Методические указания МУК 4.1.3138-13 "Измерение массовой концентрации (R)-3-гидрокси-альфа-[(метиламино)метил]бензометанола гидрохлорида (фенилэфрина гидрохлорид) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 20 ноября 2013 г.)

Методические указания МУК 4.1.3138-13
"Измерение массовой концентрации (R)-3-гидрокси-альфа-[(метиламино)метил]бензометанола гидрохлорида (фенилэфрина гидрохлорид) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 20 ноября 2013 г.)

Свидетельство о государственной метрологической аттестации N 01.00225/205-7-12.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для измерения массовой концентрации фенилэфрина гидрохлорида в воздухе рабочей зоны в диапазоне массовых концентраций 0,25-3,0 .

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИЮПАК: фенилэфрина гидрохлорид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 203,67.

Регистрационный номер CAS: 61-76-7.

Фенилэфрина гидрохлорид - белый или почти белый кристаллический порошок без запаха, горького вкуса, с температурой плавления 140-145°С. Легко растворим в воде, спирте этиловом 96%-м, 0,1%-м водном растворе о-фосфорной кислоты.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

Фенилэфрина гидрохлорид относится к адреномиметическим препаратам, оказывает симпатомиметическое, вазоконстрикторное, мидриатическое и кардиотоническое действие. Умеренно опасен при введении в желудок, малотоксичен при введении в брюшную полость, оказывает местное раздражающее действие на слизистые оболочки и кожу, обладает способностью проникать через кожные покровы. При ингаляции оказывает влияние на ЦНС, ССС, функцию печени и почек.

Ориентировочный безопасный уровень воздействия (ОБУВ) фенилэфрина гидрохлорида в воздухе рабочей зоны 0,5 .

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентных условий и проведении анализа в точном соответствии с прописью методика обеспечивает выполнение измерений массовой концентрации фенилэфрина гидрохлорида с метрологическими характеристиками, не превышающими значения, представленные в табл. 1 (при доверительной вероятности Р = 0,95).

Таблица 1

Метрологические параметры

Диапазон измерений массовой концентрации фенилэфрина гидрохлорида,	Показатель точности (границы относительной погрешности), , % при Р = 0,95	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), , %	Предел повторяемости, r, %, Р = 0,95, n = 2	Критическая разность для результатов анализа, полученных в двух лабораториях, , %
От 0,25 до 3,00 вкл.	25	5	7,5	14	18

2. Метод измерений

Измерение массовой концентрации фенилэфрина гидрохлорида выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым спектрофотометрическим (УФ) детектированием. Метод основан на разделении фенилэфрина гидрохлорида и других компонентов анализируемой смеси на хроматографической колонке, заполненной сорбентом с последующей регистрацией фенилэфрина гидрохлорида с помощью ультрафиолетового детектора. Сигнал детектора прямо пропорционален концентрации фенилэфрина гидрохлорида.

Измерение проводят при длине волны 216 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на аналитические аэрозольные фильтры.

Нижний предел измерения содержания фенилэфрина гидрохлорида в анализируемом объеме раствора пробы - 0,05  мкг.

Нижний предел измерения массовой концентрации фенилэфрина гидрохлорида в воздухе 0,25  (при отборе 200  воздуха).

Метод специфичен в условиях приготовления препаративных форм на основе фенилэфрина гидрохлорида. Измерению не мешают сопутствующие вещества, входящие в состав таблеток - активные компоненты: парацетамол, аскорбиновая кислота и вспомогательные вещества: кроскармеллоза натрия, кальция гидрофосфат, этилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, магния стеарат, тальк.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Хроматограф жидкостный с градиентной системой элюирования, автосэмплером, ультрафиолетовым детектором и термостатом колонки Весы лабораторные 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г, диапазон взвешивания по шкале 1-100 мг, цена деления шкалы 1 мг, погрешность взвешивания по шкале  мг	ГОСТ OIML R 76-1-11
Набор гирь	ГОСТ OIML R 111-1
Аспирационное устройство двухканальное с диапазоном расхода 2,0-20,0 и пределом допустимой погрешности	ТУ 4215-000-11696625-03
Колбы мерные, 2-50-2, 2-1000-2	ГОСТ 1770-74
Пипетки 1-1-2-1, 1-1-2-5, 1-1-2-10	ГОСТ 29227-91
Пробирки мерные с пришлифованными пробками	ГОСТ 1770-74
Цилиндры мерные, 3-500	ГОСТ 1770-74
Иономер лабораторный c пределом рН от -1 до +19 ед.	ГОСТ 22261-76

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Фенилэфрина гидрохлорид с содержанием основного вещества не менее 98,5% в пересчете на сухое вещество, НД 42-13814-05 Ацетонитрил, осч	ТУ 6-09-14-2167-84
О-фосфорная кислота, хч, 85%-й раствор, плотность с = 1,698	ГОСТ 6552-80
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72
Вода, осч	ТУ 6-09-2502-77
Калия фосфат однозамещенный, чда Состав элюента А: водный раствор калия фосфата однозамещенного с рН 3,0 Состав элюента Б: смесь ацетонитрила и элюента А в соотношении 1:1 по объему	ГОСТ 4198-75

