Методические рекомендации по экспресс-определению микотоксинов в зерновых культурах, кормах и орехах с помощью тест-систем "RIDASCREEN FAST", производства фирмы R-Biopharm AG, Германия (утв. Министерством здравоохранения РФ 30 ноября 2004 г. N 17фц/3737)

Методические рекомендации по экспресс-определению микотоксинов в зерновых культурах, кормах и орехах с помощью тест-систем "RIDASCREEN FAST", производства фирмы R-Biopharm AG, Германия
(утв. Министерством здравоохранения РФ 30 ноября 2004 г. N 17фц/3737)

Вводится впервые

Настоящие методические рекомендации устанавливают методику экспресс-определения содержания следующих микотоксинов: зеараленона, Т-2-токсина, суммы афлатоксинов , , , в зерновых культурах, комбикормах и орехах методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Диапазоны определяемых концентраций микотоксинов приведены в таблице:

N п/п	Микотоксин	Диапазон определяемых концентраций *	Загрязняемые культуры
1.	, , ,	0,0017-0,045 мг/кг	Зерновые культуры, корма, орехи
2.	Т-2 токсин	0,05-0,4 мг/кг	Зерновые культуры, корма
3.	Зеараленон (Ф-2)	0,05-0,4 мг/кг	Зерновые культуры, корма

______________________________

* - диапазон определяемых концентраций при навеске образца 5 г.

1. Общие положения

Микотоксинами называют группу высокотоксичных канцерогенных веществ, образующихся в результате жизнедеятельности плесневых грибов Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus и Fusarium. Так, например афлатоксин , а также афлатоксины , , часто могут быть обнаружены в зерновых культурах, кукурузе, хлопковом семени и орехах. Продовольственное сырье довольно часто бывает загрязнено Т-2 токсином, однако распространенность продуцентов Т-2 токсина и уровень загрязнения сильно зависит от региональной специфики. Т-2 токсин обладает цитотоксичными и иммунодепрессивными свойствами и является серьезным фактором риска для здоровья сельскохозяйственных животных и человека. Зеараленон, будучи "растительным гормоном", обладающим эстрогенными свойствами, вызывает нарушения репродуктивной функции животных, в том числе - свиней, лошадей, крупного и мелкого рогатого скота, с клиническими признаками гиперэстрогенизма, наиболее выраженного у свиней. С продуктами растительного происхождения зеараленон может попадать также и в организм человека.

В Российской Федерации СанПиН 2.3.2.1078-02 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" устанавливает предельно допустимые концентрации зеараленона и Т-2 токсина - 0,1-1,0 мг/кг в зерновых культурах и кормах. Сумма афлатоксинов , , , в Российской Федерации не нормируется.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Имеется в виду СанПиН 2.3.2.1078-01

В последнее время в целях скрининга зарубежом в рутинной лабораторной практике широко применяется метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Наборы RIDASCREEN FAST представляют собой тест-системы для иммуноферментного анализа в комплекте с необходимыми реагентами, выпускаются серийно и предназначены для экспресс-определения микотоксинов в зерновых культурах, комбикормах и орехах.

2. Метод измерений

Принцип работы тест-систем RIDASCREEN FAST основан на методе прямого конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован антителами "захвата", специфичными к антителам к микотоксинам.

Анализ выполняется следующим образом. Исследуемые и стандартные образцы, препарат, содержащий антитела к микотоксинам и препарат, содержащий коньюгат микотоксинов с ферментом последовательно дозируются в лунки активированного планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы микотоксинов и молекулы коньюгата, конкурируя между собой, связываются антителами к микотоксинам. В то же самое время, при инкубации, происходит иммуносорбция этих антител на поверхность лунок планшета за счет их взаимодействия с антителами "захвата" на поверхности.

На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы коньюгата. После промывки планшета в его лунки дозируется раствор, содержащий субстрат и хромоген. В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы коньюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. После определенного времени развития данной цветной реакции, в результате которой хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.

Оптическая плотность в лунках, измеренная на планшетном фотометре (ридере) при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации микотоксинов в исследуемых образцах.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений массовой концентрации микотоксинов применяются следующие средства измерения, реактивы, вспомогательные устройства и материалы.

3.1. Средства измерений

Спектрофотометр для ИФА (ридер) с фильтром на 450 нм;
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г	ГОСТ 24104
Одноканальные автоматические пипетки, объем дозирования 50 мкл
8-канальные автоматические пипетки на 50 и 250 мкл;
Колба мерная 2-го класса точности вместимостью 100	ГОСТ 1770
Цилиндры градуированные 2-го класса точности вместимостью 50 и 100	ГОСТ 1770
Пипетка градуированная 2-го класса точности вместимостью 1	ГОСТ 29227

3.2. Реактивы

Тест-система RIDASCREEN FAST для иммуноферментного анализа в стандартной комплектации, включая:

Микротитровальный планшет на 48 лунок (6 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированный антителами "захвата";

