Приложение 6.6.2. Тест Хешбергера на крысах: краткосрочное скрининговое исследование для выявления (анти)андрогенных свойств

Приложение 6.6.2

Тест Хешбергера на крысах: краткосрочное скрининговое исследование для выявления (анти)андрогенных свойств

Идентичен международному документу OECD TG N 441 "Hershberger Bioassay in Rats: A Short-term Screening Assay for (Anti)Androgenic Properties" (ОЭСР Руководство N 441 "Тест Хешбергера на крысах: краткосрочное скрининговое исследование для выявления (анти)андрогенных свойств"). Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Тест Хешбергера был стандартизирован официальным экспертным комитетом в 1962 г. как инструмент для исследования андрогенных веществ. В 2001-2007 гг. тест Хешбергера на крысах подвергся обширной программе валидизации, включая создание документа, представляющего собой компиляцию детально разработанных методов из диссертационных работ, разработку руководства по препарированию животных и подробное руководство для проведения обширных внутренних и межлабораторных исследований для доказательства надежности и воспроизводимости этого теста. Данное руководство к проведению исследований является результатом обобщения длительного исторического опыта проведения биотестирования, а также опыта, полученного во время тестирования валидности и анализа полученных результатов. Исследования валидности проводились с использованием: сильного референсногоандрогена (тестостерон пропионат - ТП), двух сильных синтетических андрогенов (тренболон ацетат и метилтестостерон), сильного антиандрогенного фармацевтического продукта (Флютамид), сильнодействующего ингибитора синтеза (Финастерид), естественного андрогена (дигидротестостерон DHT), нескольких слабых антиандрогенных пестицидов (линурон, винклозолин, процимидон, ppDDE), сильного ингибитора 5а-редуктазы (Финастерид) и двух известных негативно воздействующих веществ (динитрофенол и нонилфенол).

1.2. Тест Хешбергера - это in vivo экспресс-скрининг-тест, использующий ткани мужского полового тракта для тестирования андрогенов и антиандрогенов. В 1960-х годах были проверены более 700 потенциальных андрогенов с помощью стандартизированной версии протокола. Тест основан на определении изменения веса пяти андроген-зависимых тканей кастрированных препубертатных самцов крысы. Он позволяет оценить способность вещества проявлять биологическую активность, соответствующую действию агонистов и антагонистов андрогенов или ингибиторов .

Для тестирования используются следующие пять андроген-зависимых тканей-мишеней: вентральная простата (VP), семенные пузырьки вместе со свертывающей железой и содержащимися жидкостями (SVCG), мышца, поднимающая задний проход плюс луковично- пещеристая мышца (LABC), парная бульбоуретральная железа (куперова железа) (CG) и головка пениса (GP). У кастрированных препубертатных самцов крысы эти пять тканей отвечают на андрогены увеличением абсолютного веса. Вес тканей увеличивается при воздействии сильного андрогена, но те же пять тканей реагируют на антиандрогены уменьшением абсолютного веса. Основной моделью теста Хешбергера являются хирургически кастрированные препубертатные самцы крысы, описанные в 1, 2 и 3 фазах программы валидизации теста Хешбергера.

1.3. Тест Хешбергера является механистической скрининговой процедурой in vivo для агонистов и антагонистов андрогенов и для ингибиторов , и его использование следует рассматривать в контексте документа "Концептуальная основа ОЭСР для тестирования и оценки веществ, нарушающих эндокринные функции" (прилож. 2)*.

В рамках этой Концепции тест Хешбергера используется на Уровне 3, в качестве in vivo анализа, позволяющего получать информацию об одном эндокринном механизме, а именно, об (анти-)андрогенности. Тест планируется включить в совокупность других in vivo и in vitro анализов для идентификации веществ, способных воздействовать на эндокринную систему с целью определения их опасности и оценки риска для здоровья человека и для окружающей среды.

1.4. Модификация теста Хешбергера с использованием стимулируемой некастрированной мужской особи в качестве альтернативной модели, не предусматривающей кастрации животного, не включена в данное руководство. Метод стимуляции некастрированной мужской особи был валидизирован; валидизационные исследования показали, что при использовании этого варианта теста Хешбергера, невозможно отличить влияние слабых андрогенов на массу ткани от результатов воздействия слабых антиандрогенов в использовавшихся дозировках.

1.5. Документ предназначен для испытательных лабораторий организаций Министерства здравоохранения Российской Федерации, Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также может быть использован научно-исследовательскими организациями, учреждениями высшего профессионального образования и иными организациями и учреждениями, аккредитованными в установленном порядке.

2. Общие положения

2.1. Агонисты и антагонисты андрогенов действуют в качестве лигандов рецептора андрогена и могут активировать либо ингибировать транскрипцию генов, регулируемых рецептором. Кроме того, некоторые вещества (ингибиторы ) ингибируют преобразование тестостерона в более мощный естественный андроген - дигидротестостерон в некоторых тканях-мишенях андрогенов. Такие вещества могут представлять опасность для здоровья, вызывая репродуктивные нарушения и нарушения развития организма. Поэтому существует необходимость быстро и точно распознавать такие вещества, как андроген-агонисты или антагонисты, или ингибиторы .

Несмотря на информативность, величина аффинности лиганда рецептора андрогена, определяемая in vitro методом анализа связывания с рецептором или методом транскрипционной активации репортерных генов, является не единственным показателем оценки опасности вещества. К другим причинам, определяющим опасность, относится метаболическая активация и инактивация вещества после попадания в организм, характер его распределения по тканям-мишеням и скорость выведения из тела.

