Приложение 6.6.1. Утеротропный биотест на грызунах: краткосрочный скрининг-тест для выявления эстрогенной активности

Приложение 6.6.1

Утеротропный биотест на грызунах: краткосрочный скрининг-тест для выявления эстрогенной активности

Идентичен международному документу OECD TG N 440 "Uterotropic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties" (ОЭСР Руководство N 440 "Утеротропный биотест на грызунах: краткосрочный скрининг-тест для выявления эстрогенной активности"). Принят 16 октября 2007 года. Перевод с английского (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования обеспечивает с помощью метода in vivo идентификацию химических субстанций, взаимодействующих с эндокринной системой, и позволяют оценить и классифицировать вещество в соответствии с СГС по данному виду воздействия.

1.2 Данный экспериментальный метод был разработан для получения информации об эстрогенной активности in vivo тестированного исследуемого вещества методом "утеротропного биотеста на грызунах: краткосрочный скрининг-тест для выявления эстрогенной активности". Этот метод основан на определении увеличения веса матки или утеротропной активности. Тест оценивает способность химического вещества вызывать биоэффекты в соответствии с действием агонистов или антагонистов естественных эстрогенов (например, ), однако он используется значительно реже для выявления антагонистов, чем агонистов. Матка реагирует на действие эстрогенов двумя способами. Первоначальный ответ - увеличение веса за счет накопления воды, другая реакция сопровождается увеличением веса за счет роста тканей. Реакции матки у крыс и мышей качественно сопоставимы. Данная биопроба является скрининг-методом для метода in vivo и ее применение следует рассматривать в контексте "Концептуальной основы OECD тестирования и оценки повреждающего действия химических веществ на эндокринную систему" (прилож. 6.6.1.1). В этой концептуальной структуре утеротропный биотест находится на уровне 3 как метод in vivo, позволяющий получить результаты об отдельном эндокринном механизме, т.е. эстрогенности (прилож. 6.6.1.1).

2. Общие положения

2.1. ОЭСР инициировала в 1998 г. высокоприоритетную деятельность по пересмотру существующих руководящих принципов и разработке новых руководящих принципов для скрининга и тестирования потенциально опасных факторов для эндокринной системы. Одно из направлений данной деятельности заключалось в разработке Руководства по тестированию "Утеротропный биотест на грызунах". Он в дальнейшем прошел широкомасштабную проверку достоверности, включая составление подробного справочного документа и проведение внутри- и межлабораторных исследований для выявления надежности и воспроизводимости биотеста с применением сильных эталонных (референтных) эстрогенов, слабых агонистов и сильных антагонистов эстрогенных рецепторов, негативных референтных химических соединений. Таким образом, данный метод исследования разработан на основе опыта, накопленного в ходе утверждения программы тестирования, и результатов, полученных с применением агонистов эстрогенов.

2.2. Утеротропный биотест - краткосрочный скрининг-тест, разработанный в 1930 г. и впервые стандартизованный для скрининга экспертным комитетом в 1962 г. Эстрогенные агонисты и антагонисты выступают как лиганды для эстрогенных рецепторов и и могут, соответственно, активировать или ингибировать рецепторную регуляцию транскрипции. Это может привести к потенциальному риску развития неблагоприятных последствий для здоровья, в том числе для процессов репродукции и развития. Таким образом, существует необходимость быстрого анализа и оценки химического вещества в качестве возможного эстрогенного агониста или антагониста. Являясь информативным показателем, сродство лиганда к эстрогенному рецептору или активация транскрипции репортерных генов in vitro - лишь один из нескольких факторов, определяющих риск развития опасности для здоровья. Другие детерминирующие факторы могут включать метаболическую активацию и деактивацию при поступлении химического вещества внутрь организма, распределение в тканях-мишенях и выведение из организма, по крайней мере, частично зависимые от пути поступления и проведения химического тестирования. Это вызывает необходимость выявления возможной активности вещества in vivo в соответствующих условиях, если уже имеется достоверная информация по таким его характеристикам, как Абсорбция - Распределение - Метаболизм - Элиминация (АРМЭ). Ткани матки реагируют на стимуляцию эстрогенов быстрым и энергичным ростом, особенно у лабораторных грызунов, цикл эструса которых длится около 4 дней. Различные виды грызунов, особенно крысы, также широко используются в токсикологических исследованиях для определения степени токсичности химических веществ. Таким образом, матка грызунов является соответствующим органом-мишенью для скрининга in vivo эстрогенных агонистов и антагонистов. В отношении негативных химических соединений только одно "негативное" эталонное химическое вещество, негативная утеротропная активность которого уже была определена как по "утеротропной биопроб", так и по тесту связывания рецептора и активности рецепторов в условиях in vitro, было включено в исследовательскую программу OECD. Но были проанализированы дополнительные данные тестирования, не связанные с исследовательской программой OECD, что способствовало дальнейшей поддержке спецификации утеротропного биоскрининга эстрогенных агонистов.

2.3. Метод основан на протоколах проведения утвержденных OECD исследований, надежность и воспроизводимость которых была показана в внутри- и в межлабораторных исследованиях. В настоящее время доступны два метода, а именно, метод овариэктомии взрослых (половозрелых) самок (ovx-adult method) и метод без проведения овариэктомии у неполовозрелых самок (immature method). Как показали результаты утвержденных OECD программных испытаний, оба этих метода сопоставимы по чувствительности и воспроизводимости. Однако незрелые самки в связи с интактной гипоталамо-гипофизарно-яичниковой (hypothalamic-pituitary-gonadal) (HPG) осью являются менее специфичными, но значительно более используемыми моделями исследования, чем зрелые самки с удаленными яичниками, поскольку они могут реагировать на вещества, которые взаимодействуют с осью HPG, а не просто с рецептором эстрогена. HPG оси крыс становятся функциональными в возрасте около 15 дней. До этого возраста нельзя ускорить период созревания такими методами, как введение GnRH - гонадолиберина (гонадотропин-высвобождающего гормона). Когда самка начинает достигать половой зрелости, до открытия влагалища она будет иметь несколько молчащих циклов, которые не приводят к вагинальному открытию или овуляции, но определяются некоторые гормональные флуктуации. Результатом непосредственной или опосредованной стимуляции химическим веществом HPG оси является преждевременное половое созревание, ранние овуляции и ускоренное открытие влагалища. Данные эффекты наблюдаются не только при действии химического вещества на HPG оси, но и некоторые диеты с более высоким энергетическим уровнем метаболизма по сравнению с другими могут стимулировать рост и преждевременное открытие влагалища, не обладая эстрогенной активностью. Такие продукты не будут стимулировать утеротропный эффект у самок с удаленными яичниками, поскольку их HPG оси не функционируют.

