Приложение 6.4.3. Оценка фототоксичности in vitro в тесте поглощения нейтрального красного клетками 3Т3 (3Т3 NRU)

Приложение 6.4.3

Оценка фототоксичности in vitro в тесте поглощения нейтрального красного клетками 3Т3 (3Т3 NRU)

Идентичен международному документу OECD TG N 432 "In vitro 3Т3 NRU phototoxicity test" (ОЭСР Руководство N 432 "Тест 3Т3 NRU для оценки фототоксичности in vitro"). Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования обеспечивает получение информации о фотоцитотоксических свойствах исследуемого вещества в тест-системе in vitro и тем самым позволяют прогнозировать фототоксичность данного вещества in vivo как при его накожном нанесении, так и при системном введении. Полученная информация может быть использована для классифицикации веществ в соответствии с СГС по данному виду токсичности.

1.2. До проведения эксперимента должна быть рассмотрена вся доступная информация об исследуемом веществе. Такая информация включает данные о составе и химическом строении вещества; его физико-химические свойства; результаты токсикологических испытаний in vivo и in vitro; токсикологические данные по структурно родственным веществам и предполагаемые пути использования вещества. Эта информация является необходимой для подтверждения того, что испытание является важным для защиты здоровья человека и способствует обоснованному выбору начальной дозы.

2. Общие положения

2.1. Фототоксичность определяется как токсичность химического вещества, возникающая или усиливающаяся под влиянием света, в частности при облучении кожи животного на фоне системного введения вещества.

2.2. Явление фототоксичности основано на переходе исследуемого вещества в возбужденную форму после облучения светом в УФ и видимом диапазоне.

2.3. Оценка фототоксичности in vitro в тесте поглощения нейтрального красного клетками 3Т3 (3Т3 NRU) основана на измерении относительного снижения жизнеспособности фибробластов 3Т3, подверженных действию химического вещества в присутствии света по сравнению с его отсутствием.

2.4. При этом предполагается, что вещества, выявляемые данным тестом in vitro как фототоксичные, будут проявлять фототоксичность и in vivo как при их накожном нанесении, так и при системном введении (в последнем случае после попадания вещества из кровотока в кожу).

3. Принцип метода

3.1. Фототоксическим действием обладают многие химические вещества. Их общим свойством является способность поглощать световую энергию в диапазоне излучения солнечного света. Согласно первому закону фотохимии (закону Grotthaus-Draper), фотореакции требуют достаточного поглощения квантов света. Поэтому перед началом биологического тестирования необходимо снять спектр поглощения данного вещества в УФ и видимой областях, следуя МР ОЕСР N 101 (OECD Test Guideline 101). Если молярный коэффициент экстинкции вещества меньше 10 единиц оптической плотности на моль/литр х см, оно вряд ли окажется фотоактивным. Такие вещества не нуждаются в тестировании методом 3Т3 NRU или другим биологическим методом навыявления неблагоприятных фотохимических эффектов (рис. 6.4.3.1).

3.2. Надежность и практическая значимость теста 3Т3 NRU на фототоксичность оценивалась в работах. Было показано, что данный тест in vitro может быть использован для прогноза острой фототоксичности у людей и животных in vivo. В то же время данный тест не предназначен для прогноза других неблагоприятных эффектов, которые могут возникать при комбинированном действии химического соединения и света, например: фотогенотоксичности, фотоаллергенности или фотоканцерогенности. Кроме того, данный тест не предназначен для изучения непрямых механизмов фототоксичности, влияния метаболитов изучаемого вещества или влияния смесей химических соединений.

3.3. Общим требованием ко всем тестам in vitro, оценивающим генотоксический и канцерогенный потенциал химических веществ, является использование ферментных систем метаболизма ксенобиотиков. Что касается фототоксикологии, пока выявлены только единичные случаи, в которых метаболическая трансформация вещества требуется для проявления им фототоксичности in vitro или in vivo. Таким образом, научное обоснование для дополнения данного теста системой метаболической активации отсутствует.