Все это вызывает необходимость распознать возможную активность вещества in vivo при соответственных условиях и экспозиции. Оценка in vivo становится менее важной, если такие характеристики вещества, как абсорбция - распределение - метаболизм - выведение (ADME) являются известными. Андроген-зависимые ткани отвечают быстрым и энергичным ростом в ответ на стимуляцию андрогенами, в особенности у кастрированных препубертатных самцов крысы. Грызуны, особенно крысы, так же широко используются в исследовании токсичности для оценки риска. Поэтому вариант анализа, в котором используются кастрированные препубертатные крысы и пять тканей-мишеней, является подходящим для in vivo скринирования потенциальных агонистов и антагонистов андрогена, и ингибиторов .

2.2. Данный метод тестирования основан на протоколах, которые, в соответствии с валидизацией ОЭСР, являются надежными и воспроизводимыми во внутри- и межлабораторных исследованиях. В методе представлены протоколы исследования как агонистов, так и антагонистов андрогенов.

2.3. Несмотря на некоторый разброс дозы ТП, применявшейся для определения антиандрогенов в программе валидизации теста Хешбергера различными лабораториями (0,2 против 0,4 мг/кг/день, подкожная инъекция), различие между этими двумя вариантами протоколов в способности выявлять слабую или сильную антиандрогенную активность практически отсутствовало. Доза ТП не должна быть слишком высокой, чтобы не блокировать действие слабых антагонистов андрогенного рецептора (AR), или настолько низкой, что андрогенно-зависимые ткани обнаруживали бы некоторое увеличение веса даже без ко-администрирования антиандрогена.

2.4. Ответный рост выбранных андроген-зависимых тканей определяется не только лишь андрогенами, но и другими веществами, отличными от агонистов андрогенов. Одновременный ответный рост нескольких видов тканей дает более веское подтверждение андрогенспецифичного механизма. Например, высокие дозы сильных эстрогенов могут увеличивать вес семенных везикул, однако другие андроген-зависимые ткани в данном тесте не отвечают подобным образом.

Антиандрогенные вещества могут действовать либо как антагонисты андрогенного рецептора, либо как ингибиторы . Ингибиторы дают вариабельный эффект, потому что преобразование в более мощный дигидротестостерон варьирует от ткани к ткани. Антиандрогены, которые ингибируют , такие как финастерид, имеют более заметное воздействие на вентральную простату, чем на другие ткани, по сравнению с таким сильным антагонистом AR, как флутамид. Такое различие в ответе разных тканей можно использовать для различия между AR и механизмами действия. Кроме того, AR эволюционно связан с рецепторами других стероидных гормонов и другие гормоны при высокой сверхфизиологической дозировке могут связываться с ним и противодействовать ростстимулирующему эффекту ТП. Кроме того, повышение метаболизма стероидов и понижение вследствие этого тестостерона в сыворотке, может уменьшить андроген-зависимый рост ткани. Поэтому любой положительный результат теста Хешбергера, как правило, следует оценивать с учетом совокупности свидетельств, включая, например, in vitro анализ связывания с AR и с рецептором эстрогена (ER), соответствующие анализы трансактивации транскрипции или другие in vivo анализы, оценивающие подобные ткани под воздействием андрогенов.

2.5. Опыт показывает, что ксенобиотики-андрогены встречаются реже, чем ксенобиотики-антиандрогены. Поэтому ожидается, что тест Хешбергера будет чаще использоваться для скрининга антиандрогенов. Однако процедуру тестирования андрогенов, можно рекомендовать для стероидных или стероидоподобных веществ, или для веществ, для которых указания на возможные андрогенные эффекты были получены методами, представленными в Уровне 1 или 2 Руководства (прилож. 2). Аналогично отрицательные эффекты, ассоциированные с (анти-)андрогенными профилями, могут наблюдаться в анализах Уровня 5, что требует определить, не действует ли исследуемое вещество через эндокринные механизмы.

2.6. Общепризнано, что все опыты на животных должны соответствовать местным стандартам защиты животных; описание содержания и обращения с животными, сформулированные ниже, являются минимальными требованиями, и должны подчиняться более строгим местными стандартам в случае несоответствия. Дальнейшие указания по поводу гуманного обращения с животными даются ОЭСР.

2.7. Как и в любом другом биотесте с использованием экспериментальных животных, должна быть тщательно обоснована необходимость проведения таких исследований. В целом могут быть только две причины для использования лабораторных животных:

- высокая опасность экспозиции (Уровень 1 Руководства) или свидетельства (ан- ти)андрогенности, полученные в in vitro исследованиях (Уровень 2), подтверждающие возможность такого же действия in vivo;

- наблюдается эффект, согласующийся с (анти)андрогенностью в in vivo экспериментах Уровня 4 или 5 по проверке конкретного механизма действия вещества, например проверки опосредования эффекта (анти-)андрогенным механизмом.

3. Принцип метода

3.1. Выбор вида животных и генетической линии

3.1.1. Крысы использовались в тесте Хешбергера в течение 70 лет и именно крысы выбраны для проведения теста Хешбергера в настоящее время. Поскольку результаты теста Хешбергера могут являться предварительными для долгосрочного исследования на нескольких поколениях, это позволяет использовать в экспериментах как крыс, так и мышей одного и того же вида, линии и от одного и того же поставщика.