2.4. Учитывая, что "утеротропный биотест" является скрининговым методом в условиях in vivo, подход к проведению утвержденного исследования состоял в гуманном отношении к обеим группам животных и разработке многоуровневой стратегии тестирования. В этой связи большие усилия были направлены на строгий анализ воспроизводимости и чувствительности методов тестирования эстрогенности - основной проблемы многих химических соединений, тогда как незначительное внимание было уделено антиэстрогенному компоненту. Только один антиэстроген, обладающий высокой активностью, был протестирован из очень лимитированного числа химических субстанций с выраженным антиэстрогенным профилем (не блокируются некоторыми эстрогенами). Таким образом, данный документ посвящен эстрогенному протоколу, тогда как протокол, описывающий тестирование антагонистов, включен в Справочный Документ. Чувствительность и воспроизводимость теста для субстанций с чисто выраженной антиэстрогенной активностью будут более четко определены в дальнейших исследованиях после того, как в течение определенного времени использование биотестов эстрогенности в качестве рутинных тестов позволит определить больше веществ с данным механизмом воздействия.

3. Принцип метода

3.1. "Утеротропный биотест" в связи с его чувствительностью рекомендован для использования на животных, у которых гипоталамо-гипофизарно-яичниковая ось не функционирует, следствием чего является низкий эндогенный уровень циркулирующего эстрогена. Эта система дает возможность выявить максимальный диапазон реакций на воздействие эстрогена при низком базовом уровне веса матки. Два эстрогенных чувствительных механизма самки грызуна отвечают требованию этой системы:

1) незрелые самки после отнятия от груди и до наступления полового созревания;

2) молодые половозрелые самки через достаточно длительное время после овариоэктомии, необходимое для регресса маточных тканей.

3.2. Тестируемое вещество ежедневно вводят в организм перорально через желудочный зонд или с помощью подкожной инъекции. Градуированные дозы тестируемого вещества вводят минимум двум группам экспериментальных животных (п. 4.4.7), применяется одна и та же доза для каждой группы животных в течение 3 последовательных дней при использовании неполовозрелых самок (immature method) и минимум в течение 3 дней при использовании зрелых самок после овариоэктомии (ovx-adult method). Животных забивают примерно через 24 ч после введения последней дозы. Для выявления эстрогенных агонистов оценивают статистически значимое увеличение веса матки самок, принимавших тестируемое вещество, относительно контрольной группы. Статистически значимое увеличение веса матки животных тестируемой группы свидетельствует о положительной реакции биотеста.

4. Описание метода

4.1. Выбор вида животных

4.1.1. По причине гуманного обращения с животными предпочтение должно отдаваться методу с использованием неполовозрелых крыс, избегая хирургического вмешательства на животных и исключая также возможность использования в исследовании животных, у которых имеются признаки, указывающих на начало эструса (п. 4.4.5.1). Обычно используется лабораторные грызуны, линии которых могут быть использованы для тестирования токсичности. Например, при проведении описанных тестов были использованы линии крыс Sprague-Dawley и Wistar. Линии животных со слабой реакцией на тестируемое вещество не должны использоваться. В лаборатории должна быть продемонстрирована чувствительность на тест используемых линий животных, как описано в пп. 4.4.1 и 4.4.2.

4.1.2. В "утеротропном биотесте" постоянно использовались, начиная с 1930 г., крысы и мыши. Утвержденные OECD исследования были проведены только на крысах, основываясь на понимании, что оба вида грызунов должны быть эквивалентными в формировании ответной реакции, и одного вида достаточно для проведения широкомасштабного мирового исследования с целью экономии ресурсов и животных. Крыса является выбором вида экспериментальных животных в большинстве токсикологических исследований по изучению проблем репродукции и развития. Учитывая, что имеется обширная историческая база данных для мышей, и для того, чтобы таким образом расширить сферу действия "утеротропного биотеста" на грызунах для использования в качестве тестируемых экспериментальных видов мышей, в последующем было проведено ограниченное число утвержденных исследований на мышах. Устанавливая подход по лимитированию числа тестируемых веществ для экономии ресурсов и животных, участвующих в разработке теста, лаборатории показали, что "утеротропный биотест" на зрелых молодых мышах с удаленными яичниками позволяет получить качественные и количественные результаты, и, что данные, полученные у крыс и мышей, хорошо соответствуют друг другу. Поскольку результат "утеротропного биотеста" может быть предварительным в долгосрочном исследовании, это позволяет использовать животных одной линии и источника в обоих исследованиях. В перекрестных исследованиях использовалось ограниченное число OVX мышей (мышей с овариоэктомией) и отчет не предоставляет надежные данные для утверждения модели незрелых мышей, что, таким образом, не позволяет рассматривать модель неполовозрелых мышей в рамках данного метода.

4.1.3. Таким образом, в некоторых случаях в качестве экспериментальной модели животных могут использоваться мыши вместо крыс. При выборе данных видов должно быть представлено рациональное обоснование, основанное на токсикологических, фармакокинетических и/или других критериях. При проведении теста на мышах, возможно, возникнет необходимость модификации протокола ведения тестирования. Например, потребление пищи относительно веса тела выше у мышей, чем у крыс, и в соответствии с этим содержание фитоэстрогенов в пище мышей должно быть ниже, чем у крыс.