3.4. Тест 3Т3 NRU на фототоксичность основан на сравнении цитотоксичности химического вещества при тестировании в присутствии и в отсутствии облучения нецитотоксической дозой света, имитирующего по спектру солнечный свет. Оценкой цитотоксичности вещества в данном тесте является зависимое от его концентрации снижение поглощения клетками витального красителя (нейтрального красного, НК) при измерении через 24 часа после воздействия исследуемого химического вещества в комбинации с облучением. Нейтральный красный - слабый катионный краситель, быстро проникающий через клеточную мембрану недиффузионным механизмом и накапливающийся в лизосомах клеток. Повреждение чувствительных лизосомальных мембран приводит к нарушению стабильности лизосом и другим изменениям, которые постепенно становятся необратимыми. Вследствие этих изменений, вызываемых веществами-ксенобиотиками, поглощение и связывание НК клетками снижается. В результате можно различить живые, поврежденные и мертвые клетки, что и является основой данного теста.

3.5. Культуру клеток 3Т3 мышей Balb/c выдерживают в питательной среде в течение 24 часов для формирования монослоя. Для каждого тестируемого вещества подготавливают два планшета на 96 ячеек, в каждом из которых клетки ЗТЗ инкубируются в присутствии восьми различных концентраций данного вещества в течение часа. После этого один из планшетов облучают светом в максимальной нецитотоксичной дозе, в то время как второй планшет держат в темноте. Далее инкубационную среду в обоих планшетах заменяют свежей питательной средой и еще через 24 часа определяют жизнеспособность клеток по поглощению НК. Жизнеспособность клеток при действии каждой использованной концентрации тестируемого вещества выражают в процентах от соответствующего контроля, обработанного одним растворителем. Для оценки фототоксического потенциала данного вещества сравнивают зависимости концентрация-эффект, полученные в присутствии и отсутствии облучения, обычно используя для этого соответствующие величины полуингибирующих концентраций (IC50), т.е. концентраций вещества, снижающих жизнеспособность клеток по сравнению с необработанным контролем на 50%.

4. Описание метода

4.1. Подготовка к опыту

Культура клеток

4.1.1. При валидации данного метода использовался постоянный штамм фибробластов мышей 3Т3 Balb/c (клон 31), полученный из Американской коллекции клеточных культур (American Type Culture Collection - АТСС; Manassas, VA, USA) или из Европейской коллекции клеточных культур (European Collection of Cell Cultures - ECACC; Salisbury, Wiltshire, UK), поэтому рекомендуется приобретать данный штамм у надежных поставщиков. Можно использовать и другие клетки или их постоянные штаммы, если условия их культивирования адаптированы к специфическим требованиям данного метода, но в этих случаях эквивалентность замены должна быть доказана экспериментально.

4.1.2. Культура клеток должна регулярно проверяться на отсутствие загрязнения микоплазмой, в противном случае она не может использоваться.

4.1.3. Необходимо также регулярно проверять чувствительность клеток к ультрафиолету (УФ), используя изложенную в данном методе процедуру контроля качества. Поскольку чувствительность клеток к ультрафиолету А (УФ-А) с числом пассажей может постепенно возрастать, следует использовать клетки 3Т3, прошедшие как можно меньше пассажей, - желательно менее 100 (см. рис. 3).

Условия культивирования

4.1.4. При обычном пересеве клеток и во время эксперимента следует использовать подходящие культуральные среды и условия культивирования; например, для штамма Balb/c 3Т3 - среду DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, т.е. среду Игла в модификации Дульбекко) с добавлением 10% сыворотки новорожденных телят, 4 мМ глутамина, 100 ME пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в условиях влажной инкубации при 37°С и 5,0-7,5% , в зависимости от буферного раствора. Условия культивирования штамма должны обеспечивать нормальную продолжительность клеточного цикла клеток Balb/c 3Т3 или другой используемой клеточной линии.

Подготовка культуры клеток

4.1.5. Клетки замороженных исходных штаммов высевают на питательную среду с определенной плотностью и пересеивают перед использованием в тесте на фототоксичность как минимум один раз.

4.1.6. Плотность посева клеток должна быть такой, чтобы к концу опыта (на момент определения жизнеспособности клеток через 48 часов после их посева в планшет) клетки еще не образовывали монослоя. Для Balb/c 3Т3 клеток, растущих в 96-луночном планшете, рекомендуемая плотность посева составляет 1 х 104 клеток на ячейку.