3.1.2. Протокол позволяет лабораториям выбрать для исследования генетическую линию крыс, которая исторически используется данной лабораторией, или часто используемые линии крыс. Нельзя использовать животных, которые биологически созревают значительно позже, чем за 42 дня, так как при проведении кастрации особей в возрасте 42 дней возможно не удастся измерить изменение веса головки полового члена, что может быть сделано лишь после того, как крайняя плоть отделена от ствола полового члена. Крысы, происходящие от линии Fisher 344, за редким исключением, не должны использоваться, поскольку у них другое время полового созревания, по сравнению с наиболее часто используемыми линиями, как Sprague Dawley или Wistar. Если линия Fisher 344 все-таки используется, крысы должны быть кастрированы в несколько более старшем возрасте и лаборатория должна подтвердить, что они имеют достаточную чувствительность в эксперименте. Лаборатория должна предоставить четкое обоснование для выбора определенной линии крыс. В случае если тестирование может являться предварительным для последующего определения оральной дозы, для изучения развития, репродукции или для долгосрочного исследования, предпочтительно использовать животных одной линии и от одного поставщика на всех этапах данного исследования.

3.2. Условия содержания и кормления

3.2.1. Все процедуры должны соответствовать местным стандартам содержания лабораторных животных. Приведенные процедуры содержания и обращения с животными являются минимальными стандартами и должны подчиняться более строгим местными стандартам в случае несоответствия. Температура в помещении с экспериментальными животными должна быть 22°С (с диапазоном ). Относительная влажность не меньше 30% и не выше 70% (кроме периода уборки помещения). Оптимально поддержание относительной влажности 50-60%. Освещение должно быть искусственным. Ежедневная продолжительность освещения должна составлять 12 часов света, 12 темноты.

3.2.2. Предпочтительно содержать животных не изолированно, а в группах, из-за молодого возраста и социальности животных. Содержание двух или трех животных в одной клетке помогает избегать перенаселенности и связанного с этим стресса, что могло бы отразиться на гормональном контроле развития исследуемых половых тканей. Клетки должны быть тщательно вычищены, чтобы удалить возможные загрязнители, и расположены так, чтобы минимизировать возможные эффекты от их расположения. Клетки должны быть надлежащего размера (), что предотвратит скученность.

3.2.3. Каждое животное должно быть идентифицировано индивидуально (маркировкой уха или меткой) с использованием гуманных методов. Метод идентификации должен быть задокументирован.

3.2.4. Питьевая вода и корм предоставляются ad libitum. Лаборатории, выполняющие тест Хешбергера, должны использовать питание, обычно используемое в лаборатории при тестировании веществ. В экспериментах по валидизации теста Хешбергера не было обнаружено никаких эффектов или вариабельности, связанных с используемым питанием. Состав используемой диеты должен быть задокументирован и образец рациона сохранен для анализа, если потребуется.

3.3. Критерии результатов теста Хешбергера для исследования андроген-зависимых изменений веса органов

3.3.1. В эксперименте по валидизации не было обнаружено никаких свидетельств, что уменьшение массы животного вызывало бы относительное увеличение или уменьшение веса тканей, используемых для исследования.

3.3.2. Среди различных линий крыс, успешно использовавшихся при валидизации теста Хешбергера, вес андроген-зависимых органов был выше у больших по весу линий крыс, чем у более легких. Поэтому критерии теста Хешбергера не включают абсолютную величину веса органа для положительных и отрицательных контролей.

3.3.3. Поскольку коэффициент вариации (CV)* веса ткани имеет обратную зависимость от статистической значимости, критерии теста Хешбергера основаны на максимальных значениях CV для каждой ткани (таблица).

Результаты получены в процессе экспериментов по валидизации ОЭСР. В случае отрицательных результатов необходимо проверить CV в контрольной группе и в группе с большей дозой воздействия, чтобы определить, не был ли превышен критерий максимального (CV).

Таблица

Максимальные допустимые CV, определенные для исследуемых тканей-мишеней, для модели с использованием кастрированных животных в экспериментах валидизации ОЭСР*

Ткань	Антиандрогенный эффект, %	Андрогенный эффект, %
Семенные пузырьки	40	40
Вентральная простата	40	45
Мышца, поднимающая анус, и луковично-пещеристая мышца	20	30
Бульбоуретральная железа (куперова железа)	35	55
Головка пениса	17	22
* Пороговое значение CV для каждой ткани определялось из графика значений CV, расположенных последовательно от самого маленького значения к самому большому, - для всех средних значений всех экспериментов, проводившихся при валидизации теста для каждой модели (тестирование агонистов и антагонистов). Пороговое значение CV определялось как точка, в которой приращение для следующих более высоких значений ряда резко возрастало по сравнению с предшествующими приращениями. Нужно отметить, что хотя этот анализ идентифицировал относительно надежные пороговые значения для антагонистической модели испытания, кривые значений в тесте с агонистами показали более однородные увеличения, делая определение пороговых значений описанным способом несколько произвольными

3.3.4. Исследование должно быть повторено, если:

1) три или больше из десяти возможных индивидуальных СV в контрольной группе и в группе с большей дозой воздействия превышают максимумы, допустимые при тестировании агонистов и антагонистов, представленных в таблице;

2) по крайней мере, в двух исследуемых тканях эффект оказался на грани достоверности (т.е. имел р-значение между 0,05 и 0,1).

4. Описание метода

4.1. Соответствие лаборатории требованиям документа

В отличие от утеротропного анализа (TG 440), перед проведением теста Хешбергера не требуется демонстрировать компетентность лаборатории, потому что положительный (тестостерон пропионат и флутамид) и отрицательный контроли проводятся одновременно с опытом как неотъемлемая часть исследования.

4.2. Количество и состояние животных

Каждая экспериментальная и контрольная группы включают минимум 6 животных. Это относится и к андрогенным, и к антиандрогенным вариантам проведения эксперимента.