4.2. Условия содержания и питание

4.2.1. Все процедуры должны соответствовать местным стандартам ухода за лабораторными животными. Приведенное в методе описание ухода и тестирования представляют собой минимальный стандарт и могут быть заменены при наличии местными правилами. Температура в экспериментальной комнате должна быть 22°С . Относительная влажность воздуха - не менее 30% и не более 70%, за исключением периода уборки комнаты. Цель - относительная влажность воздуха 50-60%. Освещение должно быть искусственным. Ежедневная последовательность освещения: свет - 12 ч, темное время - 12 ч.

4.2.2. Лабораторная диетическая пища и питьевая вода должны предоставляться в свободном доступе (ad libitum). Молодые половозрелые животные могут быть размещены в клетках отдельно или в группе до 3 особей. Молодым животным рекомендуется групповое размещение.

4.2.3. Известно, что высокие уровни эстрогенов в лабораторных пищевых диетах приводят к увеличению веса матки грызунов, достаточному для выявления методом "утеротропного биотеста". Высокие уровни фитоэстрогенов и энергии метаболизма в лабораторных пищевых диетах могут также привести к раннему половому созреванию, если используются незрелые животные. Наличие фитоэстрогенов является главным образом результатом включения в пищевые диеты продуктов сои и люцерны, и концентрации фитоэстрогенов, как было показано, варьируются от партии к партии стандартных лабораторных диет. Масса тела является важной переменной величиной, поскольку количество потребляемой пищи связано с массой тела. Таким образом, фактическая доза потребляемых с пищей фитоэстрогенов может варьироваться среди животных одного вида и возраста. У неполовозрелых самок крыс объем потребляемой пищи в соответствии с весом может примерно быть вдвое выше, чем у молодых половозрелых крыс с удаленными яичниками. У молодых половозрелых мышей потребление пищи в соответствии с весом может быть в 4 раза выше, чем у молодых половозрелых крыс с удаленными яичниками.

4.2.4. Результаты "утеротропного биотеста", однако, показывают, что ограниченное содержание фитоэстрогенов в питании является приемлемым и не снижает чувствительность теста. Следует иметь в виду, что уровни содержания фитоэстрогенов в пище для неполовозрелых самок крыс линии Sprague Dawley and Wistar не должны превышать уровней, эквивалентных 350 мкг генистеина/грамм лабораторной диетической пищи. Такая диета также целесообразна при тестировании на молодых половозрелых крысах с удаленными яичниками, поскольку потребление пищи в соответствии с массой тела меньше у молодых половозрелых крыс, чем у неполовозрелых. Если в исследовании необходимо использовать молодых половозрелых мышей с удаленными яичниками или более чувствительных на действие фитоэстрогенов линии крыс, необходимо учесть пропорциональное сокращение уровней фитоэстрогенов в диетическом лабораторном питании [20]. Кроме того, различия в возможной энергии метаболизма различных диет могут привести к изменению начального срока полового созревания.

4.2.5. Предварительно до проведения исследования необходимо провести тщательный подбор диеты без повышенных уровней содержания фитоэстрогенов или метаболизируемой энергии, которые могут привести к искажению результатов. Обеспечение надлежащего исполнения тестовой системы, используемой в лаборатории, как указано в пп. 4.4.1 и 4.4.2 данного метода, является важным для контроля обоих этих факторов. В качестве обеспечения согласованности и достоверности исследований в соответствии со стандартом НЛП, должна проводиться репрезентативная выборка каждой партии диетической лабораторной пищи, используемой во время исследования, для анализа уровней содержания фитоэстрогенов (например, в случае большого контрольного веса матки относительно контрольных показателей имеющейся базы данных или неадекватного ответа на действие эталонного эстрогена, 17 альфа этинилэстрадиола). Аликвоты проб должны быть проанализированы в ходе исследования или заморожены при -20°С или таким способом, чтобы предотвратить разложение образца до проведения анализов.

4.2.6. Некоторые материалы подстилочных принадлежностей могут содержать естественные эстрогенные или антиэстрогенные субстанции (например, кукурузный початок, как известно, влияет на циклы крыс и является антиэстрогеном). Выбранные подстилочные материалы должны содержать минимальный уровень фитоэстрогенов.

4.3. Подготовка животных

4.3.1. Общепризнано, что уход за всеми животными, используемыми в тестировании, будет соответствовать местным стандартам ухода за животными; описание ухода и процесса проводимых процедур изложено ниже и является минимальным стандартом, которое может быть изменено согласно местным правилам. Ниже даются указания ОЭСР на гуманное отношение к животным.

4.3.2. Экспериментальные животные без каких-либо заболеваний или физических аномалий распределяются случайной выборкой в контрольные и опытные группы. Клетки с крысами должны быть расположены таким образом, чтобы свести к минимуму возможные эффекты, связанные с их расположением. Каждое животное должно быть помечено. Предпочтительно, чтобы неполовозрелые животные до отнятия от груди были размещены во время акклиматизации в клетках с матерями или замещающими их животными ("dams or foster dams"). Период акклиматизации до начала проведения эксперимента составляет около 5 дней для молодых половозрелых животных и для незрелых крыс при грудном вскармливании матерями или замещающими их крысами. Если неполовозрелые животные получены для эксперимента после отнятия от грудного материнского питания, необходимо сократить период акклиматизации, поскольку дозированное введение следует начать сразу же после отнятия от груди (п. 4.4.4).

4.4. Процедура тестирования

До начала тестирования, проводимых in vivo, важно убедиться, что получаемые результаты действительно необходимы. Например, существуют два условия, когда могут потребоваться результаты тестирования:

- высокий уровень воздействия (Уровень 1 Основы Концепции, прилож. 6.6.1.1) или указания об эстрогенности (Уровень 2) вызывают необходимость проведения исследования на выявление данного эффекта in vivo;

- эффекты, указывающие на эстрогенность в Уровне 4 или 5 в тестах in vivo, для обоснования связи эффектов с эстрогенным механизмом, что невозможно было определить в тестах in vitro.

4.4.1. Верификация профессиональной компетентности лаборатории.