4.1.7. Для каждого исследуемого вещества производят идентичный посев клеток в два отдельных 96-луночных планшета. Планшеты в течение опыта находятся в идентичных условиях, за исключением промежутка времени, в котором один из планшетов облучают (+Irr), а другой держат в темноте (-Irr).

Подготовка исследуемого вещества

4.1.8. При отсутствии сведений о стабильности растворов данного вещества, растворы для тестирования должны быть приготовлены непосредственно перед использованием. Рекомендуется приготавливать растворы и проводить первоначальную обработку ими клеток на свету, что позволит избежать фотоактивации или деградации исследуемого вещества до облучения.

4.1.9. Исследуемые вещества должны быть растворены в забуференном солевом растворе, например в сбалансированном солевом растворе Эрла (EBSS) или в других физиологически сбалансированных буферных растворах, которые не должны содержать белков и компонентов, поглощающих свет (например, цветных pH-индикаторов и витаминов) во избежание помех во время облучения. Так как при облучении клетки находятся в течение примерно 50 минут вне инкубатора, необходимо принимать меры для предотвращения их защелачивания. При использовании слабых буферов, таких как EBSS, это может достигаться путем инкубации клеток при 7,5% . Если клетки инкубируют при 5% , то должна быть использована среда с более высокой буферной емкостью.

4.1.10. При тестировании веществ, имеющих плохую растворимость в воде, необходимо подобрать подходящий растворитель. Этот растворитель должен присутствовать в постоянном объеме во всех экспериментальных вариантах, включая негативный контроль на растворитель и все использующиеся концентрации тестируемого вещества, и не должен быть цитотоксичным в данной концентрации. Исследуемые концентрации веществ должны быть подобраны так, чтобы избежать образования осадка или помутнения раствора.

4.1.11. Рекомендуется использовать в качестве растворителей диметилсульфоксид, этанол и другие органические растворители с низкой цитотоксичностью. Перед использованием необходимо провести оценку специфических свойств растворителя, например, оценить возможность его реакции с исследуемым веществом, возможность гашения цитотоксического эффекта, проявления антирадикальных свойств и/или изменения химической устойчивости тестируемого вещества в данном растворителе.

4.1.12. При приготовлении растворов можно использовать вортекс, ультразвук или нагревание до необходимых температур, если это не влияет на устойчивость тестируемых соединений.

Условия облучения

4.1.13. Источник света. Выбор источника света и фильтров является критическим фактором в тестировании на фототоксичность. Для изучения фототоксических реакций in vivo обычно используют облучение светом видимого диапазона или УФ-А; область УФ-В используется редко из-за высокой цитотоксичности, увеличивающейся в 20 раз при изменении длины волны от 313 до 280 нм. Основными требованиями при выборе источника света является наличие в его диапазоне тех длин волн, которые могут быть поглощены тестируемым веществом, т.е. входят в спектр его поглощения, а также достаточная мощность, с тем чтобы в практически разумные сроки могла быть достигнута доза облучения, необходимая для определения стандартных фототоцитотоксичных веществ. В то же время спектральный диапазон и мощность источника света не должны приводить к эффектам, отличным от фотоцитотоксических, например выделению тепла при инфракрасном облучении.

4.1.14. Наиболее оптимальным вариантом искусственного источника света является использование солнечных симуляторов, спектр излучения которых совпадает со спектром излучения Солнца, измеряемым в дневное время на открытой местности. В качестве симуляторов солнечного света чаще всего используют ксеноновую или ртутно-галогеновую лампы; последняя дешевле и выделяет меньше тепла, но хуже совпадает по спектру с естественным солнечным светом. Поскольку все солнечные симуляторы испускают значительное количество света в высокотоксичной области УФ-В, они должны быть укомплектованы соответствующим фильтром для отсечения этой области спектра излучения. Все сорта лабораторного пластика для культивирования клеток содержат УФ-стабилизаторы, поэтому спектр излучения источника света может быть измерен в тех же самых 96-луночных планшетах, которые используются для проведения данного теста. Независимо от выбранных светофильтров и их неизбежного влияния на установку в целом, спектр испускания системы не должен отличаться от стандартного дневного света в соответствии с ISO 18909.

