Приложение 6.8.3. Микроядерный тест на эритроцитах млекопитающих

Приложение 6.8.3

Микроядерный тест на эритроцитах млекопитающих

Идентичен международному документу OECD TG N 474 "Mammalian Erythrocyte Mi- cronucleus Test" (ОЭСР Руководство N 474 "Микроядерный тест на эритроцитах млекопитающих"). Принят 21 июля 1997 г. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает порядок проведения испытания химических веществ в микроядерном тесте на эритроцитах млекопитающих in vivo. Микроядерный тест на млекопитающих in vivo используют для выявления индукции исследуемым веществом нарушений хромосом или митотического аппарата эритробластов при анализе эритроцитов в костном мозге или в периферической крови животных, обычно грызунов.

1.2. Цель микроядерного теста - идентифицировать вещества, вызывающие цитогенетические нарушения, которые формируют микроядра, содержащие отставшие фрагменты хромосом или целые хромосомы.

1.3. При формировании в костном мозге из эритробласта полихроматофильного эритроцита ядро выталкивается из клетки. Любые образовавшиеся микроядра могут остаться в денуклеированной цитоплазме. Микроядра в этих клетках легко визуализируются из-за отсутствия в них ядра. Повышение частоты полихроматофильных эритроцитов с микроядрами у экспериментальных животных является показателем индуцированных нарушений хромосом.

2. Общие положения

2.1. Обычно исследуют костный мозг грызунов, поскольку полихроматофильные эритроциты образуются в этой ткани. Анализ незрелых (полихроматофильных) эритроцитов с микроядрами в периферической крови также приемлем у любых видов, у которых селезенка не способна элиминировать эритроциты с микроядрами или для которых показана адекватная чувствительность в выявлении соединений, вызывающих структурные или численные нарушения хромосом. Микроядра можно различать по ряду критериев. Они включают идентификацию присутствия или отсутствия кинетохора или ДНК-центромер в микроядре. Частота незрелых (полихроматофильных) эритроцитов - принципиальный показатель теста. Доля зрелых (нормохромных) эритроцитов с микроядрами в периферической крови от проанализированного числа зрелых эритроцитов также может быть использована как показатель, если обработка животных длится 4 и более недель.

2.2. Микроядерный тест на млекопитающих in vivo особенно адекватен при оценке мутагенной опасности, поскольку позволяет учесть такие факторы, как метаболизм, фармакокинетику вещества, процессы репарации ДНК, хотя они могут варьировать от вида к виду, в разных тканях и для разных генетических событий. Тест in vivo также полезен при дальнейшей оценке мутагенного эффекта, выявленного в тест-системах in vitro.

2.3. Этот тест не подходит для оценки, если известно, что вещество или активный метаболит не достигают ткани мишени.

3. Принцип метода

3.1. Животных подвергают воздействию исследуемого соединения, используя соответствующий путь введения. При работе с костным мозгом, животных умерщвляют через соответствующий интервал времени после введения, выделяют костный мозг, готовят препараты и проводят окраску. При работе с периферической кровью, ее берут через определенный интервал времени после воздействия, готовят мазки и проводят окраску.

4. Описание метода

4.1. Материалы

Выбор животных

4.1.1. При работе с костным мозгом рекомендуется использовать мышей или крыс, хотя могут использоваться и другие виды млекопитающих. При работе с периферической кровью, рекомендуются мыши. Может быть использован любой другой вид млекопитающих, если показано, что у животных этого вида селезенка не элиминирует эритроциты с микроядрами, а также этот вид одинаково чувствителен при определении соединений, индуцирующих структурные и численные нарушения хромосом. Обычно используют лабораторные штаммы молодых здоровых животных. В начале исследования колебания массы животных должны быть минимальны, не превышая 20% средней массы животных каждого пола.

Условия содержания и кормления

4.1.2. Температура в экспериментальных комнатах вивария должна быть . Относительная влажность должна быть не ниже 30% и не превышать 70% во время уборки, оптимально 50-60%. Освещение искусственное. Световой режим: 12 ч освещения, 12 ч темноты. Может быть использована стандартная лабораторная диета без ограничения питьевой воды. На выбор диеты может влиять необходимость приготовления особой смеси корма при введении вещества с кормом. Животных содержат в клетках индивидуально или небольшими группами одного пола.