Два различных подхода могут использоваться для верификации профессиональной компетентности лаборатории:

- Периодическая верификация, основанная на основополагающих контрольных исследованиях (п. 4.4.2). По крайней мере, каждые 6 месяцев и каждый раз при наличии каких-либо изменений, которые могут повлиять на процесс проведения исследования (например, новый состав диетического питания, изменение в составе работающего персонала, изменение линии лабораторных животных или их источника поступления и т.д.), репрезентативность тестируемой системы (модель животного) должна быть верифицирована с применением соответствующей дозы (основанной на результатах основополагающего контрольного исследования, описанного в п. 4.4.2) эталонного эстрогена: ( estradiol) (CAS N 57-63-6) (ЕЕ).

- Использовать при каждом тестировании параллельные контрольные группы, включая группу с введением соответствующей дозы эталонного эстрогена.

Если тестируемая система дает непрогнозируемую реакцию, условия эксперимента должны быть проанализированы и изменены соответствующим образом. Рекомендуется, чтобы доза вводимого эталонного эстрогена в каждом тесте составляла примерно .

4.4.2. Основополагающее контрольное исследование.

Прежде чем лаборатория начинает в первый раз проводить исследование в соответствии с данным документом, должен быть продемонстрирован профессиональный уровень лаборатории путем тестирования дозо-зависимого ответа модели экспериментального животного при введении соответствующей дозы эталонного эстрогена (/CAS N 57-63-6/ЕЕ/) и, как минимум, при введении 4-кратной дозы. Необходимо провести сравнительный анализ изменения веса матки с данными показателями имеющейся базы данных. Если основополагающее контрольное исследование не позволило получить ожидаемые результаты, условия эксперимента должны быть проанализированы и соответствующим образом изменены.

4.4.3. Количество и состояние животных.

Каждая опытная и контрольная группы должны состоять, как минимум, из 6 животных (как для протокола ведения эксперимента с неполовозрелыми, так и ovx-молодыми половозрелыми животными).

4.4.4. Возраст незрелых животных.

При проведении "утеротропного биотеста" на неполовозрелых животных должен быть указан их день рождения. Введение тестируемого вещества должно начинаться достаточно рано для того, чтобы избежать в конце эксперимента взаимосвязи физиологического роста эндогенных эстрогенов с половым созреванием. С другой стороны, имеются сведения, что очень молодые животные могут быть менее чувствительными. При определении оптимального возраста каждая лаборатория должна принимать во внимание свои основополагающие данные по созреванию животных. В качестве общего ориентира, введение тестируемого вещества можно начинать сразу же после раннего отнятия от груди на 18-й постнатальный день (принимая день рождения как постнатальный день 0). Введение тестируемого вещества предпочтительно должно быть завершено на 21-й постнатальный день, но в любом случае до 25-го постнатального для, поскольку по истечении этого возраста гипоталамо-гипофизарно-яичниковая ось начинает функционировать, и уровни эндогенных эстрогенов могут начать расти с соответствующим увеличением исходных показателей веса матки и увеличить групповые стандартные отклонения.

4.4.5. Процедура овариоэктомии.

4.4.5.1. Для получения самок крыс и мышей с удаленными яичниками (опытные и контрольные группы) процедура овариоэктомии должна производиться между 6- и 8-недельным возрастом. Для крыс, как минимум, должно пройти 14 дней от дня овариоэктомии до первого дня введения тестируемого вещества, чтобы свести регрессионные процессы матки до минимальной стабильной базовой линии, необходимой для начала эксперимента. Для мышей должно пройти, как минимум, 7 дней от дня овариоэктомии до первого дня введения тестируемого вещества. Поскольку незначительных участков ткани матки достаточно для продуцирования значительных уровней циркулирующих эстрогенов, животные должны быть протестированы до их использования в эксперименте методом анализа эпителиальных клеток мазков влагалища, как минимум, в течение 5 последовательных дней (т.е. на 10-14-й дни после процедуры овариоэктомии у крыс). При выявлении у животных признаков начала эструса, их использование в эксперименте не разрешается. Кроме того, если при вскрытии животных в конце эксперимента обнаруживается наличие заглушек яичников (ovarian stubs), то данный факт необходимо рассматривать как присутствие тканей данных органов, а полученные от данных животных результаты исследований не должны приниматься в расчет.

4.4.5.2. Процедура овариоэктомии животного начинается с разреза вентральной брюшной стенки после проведенного должным образом наркоза. Разрез, открывающий дорсолатеральную брюшную стенку, должен достигать примерно 1 см и находиться в медианной точке между нижней границей ребер и подвздошного гребня, располагаясь на несколько миллиметров ближе к латеральному краю поясничной мышцы. Яичник должен быть извлечен из брюшной полости на асептическое поле и отсечен на стыке яйцевода и тела матки. После подтверждения отсутствия массивного кровотечения разрез брюшной стенки зашивают шовным материалом. На кожу накладывают аутоклипсы или зашивают соответствующим швом. Точки перевязки схематически показаны на рис. 6.6.1.1. Соответствующая послеоперационная анальгезия должна использоваться согласно рекомендациям ветеринарного ухода за грызунами.

4.4.6. Масса тела.

При использовании ovx-adult метода масса тела и матки не коррелируют, поскольку масса матки зависит от наличия таких гормонов, как эстрогены, но не от факторов роста, регулирующих размеры тела. Напротив, вес тела связан с весом матки у неполовозрелых крыс до наступления полового созревания [34]. Таким образом, на начальном этапе исследования с использованием модели неполовозрелых крыс, изменения массы тела экспериментальных крыс должны быть минимальными и не превышать от средней массы. Это означает, что размер помета должен быть стандартизован заводчиком, чтобы быть уверенным в том, что потомство от различных самок животных будет получать примерно одинаковое грудное питание. Распределение животных по группам (контрольная и опытная) должно осуществляться так, чтобы средний вес тела животных в группах не имел статистически значимых различий. Следует избегать распределения в одну группу животных из одного помета, насколько это возможно без увеличения числа пометов.

4.4.7. Дозы введения.