4.1.15. Пример спектра излучения солнечного симулятора с фильтром, удовлетворяющего условиям проведения данного теста, приведен на рис. 6.4.3.2. Данный металлогалогенный источник света (модель SOL 500) использовался на стадии валидации теста 3Т3 NRU. На рисунке показаны спектры излучения при комбинации симулятора SOL 500 с двумя разными фильтрами Н1 и Н2, а также дополнительный фильтрующий эффект пластиковой крышки 96-луночного культурального планшета. Фильтр Н2 использовался только в тех тест-системах, которые могут перенести повышенное количество излучения диапазона (тест с использованием модельного кожного покрова и тест на фотогемолиз эритроцитов). В тесте 3Т3 NRU на фототоксичность использовался фильтр Н1.

Как это видно из графика, дополнительный фильтрующий эффект крышки культурального планшета проявляется в основном в области УФ-В, но при этом сохраняется достаточная интенсивность излучения УФ-В для возбуждения тех веществ, которые поглощают свет в основном в этой области спектра (например, Амиодарон, таблица).

4.1.16. Дозиметрия. Интенсивность источника света должна подвергаться проверке перед каждым опытом с использованием подходящего широко диапазонного УФ-метра. Эти измерения проводят в тех же 96-луночных планшетах, которые используются для проведения теста 3Т3 NRU. В соответствии с используемым источником света УФ-метр должен быть поверен и откалиброван. Для поверки рекомендуется использовать второй стандартный УФ-метр того же типа с идентичной калибровкой - лучше всего спектрорадиометр.

4.1.17. Показано, что можно найти дозу облучения в области УФ-А, нетоксичную для клеток Balb/c 3Т3 и в то же время имеющую достаточную мощность для возбуждения химических соединений и протекания фотохимических реакций. Например, в ряде работ для достижения дозы облучения 5 в течение 50 минут освещенность была установлена на уровне 1,7 . На рис. 6.4.3.3 показана чувствительность клеток 3Т3 мышей Balb/c к излучению солнечного симулятора в области УФ-А, изучавшаяся на стадии превалидации теста 3Т3 NRU на фототоксичность. Исходные данные были получены в 7 независимых лабораториях [1]. Две нижние кривые (незакрашенные значки) были получены при использовании состарившейся культуры клеток, прошедшей большое количество пассажей и подлежащей замене на свежую. Остальные кривые (закрашенные значки) получены на клетках с удовлетворительной устойчивостью к облучению светом. По этим данным, максимальная нецитотоксичная доза облучения клеток 3Т3, показанная вертикальной линией, составила 5 . Горизонтальной пунктирной линией отмечен максимальный приемлемый эффект облучения (снижение выживаемости клеток по сравнению с темновым контролем на 25%).

4.1.18. При использовании других штаммов клеток и других источников света дозу облучения нужно рассчитать таким образом, чтобы она не была токсична для клеток, но в тоже время была достаточна для возбуждения стандартных фототоксинов. Время экспозиции рассчитывают по следующей формуле:

(1)

4.2. Условия проведения эксперимента

Концентрации исследуемых веществ

4.2.1. Диапазон концентраций исследуемого вещества в присутствии (+Irr) и в отсутствии (-Irr) облучения светом должен быть подобран в предварительных экспериментах. Может оказаться полезным определение растворимости вещества в начале эксперимента и через 60 минут (или через другой промежуток времени, в зависимости от длительности облучения), так как растворимость может изменяться во времени или в процессе облучения. Чтобы избежать артефактов, связанных с нефизиологическими изменениями pH при изучении фототоксичности веществ с активными кислыми или щелочными группами, pH культуральной среды после добавления тестируемого вещества должен находиться в диапазоне 6,5-7,8.

4.2.2. Максимальная концентрация исследуемого вещества не должна нарушать физиологическое равновесие культуры клеток, в частности по осмотическим характеристикам и водородному показателю. В зависимости от исследуемого вещества, его максимальная концентрация может ограничиваться и другими факторами, например физико-химическими свойствами вещества. Для малорастворимых веществ, не являющихся токсичными вплоть до насыщающей концентрации, в качестве максимальной берется самая высокая из реально достижимых концентраций. Общим правилом является отсутствие преципитации исследуемого вещества при всех исследуемых концентрациях. Максимальная концентрация исследуемого вещества не должна превышать 1 000 мкг/мл, а молярность его растворов - 10 ммолей/л. Разведение раствора с максимальной концентрацией исследуемого вещества для получения ряда из 8 тестируемых концентраций следует проводить с использованием постоянного коэффициента разведения.