Комплект стандартных растворов микотоксинов в водном растворе метанола, объемом 1,3 , со следующими концентрациями:

Сумма афлатоксинов	0 мкг/л (нулевой стандарт), 1.7 мкг/л, 5 мкг/л, 15 мкг/л, 45 мкг/л;
Зеараленон	0 мкг/л (нулевой стандарт), 50 мкг/л, 100 мкг/л, 200 мкг/л, 400 мкг/л;
Т-2 токсин	0 мкг/л (нулевой стандарт), 50 мкг/л, 100 мкг/л, 200 мкг/л, 400 мкг/л;

Антитела к микотоксинам (черная крышка), объемом 3 ;

Коньюгат микотоксинов с пероксидазой (красная крышка), объемом 3 ;

Субстрат/хромоген (белая крышка) подкрашенный раствор объемом 6 ;

Стоп-реагент (желтая крышка), содержащий 1 N раствор серной к-ты, объемом 6 ;

Инструкцию по использованию тест-системы на русском и английском языках;

Логарифмическую бумагу;

Метанол, ч.д.а	ГОСТ 6995-77
Дистиллированная (или деионизированная) вода	ГОСТ 6709

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Мельница для размола сыпучих продуктов

Колба коническая со шлифом и притертой пробкой на 50 (100) типа КН-1 по ТУ 92-891.029-91

Пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками

Воронки лабораторные типа В-36 по ГОСТ 25336

Фильтровальная бумага "красная лента"

Наконечники для автоматических пипеток;

Ванночки для реагентов;

Листовая фильтровальная бумага;

Разовые резиновые перчатки;

Тара для лабораторных отходов.

Замечания по использованию и хранению тест-систем RIDASCREEN FAST:

Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности. Срок годности тест-системы указан на этикетке.

Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии. Не используйте реагенты других производителей. Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения.

Храните набор при температуре 2-8°С. Не замораживайте набор.

Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет.

Поскольку раствор хромогена светочувствителен, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором.

В случае голубоватого окрашивания розового раствора хромогена не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора является признаком его порчи.

Если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, не превышает 0.6, это также может быть признаком порчи реагентов.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства.

4.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией.

4.3. Внимание! Стандартные растворы содержат токсичные микотоксины. При работе используйте разовые резиновые перчатки, избегайте контакта реагентов с кожей.

4.4. После каждого анализа следует тщательно промывать оборудование и лабораторную посуду для предотвращения перекрестного загрязнения от пробы к пробе. Все использованные материалы, жидкие отходы, расходные материалы и лабораторная посуда должны быть деконтаминированы путем замачивания в течение 30 минут в 5% растворе гипохлорита натрия с последующим добавлением в раствор ацетона 5% по объему и выдерживанием еще 30 минут. Для мытья стеклянной посуды, загрязненной микотоксинами, рекомендуется использовать 10% раствор гипохлорита натрия. С помощью раствора соляной кислоты подкислите раствор гипохлорита до рН 7, залейте раствором загрязненную посуду и оставьте в контакте с раствором на ночь. Затем лабораторную посуду следует отмыть обычными лабораторными моющими средствами и промыть дистилированной водой.

4.5. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Избегайте контакта стоп-реагента с кожей.

4.6. Метанол относится к легковоспламеняющимся растворителям. Емкость с метанолом должна быть всегда плотно закрыта. Храните емкость с метанолом вдали от источников тепла, искр и открытого пламени. Не курите во время работы. Метанол токсичен при попадании внутрь! Пары метанола токсичны! Не вдыхайте пары метанола! Избегайте контакта метанола с кожей.

5. Требования к квалификации персонала

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное образование, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе стажировки.

6. Условия измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

Температура воздуха	20-25°С;
Атмосферное давление	84.0-106.7 кПа (630-800 мм рт. ст.);
Влажность воздуха	не более 80% при температуре 25°С;
Напряжение в сети	В;
Частота переменного тока	Гц

7. Подготовка к проведению анализа

7.1. Отбор проб

Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией по отбору проб. Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора. Пробы, предназначенные для анализа, должны хранится в холодном темном месте.

7.2. Подготовка реактивов и материалов

Перед использованием доведите температуру всех реагентов (включая дистиллированную воду) до комнатной (20-25°С). Это займет около 1 часа.

Стандартные растворы. Стандартные растворы микотоксинов поставляются готовыми для использования. Величина концентрации микотоксинов, нанесенная на флаконы с растворами дана с учетом фактора разбавления исследуемых образцов при пробоподготовке, поэтому результат определения может быть получен непосредственно по калибровочной кривой.

Приготовление 70%-ного раствора метанола. В мерную колбу на 100 помещают 70 метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.

Микротитровальный планшет. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов вместе с рамкой. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет с силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2-8°С.

7.3. Пробоподготовка

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

7.1. Исследуемую пробу размалывают с помощью мельницы для размола сыпучих продуктов.