4.4.7.1. Для определения эстрогенной активности тестируемого вещества in vivo, как правило, достаточны две опытные группы с различными дозами введения тестируемого вещества и одна контрольная группа животных. Эта схема эксперимента является предпочтительной по соображениям защиты животных. Если целью работы является получение кривых дозоэффективной зависимости или экстраполяция на более низкие дозы, как минимум, необходимо изучение 3 доз вещества (3 опытные группы). Если необходимо получить дополнительную информацию, помимо выявления эстрогенной активности (такую, как оценка потенциальной опасности), должны рассматриваться различные режимы дозирования тестируемого вещества. Условия содержания и проведения эксперимента для животных контрольной и опытных групп должны быть идентичными, за исключением процесса введения тестируемых веществ опытным крысам. Если при введении тестируемого вещества опытным животным используются разбавляющие растворы, то животным контрольной группы должны вводить тот же разбавляющий раствор (если в разных опытных группах вводятся разные объемы разбавляющего раствора, то контрольным животным должен вводиться его наибольший объем).

4.4.7.2. Целью "утеротропного биотеста" является выбор доз, которые обеспечивают выживаемость животных, не оказывают на них значительный токсический эффект или не вызывают дистресс-реакцию через 3 последующих дня после введения химического вещества даже в максимальной дозе 1 000 мг/кг/сутки. Все дозы тестируемых веществ и связанных с ними материалов должны быть предложены и приняты для эксперимента с учетом имеющихся данных по их токсичности и токсикокинетике. При выборе самого высокого уровня дозы необходимо в первую очередь учитывать LD50 и/или имеющуюся информацию по острой токсичности для предотвращения смерти, сильных страданий и дистрессов у животных. Самая высокая доза должна представлять максимально толерантную дозу (MTD); исследование, проведенное с использованием уровня дозы, индуцирующей положительный утеротропный ответ, также должно приниматься. Большие интервалы между дозами в целом также приемлемы. Если нет подходящих доступных данных, может быть выполнено исследование по обоснованию выбора диапазона доз для определения таких их уровней, которые будут использоваться при тестировании.

4.4.7.3. Кроме того, если эстрогенную потенциальную активность агониста можно оценить in vitro (или in silico - компьютерное моделирование биологического эксперимента), эти данные могут быть приняты во внимание при выборе доз. Например, количество тестируемого химического вещества, которое может вызвать утеротропные реакции, эквивалентные эталонному агонисту (этинилэстрадиол), оценивается in vitro по его относительной потенциальной активности для этинилэстрадиола. Высшая доза будет рассчитываться умножением этой эквивалентной дозы на соответствующий коэффициент, например 10 или 100.

4.4.8. Обсуждение обоснования выбора диапазона доз.

При необходимости может проводиться исследование по обоснованию выбора диапазона доз с использованием нескольких животных. В данном случае можно пользоваться документом [45] для определения признаков токсичности или дистресса животных. В случае возможности обоснования диапазона доз в проведенном 3-дневном исследовании, примерно через 24 часа после последнего введения тестируемого вещества, матка должна быть удалена и взвешена. Полученные результаты могут затем использоваться для построения основной схемы исследования (выбор приемлемых доз исследования - максимальной и минимальной, определение числа опытных групп).

4.4.9. Введение доз.

4.4.9.1. Тестируемое вещество вводят перорально через желудочный зонд или подкожно инъекционно. При выборе пути введения тестируемого вещества должны приниматься во внимание следующие факторы: благополучие животных; такие токсикологические аспекты, как соответствие путям воздействия тестируемого вещества на организм человека (например, пероральное введение через желудочный зонд соответствует модели приема вещества внутрь, подкожная инъекция - модели ингаляции или кожной адсорбции); физико-химические свойства тестируемого вещества, и особенно имеющаяся токсикологическая информация, а также данные по метаболизму и кинетике (например, необходимо предотвратить первый проход метаболизма путем повышения эффективности конкретного пути).

4.4.9.2. Рекомендуется, по возможности, использовать, в первую очередь, водный раствор/суспензию. Но поскольку большинство эстрогенных лигандов или их метаболические предшественники, как правило, гидрофобны, наиболее распространенным подходом является использование раствора/суспензии масла (например, кукурузного, арахисового, кунжутного или оливкового масла). Однако эти виды масла различаются по калорийности и содержанию жира, и в связи с этим масляные растворы могут повлиять на потребление общей энергии метаболизма (ME), потенцируя, таким образом, конечные изменения таких показателей, как вес матки, особенно у неполовозрелых животных. В связи с этим в предварительном исследовании необходимо провести сравнительное тестирование биоэффекта любого растворителя, который будет использоваться в дальнейших исследованиях, и тестирование контрольной группы без введения растворителя. Тестируемые вещества могут быть растворены в минимальном количестве 95%-го этанола или другого соответствующего растворителя и далее доведены до конечных рабочих концентраций с помощью использующегося в процессе тестирования разбавляющего средства. Необходимо знать токсические характеристики растворителя, который должен быть протестирован в отдельной контрольной группе животных с введением им только данного растворителя. Если тестируемое вещество считается стабильным, следует подогреть его раствор и энергично встряхнуть для полного растворения вещества. Необходимо определить стабильность тестируемого вещества в разбавляющем средстве. Если тестируемое вещество стабильно в течение всего периода исследования, то начинают тестирование одной из доз тестируемого вещества. Разведение определенных доз вещества проводится ежедневно.

4.4.9.3. Выбор временных интервалов введения доз зависит от модели теста (п. 4.4.4 для модели неполовозрелых животных и п. 4.4.5 для модели половозрелых животных с удаленными яичниками - ovx-adult модель). Неполовозрелым самкам крыс вводятся дозы тестируемого вещества ежедневно в течение 3 дней подряд. Также рекомендовано 3-дневное тестирование для самок крыс с удаленными яичниками, но возможно и более длительное тестирование для выявления тестируемых веществ со слабой эстрогенной активностью. Для половозрелых самок мышей с удаленными яичниками 3-дневное тестирование является достаточным, а увеличение длительности тестирования до 7 дней для выявления сильно выраженных эстрогенных агонистов не выявило существенных преимуществ. Однако такая закономерность не была определена для слабо выраженных эстрогенов, и в связи с этим определение степени их активности в тесте с самками мышей с удаленными яичниками необходимо проводить в течение 7 дней. Тестируемое вещество должно вводиться в одинаковой дозе ежедневно в одно и то же время. Это необходимо для поддержания постоянного уровня дозы для организма животного с учетом его веса (например, миллиграмм тестируемого вещества на килограмм веса животного в сутки). Что касается объема введенного раствора тестируемого вещества, то его изменения на основе веса тела должны быть минимизированы путем корректировки концентрации раствора тестируемого вещества для обеспечения постоянного объема на основе веса тела при всех уровнях доз и при различных путях поступления в организм.