4.2.3. Если предварительные эксперименты показали, что в отсутствии облучения исследуемое вещество нетоксично для клеток 3Т3 вплоть до максимальной концентрации, а при облучении (+Irr) высоко токсично, диапазоны концентраций вещества в подсериях (-Irr) и (+Irr) могут различаться в соответствии с принципом обеспечения адекватного качества данных внутри подсерий.

Контрольные эксперименты

4.2.4. Чувствительность клеток к облучению, регулярный контроль. Культуру клеток необходимо регулярно проверять (например, при каждом пятом пассаже) на чувствительность к используемому источнику света, оценивая их жизнеспособность при воздействии возрастающих доз облучения. Для этого нужно взять несколько доз облучения, включая те, которые существенно превышают используемые при тестировании веществ на фототоксичность методом 3Т3 NRU. Проще всего определить эти дозы в УФ-части спектра излучения источника света. Клетки высеивают с той же плотностью, как и для проведения теста на фототоксичность 3Т3 NRU, облучают на следующий день и еще через сутки определяют их жизнеспособность по поглощению НК. Полученную при этом максимальную нецитотоксическую дозу облучения (например, при валидации данного метода она составила 5 УФ-А) используют для демонстрации правильной классификации эталонных фотоактивных веществ (таблица).

4.2.5. Чувствительность клеток к облучению, проверка в текущем эксперименте. Постановка метода отвечает критериям качества, если жизнеспособность облученных проб контроля на растворитель составляет не меньше 80% от жизнеспособности соответствующих необлученных контрольных проб.

4.2.6. Жизнеспособность контрольных проб с добавленным растворителем. Следует убедиться, что используемая плотность посева клеток (например, ) обеспечивает нормальную скорость роста штамма с удвоением количества клеток за каждые два дня, что можно определить по величине оптической плотности НК, экстрагированного из контрольных проб, влиянию растворителя, при длине волны 540 нм (ОП540). Тест отвечает принятым критериям, если среднее значение ОП540 в необлученных контрольных пробах не менее 0,4 единиц (что примерно в 20 раз выше, чем фоновая оптическая плотность растворителя при данной длине волны).

4.2.7. Положительный контроль. Параллельно с каждым проводимым тестом ЗТЗ NRU на фототоксичность должно тестироваться известное эталонное вещество с хорошо изученными фототоксическими свойствами. Рекомендуется использовать (CPZ), который давал следующие полуингибирующие концентрации (IC50) при использовании стандартного протокола теста: при облучении от 0,1 до 2,0 мкг/мл, без облучения от 7,0 до 90,0 мкг/мл. Фактор фотоактивности (Photo Irritation Factor, PIF) вещества, используемого как положительный контроль, должен быть не менее 6. Необходимо сохранять и периодически анализировать данные, полученные в тесте 3Т3 NRU для положительных контролей.

4.2.8. Вместо хлорпромазина в качестве положительного контроля можно использовать и другие фототоксичные вещества, если они больше соответствуют изучаемому веществу по структуре и растворимости.

Проведение тестирования:

1-й день

4.2.9. Внести по 100 мкл культуральной среды в краевые ячейки 96-луночного микропланшета для культивирования клеток (слепые пробы). В оставшиеся лунки внести по 100 мкл суспензии клеток с концентрацией клеток/мл питательной среды (то есть по клеток в каждую лунку). Для тестирования каждого вещества, включая негативный и позитивный контроли, нужно приготовить по два планшета.

4.2.10. Культивировать клетки 24 часа, пока они не займут половину площади дна ячейки (до состояния полумонослоя). Этот инкубационный период необходим для адаптации фибробластов, адгезии к поверхности пластика и вхождения в фазу экспоненциального роста.