4.3. Кастрация

Необходим начальный период адаптации в несколько дней после прибытия животных, чтобы убедиться, что они здоровы и находятся в хорошем состоянии. Поскольку животные, кастрированные до достижения постнатального возраста 42 дней, могут не обнаружить отделения крайней плоти, животных, используемых в эксперименте, кастрируют непосредственно в постнатальный или на следующий день, но не раньше. Животных кастрируют под анестезией; делают разрез на мошонке и удаляют оба яичка с перевязкой придатка семенника, кровеносных сосудов и семенных протоков. Убедившись, что нет кровотечения, мошонку зашивают или закрывают скрепками. Первые несколько дней после операции животные должны находиться под анальгетиками для облегчения постхирургического дискомфорта. Если кастрируемые животные были закуплены у поставщика, то он должен предоставить сведения по возрасту животных и стадии половой зрелости.

4.4. Адаптация после кастрации

Животные должны продолжить адаптацию к лабораторным условиям в течение минимум 7 дней после кастрации, чтобы произошло уменьшение веса тестируемых тканей. Животных осматривают ежедневно, животных с симптомами заболеваний или физических отклонений исключают из эксперимента. Первое введение дозы тестируемого вещества можно произвести уже на 49-й постнатальный день, но не позже, чем на 60-й постнатальный день. Возраст на момент аутопсии не должен превышать 70 постнатальных дней. Эта гибкость сроков позволяет лаборатории эффективно планировать экспериментальную работу.

4.5. Масса тела и рандомизация группы

Различия индивидуальной массы тела приводят к внутри- и межгрупповой вариабельности веса образцов тканей. Увеличение вариабельности веса образцов тканей приводит к увеличению коэффициента вариации и уменьшению статистической мощности анализа (иногда называемой чувствительностью испытания). Поэтому изменение массы тела контролируют и экспериментально, и статистически.

Экспериментальный контроль проводят для уменьшения внутри- и межгрупповой вариабельности массы тела. Во-первых, слишком мелких и слишком крупных животных исключают из исследования. В начале исследования вариабельность массы тела используемых животных не должна превышать среднего веса (например, г для кастрируемых препубертатных крыс). Во-вторых, животных распределяют по группам (и контроль, и опыт) случайным образом, так чтобы средний вес животного в каждой группе статистически не отличался от любой другой группы. Используемую процедуру блочной рандомизации документируют.

Токсичность вещества может снижать массу тела животных экспериментальных групп по отношению к животным контрольной группы, поэтому массу тела в первый день введения дозы (но не массу тела при аутопсии) используют в качестве ковариаты при анализе.

4.6. Дозирование

Чтобы установить, может ли тестируемое вещество оказывать андрогенное действие in vivo, обычно используют две экспериментальные группы с различными дозами тестируемого вещества, плюс группа положительного контроля и группа контроля используемого носителя (отрицательный контроль). Такой порядок проведения эксперимента также предпочтителен по причинам защиты животных. Если целью является получение кривой доза-эффект или экстраполяция на более низкие дозы, используют, по крайней мере, 3 группы с разными дозами. Если помимо простого выявления андрогенной активности требуется дополнительная информация (например, оценка потенциальной опасности тестируемого вещества), используют иной режим дозирования. При тестировании на антиандрогенную активность, тестируемое вещество вводят совместно с референсным агонистом андрогена. В тестровании используют минимум 3 группы животных с различными дозами тестируемого вещества, плюс группы положительного и отрицательного контроля. За исключением введения тестируемого вещества, содержание и обращение с животными контрольной и экспериментальной групп должно быть идентичным. Если при введении тестируемого вещества используется носитель, то контрольные группы также должны получать носитель в объеме, равном максимальному используемому объему в экспериментальных группах.

Выбор уровня доз проводят с учетом имеющихся данных по токсичности и токсико- кинетике для тестируемого или родственных веществ. При выборе самого высокого уровня дозы сначала учитывают и/или информацию по острой токсичности, чтобы избежать смерти, мучений или стресса животных и информацию о дозах, используемых в субхронических и хронических исследованиях. В целом самая высокая доза не должна вызывать снижения итоговой массы тела больше, чем на 10% от контроля.

Самая высокая доза должна быть: 1) либо самой высокой дозой, которая гарантирует выживание животных без существенной токсичности или причинения страданий животным после 10 дней проведения эксперимента, вплоть до максимума в 1 000 мг/кг/день; 2) либо самой высокой дозой, вызывающей (анти)андрогенное воздействие, при этом из них - наиболее низкая. При скринировании приемлемы дозы с большим шагом разведения, например, 1/2 lg (что соответствует шагу дозы в 3,2 раза) и даже в 1 lg. Если нет подходящих доступных данных, проводят предварительное исследование для определения диапазона доз основного исследования.

4.7. Предельный уровень дозы

Если тестирование предельной дозы в 1 000 мг/кг/день и более низких доз, используемых при тестировании, не выявляет статистически достоверного изменения массы исследуемых вспомогательных половых тканей, то дополнительные высокие уровни доз не проверяют. Указанную предельную дозу не увеличивают, за исключением тех случаев, когда из данных по реальному уровню экспозиции людей следует необходимость использования более высокой дозы.

4.8. Рекомендации по выбору диапазона доз

При необходимости проводят предварительное определение диапазона доз, используя нескольких животных из основного исследования [пересмотренные Руководства ОЭСР для тестирования острой токсичности (TG 420, TG 423, TG 425)].

