Приложение В (справочное). Метод выделения ДНК из грамотрицательных бактерий

Приложение В
(справочное)

Метод выделения ДНК из грамотрицательных бактерий

B.1 Применение

Данный метод применим для выделения ДНК из грамотрицательных бактерий путем лизиса или кипячения.

B.2 Состояние метода

Данный метод хорошо известен и широко применялся [1]. Более того, данный метод прошел валидацию в совместном исследовании по обнаружению штаммов Salmonella в образцах сухого молока, прошедших культуральное обогащение на бульоне [2], [3], и совместном исследовании по обнаружению образующих веротоксин-образующей Escherichia coli (VTEC) в рубленом мясе [4], [5].

B.3 Принцип

В данном методе применяется несколько этапов центрифугирования для отбора бактерий. Бактериальные клетки промываются, лизируются с помощью инкубации при температуре от 95°С до 100°С, а затем центрифугируются для преципитации остатков клеточных стенок, полисахаридов и белков, что позволяет в итоге получить экстракт нуклеиновых кислот.

Стартовым материалом обычно является питательный бульон для культурального обогащения.

B.4 Реактивы

В.4.1 Буфер для промывания, физиологический раствор [] или фосфатно-солевой буферный раствор, ФСБ (, , , ; ).

B.5 Аппаратура и оборудование

Обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.

B.5.1 Дозаторы с микролитровыми рабочими объемами

B.5.2 Настольная центрифуга, для микролитровых реакционных пробирок, с вместимостью от 1,5 до 2 , и регулируемым ускорением до 10000 g.

B.5.3 Водяная баня или твердотельный термостат, для микролитровых реакционных пробирок, способных выдерживать нагрев до 100°С.

B.5.4 Мешалка, например вихревой смеситель.

B.6 Методика

B.6.1 Общие положения

После обогащения выделяют бактериальную ДНК согласно описанию в В.6.2.

B.6.2 Процедура выделения

Переносят 1 культуральной среды после обогащения в реакционную пробирку. Центрифугируют суспензию клеток в течение десяти минут при ускорении 10000 g (В.5.2). Удаляют супернатант.

Ресуспендируют осадок в 1 буфера для промывки (В.4.1) или воды. Центрифугируют суспензию клеток в течение десяти минут при ускорении 10000 g (В.5.2). Удаляют супернатант.

Ресуспендируют осадок в объеме воды от 200 до 250 мкл. Проводят термическое разрушение клеток путем нагрева до температуры 95°С в течение 20 мин (для Salmonella) или до 100°С в течение 15 мин (для шигатоксин-продуцирующей Escherichia coli (STEC)).

Переносят реакционные пробирки в ледяную баню для быстрого охлаждения.

Тщательно перемешивают лизат (например с помощью встряхивателя (В.5.4)]). Центрифугируют при температуре от 20°С до 25°С в течение 3 мин при ускорении 10000g (Salmonella) или 10 с при ускорении 10000g (STEC).

Переносят супернатант в чистую микролитровую реакционную пробирку.

Если для экстрактов нуклеиновых кислот наблюдается по соответствующим контролям эффект ингибирования, то они должны быть очищены перед использованием в ПЦР.

По выбору вместо методов термического разрушения клеток и необходимой очистки можно использовать имеющиеся в продаже системы выделения и очистки ДНК при условии соблюдения инструкций производителя.

B.7 Валидация

Данный метод широко применяется и является основным методом в молекулярной биологии. Кроме того, данный метод прошел валидацию в совместных межлабораторных испытаниях.

В 1998 году межлабораторное испытание было организовано рабочей группой "ПЦР для обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах" института DIN (Немецким институтом стандартизации). В этом испытании приняли участие двенадцать лабораторий, каждая из которых получила по 20 образцов. Материал образца представлял собой сухое молоко с низким содержанием жира. Часть этого сухого молока была искусственно контаминирована Salmonella (1000 КОЕ на 25 г). Подготовка образцов перед выделением ДНК в лаборатории выполнялась следующим образом: 25 г образца добавлялось к 250 неселективной среды для обогащения (бриллиантовый зеленый 0,002%) и инкубировалось при температуре 37°С в течение 16 ч. Выделение нуклеиновых кислот начиналось из 1 такого культурального бульона. Экстракты анализировались в ПЦР. Всего было проанализировано 240 образцов; результаты для 1-го образца были признаны ложноотрицательными, для 2-х - ложноположительными; в 14 образцах наблюдалось ингибирование ПЦР.

В 2001 году данный метод прошел валидацию в совместном исследовании, организованном рабочей группой "ПЦР для обнаружения микроорганизмов в пищевых продуктах" в Немецком Федеральном Институте защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgW) согласно статье 35 Немецкого федерального закона о пищевых продуктах. Участвовали одиннадцать лабораторий. Каждая лаборатория получила десять образцов рубленого мяса, приготовленного из двухосновных матриц. В каждом случае пять образцов были равномерно контаминированы известными штаммами STEC/EHEC в дозах от 54 КОЕ/25 г до 308 КОЕ/25 г рубленого мяса. Содержание сопутствующей микрофлоры составляло от 105 КОЕ/г до 106 КОЕ/г, однако иногда было выше этих значений (в результате транспортировки). Образцы 1 - 9 (подготовленные из основного материала) дополнительно имели естественное загрязнение 4 штаммами STEC. Для всех лабораторий было показано 100 %-ное обнаружение в ПЦР.