Межгосударственный стандарт ГОСТ 32835-2014 "Продукция соковая. Определение микотоксинов методом тандемной высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС)" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 августа 2014 г. N 896-ст)

Juice products. Determination of mycotoxins by tandem high performance liquid mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

Дата введения - 1 января 2016 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Разработан Федеральным государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования "Московский государственный университет пищевых производств" (ФГБОУ ВПО "МГУПП")

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 июня 2014 г. N 45-2014)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения Беларусь Киргизия Россия	AM BY KG RU	Минэкономики Республики Армения Госстандарт Республики Беларусь Кыргызстандарт Росстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 августа 2014 г. N 896-ст ГОСТ 32835-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2016 г.

5 Настоящий стандарт разработан с учетом положений следующих международных документов:

- CODEX STAN 247-2005 Codex General Standard For Fruit Juices And Nectars of the Codex Alimentarius Commission (Единый международный стандарт Комиссии Кодекс Алиментариус на фруктовые соки и нектары);

- Regulation of the Commission of the European Union of 23.02.2006 r. No. 406/2006/EC Laying down the sampling methods and methods of analysis for the official control of the levels of mycotoxins in foodstuffs (Регламент Комиссии Европейского союза от 23.02.2006 г. N 406/2006/ЕС "О методах отбора проб и методах анализа для официального контроля уровней микотоксинов в пищевых продуктах");

- AIJN Code of Practice for Evaluation of Quality and Authenticity of Fruit and Vegetable Juices of the European Fruit Juice Association (Свод правил для оценки качества и подлинности фруктовых и овощных соков Европейской ассоциации фруктовых соков).

6 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на соки и другую соковую продукцию из фруктов и овощей, за исключением клеток цитрусовых фруктов, и устанавливает метод определения микотоксинов - патулина и охратоксина А - с применением тандемной высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии в диапазоне измерений массовой концентрации патулина от 0,1 до 100,0  и охратоксина А от 0,1 до 20,0 .

Примечание - Настоящий стандарт рекомендуется применять в цепях апробации и накопления дополнительной информации в части его применения.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.010-76 Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ ISO 3696-2013 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля

ГОСТ ИСО 5725-1-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ ИСО 5725-2-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ 5789-78 Реактивы. Толуол. Технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные. Типы. Основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб

ГОСТ 26671-85 Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов

ГОСТ 29030-91 Продукты переработки плодов и овощей. Пикнометрический метод определения относительной плотности и содержания растворимых сухих веществ

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835/1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 32689.1-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для газохроматографического определения остатков пестицидов Часть 1. Общие положения

ГОСТ 32689.2-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для газохроматографического определения остатков пестицидов Часть 2. Методы экстракции и очистки

ГОСТ 32689.3-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для газохроматографического определения остатков пестицидов Часть 3. Определение и подтверждение результатов

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Сокращения

ВЭЖХ-МС/МС - тандемная высокоэффективная жидкостная хроматомасс-спектрометрия;

ОТА - охратоксин А;

ПАТ - патулин;

ESI - ионизация распылением в электрическом поле (Electrospray Ionization);

IARC - Международное агентство по исследованию онкологических заболеваний;

LOD - предел детектирования;

LOQ - предел количественного определения;

SRM - идентификация компонентов в режиме контроля селективных реакций (Selected Reaction Monitoring).

4 Сущность метода

Сущность метода заключается в предварительной экстракции микотоксинов ПАТ и ОТА ацетонитрилом в присутствии безводного сульфата магния, концентрировании, перерастворении в ацетонитриле и количественном определении массовой концентрации микотоксинов с применением ВЭЖХ-МС/МС с ионизацией распылением в электрическом поле и идентификацией компонентов в режиме контроля селективных реакций.