В тесте Хершбергера выбирают дозы, которые гарантируют выживание животных без существенной токсичности или причинения страданий животным после 10 дней проведения эксперимента, вплоть до максимума в 1000 мг/кг/день. Если эти требования в эксперименте по определению диапазона выполняются, то после 10 дней введения дозы, приблизительно через 24 часа после введения последней дозы, проводят аутопсию и определяют вес исследуемые ткани. Эти результаты используют для выбора доз основного исследования.

4.9. Используемые референсные вещества и носитель

В качестве референсного агониста используют тестостерон пропионат (ТП), CAS N 57-82-5. Используемая доза референсного ТП может составлять либо 0,2 мг/кг/день или 0,4 мг/кг/день. В качестве референсного антагониста используют флутамид (ФТ), CAS N 1311-84-7. Используемая доза референсного ТП составляет 3 мг/кг/день. ФТ необходимо вводить совместно с дозой референсного агониста ТП.

Если возможно, используют водный раствор/суспензию вещества. Однако, поскольку многие лиганды рецептора андрогена AR или их метаболические предшественники являются гидрофобными, используют раствор/суспензию в масле (например, в кукурузном, арахисовом, кунжутном или оливковом). Тестируемые вещества могут быть растворены в минимальном объеме 95%-го этанола или другого подходящего растворителя, а затем растворены в используемом носителе до конечных рабочих концентраций. Токсические свойства растворителя проверяют на отдельной контрольной группе. Если тестируемое вещество является устойчивым, ускоряют его растворение с помощью осторожного нагрева и энергичного механического перемешивания. Стабильность тестируемого вещества определяют в используемом носителе. Если тестируемое вещество является стабильным в течение всего исследования, готовят одну аликвоту рабочего раствора, а используемые дозировки разводят ежедневно с соблюдением всех предосторожностей для предотвращения контаминации.

4.10. Введение дозы

ТП вводят подкожно, а ФТ - принудительно внутрижелудочно.

Тестируемое вещество вводят либо принудительно внутрижелудочно, либо подкожно. При выборе способа введения тестируемых веществ учитывают соображения защиты животных и сохранения физических/химических свойств тестируемого вещества. Кроме того, учитывают токсикологические аспекты поступления вещества в человеческий организм (например, принудительно внутрижелудочно - в качестве модели поступления с пищей или водой; подкожная инъекция - в качестве модели вдыхания или кожной абсорбции). Также учитывают существующую токсикологическую информацию и данные по метаболизму и кинетике (например, чтобы избежать досистемного метаболизма, для выбора маршрута воздействия и наибольшей эффективности).

Дозы вводят животным в одно и то же время, одним и тем же способом в течение десяти дней подряд - приблизительно с 24-часовыми интервалами. Уровень дозы ежедневно корректируют в соответствии с ежедневным измерением массы тела животного. Объем и время введения дозы регистрируют ежедневно. Снижение массы тела, клинические показатели и другие наблюдаемые изменения учитывают при интерпретации. Для принудительного внутрижелудочного введения используют желудочный зонд или подходящую интубационную канюлю. Максимальный объем жидкости, который используют одномоментно, зависит от размера экспериментального животного. Необходимо следовать местным руководствам по уходу за животными, однако объем не должен превышать 5 мл/кг массы тела, за исключением использования водных растворов, для которых допустимый максимум составляет 10 мл/кг массы тела. При подкожных инъекциях дозу вкалывают в лопаточную или поясничную область стерильной иглой (размер 23-25), используя инсулиновый шприц. Места инъекции не бреют. Любые потери, утечка в месте инъекции или неполное дозирование регистрируют. Суммарный объем, введенный крысе за день, не должен превышать 0,5 мл/кг массы тела.

4.11. Особенности процедуры тестирования для агонистов андрогена

Для тестирования агонистов андрогена в качестве отрицательного контроля используют носитель, а в качестве положительного контроля - ТП. Для проверки андроген-агонистической активности выбранные дозы тестируемого вещества вводят экспериментальным группам ежедневно, в течение 10 дней подряд. Проверяют наличие статистически значимого увеличения веса пяти половых тканей в экспериментальных группах, по сравнению с группой контроля носителя.

4.12. Особенности процедуры тестирования для антагонистов андрогена и ингибиторов

При тестировании антагонистов андрогена и ингибиторов 5а-редуктазы группе отрицательного контроля вводят ТП, а группе положительного контроля вводят ФТ совместно с референсным агонистом ТП. Для проверки активности, характерной для антагонистов андрогена и ингибиторов выбранные дозы тестируемого вещества и референсного ТП вводят экспериментальным группам ежедневно, в течение 10 дней подряд. Проверяют наличие статистически значимого снижения веса пяти проверяемых добавочных половых тканей в экспериментальных группах (тестируемое вещество плюс референсный ТП) по сравнению с группой отрицательного контроля (только ТПР).

5. Анализ и интерпретация данных

5.1. Клинические наблюдения

Общеклинические наблюдения проводят, по крайней мере, один раз в день, а при обнаружении признаков токсичности - более часто. Наблюдения предпочтительно проводить в то же самое время суток, с учетом интервала проявления ожидаемых пиковых эффектов после введения дозы. Все животные должны наблюдаться на предмет заболеваемости и общих клинических признаков, таких как изменения поведения, кожи, меха, глаз, слизистых оболочек, появление секреции и выделений, изменение автономной активности (например, слезоточивость, пилоэрекция, размер зрачка, необычный дыхательный паттерн).

Умершее животное удаляют из клетки и утилизируют, собранные данные в дальнейшем анализе не используют. Информацию о смерти животного документируют вместе с описанием очевидных причин гибели. Умирающих животных умерщвляют гуманным способом. Информацию об умирающих и впоследствии подвергнутых эвтаназии животных документируют с описанием очевидных причин заболевания.

