Приложение 6.4.2. Кожно-резорбтивное действие: метод in vitro

Приложение 6.4.2

Кожно-резорбтивное действие: метод in vitro

Идентичен международному документу OECD TG N 428 "Skin Absorption: in vitro Metod (ОЭСР Руководство 428 "Кожно-резорбтивное действие: метод in vitro"). Международный документ разработан Организацией Экономического Сотрудничества и Развития (ОЭСР/ОЕСD), принят 13 апреля 2004 г. Перевод с английского (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования обеспечивает получение информации о кожно-резорбтивном действии веществ при их тестировании in vitro и позволяют оценить и классифицировать вещество в соответствии с Согласованной на глобальном уровне системой классификации и маркировки (СГС) по данному виду воздействия.

1.2. Данный экспериментальный метод был разработан для получения информации об абсорбции исследуемого вещества, нанесенного на вырезанный кусочек кожи. Это исследование может проводиться в сочетании с исследованием кожно-резорбтивного действия in vivo по руководству OECD (метод in vivo) или отдельно. Для содействия в планировании эксперимента, основанного на данном методе in vitro, и гарантирования надежности результатов исследования можно рекомендовать учитывать и Руководство OECD по проведению исследований по абсорбции кожи.

2. Общие положения

2.1. Изучение и оценка кожно-резорбтивного действия веществ при их тестировании in vitro является особенно важной в тех случаях, когда накожный путь поступления веществ является приоритетным. Методы для оценки кожно-резорбтивного действия и дермального распределения веществ могут быть подразделены на две категории: in vivo и in vitro. Методы in vivo исследования кожно-резорбтивного действия хорошо проработаны, позволяют получить фармакокинетическую информацию для ряда видов животных и представлены в Руководстве OECD.

Методы in vitro также использовались много лет для измерения кожной абсорбции. Хотя формальная проверка достоверности исследований методом in vitro не была выполнена, эксперты OECD в 1999 г. приняли решение, что было предоставлено достаточно данных, подтверждающих достоверность оценки кожно-резорбтивного действия методом in vitro. Более подробная информация, доказывающая правомерность этого метода, включая значительное количество прямых сравнений методов in vivo и in vitro, представлены в Руководстве OECD. Методы in vitro оценивают диффузию химических веществ в и через кожу в приемный (жидкостный) резервуар и могут использовать нежизнеспособную кожу для измерения только диффузии, или свежую метаболически активную кожу для одновременного измерения диффузии и кожного метаболизма. Такие методы нашли практическое применение при сравнении распространения вещества в и через кожу в различных составах и также могут обеспечивать полезные модели при оценке перкутанной абсорбции кожи человека.

2.2. Метод in vitro не может применяться во всех ситуациях и для всех классов химических веществ. Методы in vitro можно использовать для начального количественного определения проницаемости кожи. В определенных случаях можно сравнивать полученные данные с данными, полученными методом in vivo. Необходимо учитывать руководство для дальнейшей разработки ситуаций, применимых для метода in vitro.

2.3. Данный документ содержит основные принципы для измерения кожно-резорбтивного действия и распространения исследуемого вещества с использованием удаленной кожи. Проникающая способность кожи сохраняется после удаления от тела (вырезка кусочка кожи), потому что сохраняется жизнеспособность кожи. Как оказалось, у кожи была выявлена способность усваивать некоторые химикаты во время всасывания через кожу, и проницаемость кожи после отделения ее от тела поддерживается за счет основного диффузионного барьера нежизнеспособной роговой оболочки, а активное прохождение вещества через кожу не было зарегистрировано. В исследовании может использоваться кожа многих видов млекопитающих, в том числе и кожа человека.

3. Принцип метода

3.1. Исследуемое вещество, которое может быть помечено радиоактивной меткой, наносят на поверхность кожного образца, разделяющего две камеры диффузионной ячейки. Вещество оставляют на коже на определенное время при определенных условиях до удаления вещества с использованием подходящей процедуры очистки. Приемную жидкость собирают в различные периоды в течение эксперимента и анализируют на присутствие вещества и/или его метаболитов. Когда используются метаболически активные системы, метаболиты исследуемых веществ можно анализировать подходящими методами. По окончании эксперимента при необходимости количественно оценивают распределение исследуемого вещества и его метаболитов.

3.2. При соответствующих условиях, рассмотренных в данной методике, абсорбцию исследуемого вещества в течение данного периода измеряют путем анализа приемного раствора и обработанной кожи. Исследуемое вещество, оставшееся на коже, нужно рассматривать как абсорбированное, если только не показано, что абсорбция может определяться только из величин приемного раствора. Анализ других компонентов (вещество, смытое с кожи или оставшееся в кожных слоях) позволяет проводить дальнейшую оценку данных, включая полное распределение анализируемого вещества и процент восстановления.

