 мг/мл), тщательно перемешать.

4) Расплавленную агарозу с бромистым этидием разлить в подготовленную камеру (с вложенной гребенкой). Толщина геля 0,5-0,7 см.

5) Через 30-40 мин удалить гребенку.

6) Готовый гель использовать сразу.

Проведение электрофореза

1) Поместить гель в камеру для электрофореза, заполненную буфером 0,5х TBE (или 1х буфера TAE). Толщина слоя буфера над поверхностью геля примерно 2-3 мм.

2) Смешать в отдельной пробирке 2 мкл раствора для нанесения и 10 мкл амплификата. Внести смесь в лунки геля под буфер. (Можно использовать соотношение раствор для внесения: реакционная смесь - 2:8). В одну из лунок (чаще в крайнюю) внести маркер молекулярной массы (можно 100-1000 В.р.).

3) В режиме постоянного напряжения 100 V электрофорез длится примерно 60-70 мин.

4) Гель поместить на фильтр трансиллюминатора и просмотреть в проходящем ультрафиолетовом свете.

5) Если приходится работать с открытым источником УФ-излучений, для защиты глаз от вредного воздействия ультрафиолетового излучения использовать специальные защитные очки!

6) При оценке результата ПЦР ожидаемый размер продукта (относительно маркера) - 300-350 п.н.:

- L. infantum - 320 п.н.;

- L. donovani - 320 п.н.;

- L. tropica - 320 п.н.;

- L. major - 340 п.н.;

- L. turanica - 350 п.н.

Документировать результат электрофореза - либо на фотопленку "Микрат Изопан" (изопанхроматическая фотопленка чувствительностью 3 ед. ГОСТ, фотографическая широта - 10, разрешение - 300 линий/мм), либо при помощи гельдокументирующей системы.

Фотокопия геля должна быть приложена к отчету по идентификации (при цифровой съемке - распечатывается на принтере с разрешением не менее 300 dpi).

Рестрикционный анализ

Для видовой идентификации образцов лейшманий используют различные методы. Одним из рациональных является рестрикционный анализ. Он особенно удобен для неэндемичных по лейшманиозу стран, когда возможен завоз любого вида лейшманий, а также стран, где циркулирует не один вид лейшманий. Рестрикционный анализ амплифицируемой ITS1 области позволяет идентифицировать даже неизвестный изолят на уровне вида.

Идентификация вида лейшманий необходима для правильной диагностики и прогнозов болезни, а также принятия правильного решения относительно лечения и мер контроля.

Рестрикция

Рестрикционный анализ необходимо провести с исследуемыми образцами, показавшими положительный результат. Также необходимо поставить положительный и отрицательный контроли рестрикции.

Для рестрикции использовать энзим Hae III, относящийся к классу рестрикционных эндонуклеаз типа II:

- 5'-GG CC-3';

- 3'-CC GG-5'.

Реакционная смесь для проведения рестрикционного анализа в зависимости от интенсивности ПЦР-продукта (как наблюдали на геле) приведена в табл. 5.

Таблица 5

Реакционная смесь для рестрикции

N п/п	Реактивы	Объем ITS1-продукта, мкл
		10	15	20
1	10х буфер рестиктазы	1,5	2,0	2,5
2	Деионизированная вода	2,5	2,0	1,5
3	Рестрикционный энзим (10 Ед/мкл) HAE III	1,0	1,0	1,0
4	Общий объем	15,0	20,0	25,0

Примечание. Общую реакционную смесь готовить из расчета на одну больше необходимого количества проб, т.е. если 5 образцов, приготовьте из расчета на 6, так уменьшатся ошибки пипетки.

1) Для приготовления общей реакционной смеси реактивы в стерильную 0,5 мл микроцентрифужную пробирку вносить на холоде (целесообразно использовать настольный кулер для пробирок).

2) Аккуратно встряхните реакционную смесь и центрифугируйте ее несколько секунд для того, чтобы все капли со стенок опустились.

3) Внесите буфер и воду в пробирку первыми. Если сначала внести энзим, а затем буфер, может начаться необратимая денатурация. Не используйте энзима более 10% от финального объема реакционной смеси. Рестриктазу хранить в "ледяном" штативе!

4) Подпишите стерильные 0,5 мл микроцентрифужные пробирки и разлейте по 5 мкл из общей реакционной смеси в каждую пробирку. Добавьте адекватную порцию ITS1 ПЦР-продукта и перемешайте. Центрифугируйте смесь короткое время, чтобы осадить все капли.

5) Инкубируйте при 37°C в течение 2 ч на водяной бане или термостате.

6) Приготовьте агарозный гель.

Проведение электрофореза

1) После инкубации смешать не более 20 мкл рестрикционного продукта с 3 мкл раствора для нанесения на гель. (Можно добавить раствор в пробирку). Внести смесь в лунки геля. В 2 лунки (чаще в крайние) внести маркеры молекулярной массы (можно 10-100 В.р. и 100-1000 В.р.).

2) Поместить гель в камеру для электрофореза, заполненную буфером 1х TBE. Толщина слоя буфера над поверхностью геля примерно 2 - 3 мм.

3) В режиме постоянного напряжения 100 V электрофорез длится примерно 110-130 мин.

4) Гель (без формы) поместить на фильтр трансиллюминатора и просмотреть в проходящем ультрафиолетовом свете.

5) Документировать результат электрофореза - либо на фотопленку "Микрат Изопан" (изопанхроматическая фотопленка чувствительностью 3 ед. ГОСТ, фотографическая широта - 10, разрешение - 300 линий/мм), либо при помощи гельдокументирующей системы. Фотокопия геля должна быть приложена к отчету по идентификации (при цифровой съемке - распечатывается на принтере с разрешением не менее 300 dpi).

Примечание. Клинические образцы и продукты реакций рекомендуется хранить в течение 1 месяца (для повторного анализа в случае возникновения спорных случаев диагностики).

Ожидаемые размеры фрагментов рестрикции представлены в табл. 6.

Таблица 6

Размеры фрагментов рестрикции

Рестрикционный энзим	Виды лейшманий
	L. donovani	L. infantum	L. chagasi	L. aethiopica	L. tropica	L. major	L. turanica	L. mexicana	L. amazonensis	L. braziliensis	L. guyanensis	L. panamanensis
Hae III				200	185		203
	164	184	184					186
				57	57	203	57		186	156	156	156
	72	72	72					88
				54	53	132	53		142	143	137	139
	54	55	55					59
				23	24		24

На рис. 14 представлен пример результата электрофоретического разделения фрагментов рестрикции ITS1-продуктов разных видов лейшманий при использовании энзима Hae III (по G. Schonian, A. Nasereddin, N. Dinse et al., 2003) (не приводится).