Подготовка животных к исследованию

4.1.3. Методом случайного отбора формируют контрольные и экспериментальные группы здоровых молодых животных. Каждое животное идентифицируют. Животных акклиматизируют к лабораторным условиям по крайней мере в течение 5 дней. Клетки располагают таким образом, чтобы минимизировать возможные эффекты вследствие расположения клеток.

Приготовление исследуемых соединений

4.1.4. Твердые соединения растворяют или суспендируют в соответствующем растворителе и разводят, если необходимо, перед введением животным. Жидкие вещества можно вводить непосредственно или разводить перед введением. Пока стабильность растворов исследуемого вещества при соответствующем хранении не будет показана, следует использовать свежие растворы.

4.2. Условия испытания

Растворитель/разбавитель

4.2.1. Растворитель/разбавитель не должен оказывать токсическое действие при использованных уровнях доз и не должен вступать в реакцию с исследуемым веществом. Если используют малоизвестный растворитель/разбавитель, его включение должно быть обосновано данными, указывающими на совместимость с исследуемым веществом. По возможности рекомендуется использовать водные растворы.

Контроли

4.2.2. Соответствующие положительные и отрицательные (растворитель/разбавитель) контроли должны быть в каждом опыте для каждого пола. За исключением обработки тестируемым веществом животные контрольных групп должны находиться в тех же условиях, что и животные экспериментальных групп.

4.2.3. Соединения положительного контроля при выбранных уровнях экспозиции должны индуцировать значимое повышение уровня микроядер над контролем. Дозы положительного контроля следует подбирать так, чтобы был четкий эффект, но его уровень в то же время не позволял исследователю определить зашифрованное животное группы положительного контроля. Допускается введение положительного контроля путем, отличающимся от введения исследуемого вещества, и использование одного времени введения. Когда необходимо, возможно в качестве положительного контроля использовать вещество, по химическому классу сходное с известным веществом положительного контроля. Примеры веществ положительного контроля приведены ниже.

Вещество и номер CAS

Этилметансульфонат [номер CAS 62-50-0]

Этилнитрозомочевина [номер CAS 759-73-]

Митомицин С [номер CAS 50-07-7]

Циклофосфамид (моногидрат) [номер CAS 50-18-0 (номер СAS 6055-19-2)]

Триэтиленмеламин [номер CAS 51-18-3]

4.2.4. Пока приемлемая вариабельность и частота клеток с микроядрами не будет показана по данным исторического контроля, в группе отрицательного контроля (контроль с растворителем/разбавителем) обработка животных проводится тем же путем и в том же режиме, что и обработка экспериментальных групп животных. Если в группе отрицательного контроля делается однократное введение, наиболее подходящим является первое время забоя. Дополнительно, контрольную группу без обработки следует также использовать до тех пор, пока исторические или опубликованные данные не покажут, что выбранный растворитель не индуцирует вредный или мутагенный эффекты.

4.2.5. При анализе периферической крови проба до обработки может быть также приемлема в качестве соответствующего отрицательного контроля, но лишь в случае коротких периодов воздействия (1-3-кратные введения), когда ожидают, что данные будут в пределах колебаний исторического контроля.

4.3. Проведение эксперимента

Число и пол животных

4.3.1. В каждой экспериментальной и контрольной группе должно быть не менее 5 животных каждого пола. Если ко времени проведения исследования имеются данные работ на том же виде животных и при той же схеме введения, которые показывают на отсутствие существенных различий в токсичности между полами, тогда достаточно проведение опыта на одном поле животных. В случае, если у человека экспозиция веществом специфична для разных полов, например, для ряда лекарств, эксперимент может быть проведен на животных соответствующего пола.

Схема введения

4.3.2. Не может быть рекомендована стандартная схема затравки (т.е. 1, 2 и более введений с 24-часовым интервалом). Пробы при длительных режимах введения доз приемлемы, если положительный эффект был показан в работе или при отрицательном ответе была выявлена токсичность, или была использована максимальная доза и введение вещества проведено до времени отбора пробы. Исследуемое вещество можно вводить в дробных дозах, т.е. 2 введения в тот же день, разделенных по времени не больше, чем на несколько часов, чтобы ввести большой объем материала.

4.3.3. Эксперимент может быть проведен 2 способами.