3.3. Для демонстрации правильной постановки и достоверности тестовой системы в испытательной лаборатории результаты для соответствующих контрольных веществ должны быть доступны и соответствовать данным, опубликованным для используемого метода в литературе. Данное требование может быть удовлетворено путем тестирования соответствующего контрольного (справочного) вещества (предпочтительно с липофильностью, близкой к исследуемому веществу) параллельно с исследуемым веществом или путем рассмотрения соответствующих литературных данных для ряда контрольных (справочных) веществ с различной липофильностью (например, кофеин, бензойная кислота или тестостерон).

4. Описание метода

4.1. Подготовка

4.1.1. В эксперименте может использоваться кожа человека или животных. Необходимо, чтобы при использовании кожи человека соблюдались национальные, международные и этические нормы. Предпочтительно использовать жизнеспособную кожу, нежизнеспособная кожа также может использоваться при условии, что подтверждена ее целость. Пригодными для применения являются как эпидермальные мембраны (разделенные обработкой энзимами, теплом или химическим способом), так и расщепленные кожные образцы (обычно 200-400 мкм толщиной), подготовленные с дерматом. Может использоваться кожа обычной толщины, но избыточной толщины кожи (приблизительно >1 мм) следует избегать, если только это не является специальным требованием для определения вещества в слоях кожи. Важно, чтобы кожа была предварительно подготовлена. Несоответствующая обработка может привести к повреждению рогового слоя, поэтому целость подготовленной кожи должна быть проверена. При исследовании кожного метаболизма свежесрезанная кожа должна быть использована как можно быстрее при условиях, поддерживающих метаболическую активность. Свежесрезанная кожа должна быть использована в течение 24 часов, но приемлемый период хранения кожи может изменяться в зависимости от системы энзимов, вовлеченных в метаболизм, и температур хранения. Когда пробы кожи хранятся до использования, необходимо убедиться, что барьерная функция поддерживается.

4.1.2. Исследуемое вещество - это вещество, характеристики проникновения которого в кожу должны быть изучены. В идеале анализируемое вещество должно иметь радиоактивную метку. Исследуемое вещество (например, чистый, разбавленный или смешанный материал, содержащий исследуемое вещество, которое наносится на кожу) должно быть подготовлено в той же форме (или в форме соответствующего суррогата), в которой человек или другие потенциальные целевые виды могут подвергаться его воздействию. Любое отклонение от подготовительного процесса должно быть оправданным. Обычно используются две и более концентрации исследуемого вещества, охватывающие реальный диапазон доз потенциального воздействия на организм человека. Также должен быть рассмотрен экспериментальный диапазон типичных составов. При нормальных условиях воздействия химических веществ на организм человека обычно сталкиваются с конечными дозами. Следовательно, необходимо использовать накожные аппликации, которые имитируют воздействие на организм человека. Нанесение вещества, имитирующее экспозицию человека, составляет 1-5 кожи для твердых веществ и до 10 для жидкостей. Количество должно быть обосновано ожидаемыми условиями проведения испытания, целями исследования и физическими характеристиками пробы. Например, нанесения на кожу могут быть бесконечными там, где применяются большие объемы на единицу поверхности.

4.1.3. На пассивную диффузию веществ и, соответственно, на кожное всасывание влияет температура. Для диффузионной камеры и кожи должна поддерживаться постоянная температура, близкая к нормальной температуре кожи . Различные конструкции ячеек требуют применения различных водяных бань и нагреваемых температурных блоков для поддержания физиологической нормы для кожи и приемного раствора. Предпочтительно поддерживать влажность в диапазоне между 30 и 70%.

4.1.4. Диффузионная ячейка.

Диффузионная ячейка (рисунок) состоит из донорской и приемной камер, между которыми помещается кожа (пример типичного устройства приведен на рисунке). Ячейка должна обеспечивать герметичность вокруг кожи, способствовать легкому приготовлению образцов и хорошему перемешиванию приемного раствора в контакте с обратной стороной кожи, оптимальный температурный контроль ячейки и ее содержимого. Для проведения эксперимента подходят как статические, так и проточные диффузионные ячейки. Донорские ячейки оставляют открытыми во время экспозиции определенной дозой экспериментальной пробы. Для неопределенных доз или при конкретных программах для определенных доз ячейки могут быть закрыты.