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Колонка аналитическая размером 150x3,0 мм с защитной предколонкой размером 10x3,9 мм, заполненная обращённо-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C 8, размером частиц 5,0 мкм Аналитические аэрозольные фильтры гидрофильные на основе ацетилцеллюлозы (фильтры)	ТУ 95-1892-89
Фильтродержатели	ТУ 95.72.05-77
Мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм	ТУ 9471-002-10471723-03
Бюксы стеклянные	ГОСТ 25336-82
Палочки стеклянные	ГОСТ 25336-82
Воронки химические	ГОСТ 25336-82
Дистиллятор	ГОСТ Р 50444
Шкаф сушильный	ТУ 61-1-721-79

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, 12.1.005-88 (с изм. 1).

4.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-09 и инструкцией по эксплуатации прибора.

4.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленные ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, имеющий высшее образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедший обучение и владеющий техникой анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), освоивший метод анализа в процессе тренировки и уложившийся в нормативы оперативного контроля при проведении процедур контроля погрешности анализа.

6. Условия измерений

6.1. Процессы приготовления растворов и подготовку проб к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха	;
- атмосферное давление	(84-106) кПа;
- относительная влажность воздуха, не более	80%.

6.2. Выполнение измерений на спектрофотометре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, отбор проб.

7.1. Подготовка посуды

Стеклянную посуду несколько раз промывают водопроводной водой, заливают хромовой смесью и выдерживают 1 ч. После этого посуду извлекают из хромовой смеси, ополаскивают несколько раз водопроводной водой, затем дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу. Чистую посуду хранят в закрытом виде.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. Основной стандартный раствор фенилэфрина гидрохлорида с массовой концентрацией 1 000  готовят растворением  г фенилэфрина гидрохлорида в 0,1%-м растворе ортофосфорной кислоты в мерной колбе вместимостью 50 . Раствор используют свежеприготовленный. Растворы устойчивы в течение 1 ч.

7.2.2. Рабочий стандартный раствор фенилэфрина гидрохлорида N 1 с массовой концентрацией 100  готовят разбавлением 5,0  основного стандартного раствора фенилэфрина гидрохлорида 0,1%-м раствором о-фосфорной кислоты в мерной колбе вместимостью 50 . Раствор используют свежеприготовленный. Растворы устойчивы в течение 1 ч.

7.2.3. Приготовление о-фосфорной кислоты раствора 0,1 %.

В мерную колбу вместимостью 1 000 , содержащую около 500  воды особо чистой, помещают 0,7  о-фосфорной кислоты концентрированной, затем доводят объем водой особо чистой до метки и перемешивают. Срок годности раствора 1 месяц.

7.2.4. Приготовление элюента А.

В мерной колбе вместимостью 1 000  растворяют 3,4 г калия фосфата однозамещенного в 900  воды особо чистой, доводят рН полученного раствора до 3,0 прибавлением о-фосфорной кислоты концентрированной с потенциометрическим контролем, доводят объем раствора водой особо чистой до метки и перемешивают. Затем раствор дегазируют фильтрованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Элюент хранят в герметичной стеклянной посуде в холодильнике 14 суток.

7.2.5. Приготовление элюента Б.

В мерной колбе вместимостью 1 000  смешивают по 500  ацетонитрила и элюента А.

Элюент хранят в герметичной стеклянной посуде в холодильнике в течение месяца.

7.3. Подготовка хроматографа

Подготовку хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

Проверка пригодности хроматографической системы.

Хроматографическая система считается пригодной, если на хроматограммах раствора фенилэфрина гидрохлорида с массовой концентрацией 1 000  выполняются следующие условия:

- относительное стандартное отклонение площадей пиков по 5 последовательным хроматограммам для объема вводимой пробы 0,01 ;

- фактор асимметрии пика фенилэфрина гидрохлорида - не более 1,8.

7.4. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания фенилэфрина гидрохлорида в хроматографируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной градуировки по шести сериям измерений и шести концентрациям вещества в каждой серии (табл. 2). Для этого на фильтры, помещенные в бюксы, наносят пипеткой вместимостью 1  основной стандартный раствор фенилэфрина гидрохлорида с массовой концентрацией 1 000  и рабочий стандартный раствор фенилэфрина гидрохлорида с массовой концентрацией 100  в соответствии с табл. 2. После этого фильтры подсушивают при комнатной температуре, затем, используя пипетку вместимостью 5,0 , заливают 5,0  0,1%-го раствора о-фосфорной кислоты и оставляют на 10 мин периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтры отжимают, растворы сливают в мерные пробирки вместимостью 10,0 , а фильтры повторно заливают 5,0  0,1%-го раствора о-фосфорной кислоты и оставляют на 10 мин, периодически помешивая стеклянной палочкой. Затем фильтры тщательно отжимают, растворы сливают в те же пробирки, объем доводят до 10,0  0,1%-м раствором о-фосфорной кислоты, далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Таблица 2

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении фенилэфрина гидрохлорида

