Межгосударственный стандарт ГОСТ 32011-2013 (ISO 16654:2001) "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения Escherichia coli О157" (утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 июня 2013 г. N 226-ст)

3.1 escherichia coli О157 (Е. coli О157): Микроорганизмы, дающие типичный рост на поверхности селективного агара, образующие индол и специфическим образом агглютинирующие с антисывороткой к антигену О157.

 

Примечания:

1 Сорбит-положительные штаммы Е. coli О157 не обнаружены в среде CT-SMAC (5.2).

2 Обнаружены некоторые индол-отрицательные мутации.

5.1 Обогатительная среда (модифицированный триптон-соевый бульон с новобиоцином (mTSB + N)

 

Состав:

Ферментативный перевар казеина                          17,0 г

Ферментативный перевар сои                              3,0 г

0(+)-глюкоза                                            2,5 г

Желчные соли No. 3                                      1,5 г

Хлорид натрия                                           5,0 г

Моногидрофосфат калия ()                          4,0 г

Дистиллированная вода                                   1 000 

 

5.1.1 Приготовление среды

Растворяют компоненты или готовую дегидратированную питательную среду в воде, при необходимости подогревают. Устанавливают уровень рН, используя рН-метр (см. 6.6), если необходимо, так, чтобы после стерилизации он соответствовал рН при температуре 25°С.

Разливают среду в соответствующих количествах в колбы или склянки (6.7).

Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (см. 6.1) при температуре 121°С.

5.1.1.1 Раствор новобиоцина

Состав:

Новобиоцин                                             0,45 г

Дистиллированная вода                                  100 см

Приготовление раствора:

Растворяют новобиоцин в воде и стерилизуют фильтрованием через микропористую мембрану.

Готовят раствор перед определением.

5.1.1.2 Приготовление готовой среды

Непосредственно перед применением в среду (см. 5.1.1) добавляют 1  или раствора новобиоцина (см. 5.1.1.1) или к , или к с охлажденной среды mTSB (см. 5.1.1).

Конечная концентрация новобиоцина равна среды mTSB.

5.2 Первая селективная среда для выделения микроорганизмов: агаровая среда Мак-Конки с сорбитом и суплементом СТ (цефиксим и теллурит калия) (CT-SMAC)

5.2.1 Основная среда

Состав:

Ферментативный перевар казеина                          17,0 г

Ферментативный перевар животных тканей                  3,0 г

Сорбит                                                  10,0 г

Желчные соли No. 3                                      1,5 г

Хлорид натрия                                           5,0 г

Нейтральный красный                                     0,03 г

Кристаллический фиолетовый                              0,001 г

Агар                                                    9 - 18 г*

Дистиллированная вода                                   1 000 

5.2.1.1 Приготовление среды

Растворяют основные компоненты или готовую дегидратированную основу в воде, при необходимости кипятят. Устанавливают уровень рН (см. 6.6), если необходимо, чтобы после стерилизации он соответствовал при температуре 25°С, стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (см. 6.1) при температуре 121°С.

5.2.2 Раствор теллурита калия

Состав:

Теллурит калия для бактериологического исследования     0,25 г

Дистиллированная вода                                   100 

5.2.2.1 Приготовление

Растворяют теллурит калия в воде и стерилизуют фильтрованием через микропористую мембрану.

Раствор можно хранить при комнатной температуре в течение 1 мес, но, если образуется белый осадок, его не применяют.

5.2.3 Раствор цефиксима

Состав:

Цефиксим                                                 5,0 мг

Дистиллированная вода                                    100,0 

5.2.3.1 Приготовление раствора

Растворяют цефиксим в воде и стерилизуют фильтрованием через микропористую мембрану.

 

Примечание - Возможно, цефиксим надо будет растворить в этаноле.

 

Этот раствор хранят при температуре °С в течение 1 нед.