4.4.9.4. Внутрижелудочное введение животным тестируемого вещества должно осуществляться однократно через желудочный зонд или соответствующую интубационную канюлю. Максимальный объем раствора, который может быть введен однократно, зависит от размера тестируемого животного. Необходимо следовать местным руководствам по уходу за лабораторными животными, но при этом объем введенного раствора не должен превышать 5 мл/кг веса тела, кроме случаев введения водных растворов, когда возможно их введение в объеме 10 мл/кг веса тела.

4.4.9.5. Введение тестируемого вещества путем подкожной инъекции должно проводиться в объеме одной суточной дозы. Инъекцию следует проводить в область дорсокапсулярного (лопаточного) или люмбарного (поясничного) отдела позвоночника стерильной иглой (например, 23- или 25-gauge) и туберкулиновым шприцем. Выбривание шерсти в области инъекции не обязательно. Любые потери, утечки в месте инъекции или введение неполной дозы должны быть зарегистрированы. Общий суточный объем раствора при инъекционном подкожном введении не должен превышать 5 мл/кг веса тела (кроме случаев с введением водных растворов, когда суточный объем инъецированного раствора можно увеличить до 10 мл/кг веса тела) и вводится распределением в 2 участка тела.

4.4.10. Наблюдения.

4.4.10.1. Общие и клинические наблюдения.

Общие клинические наблюдения необходимо проводить, как минимум, один раз в день и чаще при выявлении признаков токсичности. Наблюдения должны проводиться в одно и то время суток с учетом периода ожидаемого пика эффектов после введения тестируемого вещества. Все животные должны быть обследованы по таким параметрам, как смертность, заболеваемость и таким общим признакам, как изменение поведенческих реакций, состояния кожи, шерсти, глаз, слизистых мембран, появление выделений и экскреций, наличие вегетативных нарушений (например, слезотечение, пилоэрекция, изменение размера зрачка, нарушение дыхания).

4.4.10.2. Масса тела и потребление пищи.

Все животные должны быть взвешены с точностью до 0,1 г с самого начала проведения эксперимента при их распределении по группам. Дополнительно может измеряться потребляемое животными за время тестирования количество пищи, которое можно оценить по весу кормушки каждой клетки. Результаты потребления пищи следует выражать в г/крыса/сутки.

4.4.10.3. Анатомирование и измерения массы матки.

4.4.10.3.1. Через 24 ч после последнего введения тестируемого вещества крысы должны быть забиты гуманным способом. Идеально, если анатомирование животных в анализируемых группах будет проводиться при их рандомизированной выборке, чтобы избежать уменьшения или увеличения дозы воздействия тестируемого вещества на организм животных, что может отразиться на полученных результатах. Задачей тестирования является определение сырой и блоттированной массы матки. Сырая масса матки включает массу самой матки и массу жидкости, содержащейся в ее просвете. Блоттированная (blotted) масса, то есть масса матки без жидкости, определяется после удаления жидкости из просвета матки.

4.4.10.3.2. До вскрытия животного необходимо провести осмотр влагалища у неполовозрелых животных на выявление его открытого статуса. Процедура диссекции матки начинается открытием абдоминальной стенки в области лобкового симфиза. Затем рога матки и яичники, если они присутствуют, отсоединяются от дорсальной абдоминальной стенки. Мочевой пузырь и мочеточники удаляются с вентральной и латеральной стороны матки и влагалища. Фиброзные связки между прямой кишкой и влагалищем разрезаются так, чтобы определялись пересечение вагинального отверстия и перинеальной кожи. Матка и влагалище отсоединяют от тела, перерезая вагинальные стенки чуть выше перекрестка между перинеальной кожей, как показано на рис. 6.6.1.2. Матку необходимо отделить от стенки тела, осторожно разрезая маточную брыжейку в точке ее приложения вдоль всей дорсальнолатеральной длины каждого рога матки. Обработка матки после извлечения из тела животного должна производиться достаточно быстро, чтобы избежать обезвоживания тканей. В случае небольших органов, таких как матка, снижение веса органа в результате обезвоживания становится значительным. При наличии у крыс яичников, они удаляются в области яйцеводов, при этом необходимо предотвратить потерю жидкого содержимого в просвете органов из рогов матки. У животных с удаленными яичниками необходимо провести обследование на выявление наличия заглушек яичников с целью определения возможного сохранения тканей яичников. Избыток жира и соединительная ткань должны быть полностью удалены. Влагалище отсекается от матки чуть ниже шейки матки, так что шейка матки остается с телом матки, как показано на рис. 6.6.1.2.

4.4.10.3.3. Каждая матка должна быть зарегистрирована и взвешена на контейнере (например, на чашке Петри или пластиковых чашках для взвешивания), соблюдая постоянно осторожность, чтобы избежать обезвоживания органа до взвешивания (например, на чашку Петри можно поместить фильтровальную бумагу, слегка смоченную физиологическим раствором). Матка взвешивается вместе с жидким содержимым просвета органа с точностью до 0,1 мг (сырой вес матки).

4.4.10.3.4. Каждая матка затем индивидуально обрабатывается - удаляется жидкое содержимое из просвета органа. Оба рога матки прокалывают или режут продольно. Матку помещают на слегка смоченную фильтровальную бумагу, а вторым, слегка смоченным, фильтровальным листом бумаги осторожно надавливают на матку сверху, чтобы полностью выдавить жидкое содержимое из полости органа. Матка без жидкого содержимого взвешивается с точностью до 0,1 мг (блоттированный вес матки).

4.4.10.3.5. Показатель массы матки по окончании эксперимента может быть использован для установления факта, что соответствующий возраст незрелых интактных крыс не был превышен, однако накопленный в лаборатории банк данных по используемой в эксперименте линии животных должен быть решающим при решении данного вопроса (п. 7.4) для интерпретации результатов.