2-й день

4.2.11. После инкубации в течение суток удалить из лунок культуральную среду и осторожно промыть клетки добавлением 150 мкл забуференного раствора, используемого для инкубации. Затем внести в лунки по 100 мкл буфера, содержащего необходимые концентрации исследуемого вещества или растворителя. Использовать восемь различных концентраций исследуемого вещества. Инкубировать клетки с исследуемым веществом в темноте в течение 60 минут.

4.2.12. Один из двух планшетов, приготовленных для разведений исследуемого вещества и растворителя, выбираемый случайным образом, предназначают для определения цитотоксичности исследуемого вещества в отсутствии облучения (контрольный планшет, -Irr), а другой - для оценки фотоцитотоксичности (опытный планшет, +Irr).

4.2.13. Для проведения экспозиции планшета +Irr облучают клетки при комнатной температуре в течение примерно 50 минут через крышку 96-луночного планшета наибольшей из доз света, не являющихся цитотоксичными. Второй планшет (-Irr) на этот промежуток времени помещают в темный контейнер.

4.2.14. Удаляют из лунок инкубационную среду и дважды осторожно промывают их добавлением 150 мкл буферного раствора, используемого при инкубации, но не содержащего исследуемое вещество. После этого заменяют буферный раствор культуральной средой и ставят планшет в термостат на ночь (на 18-22 ч).

3-й день

Микроскопический анализ

4.2.15. Используя фазово-контрастный микроскоп, проводят оценку роста клеток, их морфологии и непрерывности монослоя. Регистрируют возможное влияние изучаемого вещества на морфологию клеток и скорость их роста.

Оценка поглощения НК

4.2.16. Промывают клетки добавлением 150 мкл теплого буферного раствора. Удаляют промывочный раствор из планшета. Добавляют в лунки по 100 мкл НК (3-амино-7-диметиламино-2-метилфеназин гидрохлорид, CAS 553-24-2; C.I. 50040), растворенного в культуральной среде без сыворотки в концентрации 50 мкг/мл, и инкубируют 3 часа.

4.2.17. После инкубации удаляют среду с НК и промывают клетки 150 мкл буферного раствора. Затем сливают его и полностью удаляют остатки буферного раствора промоканием или центрифугированием.

4.2.18. В каждую лунку добавляют точно по 150 мкл свежеприготовленного десорбирующего раствора (49 частей воды + 50 частей этанола + 1 часть уксусной кислоты).

4.2.19. Инкубируют планшеты на шейкере при небольшой скорости встряхивания 10 минут; за это время НК экстрагируется из клеток в десорбирующий раствор, в котором он хорошо растворим.

4.2.20. Измеряют оптическую плотность экстракта НК в спектрофотометре при длине волны 540 нм против слепых проб, расположенных по периметру культурального планшета. Сохраняют данные в файле соответствующего формата.

5. Анализ и интерпретация данных

Качество и количество данных

5.1. Экспериментальные данные должны позволять проведение значимого анализа зависимостей концентрация-эффект, полученных в присутствии и отсутствии облучения, и, если возможно, определение соответствующих концентраций исследуемого вещества, при которой жизнеспособность клеток 3Т3 снижалась до 50% (IC50). В случае обнаружения цитотоксичности оба ряда данных необходимо отсортировать в порядке увеличения концентраций исследуемого вещества для аппроксимации их кривой.

5.2. Как для явно положительных, так и для явно отрицательных результатов обычно достаточно провести один основной эксперимент, с одним или несколькими предварительными опытами, в которых подбирается нужный диапазон концентраций.

5.3. Вещества, давшие сомнительные, пограничные или нечеткие результаты, должны быть подвергнуты дополнительному тестированию с соответствующей модификацией условий эксперимента - изменением диапазона или шага концентраций, времени прединкубации или времени облучения клеток, в частности для нестабильных веществ можно использовать укороченное время инкубации.

Оценка результатов

5.4. Для оценки результатов вычисляют фактор фотовозбуждения (Photo Irritation Factor, PIF) или средний эффект облучения (Mean Photo Effect, МРЕ).