5.2.4 Готовая питательная среда

Состав среды:

Основная среда (см. 5.2.1)                               1 000 

Раствор теллурита калия (см. 5.2.2)                      1,0 

Раствор цефиксима (см. 5.2.3)                            1,0  

5.2.4.1 Приготовление среды

Основную среду сразу же после стерилизации или охлаждают (см. 5.2.1) до температуры от 44°С до 47°С (см. 6.5), или расплавляют ее, пропаривая предварительно стерилизованную и застывшую основную среду, а затем охлаждают до температуры от 44°С до 47°С.

Добавляют 1  раствора теллурита и раствора цефиксима к основной среды. Перемешивают и разливают приблизительно по в стерильные чашки Петри (см. 6.15). Оставляют застывать.

Окончательная концентрация теллурита составляет , а цефиксима - .

Непосредственно перед употреблением чашки с агаром высушивают, сняв крышки и перевернув их вверх дном, в сушильном шкафу при температуре от 25°С до 50°С (см. 6.2), пока с поверхности среды не исчезнут все капли. Чашки с агаром можно также сушить в защитном шкафу с ламинарным потоком в течение 30 мин с приоткрытыми крышками или оставить на ночь с закрытыми крышками.

Приготовленные заранее невысушенные чашки можно хранить в темных пластиковых пакетах или в других сохраняющих влагу контейнерах в холодильнике при температуре °С в течение двух недель.

5.3 Вторая селективная среда для выделения микроорганизмов

По выбору лаборатории используют любую другую твердую селективную среду дополнительно к агару CT-SMAC и специально предназначенную для выделения Escherichia coli О157.

Непосредственно перед употреблением чашки с агаром высушивают (см. 5.2.4.1).

Приготовленные заранее невысушенные чашки можно хранить в темных пластиковых пакетах или в других сохраняющих влагу контейнерах в холодильнике при температуре °С в течение такого срока, который не приведет к изменению их характеристик.

5.4 Питательный агар

Состав:

Мясной экстракт                                           3,0 г

Пептон                                                    5,0 г

Агар                                                      9 - 18 г*

Дистиллированная вода                                     1 000 

5.4.1 Приготовление питательного агара

Растворяют компоненты или готовую дегидратированную основу среды в воде, при необходимости подогревают. Устанавливают уровень рН так, чтобы после стерилизации он соответствовал при температуре 25°С.

Переносят среду в колбы или склянки (см. 6.7) соответствующей вместимости.

Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (см. 6.1) при температуре 121°С.

5.4.2 Приготовление чашек с питательным агаром

Переносят расплавленной, охлажденной среды (см. 5.4.1) при температуре от 44°С до 47°С (см. 6.5) в чашки Петри и оставляют застывать.

Непосредственно перед употреблением чашки с агаром высушивают (см. 5.2.4.1).

Приготовленные заранее невысушенные чашки можно хранить в темных пластиковых пакетах или в других сохраняющих влагу контейнерах в холодильнике при температуре °С в течение двух недель.

5.5 Триптон/триптофановая среда

Состав среды:

Триптон                                                   10,0 г

Хлорид натрия                                             5,0 г

DL-Триптофан                                              1,0 г

Дистиллированная вода                                     1 000 

5.5.1 Приготовление среды

Растворяют компоненты в воде, доводят до кипения. Устанавливают уровень рН (см. 6.6) так, чтобы после стерилизации он соответствовал при температуре 25°С.

Разливают по в пробирки (см. 6.7) соответствующей вместимости.

Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (см. 6.1) при температуре 121°С.

5.6 Реактив Ковача на индол

 

Состав реактива:

4-диметиламинобензальдегид                                5,0 г

2-метилбутан-1-ол или пентан-1-ол                         75,0 

Соляная кислота (р20 от 1,18 г/см3 до 1,19 г/см3). . . .  25,0 

 

5.6.1 Приготовление реактива

Растворяют 4-диметиламинобензальдегид в спирте, при необходимости подогревая на водяной бане (см. 6.5), поддерживающей температуру от 44°С до 47°С. Охлаждают до комнатной температуры и добавляют соляную кислоту.

Защищают реактив от света в стеклянном флаконе из коричневого стекла и хранят при температуре (3 2)°С.

Цвет реактива - от светло-желтого до светло-коричневого, без осадка.