5 Средства измерений, вспомогательное оборудование, стандартные образцы, реактивы и посуда

Система аналитическая ВЭЖХ-МС/МС* с трехквадрупольным масс-детектором для измерения в диапазоне масс от 10 до 3000 атомных единиц массы (а.е.м.), с точностью измерения массы не ниже 0,1 а.е.м, ионизацией распылением в электрическом поле, возможностями работы в режиме контроля выбранных реакций и сканирования дочерних и родительских ионов, минимальным отношением сигнал/шум 1000:1. Аналитическая система должна включать модуль ВЭЖХ, состоящий из бинарного насоса со смесителем, термостат хроматографической колонки, обеспечивающий температуру нагрева до 50°С, и хроматографическую колонку с обращенно-фазовым сорбентом зернением 5 мкм длиной 150 мм и внутренним диаметром 3 мм. Применяемая система должна обеспечивать обнаружение микотоксинов в интервале от 0,1 до 100,0 .

Спектрофотометр диапазоном измерения, позволяющим проводить испытания при длине волны от 250 до 400 нм, допускаемой абсолютной погрешностью измерений оптической плотности не более 0,1%.

Весы по ГОСТ OIML R 76-1, обеспечивающие точность взвешивания с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более 0,01 мг.

Баня ультразвуковая.

Центрифуга со скоростью вращения ротора 4000 - 5000 об/мин для пробирок вместимостью 50 .

Центрифуга со скоростью вращения ротора 10000 - 12000 об/мин для пробирок типа Эппендорф вместимостью 1,5 - 2,0 .

Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание температуры до 200°С.

Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

Встряхиватель для перемешивания.

Устройства дозирующие жидких проб постоянной или переменной вместимостью 20 - 1000  с относительной погрешностью дозирования фактического объема не более 2,5%.

Микрофильтр - насадка на шприц (регенирированная# целлюлоза, диаметр 13 мм, размер пор 0,2 - 0,4 мкм).

Кюветы кварцевые рабочей длиной 1 см.

Микотоксины ПАТ и ОТА для использования в качестве образцов сравнения с содержанием основного вещества не менее 98%.

Кислота ледяная уксусная по ГОСТ 61, ч.д.а.

Ацетонитрил для градиентной ВЭЖХ.

Метанол для градиентной ВЭЖХ.

Магний сернокислый безводный, х.ч.

Кальций хлористый безводный, гранулированный, х.ч.

Хлороформ по ГОСТ 20015, х.ч.

Толуол по ГОСТ 5789, х.ч.

Спирт этиловый абсолютированный.

Вода для лабораторного анализа степени чистоты 1 по ГОСТ ISO 3696.

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1, 2, 5, 10  2-го класса точности по ГОСТ 29227.

Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 5, 10, 25, 50, 100 и 1000  исполнений 2 или 2а по ГОСТ 1770.

Колбы остродонные вместимостью 10, 25 .

Центрифужная пробирка типа Эппендорф вместимостью 1,5 - 2,0 .

Микропробирка вместимостью 100 - 400 .

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 250  любого исполнения по ГОСТ 1770.

Пробирка для центрифугирования с завинчивающейся крышкой вместимостью 50 

Чашка фарфоровая диаметром 125 - 150 мм.

Эксикатор лабораторный вместимостью 3 .

Воронки лабораторные по ГОСТ 25336.

Колбы плоскодонные вместимостью 50, 100, 250  по ГОСТ 25336.

Стаканы химические вместимостью 10, 20, 50, 100 и 200  по ГОСТ 25336.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, посуды, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также стандартных образцов, реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

6 Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 26313. Подготовка и хранение проб - по ГОСТ 26671, ГОСТ 32689.1, ГОСТ 32689.2 и ГОСТ 32689.3.

7 Подготовка к проведению испытаний

7.1 Общие требования

Перед испытанием проводят предварительную подготовку лабораторной посуды, а также проверку качества реактивов и вспомогательных материалов согласно требованиям ГОСТ 32689.1, ГОСТ 32689.2 и ГОСТ 32689.3.

7.2 Приготовление вспомогательных растворов

7.2.1 Приготовление подвижной фазы А

В мерную колбу вместимостью 1000 с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной или фторопластовой пробкой помещают пипеткой 1  ледяной уксусной кислоты, 100  метанола и доводят до метки бидистиллированной водой. Смесь тщательно перемешивают.