5.5. Для оценки степени фототоксичности вещества (см. ниже) необходимо аппроксимировать полученные экспериментальные данные непрерывной зависимостью доза-эффект (т.е. построить соответствующую модель). Для этого обычно используют нелинейный регрессионный анализ. Для оценки влияния вариабельности экспериментальных данных на аппроксимирующую кривую рекомендуется использовать метод бутстреппинга, основанный на принципе Монте-Карло.

5.6. Формула для расчета фактора фотовозбуждения (PIF):

Если хотя бы одно из двух значений невозможно определить, величину PIF не рассчитывают.

5.7. Средний эффект облучения (МРЕ) основан на сравнении кривых концентрация-ответ в присутствии и в отсутствии облучения. Он определяется как средневзвешенное значение из полученной выборки отдельных значений фотоэффекта при разных концентрациях вещества:

Значение фотоэффекта РЕс для данной концентрации С определяется как произведение эффекта ответа REc и эффекта дозы DEc, т.е. РЕс = REc х DEc. Эффект ответа рассчитывается как различие между ответами, наблюдаемыми в присутствии и отсутствии света, т.е. REc = Rc (-Irr) - Rc (+Irr). Эффект дозы рассчитывается по формуле:

, где

С* - эквивалентная концентрация, т.е. концентрация вещества, при которой отклик +Irr равен отклику -Irr. Если величина С* не может быть определена, поскольку отклики на кривой +Irr всегда выше или ниже, чем на кривой -Irr, эффект дозы принимается за 1.

Весовой коэффициент берется по максимальной величине отклика: {Ri (+Irr), Ri (-Irr)}. Сетку концентраций Ci выбирают так, чтобы в каждый интервал концентраций попадало одинаковое количество точек.

Вычисление МРЕ ограничено максимальной величиной концентрации, при которой хотя бы одна из двух кривых дает величину отклика как минимум 10%. Если эта максимальная концентрация выше, чем наибольшая концентрация, использованная в +Irr эксперименте, для оставшейся части кривой +Irr устанавливают величину отклика "0". Вещество классифицируется как фототоксическое, если значение МРЕ больше установленной пороговой величины 0,15.

5.8. Программное обеспечение для расчета значений PIF и МРЕ можно получить в Секретариате ОЭСР.

Интерпретация результатов

5.9. На основании результатов валидации теста 3Т3 NRU,

при PIF < 2 или МРЕ < 0,1 исследуемое вещество определяют как "нефототоксичное";

при 2 < PIF < 5 или 0,1 < МРЕ < 0,15 - как "возможно фототоксичное";

и при PIF > 5 или МРЕ > 0,15 как "фототоксичное".

5.10. Лаборатории, впервые налаживающие данный метод, до проведения исследований химических веществ на фототоксичность должны провести тестирование стандартных эталонных веществ, перечисленных в таблице, и убедиться в том, что полученные значения PIF и МРЕ близки к величинам, указанным в таблице.

5.11. Если фототоксический эффект наблюдается только при максимальных исследуемых концентрациях (особенно для водорастворимых веществ), для оценки опасности данного вещества могут понадобиться дополнительные сведения, например данные о кожной адсорбции вещества и его аккумуляции в коже и/или данные других тестов in vitro (тестирование на коже животных или человека или искусственных моделях кожи).

5.12. Если токсичность не выявлена в обоих вариантах (+Irr и -Irr) и если плохая растворимость вещества ограничивает величину концентрации, которая может быть исследована, данный метод следует признать не подходящим для исследуемого вещества и провести его изучение на другой модели.

Таблица

Химическое вещество	Номер CAS	Pif	Мре	Максимум поглощения света	Растворитель*
Амиодарон гидрохлорид	19774-82-4	>3,25	0,27-0,54	242 нм, 300 нм (плечо)	этанол
Хлорпромазин гидрохлорид	69-09-0	>14,4	0,33-0,63	309 нм	этанол
Норфлоксацин	70458-96-7	>71,6	0,34-0,90	316 нм	ацетонитрил
Антрацен	120-12-7	>18,5	0,19-0,81	356 нм	ацетонитрил
Протопорфирин IX, динатриевая соль	50865-01-5	>45,3	0,54-0,74	402 нм	этанол
L-гистидин	7006-35-1	нет	0,05-0,10	211 нм	вода
Гексахлорофен	70-30-4	1,1-1,7	0,00-0,05	299 нм 317 нм (плечо)	этанол
Лаурилсульфат натрия	151-21-3	1,0-1,9	0,00-0,05	не поглощает	вода
* Растворитель, используемый для измерения поглощения

6. Подготовка отчета

Отчет о проведении испытания должен содержать следующую информацию.