5.2. Масса тела и потребление пищи

Всех животных ежедневно взвешивают с точностью до 0,1 г, начиная перед началом тестирования, когда животные уже поделены на группы. Дополнительно измеряют количество еды, потребленной в каждой клетке за время эксперимента, путем взвешивания дозаторов корма. Потребление пищи выражают в граммах на крысу за день.

5.3. Вскрытие и взвешивание тканей и органов

Спустя 24 часа после последнего введения тестируемого вещества крыс подвергают эвтаназии и обескровливают согласно обычной процедуре, принятой в лаборатории, после чего проводят аутопсию. Способ гуманного умерщвления должен быть указан в лабораторном отчете. Порядок проведения аутопсии рандомизируют по всем группам в направлении возрастания или убывания дозы. Любые особенности, обнаруженные при аутопсии, как то: патологические изменения; видимые повреждения, отмечают и протоколируют. Определяют вес пяти андроген-зависимых тканей (VP, SV, LABC, COW, GP). Ткани вырезают, тщательно отделяют от излишков прилегающих тканей и жира и взвешивают непосредственно после выделения. С каждой тканью необходимо обращаться с особой осторожностью, чтобы избежать потери жидкости и обезвоживания, что может внести значительные ошибки, приводя к занижению веса и вариабельности результатов. Некоторые ткани имеют очень маленький размер или плохо поддаются диссекции, что также повышает вариабельность. Поэтому важно, чтобы персонал, проводящий диссекцию добавочных половых тканей, владел стандартными процедурами диссекции этих тканей. Стандартный протокол действий (SOP) по диссекции доступен в OECD. Тщательное практическое обучение в соответствии с руководством по диссекции (SOP) позволит минимизировать опасность увеличения вариабельности при диссекции. В идеале один и тот же прозектор должен заниматься диссекцией всех тканей, чтобы устранить межличностные различия в обработке ткани. Если это невозможно, аутопсию надо спланировать так, чтобы каждый прозектор анализировал свой вид ткани во всех группах, и не возникало ситуации, когда один человек анализирует все ткани в контрольной группе, а кто-то другой занимается тканями из экспериментальных групп. Каждую добавочную половую ткань взвешивают, не осушая, с точностью до 0,1 мг, для каждого животного регистрируют вес каждой ткани.

Некоторые ткани имеют очень маленький размер или плохо поддаются диссекции, что повышает разброс данных. Предшествовавшие исследования указали на диапазон значений коэффициента вариации (CV), который, по-видимому, определяется уровнем мастерства лаборатории. В нескольких случаях значительные различия в абсолютном весе тканей VP и COWS наблюдались в пределах одной лаборатории.

Вес печени, двух почек и двух надпочечников может измеряться дополнительно. Ткани освобождают от прилегающих фасций и жира. Вес печени определяют с точностью до 0,1 г, пару почек и пару надпочечников взвешивают с точностью до 0,1 мг, результаты взвешиваний регистрируют. Печень, почки и надпочечники находятся под влиянием андрогенов и являются индикатором системной токсичности.

Измерение уровня лютинизирующего гормона (LH), фолликулостимулирующего гормона (FSH) и тестостерона (Т) в сыворотке необязательно. Однако значение уровня Т в сыворотке позволяет определить, вызывает ли тестируемое вещество индукцию метаболизма тестостерона печенью, понижая его уровень в сыворотке. Не зная уровень Т, этот эффект может быть приписан действию через антиандрогенный механизм. Значение уровня LH дает информацию о способности антиандрогена не только уменьшать вес органа, но и затрагивать гипота- ламическо-гипофизарную функцию, что в долгосрочных исследованиях может вызвать опухоль семенников. FSH является важным гормоном сперматогенеза.

Определение уровня Т4 и Т3 в сыворотке также является необязательным измерением, но может дать полезную дополнительную информацию о способности тестируемого вещества нарушать гомеостаз щитовидной железы. Забор крови для измерения гормонов производят методом сердечной пункции, перед умерщвлением животных. Предварительно крыс обезболивают методом, не влияющим на измерение гормонов. Документируют способ подготовки сыворотки, производителя наборов для радиоиммунного или иного метода анализа, описание аналитических процедур и результаты измерения Т и LH в виде нг/мл сыворотки.

5.4. Процедура диссекции тканей

Подробное руководство и фотографии опубликованы в качестве дополнительных материалов по программе валидизации ОЭСР. Видеозапись проведения диссекции доступна на сайте FDA Кореи (Корейское Управление по контролю за продуктами и лекарствами):

- расположив животное брюшной стороной вверх, проверьте, отделилась ли крайняя плоть члена от головки полового члена. Если это так, сдвиньте крайнюю плоть, удалите головку полового члена, взвесьте и запишите вес с точностью 0,1 мг;

- разрежьте кожу живота и вскройте брюшную полость, обнажив внутренние органы. При проведении взвешивания дополнительных органов удалите и взвесьте печень с точностью 0,1 г, удалите желудок и кишечник, удалите и взвесьте пару почек и пару надпочечников с точностью 0,1 мг. Диссекция этих органов открывает мочевой пузырь и позволяет начать диссекцию исследуемых добавочных половых тканей;