Срок хранения подвижной фазы А при комнатной температуре - не более одного месяца.

7.2.2 Приготовление подвижной фазы Б

В мерную колбу вместимостью 1000  с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной или фторопластовой пробкой помещают пипеткой 1  ледяной уксусной кислоты и доводят до метки метанолом. Смесь тщательно перемешивают.

Срок хранения подвижной фазы Б при комнатной температуре - не более одного месяца.

Примечание - Недопустим контакт подвижной фазы с резиной и полимерными материалами [за исключением политетрафторэтилена (ПТФЭ)].

7.2.3 Приготовление растворителя 1

В подходящей емкости смешивают 99 объемных частей толуола и одну объемную часть ледяной уксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают.

Срок хранения растворителя 1 при комнатной температуре - не более 6 мес.

7.3 Подготовка сернокислого магния

Используемый при проведении экстракции в качестве сорбента сернокислый безводный магний даже в пределах срока годности необходимо высушивать для удаления поглощенной влаги воздуха. Сорбент прокаливают при температуре 180°С - 200°С в течение 6 - 10 ч и хранят в эксикаторе над безводным хлористым кальцием. Критерием годности реактива служит отсутствие дополнительного водного слоя при нагревании раствора, проведении стадии экстракции до температуры 30°С - 40°С и через 2 - 3 мин перемешивания реакционной массы.

7.4 Приготовление исходных растворов микотоксинов

7.4.1 Приготовление растворов ПАТ

7.4.1.1 Приготовление исходного раствора ПАТ массовой концентрации 200 

Берут 2,0 мг чистого кристаллического ПАТ, взвешенного с точностью 0,01 мг, растворяют в мерной колбе вместимостью 10  в небольшом количестве хлороформа и затем доводят объем раствора хлороформом до метки.

Срок хранения исходного раствор ПАТ при температуре 0°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более 1 мес.

7.4.1.2 Приготовление раствора ПАТ массовой концентрации 20 

Переносят 1  полученного исходного раствора ПАТ (см. 7.4.1.1) в мерную колбу вместимостью 10  и доводят объем раствора хлороформом до метки. Для определения точной массовой концентрации ПАТ в растворе отбирают 5,0 см полученного стандартного раствора ПАТ и переносят в емкость вместимостью около 15 , затем продуванием азотом удаляют хлороформ до получения сухого вещества. Сразу после получения сухого вещества вносят в емкость 5,0  абсолютного этанола. Полностью растворяют ПАТ. Полученный раствор ПАТ вносят в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см, затем регистрируют на спектрофотометре спектр раствора в интервале длин волн от 250 до 350 нм, используя в кювете сравнения в качестве контроля абсолютный этанол.

Массовую концентрацию ПАТ в растворе , , рассчитывают по формуле

,

(1)

где А - максимальное значение оптической плотности спектра (длина волны около 275 нм), ед. ОП;

MW - молекулярная масса ПАТ, равная 153,1 г/моль;

1000 - коэффициент пересчета;

CF - поправочный коэффициент, определенный согласно приложению A;

- молярный коэффициент оптического поглощения (экстинкции), равный 14600, .

7.4.1.3 Приготовление раствора ПАТ массовой концентрации 100 

5  исходного раствора ПАТ в хлороформе массовой концентрации 200  (см. 7.4.1.1) переносят в мерную колбу вместимостью 10 , концентрируют до сухого остатка при комнатной температуре под током азота и немедленно перерастворяют в ацетонитриле, доводя им объем в колбе до метки.

7.4.1.4 Срок хранения растворов ПАТ по 7.4.1.2 и 7.4.1.3 при температуре 0°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более 24 ч.

Перед использованием температуру растворов доводят до комнатной (не допускается удалять алюминиевую фольгу с мерной колбы до достижения содержимым комнатной температуры). По причине деструкции ПАТ не допускается хранить образцы сравнения в виде тонкой пленки сухого вещества, полученной после удаления растворителя [1] - [2].