5.7 Иммуномагнитные частицы, связанные с антителами к Escherichia coli О157

Иммуномагнитные частицы, связанные со специфическими антителами к палочке Е. coli О157, для концентрации и сепарации этих микроорганизмов.

 

Примечание - При подготовке иммуномагнитных частиц к использованию необходимо соблюдать инструкции изготовителя.

 

5.8 Промывочный буфер: модифицированный фосфатный буфер 0,01 моль/ , уровень рН 7,2

 

Состав буфера:

Хлорид натрия                                             8,0 г

Хлорид калия                                              0,2 г

Вторичный кислый фосфат натрия (безводный)                1,44 г

Первичный кислый фосфат калия (безводный)                 0,24 г

Полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат (сироп Tween 20)         0,2 

Дистиллированная вода                                     1 000 

 

5.8.1 Приготовление буфера

Растворяют компоненты в воде. Устанавливают уровень рН (см. 6.6) при температуре 25°С.

Разливают в колбы (см. 6.7) и стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (см. 6.1) при температуре 121°С. Раствор может быть мутным, но становится прозрачным после отстаивания.

Допускается использовать готовый фосфатный буфер того же состава и с теми же характеристиками.

5.9 Физиологический раствор

 

Состав раствора:

Хлорид натрия                                             8,5 г

Дистиллированная вода                                     1 000 

 

5.9.1 Приготовление раствора

Растворяют хлорид натрия в воде. Разливают в колбы и стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве при температуре 121°С.

5.10 Антисыворотка против Escherichia coli О157

Антисыворотку можно приобрести в специальных лабораториях или купить как выделенный соматический серотип О157.

Антисыворотка должна быть протестирована на неизвестные культуры с помощью положительных и отрицательных контролей.

6.1 Оборудование для стерилизации сухим жаром (печь) и/или стерилизации паром (автоклав)

6.2 Сушильный шкаф или термостат, поддерживающий температуру от 25°С до 50°С.

6.3 Термостат, поддерживающий температуру °С.

6.4 Инкубатор, поддерживающий температуру °С.

6.5 Водяная баня, поддерживающая температуру от 44°С до 47°С.

6.6 рН-метр, с разрешением 0,01 единицы рН при температуре 25°С, измеряющий с точностью 0,1.

6.7 Пробирки, колбы или склянки, соответствующей вместимости, для стерилизации и хранения питательных сред и инкубации жидких сред.

6.8 Мерные цилиндры, соответствующей вместимости, для приготовления разведений и готовых сред.

6.9 Градуированные пипетки с полным сливом, номинальным объемом и , градуированные на и , соответственно.

6.10 Петли и иглы, изготовленные из платино-иридиевого или никель-хромового сплава, или пипетки Пастера, или петли одноразового использования.

6.11 Механические пипетторы с воздухозамещением, стерильные, с рабочим диапазоном от 20 мкл до 200 мкл и делениями на , или аналогичные.

6.12 Магнитный сепаратор с магнитным штативом, для концентрации иммуномагнитных частиц, применяемый для пробирок (см. 6.13).

6.13 Пробирки полипропиленовые типа Эппендорф, с навинчивающимся колпачком, стерильные, одноразовые, центрифужные, вместимостью , подходящие для магнитного штатива.

Следует избегать образования аэрозолей при открытии.

6.14 Роторный смеситель (работающий в режиме авторотации, смеситель проб крови), вращающийся со скоростью от 15 до .

6.15 Чашки Петри, диаметром 90 мм и 140 мм.

6.16 Смеситель типа Вортекс.

9.1 Проба для анализа и исходная суспензия

Для приготовления исходной суспензии пробу для анализа (г или ) добавляют к модифицированному триптон-соевому бульону с новобиоцином (mTSB + N) объемом 9  или массой 9 г, предварительно нагретого в инкубаторе до температуры 41,5°С, чтобы проба для анализа была в соотношении с mTSB + N как 1/10 (масса к объему или объем к объему).

Рекомендуется использовать пакеты Стомахер с сетчатыми вставками для снижения интерференции пищевых частиц с набором реактивов для иммунозахвата (см. 9.3).