- чтобы вырезать вентральную простату (VP), отделите мочевой пузырь от мышечного слоя брюшины, разрезав соединительную ткань вдоль средней линии. Переместите мочевой пузырь антериально (вперед), к семенным пузырькам (SV), обнажив левый и правый лепестки VP (покрытые слоем жира). Тщательно отделите жир от правого и левого лепестка. Осторожно отодвиньте правый лепесток VP от уретры и отсеките его. Все еще удерживая правый лепесток, осторожно отодвиньте левый лепесток VP от уретры и тоже отрежьте; взвесьте и запишите вес с точностью 0,1 мг;

- чтобы вырезать SVCG, отодвиньте мочевой пузырь в каудальном направлении, открывая семявыносящий проток, правый и левый семенные пузырьки и свертывающую железу (SVCG). Предотвратите утечку жидкости, фиксируя кровоостанавливающий зажим у основания SVCG, где семявыносящий проток присоединяется к уретре. Осторожно отрежьте SVCG с прикрепленным зажимом, отделите жир и ткани, поместите в предварительно взвешенную лодочку, удалите зажим, взвесьте и запишите вес с точностью 0,1 мг;

- чтобы вырезать мышцу, поднимающую задний проход (LA), и луковично-пещерис- тую мышцу (ВС), обнажите эти мышцы и основание пениса. Мышцы LA охватывают прямую кишку, а передние LA и ВС мышцы присоединены к луковице полового члена. На участке от основания полового члена до переднего конца заднего прохода удалите кожу и прилегающие ткани перианальной области. Постепенно отделите мышцы ВС от луковицы полового члена и прилегающих тканей. Прямую кишку разрежьте на две части, после чего отрежьте LABC. Вырезанные LABC освободите от жира и прилегающей ткани, взвесьте и запишите вес с точностью 0,1 мг;

- после удаления LABC становятся видны округлые бульбоуретральные железы (куперовы железы) (CG), располагающиеся дорсально относительно основания луковицы полового члена. Отделите CG с большой осторожностью, чтобы не повредить тонкую капсулу и не допустить потери жидкости. Обе CG взвесьте и запишите вес с точностью 0,1 мг;

- если во время аутопсии или диссекции произошла потеря секрета какой-либо железы, документируйте.

Если для каждого вещества необходима аутопсия большего количества животных, чем приемлемо за один день, то начало исследования распределяют на два последующих дня. Тогда аутопсию и диссекцию тоже распределяют на два дня. При этом, эксперимент планируют так, чтобы в каждый из двух дней использовалась половина животных из каждой группы.

Трупы животных после аутопсии утилизируют принятым в лаборатории способом.

6. Подготовка отчета

6.1. Данные.

Данные представляют индивидуально для каждого животного (масса тела, вес каждой добавочной половой ткани, дополнительные измерения (если проводились) и другие ответы и наблюдения), а также для каждой группы животных (средние величины и стандартные отклонения для всех проведенных измерений). Данные сводят в итоговую таблицу. В начале теста указывают число животных, павших во время теста, число животных, имевших проявления токсичности; приводят описания признаков наблюдаемой токсичности, включая время начала, продолжительность и серьезность манифестации.

6.2. Итоговый отчет включает:

Лаборатория:

- название и адрес лаборатории;

- ответственный исполнитель, другой персонал и их обязанности по проведению тестирования;

- дата начала и конца тестирования: первый день введения тестируемого вещества и последний день проведения аутопсии соответственно.

Тестируемое вещество, реагенты и средства контроля:

- идентичность (название, CAS номер, если имеется), источник, номер партии, чистота, поставщик; характеристики тестируемого вещества;

- физико-химические свойства тестируемого вещества;

- условия хранения, методы и частота подготовки растворов тестируемых веществ, реагентов и контролей;

- стабильность тестируемого вещества;

- любые проводившиеся анализы вводимых растворов/суспензий.

Носитель:

- характеристика носителя (идентичность, поставщик, номер партии);

- обоснование выбора носителя (кроме воды).

Экспериментальные животные и их содержание:

- используемая разновидность/линия крыс, обоснование выбора;

- источник или поставщик животных, включая полный адрес;

- число и возраст поставляемых животных;

- условия содержания (температура, освещение и т.д.);

- корма (название, тип, поставщик, номер партии, состав и, если известно, уровень фитоэстрогенов);

- подстилка (название, тип, поставщик, состав);

- условия содержания в клетке и число животных на клетку.

Условия тестирования:

- возраст при кастрации и продолжительность акклиматизации после кастрации;

- вес каждого животного в начале исследования, с точностью 0,1 г;

- способ рандомизации и информация по разбивке на группы и по клеткам для контроля носителя, референсных веществ и доз тестируемого вещества;

- средняя величина и стандартное отклонение массы тела для каждой группы, для каждого дня эксперимента;

- обоснование выбора дозы;

- путь введения тестируемого вещества и обоснование выбора маршрута поступления;

- в случае теста на антиандрогенность - применение ТП (доза и объем);

- тестируемое вещество (доза и объем);

- время введения дозы;

- процедуры аутопсии, включая метод анестезии и обескровливания;

- если проводился анализ сыворотки, необходимо предоставить детали метода. Например, если используется радиоиммунный анализ (РИА): описание метода РИА, поставщик наборов РИА, сроки годности набора, процедура подсчета сцинтиляции, стандартизация протокола.

Результаты

Ежедневные наблюдения для каждого животного в ходе тестирования:

- масса тела, с точностью 0,1 г;

- клинические признаки (если таковые имелись);

- имеющиеся измерения или примечания о потреблении пищи.

Наблюдения вскрытия трупа для каждого животного:

- дата проведения аутопсии;

- принадлежность группе (контроль, тест, ТП);

- ID животного;

- прозектор;

- время суток, когда проводилась аутопсия и диссекция;

- возраст животного;

- масса тела при аутопсии, отмечая любое статистически значимое увеличение или уменьшение;

- процедура обескровливания и диссекции.