7.4.2 Приготовление исходного раствора ОТА

7.4.2.1 Приготовление исходного раствора ОТА массовой концентрации 20 

2,0 мг чистого кристаллического ОТА, взвешенного с точностью 0,01 мг, растворяют в химическом стакане вместимостью 25  растворителем 1 (см. 7.2.3) и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100  и доводят растворителем 1 объем раствора до метки.

Для определения точной массовой концентрации ОТА в растворе полученный исходный раствор ОТА вносят в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см, затем регистрируют на спектрофотометре спектр раствора в интервалов длин волн от 300 до 370 нм, используя в кювете сравнения в качестве контроля растворитель 1.

Массовую концентрацию ОТА в исходном растворе , , рассчитывают по формуле

,

(2)

где А - максимальное значение оптической плотности спектра (длина волны около 333 нм), ед. ОП;

MW - молекулярная масса ОТА, равная 402,7 г/моль;

1000 - коэффициент пересчета;

CF - поправочный коэффициент, определенный согласно приложению А;

- молярный коэффициент оптического поглощения (экстинкции), равный 544, .

Срок хранения исходного раствора ОТА при температуре минус 18°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более четырех лет.

7.4.2.2 Приготовление раствора ОТА массовой концентрации 5 

Отбирают 2,5  исходного раствора ОТА (7.4.2.1), переносят в мерную колбу вместимостью 10 и доводят растворителем 1 (см. 7.2.3) до метки.

Срок хранения раствора ОТА при температуре 4°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более 24 ч.

Перед использованием температуру раствора доводят до комнатной (не допускается удалять алюминиевую фольгу с мерной колбы до достижения содержимым комнатной температуры) [1] - [4].

7.5 Приготовление градуировочных растворов ПАТ и ОТА

Градуировочные растворы ПАТ и ОТА готовят путем смешивания определенных объемов их исходных растворов (см. 7.4.1.1 и 7.4.2.1) с осветленным яблочным соком, который не содержит определяемые аналиты.

7.5.1 Приготовление градуировочных растворов ПАТ

7.5.1.1 Приготовление промежуточного раствора ПАТ массовой концентрации 1000 (раствор п-1)

1  раствора ПАТ (см. 7.4.1.3) или 1  стандартного образца состава ПАТ массовой концентрации ПАТ 100  переносят в мерную колбу вместимостью 100  и доводят ацетонитрилом объем раствора до метки.

7.5.1.2 Приготовление промежуточного раствора ПАТ массовой концентрации 10 (раствор п-2)

1  раствора п-1 (см. 7.5.1.1) переносят в мерную колбу вместимостью 100  и доводят ацетонитрилом объем раствора до метки.

7.5.1.3 Приготовление градуировочных растворов ПАТ

Отбирают в соответствии с таблицей 1 определенные объемы промежуточных растворов п-1 и п-2 (см. 7.5.1.1 и 7.5.1.2) и вносят в мерные колбы вместимостью 10 .

Таблица 1- Объемы растворов п-1 и п-2 для приготовления градуировочных растворов ПАТ

Наименование показателя	Градуировочные растворы
	1	2	3	4	5	6	7
Объем раствора п-2,	0,1	0,5	1,0	-	-	-
Объем раствора п-1,	-	-	-	0,1	0,2	0,5	1,0
Количество введенного ПАТ, нг	1	5	10	100	200	500	1000
Массовая концентрация ПАТ в растворе,	0,1	0,5	1,0	10	20	50	100

Доводят объем раствора в колбах до метки осветленным яблочным (или иным фильтрованным) соком.

Срок хранения градуировочного раствора при температуре 0°С - 4°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой - не более 24 ч.

7.5.2 Приготовление градуировочных растворов ОТА

7.5.2.1 Приготовление промежуточного раствора ОТА массовой концентрации 200 (раствор A-1)

1  раствора ОТА концентрацией 5  (см. 7.4.2.2) концентрируют до сухого остатка под током азота при комнатной температуре и немедленно переносят с помощью ацетонитрила в мерную колбу вместимостью 25 .