4.4.10.4. Дополнительные исследования.

После взвешивания матка может быть зафиксирована в 10%-м растворе забуференного нейтрального формалина для гистопатологического исследования с последующим окрашиванием срезов гематоксилин-эозином. Соответственно, может быть исследовано влагалище (п. 2.3). Кроме того, может быть проведена количественная морфометрическая оценка эпителия эндометрия для сравнительного анализа.

5. Данные и отчетность

5.1. Данные

5.1.1. Данные (результаты) исследования должны включать:

- количество использованных животных в начале исследования;

- количество и идентификацию животных, найденных мертвыми во время исследования или убитых по гуманным соображениям, а также дату и время смерти;

- количество и идентификацию животных с признаками токсического действия и описание наблюдаемых признаков токсического действия, включая время проявления, длительность и тяжесть любого токсического эффекта;

- число и идентификацию животных, у которых обнаружены какие-либо повреждения, и описание типа повреждений.

5.1.2. Для каждого конкретного животного должны быть запротоколированы следующие данные: показатели веса тела, сырой вес матки, блоттированный вес матки. Необходимо провести статистический анализ данных, полученных при тестировании эстрогенных агонистов, для выявления статистически значимого (р < 0,05) увеличения веса матки при действии тестируемого вещества. Соответствующий статистический анализ должен быть проведен для выявления показателей веса сырой и блоттированной матки. Например, полученные данные могут быть оценены методом ковариационного анализа (ANCOVA) с весом животного при вскрытии как ковариабельные. Предварительно необходимо провести дисперсно-стабилизирующее логарифмическое преобразование (variance-stabilizing logarithmic transformation) показателей веса матки. Тест Dunnett и Hsu подходит для проведения парных сравнений каждой опытной группы относительно контрольной группы и определения доверительных интервалов. Метод Studentised residual plots может быть использован для обнаружения возможных отклонений и оценки однородности дисперсии. Эти методы были применены при выполнении утвержденных OECD программ с использованием PROC GLM в статистической системе анализа (SAS институт, Кэри, Северная Каролина - Statistical Analysis System (SAS Institute, Cary, Северная Каролина), версия 8 [6, 7].

5.1.3. Заключительный отчет должен содержать следующую информацию:

5.1.3.1. Исследовательский центр:

- ответственный персонал и их исследовательские обязанности;

- данные, полученные при выполнении Основополагающего Положительного Контрольного Теста и периодических положительных контрольных тестов (пп. 4.4.1 и 4.4.2).

5.1.3.2. Тестируемое вещество:

- характеристика тестируемого вещества;

- физическая природа и, в случае наличия, физико-химические свойства;

- метод и частота подготовки разведений;

- любые данные относительно стабильности;

- любые анализы при выборе доз.

5.1.3.3. Растворитель:

- характеристика используемого в тесте растворителя (природа, источник приобретения и объем);

- обоснование выбора растворителя (если не является водой).

5.1.3.4. Тестируемые животные:

- виды, линии и обоснование их выбора;

- поставщик и конкретный источник поступления;

- возраст, по данным поставщика, и день рождения;

- для неполовозрелых животных - получены ли они от поставщика с матерями или замещающими матерей животными или нет, дата отлучения от груди;

- детальное описание процедуры акклиматизации животных;

- количество животных в каждой клетке;

- детали и методы идентификации каждого животного и группы.

5.1.3.5. Условия для проведения анализа:

- детали рандомизации процесса (то есть, используемый метод);

- обоснование выбора доз;

- подробная информация о тестируемых веществах, формула, их определенные концентрации, показатели стабильности и однородности;

- детали введения тестируемого вещества и обоснование выбора путей введения;

- диета (название, тип, поставщик, содержание и, если известно, уровни содержания фитоэстрогенов);

- источник воды (например, водопроводная или фильтрованная вода) и оборудование (по насосно-компрессорным трубам (НКТ) от большого контейнера, в бутылках и т.д.);

- подстилочные принадлежности (название, тип, поставщик, содержание);

- запись условий проживания в клетке, интервал освещения, комнатная температура и влажность, уборка;

- детальное описание вскрытия животного и процедуры взвешивания матки;

- описание статистических анализов.

5.2. Основные результаты теста

5.2.1. Для каждого животного:

- ежедневный вес (с момента распределения по группам до вскрытия животного) (с точностью до 0,1 г);

- возраст (в днях, считая день рождения как 0) к моменту начала введения тестируемого вещества;

- дата и время введения каждой дозы тестируемого вещества;

- расчетный объем и дозировка введения тестируемого вещества и описание фактов любых потерь введенных доз во время или после введения;

- ежедневные показатели состояния животного, включая соответствующие симптомы и наблюдения;

- предположительная причина смерти (если животное во время проведения исследования найдено мертвым или умирающим);

- дата и время гуманного умерщвления с временным интервалом после последнего введения дозы вещества;

- вес сырой матки (с точностью до 0,1 мг) и любые замечания о потерях жидкого содержимого из просвета органа до времени вскрытия животного и препарирования органа для взвешивания;

- блокированный вес матки (с точностью до 0,1 мг).

5.2.2. Для каждой группы животных:

- ежедневный средний вес тела (с точностью до 0,1 г) и стандартные отклонения (с момента распределения животных по группам до момента их вскрытия);

- средний вес сырой матки и средний вес блоттированной матки (с точностью до 0,1 г) и стандартные отклонения;

- если оценивается, ежедневное потребление продовольствия (рассчитывается как грамм потребляемого продовольствия на одно животное);

- результаты статистического анализа различий сырого и блоттированного веса матки животных опытных групп относительно указанных различий соответствующих контрольных групп;

- результаты статистического анализа различий общего веса тела и веса тела животных опытных групп относительно указанных различий соответствующих контрольных групп.