9.2 Обогащение

Инкубируют (см. 6.4) исходную суспензию, приготовленную в соответствии с 9.1, при температуре 41,5°С в течение 6 ч, а затем еще в течение 12 - 18 ч (фактическая продолжительность от 18 до 24 ч).

6-часовая инкубация, за которой следует иммуномагнитная сепарация и посев на чашки с селективным агаром, может дать положительный результат обнаружения презумптивных бактерий, который может стать отрицательным после дальнейшей 18-часовой инкубации.

9.3 Иммуномагнитная сепарация

9.3.1 Общие требования

Иммуномагнитную сепарацию следует проводить спустя 6 ч после инкубации и еще раз, если необходимо, после 12 - 18 ч инкубации.

Для иммунозахвата необходимо следовать инструкциям изготовителя в отношении методики и метода применения набора реактивов и оборудования.

9.3.2 Иммунозахват

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! - Используют только асептические методы, чтобы избежать любого внешнего загрязнения и образования аэрозолей. Выполняют эту процедуру в защищенной от загрязнений камере, если имеется. Работают в перчатках.

Используя магнитный сепаратор (см. 6.12) и иммуномагнитные частицы, связанные с антителами к Е. coli О157, выполняют следующую процедуру захвата/сепарации.

Смешивают обогатительную культуру (см. 9.2) и оставляют для осаждения всех крупных пищевых частиц. В полипропиленовую пробирку типа Эппендорф (см. 6.13) добавляют 20 мкл подготовленных иммуномагнитных частиц (5.7) при комнатной температуре. Отделяют верхнего слоя жидкости от обогатительной культуры, стараясь, по возможности, избегать попадания любых пищевых частиц или жировых включений, и переносят в полипропиленовую пробирку типа Эппендорф.

Перемешивают суспензию в роторном смесителе (см. 6.14) со скоростью вращения приблизительно от 12 до в течение 10 мин.

9.3.3 Сепарация

Устанавливают каждую полипропиленовую пробирку типа Эппендорф (см. 9.3.2) в магнитный штатив (см. 6.12) и дают магнитным частицам скопиться около магнита, слегка покачивая штатив на 180°. Осторожно открывают колпачок, стараясь не задеть частицы на стенке пробирки. Используя каждый раз новую стерильную пипетку Пастера (см. 6.10) для каждой пробы, с пробиркой в магнитном штативе, удаляют жидкость, медленно отсасывая ее со дна пробирки. Добавляют стерильного промывочного буфера (см. 5.8) и закрывают колпачком. Удаляют магнит из штатива. Перемешивают содержимое пробирок, осторожно поворачивая штатив на 180°, и затем возвращают магнит на штатив.

Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать перекрестного загрязнения при добавлении свежего буфера.

Продолжают процедуру, как описано выше, чтобы удалить промывочную жидкость новой пипеткой Пастера для каждой пробы. Повторяют процедуру промывки несколько раз.

Вынимают из магнитного сепаратора, добавляют стерильного промывочного буфера в пробирку и ресуспендируют магнитные частицы.

 

Примечание - Эту процедуру трудно применять к жирным продуктам или свежим сырам.

 

9.4 Посев на чашки с селективным агаром и идентификация колоний Е. coli О157

9.4.1 Посев на чашки

С помощью механического пипеттора (см. 6.11) переносят промытых и ресуспендированных магнитных частиц на предварительно высушенную чашку с агаровой средой Мак-Конки с сорбитом и суплементом СТ (цефиксим и теллурит калия) (см. 5.2), а также на предварительно высушенную чашку со второй селективной средой для выделения микроорганизмов (см. 5.3).

Делают посев частиц штрихом, используя стерильную петлю (см. 6.10), для получения множества хорошо изолированных колоний на поверхности агара.

Инкубируют посевы в термостате CT-SMAC при температуре 37°С в течение 18 - 24 ч, а также инкубируют вторую селективную среду для выделения при тех же температуре и времени.

В зависимости от типа пищевой пробы и ее микробиологической обсемененности инкубация в течение 20 - 24 ч может привести к бурному росту других бактерий на чашках с селективным агаром, что затруднит обнаружение колоний Е. coli О157.