7.5.2.2 Приготовление промежуточного раствора ОТА массовой концентрации 10 (раствор A-2)

0,5  промежуточного раствора ОТА A-1 (см. 7.5.2.1) переносят в мерную колбу вместимостью 10  и доводят ацетонитрилом раствор до метки.

7.5.2.3 Приготовление градуировочных растворов ОТА

Отбирают в соответствии с таблицей 2 определенные объемы промежуточных растворов А-1 и А-2 (см. 7.5.2.1 и 7.5.2.2) и вносят в мерные колбы вместимостью 10 .

Таблица 2 - Объемы растворов А-1 и А-2 для приготовления градуировочных растворов ОТА

Наименование показателя	Градуировочные				растворы
	1	2	3	4	5	6	7
Объем раствора A-2,	0,1	0,2	0,5	1,0	-	-	-
Объем раствора A-1,	-	-	-	-	0,25	0,5	1,0
Количество введенного ОТА, нг	1	2	5	10	50	100	200
Массовая концентрация ОТА в растворе,	0,1	0,2	0,5	1,0	5,0	10	20

Доводят объем раствора в колбах до метки осветленным яблочным (или иным фильтрованным) соком.

Для проведения испытания в ВЭЖХ-МС/МС систему инжектируют по 10  приготовленных по 7.5.1.3 и 7.5.2.3 градуировочных растворов ПАТ и ОТА и проводят градуировку согласно 7.7 с учетом условий по 8.3.1.

Срок хранения градуировочного раствора при температуре 0°С - 4°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой - не более 24 ч.

7.6 Подготовка ВЭЖХ-МС/МС системы

Подготовку ВЭЖХ-МС/МС системы к измерениям проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и информацией, приведенной в приложении Б.

При настройке режимов работы масс-спектрометра рекомендуется использовать МС/МС параметры для определения микотоксинов, приведенные в приложении Б.

При этом должны быть соблюдены следующие условия:

- температура окружающего воздуха от 20°С до 25°С;

- атмосферное давление от 84 до 106 кПа;

- напряжение в электросети (22010) В;

- частота тока в электросети от 49 до 51 Гц;

- относительная влажность воздуха от 40% до 80%.

7.7 Градуировка ВЭЖХ-МС/МС системы

Градуировку системы растворами микотоксинов в соках по 7.5 проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации к ВЭЖХ-МС/МС системе и с учетом условий по 8.3.1 один раз в месяц. На хроматограммах определяют площади пиков ПАТ и ОТА и по площади пика устанавливают градуировочную зависимость в интервале концентраций согласно 7.5. Рассчитывают коэффициент корреляции и отклонения рассчитанных значений массовой концентрации микотоксинов в каждой градуировочной точке от фактического значения в соответствии с процедурой приготовления градуировочных растворов (см. 7.5). Градуировку считают приемлемой, если коэффициент корреляции составляет не менее 0,999 (для ПАТ) и 0,965 (для ОТА), а относительное отклонение рассчитанного значения массовой концентрации от фактического значения не более 10%.

Вместо относительного отклонения приемлемость градуировочной характеристики может быть оценена по относительному стандартному отклонению, которое не должно превышать 5%.

8 Проведение испытаний

8.1 Экстракция

10  () предварительно тщательно перемешанной соковой продукции вносят в пробирку для центрифугирования с завинчивающейся крышкой вместимостью 50 . В пробирку добавляют 20  ацетонитрила и 15 г безводного сернокислого магния. Смесь интенсивно перемешивают в течение трех пяти минут вручную или с помощью встряхивателя. После перемешивания полученный экстракт центрифугируют в течение 10 мин при 4000 - 5000 об/мин при комнатной температуре или 5 мин при наличии центрифуги с охлаждением при температуре 5°С. Измеряют общий объем экстракта после центрифугирования (V). 18 - 19  () экстракта, отобранного с помощью пипетки или дозирующего устройства, переносят в остродонную колбу вместимостью 25 . Раствор концентрируют до сухого остатка под током азота при комнатной температуре или на роторном испарителе при температуре не более 40°С и немедленно перерастворяют в 1  () ацетонитрила.

