Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 20837-2013 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Требования к подготовке образцов для качественного обнаружения" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. N 2133-ст)

Microbiology of food and animal feeding stuffs. Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens. Requirements for sample preparation for qualitative detection

Дата введения - 1 июля 2015 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Введение

Обнаружение патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) обычно выполняется путем указанной ниже последовательности этапов (или одновременного их выполнения):

- гомогенизация образца;

- (культуральное) обогащение исследуемого патогенного микроорганизма и обработка образца;

- выделение нуклеиновых кислот (по выбору);

- амплификация нуклеиновых кислот исследуемого патогенного микроорганизма;

- обнаружение амплифицированной ДНК исследуемого патогенного микроорганизма.

Ссылки на стандарты, относящиеся к культуральному обогащению бактерий из пищевых матриц, приведены в приложении А. Пример специального метода подготовки образца описан в приложении В.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Использование настоящего стандарта может включать применение опасных материалов, операций и оборудования. Данный стандарт не предназначен для рассмотрения всех проблем безопасности, связанных с его использованием. Пользователь настоящего стандарта несет ответственность за применение безопасных и не угрожающих здоровью методов и определение необходимости регламентных ограничений перед использованием стандарта.

1 Область применения

В настоящем стандарте приводятся критерии и примеры подготовки образцов для получения ПЦР-совместимых образцов или нуклеиновых кислот, качество и количество которых достаточны для использования в ПЦР.

В стандарте описаны общие принципы процесса подготовки образцов. Ссылки на стандарты, в которых описано обогащение микроорганизмами, приведены в приложении А, а подробное изложение метода выделения ДНК приведено в приложении В.

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, а также в случае необходимости при некоторой адаптации применим к кормам и к пробам окружающей среды.

2 Нормативные ссылки

Следующий ссылочный стандарт является обязательным для применения настоящего стандарта. Для недатированных ссылок применяется только цитируемое издание. Для недатированных ссылок применяется самое последнее издание ссылочного стандарта (включая любые изменения).

ISO 22174:2005 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - General requirements and definitions (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Общие требования и определения)

3 Принцип

3.1 Общие положения

Цель описанных методов подготовки образцов состоит в получении нуклеиновых кислот из пробы обогащенных исследуемых патогенных микроорганизмов, качество и количество которых достаточны для использования в ПЦР

Примечание - Качество нуклеиновых кислот зависит, например, от химической чистоты, средней длины молекул и структурной целостности выделенных молекул нуклеиновых кислот.

Обогащение и обработка образцов должны обеспечивать обнаружение малого количества целевых микроорганизмов и уменьшение количества веществ, ингибирующих ПЦР. Физические, химические или биохимические процедуры, обладающие меньшим разрушающим эффектом на целостность нуклеиновых кислот, должны обеспечивать получение совместимых с ПЦР-амплификацией образца или раствора нуклеиновых кислот.

3.2 Обогащение и обработка образца

Обработка образцов может начинаться непосредственно с образца или после его обогащения, согласно описанию в перечисленных в приложении А стандартах или в других стандартах, относящихся к данному вопросу.

3.3 Выделение нуклеиновых кислот

Основные принципы выделения нуклеиновых кислот состоят в высвобождении ДНК, присутствующей в бактериях, и одновременном или последующем удалении ингибиторов ПЦР

Пример метода выделения ДНК приводится в Приложении В. Этот метод является только примером, и должен быть в дальнейшем модифицирован пользователями для соответствия задачам, стоящим перед каждой лабораторией.

4 Общие требования к лаборатории

Обработку образцов следует выполнять в раздельных рабочих зонах согласно требованиям стандарта ISO 22174, 6.3.

5 Реактивы, аппаратура и оборудование

См. приложения А и В настоящего стандарта, а также ISO 22174.

6 Методика

6.1 Обогащение и обработка образцов для выявления бактерий

Обогащение образцов пищевых продуктов следует проводить согласно соответствующим стандартам или другим нормативным документам. Для обогащения можно использовать другие, более совместимые с ПЦР, культуральные среды, если было установлено путем валидации, что они имеют эффективность, сравнимую со средами, описанными в соответствующих стандартах.

Некоторые среды культурального обогащения, рекомендуемые стандартами, содержат меньшее количество ингибирующих ПЦР веществ, чем другие, что должно тщательно учитываться при выборе метода подготовки образцов.

Для некоторых продуктов необходимо принять специальные меры по подавлению роста конкурирующих сопутствующих фоновых микроорганизмов (например путем добавления селективных добавок или антибиотиков).

Могут быть опробованы менее разрушающие методы, например простое разведение, центрифугирование, гидролиз белка, фильтрация, центрифугирование в градиенте плотности, иммуномагнитная сепарация и т.д. В случае отсутствия ответа в ПЦР возможно пробное использование более жестких методов, например кипячения, применения хелатирующих добавок или более жестких химикатов, например, хлороформа и этилового спирта, или наборов реагентов с аналогичными функциями. Для снижения содержания жиров в веществах с высоким содержанием жиров могут быть использованы простые физические методы. Для уменьшения эффектов ингибирования, обусловленного высоким содержанием кальция в молочных продуктах, можно использовать хелатирующие агенты.

6.2 Выделение нуклеиновых кислот

6.2.1 Выделение ДНК

6.2.1.1 Высвобождение и очистка ДНК

Допускается комбинация нескольких принципов выделения ДНК. Например, могут быть выполнены следующие этапы:

а) разрушение белков в экстракте клеток с помощью протеаз (например, протеиназы К) и РНК с помощью рибонуклеаз;

b) преципитация образовавшихся пептидов с органическими растворителями (например, со смесью фенола и хлороформа), что позволяет оставить ДНК в водной фазе;

с) очистка раствора ДНК и дальнейшее концентрирование путем преципитации этиловым спиртом в присутствии одновалентных катионов;

d) сбор преципитата ДНК с помощью центрифугирования;

e) промывка ДНК этиловым спиртом и ресуспендирование в буфере (например, буфер трис-(гидроксиметил)аминометан/ЭДТА(Трис-ЭДТА буфер) или Трис-буфер).