7.2. Взвешивают 5 г размолотой пробы, переносят в колбу с притертой пробкой, приливают 25 70%-го водного раствора метанола.

7.3. Тщательно встряхивают колбу в течение трех минут (рекомендуется использовать аппарат для встряхивания).

7.4. Фильтруют раствор через фильтровальную бумагу типа "красная лента".

7.5. Смешивают в пробирке 1 фильтрата и 1 дистиллированной воды.

7.6. Для анализа используют 50 мкл раствора.

8. Выполнение измерений

8.1. Предварительные замечания к проведению измерений с помощью тест-системы RIDASCRIN FAST:

- Немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2-8°С, избегайте длительного хранения реагентов при комнатной температуре;

- Иммуноферментная реакция начинается после добавления в лунки планшета препарата антител. При дозировании рекомендуется использовать многоканальную пипетку;

- В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета. Избегайте перерывов при выполнении анализа;

- Воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета;

- На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света. Во время инкубации рекомендуется ставить планшет в темное место или прикрывать планшет непрозрачным экраном.

8.2. Проведение измерений

8.2.1. Извлеките из фольгированного пакета необходимое количество лунок - по одной лунке на каждую пробу. Поместите лунки в рамку.

8.2.2. Немедленно упакуйте оставшиеся лунки в фольгированный пакет вместе с осушителем и поместите на хранение при 4°С.

8.2.3. Нанесите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов, на разграфленную бумагу как это показано на рисунке (Ст. - стандарты, Пр. - пробы):

Стрип 1	Стрип 2	Стрип 3	Стрип 4	Стрип 5	Стрип 6
Ст. 1	Пр. 4	Пр. 12	Пр. 20	Пр. 28	Пр. 36
Ст. 2	Пр. 5	Пр. 13	Пр. 21	Пр. 29	Пр. 37
Ст. 3	Пр. 6	Пр. 14	Пр. 22	Пр. 30	Пр. 38
Ст. 4	Пр. 7	Пр. 15	Пр. 23	Пр. 31	Пр. 39
Ст. 5	Пр. 8	Пр. 16	Пр. 24	Пр. 32	Пр. 40
Пр. 1	Пр. 9	Пр. 17	Пр. 25	Пр. 33	Пр. 41
Пр. 2	Пр.10	Пр. 18	Пр. 26	Пр. 34	Пр. 42
Пр. 3	Пр. 11	Пр. 19	Пр. 27	Пр. 35	Пр. 43

8.2.4. Пометьте лунки, чтобы идентифицировать их после промывки.

8.2.5. Осторожно, не допуская вспенивания, перемешайте флаконы с реагентами.

8.2.6. Перед пипетированием смачивайте каждый свежий наконечник пипетки дозируемым раствором (наберите и выпустите раствор).

8.2.7. Добавьте по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие лунки. При каждом дозировании используйте новый наконечник дозатора.

8.2.8. Осторожно, не касаясь лунок, добавьте по 50 мкл препарата коньюгата в каждую лунку, согласно рисунку на разграфленной бумаге (см. п. 8.2.3).

8.2.9. Таким же образом добавьте в каждую лунку по 50 мкл препарата антител.

8.2.10. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию в темном месте при комнатной температуре в течение 10 мин (_1 мин). Не встряхивайте планшет во время инкубации!

8.2.11. Вылейте жидкость из лунок. Во избежание появления пленки поверхностного натяжения, препятствующей добавлению промывочного раствора в лунки, переверните рамку планшета и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного (не более!) постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой.

8.2.12. При помощи многоканальной пипетки или специальной промывалки, наполните лунки 250 мкл дистиллированной воды и снова опорожните лунки. Выбейте капельки жидкости как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок еще два раза.

8.2.13. Как можно быстрее добавьте по 2 капли (100 мкл) раствора хромогена/субстрата (белая крышка) в каждую лунку (лучше использовать многоканальную пипетку).

8.2.14. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию при комнатной температуре в течение 5 минут ( мин) в темноте. Не встряхивайте планшет во время инкубации!

8.2.15. Быстро добавьте в каждую лунку по 2 капли (100 мкл) стоп-реагента (желтая крышка) и хорошо перемешайте (лучше также использовать многоканальную пипетку).

8.2.16. В течение 10-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм относительно воздуха.

9. Обработка результатов измерений

Значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами делятся на значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:

Оптическая плотность лунки со стандартом (пробой)	х 100 = % поглощения
Оптическая плотность лунки с нулевым стандартом

Но величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим значениям концентрации микотоксинов в мкг/кг (ppb) строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат:

Концентрация микотоксинов в исследуемых растворах в мкг/кг (ppb) считывается по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов. Положительные результаты количественного определения концентрации микотоксинов следует подтверждать с помощью хроматографических методов.

Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например, Софт. При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения.

Главный врач Федерального центра Госсанэпиднадзора Минздрава России, Председатель Лабораторного совета Госсанэпидслужбы России

Е.Н. Беляев