При наличии на стенках сосуда нерастворимой карамельной пленки проводят ее разрушение в ультразвуковой ванне в течение трех - пяти минут. Раствор переносят в пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 - 2,0  и центрифугируют при 10000 - 12000 об/мин в течение 3 - 5 мин. Отбирают верхний слой и фильтруют через микрофильтр с размерами пор 0,2 - 0,4 мкм непосредственно в микропробирку вместимостью 100 - 400 . Для проведения испытания в ВЭЖХ-МС/МС систему инжектируют 10  приготовленной пробы.

8.2 Приготовление пробы из концентрированных продуктов

Концентрированные соки (пюре) восстанавливают водой до минимального уровня растворимых сухих веществ, предусмотренного нормативными документами на конкретный вид соковой продукции. Концентрированную соковую продукцию, минимальные уровни растворимых сухих веществ для которой не предусмотрены, восстанавливают бидистиллированной водой до содержания растворимых сухих веществ 11,2%. Содержание растворимых сухих веществ контролируют по ГОСТ 29030.

Экстракцию восстановленных проб проводят по 8.1.

8.3 Проведение измерений

8.3.1 Общие условия

Инжекцию подготовленных по 8.1 проб и градуировочных растворов проводят в выбранной последовательности. Наиболее распространен способ, когда инжекция градуировочных растворов начинает и завершает серию инжекций проб.

ВЭЖХ-МС/МС система должна быть настроена на режим SRM с переходами, обеспечивающими селективное детектирование анализируемых микотоксинов. Времена удерживания и площади пиков определяют с помощью программного обеспечения для регистрации и расчета результатов анализа, прилагаемого к ВЭЖХ-МС/МС системе. Примеры ВЭЖХ/МС/МС систем, условия разделения и масс-спектрометрического детектирования приведены в приложении Б.

Испытания проб проводят в условиях повторяемости для двух параллельных определений в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1 (подраздел 3.14) и ГОСТ ИСО 5725-2.

8.3.2 Идентификация микотоксинов

Для идентификации микотоксинов времена удерживания, полученные на растворах проб, сравнивают со временем удерживания соответствующих микотоксинов из градуировочных растворов. Для подтверждения присутствия микотоксинов проводят сравнение соотношения интенсивностей сигналов из первого и второго m/z-перехода с соотношением интенсивностей сигналов микотоксинов из градуировочных растворов.

Соотношение пиков для одного микотоксина не должно отличаться более чем на 20% от ожидаемого соотношения интенсивностей сигналов.

9 Обработка и оформление результатов испытаний

9.1 Количественное определение

Количественное определение микотоксинов в инжектированном объеме приготовленного экстракта (см. 8.1) проводят путем сравнения площади (или высоты) пика микотоксина с соответствующей градуировочной характеристикой для данного микотоксина.

Массовую концентрацию микотоксинов в испытуемой продукции С, , рассчитывают по формуле

,

(3)

где 1000 - коэффициент перевода из кубических сантиметров в кубические дециметры;

М - концентрация микотоксина в объеме экстракта 10 , инжектированном в ВЭЖХ-МС/МС

систему, определенное по градуировочной зависимости, нг;

- объем ацетонитрила, в котором был перерастворен экстракт после концентрирования, ;

V - общий объем экстракта, из которого отбирается для концентрирования объем , ;

- объем пробы, введенный в хроматограф ( = 10 ), ;

- объем пробы соковой продукции, взятой для испытания, ;

- объем экстракта, отобранный для концентрирования, .

При расчете количества микотоксинов в концентрированной соковой продукции учитывают степень ее разбавления водой согласно 8.2.

За результат измерений принимают среднеарифметическое результатов трех параллельных определений, если выполняется условие приемлемости

,

(4)

где , - максимальное и минимальное значения из полученных трех результатов параллельных определений, ;

, , - результаты трех параллельных определений, ;

- значение критического диапазона, %.