Посев на селективные среды препаратов с большими разведениями для иммуномагнитной сепарации или объемами меньше на чашку повышает возможность получения изолированных колоний Е. coli О157.

9.4.2 Идентификация типичных колоний Е. coli О157

На агаре Мак-Конки типичные колонии бывают прозрачными и почти бесцветными с бледными желтовато-коричневыми проявлениями и диаметром приблизительно 1 мм.

Исследуют вторую селективную агаровую среду для выделения типичных колоний Е. coli О157, следуя инструкциям изготовителя.

9.5 Подтверждение идентификации

Можно использовать имеющиеся в продаже миниатюрные биохимические наборы для идентификации сорбит-отрицательных и индол-положительных бактерий Е. coli и наборов для идентификации Е. coli О157 методом латекс-агглютинации при условии, что для подтверждения проводятся соответствующие тесты с известными положительными и отрицательными штаммами.

9.5.1 Отбор колоний

С каждой чашки отбирают пять типичных колоний, как указано в 9.4. Если чашка с агаром содержит менее 5 типичных колоний, необходимо исследовать все колонии.

Засевают штрихом каждую выбранную колонию на чашку с питательным агаром (см. 5.4), чтобы дать возможность разрастись хорошо выделенным колониям.

Инкубируют (см. 6.3) чашки в течение 18 - 24 ч при температуре 37°С.

Для тестов используют только чистые культуры из чашки с питательным агаром, как описано в 9.5.2 и 9.5.3.

9.5.2 Биохимическая идентификация (образование индола)

Инокулируют одну колонию чистой культуры с питательного агара (см. 9.5.1) в пробирку с трип-тон/триптофановой средой (см. 5.5).

Инкубируют (см. 6.3) при температуре 37°С в течение 24 ч.

Добавляют 1  реактива Ковача (см. 5.6) и оставляют при комнатной температуре в течение 10 мин.

Появление красного цвета указывает на положительную реакцию. Желто-коричневый цвет указывает на отрицательную реакцию.

9.5.3 Серологическая идентификация

9.5.3.1 Общее требование

Исследуют только индол-положительные колонии на серологическую реакцию с антисывороткой к Е. coli О157.

9.5.3.2 Выделение автоагглютинирующих штаммов

Одну каплю солевого раствора (см. 5.9) капают на чистое предметное стекло.

Используя петлю (см. 6.10), подмешивают к этой капле одну колонию из чашки с питательным агаром (см. 9.5.1), чтобы получилась однородная и мутная суспензия.

Осторожно встряхивают стекло в течение 30 - 60 с. Наблюдают за результатом на темном фоне и, в случае необходимости, с помощью увеличительных линз.

При обнаружении в суспензии видимых скоплений бактерий считается, что штамм способен автоагглютинировать и далее не должен тестироваться, так как реакция со специфической антисывороткой невозможна.

9.5.3.3 Реакция с антисывороткой против Е. coli О157

Используя чистую культуру из питательного агара (см. 9.5.1), суспендируют ее в свежей капле солевого раствора, как описано в 9.5.3.2 и добавляют маленькую каплю антисыворотки против Е. coli О157 (см. 5.10).

Реакция является положительной, если агглютинация проявляется в течение 1 мин.

9.5.3.4 Положительная идентификация

Считать положительными штаммы, которые дают положительную реакцию на индол и реагируют либо с антисывороткой против О157, либо с антисыворотками против О157 плюс Н7.

10.1 Испытуемые штаммы

Для обеспечения качества испытаний штаммы Е. coli О157, которые не имеют коэффициентов вирулентности, характерной для патогенности, можно получить из национальных или международных коллекций культур. Их рекомендуется применять для испытания сред и антисывороток.

10.2 Культуральный метод

Для проверки возможности лаборатории и среды обнаруживать низкое содержание бактерий Escherichia coli О157 в пищевых пробах, подлежащих анализу с помощью метода, описанного в настоящем стандарте, контрольные пробы инокулята низкой концентрации непатогенных Е. coli О157 и высокой концентрации другого штамма Е. coli должны исследоваться параллельно с пробой для анализа.