Вес пяти исследуемых целевых тканей:

- вентральная простата VP (с точностью 0,1 мг);

- семенные пузырьки и свертывающая железа (SVCG), включая содержащуюся жидкость (в паре, с точностью 0,1 мг);

- мышца, поднимающая анус, и луковично-пещеристая мышца (LABC) (с точностью 0,1 мг);

- бульбоуретральная железа (куперова железа) (COW) (с точностью 0,1 мг);

- головка полового члена (GP) (с точностью 0,1 мг).

Вес дополнительных тканей, если определялся:

- печень (с точностью 0,1 г);

- почка (пара, с точностью 0,1 мг);

- надпочечник (пара, с точностью 0,1 мг);

- общие замечания и комментарии.

Определение гормонов в сыворотке, если определялось:

- LH в сыворотке (опционально, нг/мл);

- Т в сыворотке (опционально, нг/мл).

Общие замечания и комментарии.

Резюмирование данных

Данные сводят в таблицу, содержащую численность каждой группы, среднюю величину измерения, стандартную ошибку среднего или стандартное отклонение. Таблица включает: массу животного на момент аутопсии; изменение массы тела с начала введения дозы и до аутопсии; вес измерявшихся целевых тканей; вес любых дополнительно измерявшихся органов.

Обсуждение результатов

Анализ результатов

Данные по весу тела и целевых органов на момент аутопсии обрабатывают статистически для определения однородности дисперсий, используя необходимые преобразования данных. Экспериментальные группы сравнивают с контрольной группой, используя такие методы, как ANOVA, с последующим попарным сравнением (например, применяя односторонний тест Даннетта) и указанием критерия статистически значимого различия, например . Группы, дающие статистически достоверные различия, отмечают. При анализе недопустимо использовать "относительный вес органа" из-за ложных статистических предположений, лежащих в основе этого преобразования данных.

Для агонистов андрогенов контролем является группа, получавшая только носитель. Особенности механизма действия тестируемого вещества могут приводить к различию относительного ответа разных тканей, так, например, треболон, который не метаболизируется , сильнее воздействует на LABC и GP, чем на ТР. Положительным результатом для андроген-агонистической активности считается статистически значимое увеличение веса любых двух или более из пяти измеряемых целевых андроген-зависимых тканей (VP, LABC, GP, CG и SVCG). При этом все целевые ткани должны показать определенное увеличение массы. Используя соответствующий многофакторный анализ можно проанализировать увеличение суммарного веса исследуемых тканей. Это может повысить качество анализа, особенно в тех случаях, когда только одна ткань дает статистически значимый ответ.

Для антагонистов андрогенов контролем является группа, получавшая только референсный андроген ТР. Особенности механизма действия тестируемого вещества могут приводить к различию относительного ответа разных тканей. Например, ингибиторы , такие как финастерид, сильнее воздействуют на вентральную простату, чем на другие ткани, по сравнению с сильными антагонистами AR, такими как флутамид. Положительным результатом для андроген-антагонистической активности считается статистически значимое уменьшение веса любых двух или более из пяти измеряемых целевых андрогензависимых тканей (VP, LABC, GP, CG и SVCG) по отношению к контрольному референсному андрогену ТП. При этом все целевые ткани должны показать определенное уменьшение массы. Используя соответствующий многофакторный анализ, можно проанализировать суммарный отклик исследуемых тканей. Это может повысить качество анализа, особенно в тех случаях, когда только одна ткань дает статистически значимый ответ.

Данные сводят в таблицу, содержащую среднее, стандартную ошибку среднего (или стандартное отклонение), объем выборки для каждой группы. Таблицы данных должны быть включены. Индивидуальные значения, средние величины, SE (SD) и CV результатов контрольных групп проверяют на соответствие ранее наблюдавшимся значениям. Для значений CV, превышающих CV, представленных в таблице для веса каждого органа, определяют, не допущена ли ошибка при записи или вводе данных, или лаборатория не владеет диссекцией исследуемых андроген-зависимых тканей, и необходимо дальнейшее обучение и практика. Обычно величины CV воспроизводимы между лабораториями и между исследованиями. Представленные данные должны включать, по крайней мере: вентральную простату (VP), семенные пузырьки (SVCG), мышцу, поднимающую анус, и луковично-пещеристую мышцу (LABC), бульбоуретральную железу (CG), головку полового члена (GP), печень, вес тела и изменение массы тела с начала введения доз до момента аутопсии. Если в какой-то из групп не наблюдается отделения крайней плоти, эти случаи регистрируют и анализируют по сравнению с контрольной группой, используя точный тест Фишера.

Если при проверке данных, введенных в компьютер, в сравнении с оригинальными экспериментальными записями обнаруживают значения веса ткани, являющиеся биологически маловероятными, или превышающее среднее для данной группы на три стандартных отклонения, результат тщательно проверяют и исключают из анализа.

Сравнение результатов исследования и OECD значений CV (таблица) является важным шагом в интерпретации относительно достоверности результатов исследования. Все полученные данные для групп контроля носителя должны сохраняться в лаборатории. Все полученные данные для групп положительных референсных веществ, таких как ТП и ФТ, также должны сохраняться в лаборатории. Лаборатории также могут периодически проверять действие известных слабых агонистов и антагонистов андрогенов и сохранять эти данные в лаборатории. Эти результаты можно сравнить с доступными данными OECD, чтобы гарантировать, что качество работы лаборатории обеспечивает достаточную точность и мощность статистического анализа результатов.