Расхождение между тремя параллельными определениями (в процентах от среднего значения), выполненными в одной лаборатории, не должно превышать предела повторяемости (сходимости) . равного при вероятности Р = 0,95. При соблюдении этого условия за окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение трех параллельных определений, округленное до третьего десятичного знака.

Результаты измерений регистрируют в протоколе в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025.

9.2 В случае, если полученный результат показывает, что содержание микотоксина превышает верхнюю границу диапазона градуировочной зависимости, подготавливают новую пробу, увеличивая ее разбавление водой, и проводят повторное измерение.

10 Метрологические характеристики

Метрологические характеристики метода для ПАТ и OTA соответствуют условиям, приведенным в таблице 3.

Таблица 3 - Показатели прецизионности метода ВЭЖХ-МС/МС

Диапазон измерений,	Относительное стандартное отклонение повторяемости , %	Относительное стандартное отклонение воспроизводимости , %
при определении ПАТ (не более)
< 20	30	40
20 - 50	20	30
> 50	15	25
< 1	40	60
1 - 10	20	30
> 10	15	20

Пределы обнаружения ПАТ и ОТА в пробах соковой продукции составляют: LOD - 0,03 , LOQ - 0,1 .

11 Контроль качества результатов измерений

Контроль показателей качества результатов измерений в лаборатории предусматривает проведение контроля стабильности результатов измерений с использованием проверки стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта. Периодичность контроля стабильности результатов выполняемых измерений регламентируют во внутрилабораторных документах системы качества. При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

12 Требования безопасности

При проведении измерений следует соблюдать требования:

- электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и технической документации на ВЭЖХ-МС/МС систему;

- взрывобезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.010;

- пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004;

- безопасности при работе с вредными веществами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.

ВНИМАНИЕ! При работе с микотоксинами следует учитывать, что ПАТ и ОТА обладают сильными токсическими свойствами с выраженным нефротоксическим, иммунотоксическим, тератогенным и генотоксическим действием. Согласно классификации IARC ОТА относится к потенциально опасным для человека канцерогенным веществам (группа 2В). При работе с микотоксинами необходимо соблюдать повышенные меры безопасности. Персонал лаборатории должен носить защитную одежду, в том числе защитную маску, перчатки и очки. Все операции с микотоксинами проводят в вытяжном шкафу. После завершения работ использованную лабораторную посуду и отходы подвергают деактивации.

_____________________________

* Дополнительная информация о рекомендуемых ВЭЖХ-МС/МС системах приведена в приложении А.

_____________________________

* Данные примеры являются рекомендуемыми и приведены для удобства пользователей настоящего стандарта.

** Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

Библиография

[1]	Международный официальный метод АОАС 995.10 (метод AOAC-IUPAC-IFU) "Патулин в яблочном соке"
[2]	Международный официальный метод АОАС 2000.02 "Патулин в прозрачных и мутных яблочных соках"
[3]	Международный официальный метод АОАС 970.44 "Приготовление стандартных веществ для афлатоксинов"
[4]	Международный официальный метод АОАС 2001.01 "Определение охратоксина А в вине и пиве"
[5]	В. Сьюрам, Дж. Дж. Найр, Т.В. Ньювулдт, НЛ. Леггот, Г.С. Шефард "Определение патулина в яблочном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии с химической ионизацией при атмосферном давлении". Периодическое специализированное издание Journal of Chromatography А, 2000.- 897.- p. 365 - 374
[6]	Т. Рундбергет, А.Л. Вилкинс "Определение микотоксинов плесеней рода в пищевых продуктах и кормах методом высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии". Периодическое специализированное издание Journal of Chromatography А, 2002.- 964.- p. 189 - 197
[7]	М. Рурабхатла "Мультикомпонентный анализ микотоксинов с использованием метода ВЭЖХ-МС/МС". Методические указания, Varian, 00394, 2006. - 6 р.