4.1.5. Предпочтительно использовать физиологически проводящий приемный раствор, однако могут использоваться и другие растворы при условии, что их применение обосновано. Необходимо знать точный состав приемного раствора. Исследуемое вещество должно быть достаточно растворимо в приемном растворе таким образом, чтобы это не мешало абсорбции. Приемный раствор не должен оказывать влияния на целость образца кожи. В динамических системах скорость потока не должна мешать диффузии исследуемого вещества в приемном растворе. В статических системах приемный раствор должен постоянно перемешиваться и регулярно обновляться. При изучении метаболизма приемный раствор должен поддерживать жизнеспособность кожи на протяжении всего эксперимента. Подбор видов, анатомическое место и техника препарирования должны быть обоснованы. Необходимо получение достоверных данных, как минимум, четырех повторных экспериментов для исследуемого вещества.

4.2. Условия проведения эксперимента

Экспозиция кожи исследуемым веществом может продолжаться в течение всего эксперимента или в течение более коротких периодов (то есть для имитации специфического типа воздействия на организм человека). Кожа должна быть промыта от избытка исследуемого вещества подходящим раствором моющего вещества, а промывочный раствор должен быть собран для анализа. Процедура удаления исследуемого вещества будет зависеть от предполагаемых условий использования и должна быть обоснована. Для получения характеристики абсорбционного профиля требуется период наблюдений в 24 часа. Поскольку целость кожи может быть нарушена после 24 часов, период наблюдений не должен превышать этого времени. Для исследуемых веществ, которые проникают в кожу быстро, это может быть не так важно, но для веществ, которые проникают медленно, могут потребоваться более длинные периоды. Частота отбора проб приемного раствора должна позволять представить абсорбционный профиль вещества графически.

5. Данные, анализ и отчет

5.1. Должны быть представлены данные по приемному раствору, распределению исследуемого вещества в тестовой системе, абсорбционному профилю в зависимости от времени. При использовании определенных доз должны быть рассчитаны количество вещества, смытого с кожи, количество, оставшееся на коже (и в различных слоях кожи, если проводился анализ) и количество вещества, присутствующее в приемном растворе (степень, количество и процентное содержание от используемой дозы). Иногда кожно-резорбтивное действие может выражаться с использованием только данных приемного раствора. В случае, когда исследуемое вещество остается на коже, данное количество следует включать в общее количество поглощенного вещества. При использовании неопределенных доз полученные данные могут позволять рассчитывать константу проницаемости. В последнем случае процент поглощенного вещества не может быть рассчитан.

5.2. Все компоненты тестовой системы должны быть проанализированы и определен результат. Компоненты включают донорскую камеру, смыв с поверхности кожи, пробу кожи, а также приемный раствор и приемную камеру. В некоторых случаях кожа может быть разделена на область, подвергавшуюся воздействию, и другие области, например: на роговой слой, эпидермис и дермальную фракцию для проведения отдельного анализа. Во всех исследованиях должны быть получены адекватные результаты (целью должно быть среднее значение радиоактивности , а любые отклонения должны быть обоснованы). Должны быть проанализированы с использованием подходящих методов количество исследуемого вещества в приемном растворе, проба кожи, смывы с поверхности кожи и приборов.

5.3. Отчет о проведении испытания должен включать требования, предусмотренные тестовым протоколом, в том числе обоснование использования данной тестовой системы, и содержать следующую информацию:

Исследуемое вещество:

- физическая природа, физико-химические свойства (как минимум, молекулярная масса и log Pow - коэффициент разделения), чистота (радиохимическая чистота);

- идентификационные данные (например, номер партии);

- растворимость в приемном растворе.

Проба исследуемого вещества:

- состав и обоснование использования;

- гомогенность.

Условия проведения эксперимента:

- исходная информация, источник и место расположения вырезаемого участка кожи, метод подготовки, условия хранения до использования, предварительная подготовка (очистка, обработка антибиотиком и т.д.), измерения целости кожи, метаболический статус, обоснование использования;

- устройство ячейки, состав приемного раствора, скорость течения приемного раствора или период наблюдений и процедуры;

- описание нанесения исследуемого вещества и количественное описание нанесенных доз;

- продолжительность экспозиции;

- описание удаления исследуемого вещества с кожи, например, промывка кожи;

- описание анализа кожи, способы фракционирования, используемые для демонстрации распределения кожи;

- процедуры промывки ячейки и оборудования;

- методы исследований, способы экстракции, пределы определения и аналитические методы проверки достоверности.

Результаты:

- все результаты эксперимента (нанесенная доза + смывы с кожи + кожа + приемный раствор + смывы с ячейки);

- табличное представление результатов ячейки для каждого эксперимента;

- абсорбционный профиль;

- табличное представление данных об абсорбции (выраженных как степень, количество и процентное соотношение).

Обсуждение результатов.

Выводы.