Для увеличения выхода ДНК на этапах преципитации можно использовать соосадители ДНК, например гликоген, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или транспортную РНК (тРНК). Допускается использование только соосадителей без нуклеазной активности, ПЦР-ингибирующих/конкурирующих эффектов и без гомологии последовательностей с потенциальными целевыми ПЦР-последовательностями анализируемых микроорганизмов.

Примечание - Использование лиофильной сушки для высушивания осадка ДНК, полученного после этапа преципитации, может привести к перекрестной контаминации.

ДНК может быть высвобождена путем температурного разрушения клеток (например при кипячении в течение 10 мин). После кипячения охлажденный образец центрифугируют и полученный супернатант используют в ПЦР. Перед кипячением может быть применена ферментативная обработка для улучшения разрушения клеток (например, лизоцим, мутанолизин для грамположительных бактерий), после которой образец инкубируется с протеазами. Для микроорганизмов с исключительно прочной клеточной стенкой (например Mycobacterium spp.) возможно потребуется использование других методов, например сильной встряски с шариками.

Для выделения нуклеиновых кислот могут быть использованы и другие методы, включая имеющиеся в продаже наборы реагентов, при условии, что получаемые результаты сравнимы.

6.2.1.2 Качество и количество ДНК

Качество и выход ДНК, выделенной данным методом из данной матрицы, должны быть как повторяемыми, так и воспроизводимыми применительно к амплификации в ПЦР, при условии достаточного содержания ДНК в матрице. В частности, применяемый метод должен обеспечивать получение фрагментов ДНК, средний размер которых больше или равен размеру исследуемых ПЦР-продуктов.

Концентрацию и чистоту выделенной ДНК можно оценить флуорометрическими методами или с помощью электрофореза в геле. Количественная оценка очищенной ДНК может быть выполнена спектрофотометрическими методами.

Электрофорез в агарозном геле с окраской бромистым этидием и флуоресценцией в ультрафиолетовом (УФ) свете является быстрым способом оценки качества и количества ДНК (см. [1]).

Для некоторых методов подготовки образцов (например кипячение) необходимо использовать раствор нуклеиновых кислот сразу же после приготовления, так как получаемые нуклеиновые кислоты нестабильны.

В целом следует избегать повторных замораживания и размораживания растворов нуклеиновой кислоты.

Для хранения нуклеиновых кислот с низким количеством копий используют подходящую пластиковую посуду.

Примечание - Некоторые материалы, используемые для изготовления пробирок, способны связывать нуклеиновые кислоты.

6.3 Оценка результатов

Оценка результатов испытания - по ISO 22174, 9.3 и таблица 1.

Библиография

[1] Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987 (ISBN 0-87969-309-6)

[2] Scheu, P., Gasch, A., Zschaler, R., Berghof, K. and Wilborn, F. Evaluation of a PCR-ELISA for food testing: Detection of selected Salmonella serovars in confectionery products. Food Biotechnology, 12 (1&2), 1998, pp. 1 - 12

[3] DIN 10135:1999 Method for detection of salmonella with polymerase chain reaction (PCR) [Метод обнаружения Salmonella с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)]

[4] P. Gallien, Н. Richter, Chr. Much, I. Frbe, K.-W. Perlberg, and D. Protz, Optimierung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis und zur Charakterisierung von Shigatoxin-produzierenden Escherichia coli (STEC). Lebensmitteln. Berl. Mьnch. Tierдrztl. Wschr. 110, 1997, p. 422

[5] Detection, isolation and characterization of verotoxin-forming Escherichia coli (VTEC) in minced meat by means of PCR and DNA hybridization. No. L 07.18-1 in: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal health Office, loose leaf edition, Beuth Verlag GmbH

[6] ISO 6579 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of Salmonella spp.

(Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения сальмонеллы Salmonella spp)

[7] ISO 6888-3 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) - Part 3: Detection and MPN technique for low numbers

(Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета коагулаза-положительных стафилококков (Staphylococcus aureus и другие виды). Часть 3. Обнаружение и метод MPN для низких количеств)

[8] ISO 7932 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus - Colony-count technique at 30 degrees С

(Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета предполагаемых бактерий Bacillus cereus. Техника подсчета колоний при температуре 30 град. С)

[9] ISO 7937 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens - Colony-count technigue

(Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета Clostridium perfringens. Метод подсчета колоний)

[10] ISO 10272-1 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. - Part 1: Detection method

(Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 1. Метод обнаружения)

[11] ISO 10273 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of presumptivepathogenic Yersinia enterocolitica

(Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения презумптивно патогенной бактерии Yersinia enterocolitica)

[12] ISO 11290-1 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for detection and enumeration of Listeria monocytogenes - Part 1: Detection method

(Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета микроорганизмов Listeria monocytogenes. Часть 1. Метод обнаружения)

[13] ISO 16654 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for the detection of Escherichia coli О157

(Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения палочки Escherichia coli О157)

[14] ISO/TS 20836 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Performance testing for thermal cyclers

(Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция для обнаружения патогенных пищевых микроорганизмов. Определение рабочих характеристик амплификаторов)

[15] ISO 20838 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Requirements for amplification and detection for qualitative methods

(Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция для обнаружения патогенных пищевых микроорганизмов. Требования к амплификации и обнаружению качественного анализа)

[16] ISO 21567 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of Shigella spp.

(Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения дизентерийной палочки Shigella spp.)