Номер градуировочного раствора	Объем основного стандартного раствора с концентрацией фенилэфрина гидрохлорида 1 000 ,	Объем рабочего стандартного раствора N 1 с концентрацией фенилэфрина гидрохлорида 100 ,	Массовая концентрация фенилэфрина гидрохлорида в градуировочном растворе,	Содержание фенилэфрина гидрохлорида в хроматографируемом объеме градуировочных растворов, мкг
1	0,0	0,0	0,0	0,00
2	0,0	0,5	5,0	0,05
3	0,1	0,0	10,0	0,10
4	0,2	0,0	20,0	0,20
5	0,3	0,0	30,0	0,30
6	0,4	0,0	40,0	0,40
7	0,6	0,0	60,0	0,60

Градуировочные растворы используют свежеприготовленные. Растворы устойчивы в течение 1 ч.

Инжектируют в хроматограф по 0,01  каждого из градуировочных растворов.

По полученным данным строят градуировочную характеристику зависимости площади пика (приборные единицы) от содержания фенилэфрина гидрохлорида в хроматографируемом объеме (мкг).

7.5. Условия хроматографирования градуировочных смесей и анализируемых проб

Длина волны детектора	216 нм.
Объем вводимой пробы	0,01 .
Температура колонки	40°С.

Подвижная фаза - линейный градиент в соответствии со следующей программой (табл. 3):

Таблица 3

Градиентный режим

Время, мин	Элюент А, %	Элюент Б, %
0	100	0
6	70	30
7	70	30
8	100	0
12	100	0

Расход подвижной фазы 0,8 .

Время удерживания фенилэфрина гидрохлорида мин.

За время удерживания фенилэфрина гидрохлорида принимается время удерживания пика стандарта фенилэфрина гидрохлорида, полученного при анализе стандартного раствора, с погрешностью .

Допускается изменять профиль градиента для достижения соответствия критериям пригодности хроматографической системы.

7.6. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Один раз в год градуировочную характеристику устанавливают заново.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества по п. 7.4 (в начале, середине и конце измерений) и анализируют в точном соответствии с прописью методики.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

, где (1)

- значение площади пика (приборные единицы) фенилэфрина гидрохлорида в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно;

- норматив контроля, , где

- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то выполняют повторное измерение этого образца с целью исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировочная характеристика нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировочной характеристики, предусмотренной методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики прибор градуируют заново.

7.7. Отбор проб воздуха

Отбор проб проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением N 1 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и Р 2.2.2006-05 (прилож. 9) "Общие методические требования к организации и проведению контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны", раздел 2 "Контроль соответствия максимальным ПДК".

Одновременно отбирают две параллельные пробы.

Воздух с объемным расходом 20  аспирируют в течение 10 мин через фильтр, помещенный в фильтродержатель, снабженный металлической сеткой. Для определения 1/2 ОБУВ фенилэфрина гидрохлорида отбирают не менее 200  воздуха. Отобранные пробы можно хранить в бюксах в течение трех дней.

8. Выполнение измерений

Фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс, приливают 5,0  0,1%-го раствора о-фосфорной кислоты, помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 10 мин для лучшего растворения вещества, затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в другой бюкс. Фильтр повторно обрабатывают 5,0  0,1%-го раствора о-фосфорной кислоты, снова тщательно отжимают и удаляют. Оба раствора последовательно фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в мерную пробирку вместимостью 10,0 , объем раствора доводят до метки 0,1%-м раствором о-фосфорной кислоты.

Хроматографический анализ выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.

Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждой пробы, соблюдая все условия, требуемые для градуировки хроматографической системы.

Количественное определение содержания фенилэфрина гидрохлорида (в мкг) в анализируемом объеме раствора пробы проводят по предварительно построенной градуировочной характеристике.

Примечание. Фильтрование растворов анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в 0,1%-м растворе о-фосфорной кислоте вспомогательных веществ, входящих в состав препаративных форм фенилэфрина гидрохлорида.

9. Вычисление результатов измерений

Массовую концентрацию фенилэфрина гидрохлорида в воздухе рабочей зоны С, мг/м3, вычисляют по формуле:

, где (2)

a - содержание вещества в анализируемом объеме раствора пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

В - общий объем раствора пробы, ;

б - хроматографируемый объем раствора пробы, ;

- объем воздуха, отобранного для анализа и приведенного к стандартным условиям (прилож. 1).

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

, где (3)

- результаты параллельных определений массовой концентрации фенилэфрина гидрохлорида в воздухе, ;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

10. Оформление результатов анализа

Результат количественного химического анализа представляют в виде:

, при Р = 0,95, где

- среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, ;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

Если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: "массовая концентрация фенилэфрина гидрохлорида менее 0,25  (более 3,0 )".

11. Контроль результатов измерений

11.1. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью по формуле:

, где (4)

- средние значения массовой концентрации фенилэфрина гидрохлорида, полученные в первой и второй лабораториях, ;

- значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.4).

11.2. Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-02, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

Врио руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации

А.Ю. Попова