A. Животных обрабатывают однократно. Пробы отбирают по крайней мере 2 раза, начиная не ранее 24 ч после введения, но не превышая 48 ч после введения с соответствующим интервалом между пробами. Использование времени забоя менее 24 ч после введения должно быть обосновано. Пробы периферической крови также отбирают по крайней мере дважды, начиная не ранее 36 ч после введения, с соответствующим временным интервалом после первой пробы, но не превышая 72 ч после введения. При выявлении положительного ответа при одном интервале времени забора пробы, дополнительные интервалы времени для забора проб не требуются;

Б. При режимах двух и более ежедневных введений (т.е. два и более введения с интервалом 24 ч) пробу отбирают между 18-24 ч после последнего введения для костного мозга и между 36 и 48 ч после последнего введения для периферической крови.

4.3.4. Другие интервалы времени отбора проб могут быть использованы как дополнительные, когда это необходимо.

Уровни доз

4.3.5. Если проводится ряд исследований и нет подходящих данных, то эксперимент должен быть проведен в той же лаборатории, используя те же виды, линии, пол, режим обработки, которые были в основном исследовании. Если выявлена токсичность, то для первого срока забоя тестируют 3 дозы. Их диапазон должен быть в пределах от максимальной до минимальной токсичности или отсутствия токсичности. При более поздних сроках забоя необходимо использовать лишь максимальную дозу. Максимальную дозу определяют как дозу, вызывающую такие признаки токсичности, что при повышении уровня доз при том же режиме затравки ожидается летальный эффект. Вещества со специфической биологической активностью при низких нетоксических дозах (такие как гормоны и митогены) могут быть исключением для критериев установления уровня доз и дозы необходимо подбирать в каждом конкретном случае. Максимальная доза может также быть определена как доза, вызывающая ряд признаков токсичности в костном мозге (например, снижение доли незрелых эритроцитов от общего числа эритроцитов в костном мозге или периферической крови).

Ограничения теста

4.3.6. Если доза около 2 000 мг/кг массы тела при однократном режиме воздействия или двух введениях в один день не вызывает токсического эффекта, и если генотоксичность не предполагают по результатам исследований со структурно связанными соединениями, то полную схему исследований с использованием 3 уровней доз можно не проводить.

Введение вещества

4.3.7. Исследуемое вещество обычно вводят внутрижелудочно, используя желудочный зонд или подходящую интубационную канюлю, или внутрибрюшинно. Возможно применение других способов введения при их обосновании. Максимальный объем жидкости, который вводят внутрижелудочно или путем иньекции, зависит от размеров экспериментальных животных. Обычно объем не превышает 2 мл на 100 г массы тела. Использование больших объемов должно быть обосновано. Исключение составляют раздражающие и разъедающие вещества, которые вызывают раздражающий эффект в высоких концентрациях. Вариации вводимых объемов должны быть минимизированы путем приготовления концентраций растворов, позволяющих вводить постоянный объем для всех 3 уровней доз.

Приготовление препаратов костного мозга/периферической крови

4.3.8. Клетки костного мозга обычно получают из бедренной или большой берцовой кости сразу после забоя. Клетки выделяют из бедренной или большой берцовой кости, готовят препараты и окрашивают, используя стандартные методы. Периферическую кровь берут из хвостовой вены или других кровеносных сосудов. Клетки крови окрашивают суправитально или делают мазок и затем окрашивают. Использование специфических красителей ДНК [акридиновый оранжевый или Hoechst 33258 плюс пиронин-Y] может элиминировать ряд артефактов, связанных с окрашиванием красителями, не специфичными к ДНК. Эти преимущества не мешают использованию обычных красителей (т.е. Гимза). Дополнительные системы [например, колонки с целлюлозой для удаления клеток, содержащих ядра] могут также применяться при условии, что было показано, что эти системы адекватно работают в лаборатории при учете микроядер.

Микроскопический анализ

4.3.9. Доля незрелых эритроцитов от общего (незрелые + зрелые) числа эритроцитов определяется для каждого животного при подсчете по крайней мере 200 эритроцитов для костного мозга и 1 000 эритроцитов для периферической крови. Все препараты, включая отрицательный и положительный контроли, обязательно шифруют перед началом микроскопического анализа. Минимум 2 000 незрелых эритроцитов на животное анализируют для учета незрелых эритроцитов с микроядрами. Дополнительная информация может быть получена при подсчете зрелых эритроцитов с микроядрами. При анализе препаратов доля незрелых эритроцитов от общего числа эритроцитов должна быть не меньше 20% от контрольного уровня. При затравке животных в течение 4 и более недель не менее 2 000 зрелых эритроцитов на животное анализируют при учете микроядер. Системы автоматического анализа (анализ изображения и проточная цитометрия) - допустимая альтернатива традиционному анализу, если они обоснованы и валидизированы.

