Приложение В (справочное). Метод выделения ДНК из грамотрицательных бактерий

Приложение В
(справочное)

Метод выделения ДНК из грамотрицательных бактерий

B.1 Применение

Данный метод применим для выделения ДНК из грамотрицательных бактерий путем лизиса или кипячения.

B.2 Состояние метода

Данный метод хорошо известен и широко применялся [1]. Более того, данный метод прошел валидацию в совместном исследовании по обнаружению штаммов Salmonella в образцах сухого молока, прошедших культуральное обогащение на бульоне [2], [3], и совместном исследовании по обнаружению образующих веротоксин-образующей Escherichia coli (VTEC) в рубленом мясе [4], [5].

B.3 Принцип

В данном методе применяется несколько этапов центрифугирования для отбора бактерий. Бактериальные клетки промываются, лизируются с помощью инкубации при температуре от 95°С до 100°С, а затем центрифугируются для преципитации остатков клеточных стенок, полисахаридов и белков, что позволяет в итоге получить экстракт нуклеиновых кислот.

Стартовым материалом обычно является питательный бульон для культурального обогащения.

B.4 Реактивы

В.4.1 Буфер для промывания, физиологический раствор [] или фосфатно-солевой буферный раствор, ФСБ (, , , ; ).

B.5 Аппаратура и оборудование

Обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.

B.5.1 Дозаторы с микролитровыми рабочими объемами

B.5.2 Настольная центрифуга, для микролитровых реакционных пробирок, с вместимостью от 1,5 до 2 , и регулируемым ускорением до 10000 g.

B.5.3 Водяная баня или твердотельный термостат, для микролитровых реакционных пробирок, способных выдерживать нагрев до 100°С.

B.5.4 Мешалка, например вихревой смеситель.

B.6 Методика

B.6.1 Общие положения

После обогащения выделяют бактериальную ДНК согласно описанию в В.6.2.

B.6.2 Процедура выделения

Переносят 1 культуральной среды после обогащения в реакционную пробирку. Центрифугируют суспензию клеток в течение десяти минут при ускорении 10000 g (В.5.2). Удаляют супернатант.

Ресуспендируют осадок в 1 буфера для промывки (В.4.1) или воды. Центрифугируют суспензию клеток в течение десяти минут при ускорении 10000 g (В.5.2). Удаляют супернатант.

Ресуспендируют осадок в объеме воды от 200 до 250 мкл. Проводят термическое разрушение клеток путем нагрева до температуры 95°С в течение 20 мин (для Salmonella) или до 100°С в течение 15 мин (для шигатоксин-продуцирующей Escherichia coli (STEC)).

Переносят реакционные пробирки в ледяную баню для быстрого охлаждения.

Тщательно перемешивают лизат (например с помощью встряхивателя (В.5.4)]). Центрифугируют при температуре от 20°С до 25°С в течение 3 мин при ускорении 10000g (Salmonella) или 10 с при ускорении 10000g (STEC).

Переносят супернатант в чистую микролитровую реакционную пробирку.

Если для экстрактов нуклеиновых кислот наблюдается по соответствующим контролям эффект ингибирования, то они должны быть очищены перед использованием в ПЦР.

По выбору вместо методов термического разрушения клеток и необходимой очистки можно использовать имеющиеся в продаже системы выделения и очистки ДНК при условии соблюдения инструкций производителя.

B.7 Валидация

Данный метод широко применяется и является основным методом в молекулярной биологии. Кроме того, данный метод прошел валидацию в совместных межлабораторных испытаниях.

В 1998 году межлабораторное испытание было организовано рабочей группой "ПЦР для обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах" института DIN (Немецким институтом стандартизации). В этом испытании приняли участие двенадцать лабораторий, каждая из которых получила по 20 образцов. Материал образца представлял собой сухое молоко