Исследуемое вещество:

- идентификационные данные, наименование общепринятое и наименование по номенклатуре IUPAC, номер CAS (если известно);

- физические свойства, степень очистки;

- физико-химические свойства, имеющие значение при проведении эксперимента;

- УФ/видимый спектр поглощения;

- устойчивость и фотоустойчивость (если известно).

Растворитель:

- обоснование выбора растворителя;

- растворимость исследуемого вещества в данном растворителе;

- содержание растворителя в тестовой среде.

Клетки:

- тип и источник приобретения клеток;

- отсутствие микоплазмы;

- количество пассажей культуры клеток, если известно;

- чувствительность клеток к облучению, определенная с помощью оборудования, используемого в in vitro 3Т3 NRU тесте на фототоксичность.

Условия проведения эксперимента, инкубация до и после воздействия:

- тип и состав культуральной среды;

- условия инкубации (концентрация , температура, влажность);

- продолжительность инкубации (до и после воздействия).

Условия проведения эксперимента, воздействие химическим веществом:

- логическое обоснование выбора концентраций исследуемого химического вещества, используемых в присутствии и отсутствии облучения;

- в случае ограниченной растворимости исследуемого вещества и отсутствия цитотоксичности: логическое обоснование выбранной максимальной концентрации;

- тип и состав среды, в которой проводится обработка клеток веществом (забуференного солевого раствора);

- продолжительность экспозиции веществом.

Условия проведения эксперимента, облучение:

- логическое обоснование выбора источника света;

- производитель и тип источника света и радиометра;

- спектральные характеристики излучения источника света;

- пропускание и поглощение используемых фильтров;

- характеристики радиометра и детали его калибровки;

- расстояние между источником света и планшетом;

- УФ-А-излучение на данном расстоянии, выраженное в ;

- продолжительность экспозиции УФ/видимым излучением;

- доза УФ-А (облучение х время), выраженная в ;

- температура клеточной культуры во время облучения и клеточной культуры, параллельно содержащейся в темноте.

Условия проведения эксперимента, тест на жизнеспособность с НК:

- состав среды, в которой НК добавлялся к клеткам;

- продолжительность инкубации с НК;

- условия инкубации во время обработки (концентрация , температура, влажность);

- условия экстракции НК (состав экстрагирующей смеси, продолжительность экстракции);

- длина волны при спектрофотометрическом измерении оптической плотности НК;

- вторая длина волны (референсная), при необходимости;

- состав слепой пробы при спектрофотометрии, если использовалась.

Результаты:

- жизнеспособность клеток при каждой концентрации исследуемого вещества, выраженная в процентах от среднего значения жизнеспособности в параллельных контрольных тестах с растворителем;

- кривые концентрация-ответ (концентрации вещества - соответствующие значения жизнеспособности клеток), полученные в параллельных экспериментах +Irr и -Irr;

- анализ кривых концентрация-ответ: если возможно, вычисление значений IC50 для обоих вариантов воздействия, +Irr и -Irr;

- сравнение двух кривых концентрация-ответ, полученных в присутствии и отсутствии облучения путем вычисления фактора фотовозбуждения (PIF) или среднего эффекта облучения (МРЕ);

- критерий приемлемости результатов;

- контроль на растворитель;

- абсолютная жизнеспособность культуры клеток (оптическая плотность экстракта НК) для облученных и необлученных клеток;

- результаты периодических внутрилабораторных проверок негативного контроля и контроля на растворитель (средние значения и стандартные отклонения);

- критерий приемлемости результатов, параллельный позитивный контрольный тест;

- значения IC50 (+Irr) и IC50 (-Irr) и PIF/MPE для контрольного (эталонного) вещества;

- результаты периодических внутрилабораторных проверок позитивного контроля (эталонного вещества): значения IC50 (+Irr) и IC50 (-Irr) и PIF/MPE в виде средних значений и стандартных отклонений.

Обсуждение результатов.

Заключение.