5. Результаты и отчет

5.1. Обработка результатов

5.1.1. Данные по каждому животному следует представлять в табличной форме. Экспериментальной единицей является животное. У каждого животного подсчитывают число незрелых эритроцитов, число незрелых эритроцитов с микроядрами, число незрелых эритроцитов от общего числа эритроцитов. При постоянной затравке в течение 4 и более недель, также приводят данные по зрелым эритроцитам, если их подсчитывают. Доля незрелых эритроцитов от общего числа эритроцитов и, если считается необходимым, процент эритроцитов с микроядрами приводят по каждому животному. Если нет данных по различию показателей между животными разного пола, данные можно объединить для статистического анализа.

Оценка и интерпретация результатов

5.1.2. Имеется несколько критериев определения положительного результата: зависимое от дозы повышение числа клеток с микроядрами или четкое повышение числа клеток с микроядрами в одной дозовой группе при одном временном варианте эксперимента. Биологическая обоснованность результата должна приниматься во внимание в первую очередь. Для оценки результатов дополнительно используются статистические методы. Статистическая значимость не является единственным критерием для доказательства положительного ответа. Сомнительные (противоречивые) результаты следует проверять при дальнейшем тестировании преимущественно при использовании модифицированных экспериментальных условий.

5.1.3. Вещество, которое не соответствует вышеприведенным критериям, считается немутагенным в данном тесте.

5.1.4. Хотя в большинстве экспериментов получаются четко положительные или отрицательные результаты, в редких случаях полученные данные не позволяют сделать однозначное заключение об активности исследуемого вещества. Результаты могут оставаться противоречивыми или сомнительными независимо от числа проведенных повторов. Положительные результаты в микроядерном тесте показывают, что вещество индуцирует микроядра, которые являются результатом хромосомных нарушений или повреждений митотического аппарата эритробластов у данного вида. Отрицательные результаты указывают, что при данных условиях эксперимента вещество не индуцирует микроядра в незрелых эритроцитах у исследованного вида.

5.1.5. Должна быть обсуждена вероятность, что исследуемое вещество или его метаболиты попадают в систему кровообращения или специфически в ткани-мишени (т.е. системная токсичность).

5.2. Отчет

Отчет должен включать следующую информацию.

Исследуемое соединение:

- идентификационные данные и номер CAS, если известен;

- физическую природу и чистоту;

- физико-химические параметры, имеющие значимость для данного исследования;

- стабильность веществ.

Растворитель/разбавитель:

- обоснование выбора растворителя;

- растворимость и стабильность исследуемого вещества в растворителе, если известно.

Животные:

- вид и линии животных;

- число животных, возраст и пол;

- откуда получены животные, условия содержания и кормления и т.д.;

- масса каждого животного в начале опыта, включая для каждой группы колебания массы тела, среднее значение и стандартное отклонение.

Условия эксперимента:

- данные по положительному и отрицательному (растворитель/разбавитель) контролю;

- данные опыта по выбору диапазона доз (если проводили);

- обоснование выбора доз;

- детальное описание приготовления вещества;

- детальное описание введения вещества;

- обоснование пути введения вещества;

- методы для верификации того, что вещество циркулирует в организме или достигло ткани мишени (если использовались);

- пересчет концентрации исследуемого вещества в питьевой воде или пище в дозу вещества (мг/кг массы тела в день) (если это проводили);

- детальное описание качества пищи или воды;

- детальное описание схемы обработки и забора материала;

- методы приготовления препаратов;

- методы оценки токсичности;

- критерии учета незрелых эритроцитов с микроядрами;

- число анализируемых клеток на животное;

- критерии учета вещества как положительное, отрицательное или сомнительное.

Результаты:

- признаки токсичности;

- доля незрелых эритроцитов от общего числа эритроцитов;

- число незрелых эритроцитов с микроядрами, отдельно по каждому животному;

- среднее стандартное отклонение для незрелых эритроцитов с микроядрами на группу;

- оценка зависимости эффекта от дозы, где это возможно;

- статистический анализ и использованные методы;

- данные по отрицательному контролю в опыте и исторические данные по отрицательному контролю;

- данные по положительному контролю.

Обсуждение результатов.

Заключение.