6. Обобщение важных условий проведения утеротропного биотеста на грызунах

	Крыса	Мышь
Животные
Линии	Основные лабораторные линии грызунов
Количество животных	Минимум 6 животных в каждой опытной группе
Количество групп	Минимум 2 опытные группы (п. 4.4.7.1) и негативная контрольная группа Указания для позитивных контрольных групп пп. 4.4.1 и 4.4.2
Условия содержания и питания
t° в комнате содержания животных
Относительная влажность воздуха	50-60% - не ниже 30% и не выше 70%
Ежедневная последовательность освещения	свет- 12 часов, темнота - 12 часов
Диетическое питание и питьевая вода	Ad libitum
Содержание	Индивидуально или в группах до 3 животных (социальные группы содержания рекомендованы для неполовозрелых животных)
Диета и подстилочный материал	Рекомендован низкий уровень содержания фитоэстрогенов в диете и подстилочном материале
Протокол
Метод	Метод с неполовозрелыми крысами без проведения процедуры овариэктомии (предпочтительный метод). Метод с половозрелыми самками после проведения процедуры овариоэктомии (OVX-модель)	Метод с половозрелыми самками после проведения процедуры овариоэктомии (OVX-модель)
Возраст, рекомендованный для начала проведения тестирования для неполовозрелых животных	Самый ранний срок - постнатальный день (ПНД) 18. Тестирование должно быть прекращено до ПНД 25	Нет соответствующих данных в рамках данного Теста
Возраст, рекомендованный для проведения операции овариоэктомии	В возрасте между 6 и 8 неделями
Возраст, рекомендованный для начала проведения тестирования для животных с удаленными яичниками (OVX-модель)	Минимум 14 дней должно пройти со дня проведения овариоэктомии до 1-го дня введения тестируемого вещества	Минимум 7 дней должно пройти со дня проведения овариоэктомии до 1-го дня введения тестируемого вещества
Вес тела	Различия значений веса тела должны быть минимальными и не отклоняться на от показателя среднего веса
Введение и дозирование тестируемого вещества
Путь поступления	Пероральный через желудочный зонд или подкожное инъекционное введение
Частота введений	Однократная суточная доза
Объем вводимого раствора тестируемого вещества при желудочном и инъекционном введении	мл/кг веса тела (или до 10 мл/кг веса тела в случае водных растворов) (подкожное инъекционное введение больших объемов тестируемого раствора производится в 2 сайта тела)
Длительность тестирования	3 последовательных дня для модели с неполовозрелыми крысами Минимум 3 последовательных дня для OVX-модели	7 последовательных дней для OVX модели
Время вскрытия животных	Приблизительно через 24 ч после введения последней дозы
Результаты
Положительная реакция	Статистически достоверное увеличение среднего веса матки (сырой и/или блоттированной)
Референтный (эталонный) эстроген	эстрадиол ( estradiol)

7. Руководство по интерпретации и признанию результатов

7.1. Утеротропное действие веществ не всегда полностью имеет эстрогенное происхождение. Данное действие могут оказывать также химические вещества, не являющиеся агонистами или антагонистами эстрогенов. Например, относительно высокие дозы прогестерона, тестерона или других синтетических прогестинов могут вызвать стимулирующий эффект. Любая реакция может быть проанализирована гистологическим выявлением кератинизации и ороговении слизистой оболочки влагалища. Независимо от механизма эффекта положительные результаты "утеротропного биотеста", как правило, должны инициировать мероприятия для дальнейших изысканий. Дополнительные сведения об эстрогенной активности могут быть получены в тестах in vitro, таких как тесты связывания с эстрогенными рецепторами или активации транскрипции репортерных генов, или в тестах in vivo, таких как оценка полового созревания самки.

7.2. В целом тест по выявлению эстрогенности должен считаться положительным, если существует статистически значимое увеличение веса матки (р < 0,05), по крайней мере, на уровне высокой дозы относительно данного показателя соответствующей контрольной группы. Положительный результат в дальнейшем подтверждается демонстрацией биологически выраженной взаимосвязи между дозой и величиной эффекта, принимая во внимание, что дублирование тестирования эстрогенной и антиэстрогенной активности химических соединений может повлиять на форму кривой дозо-эффективной зависимости.

7.3. Необходимо принять к сведению, что при тестировании нельзя использовать дозы, превышающие МПД (MTD) химических веществ, с целью интерпретации данных и достижения значимости результатов. Снижение веса тела, признаки токсичности и другие показатели должны тщательно оцениваться в этом отношении.

7.4. Важным моментом для анализа результатов "утеротропного биотеста" является показатель веса тела крыс соответствующей контрольной группы. Высокие значения показателей контрольной группы могут исказить достоверность результатов биопробы и ее способность выявлять активность слабых эстрогенов. Данные литературы предполагают наличие случайных высоких контрольных показателей, особенно у неполовозрелых животных. Поскольку вес матки неполовозрелых крыс зависит от многих переменных факторов, таких как тип линии крыс или вес тела, четко определенные пределы веса матки не могут быть представлены. В качестве руководства можно порекомендовать, что если значения блоттированного веса матки у неполовозрелых крыс находятся в пределах между 40 и 45 мг, полученные результаты должны вызвать подозрение в достоверности исследования, а значения веса матки выше 45 мг могут вызвать необходимость повторного проведения тестирования. Однако данный вопрос необходимо рассматривать конкретно для каждого случая. При тестировании на половозрелых крысах необходимо учитывать, что в результате проведенной, возможно, неполной овариоэктомии в организме сохраняются ткани яичников, способные продуцировать эндогенные эстрогены, которые тормозят снижение веса матки в эксперименте.

7.5. Если значения веса блоттированной матки в соответствующих контрольных группах меньше 0,09% от значений веса тела у неполовозрелых крыс и меньше 0,04% от значений веса тела у половозрелых самок с удаленными яичниками, то результаты проведенного тестирования считаются приемлемыми. Если контрольные значения блоттированного веса матки превышают указанные параметры, следует проанализировать различные факторы, включая возраст животных, правильность проведения операции овариоэктомии, присутствие в пище фитоэстрогенов и т.д., которые могут повлиять на полученные результаты, и выявленные в данном случае отрицательные реакции теста (без выявления эстрогенной активности) должны приниматься и использоваться с осторожностью.

7.6. Полученные в лаборатории данные при исследовании контрольных животных различных экспериментов ("исторические данные") должны сохраняться и накапливаться. Исторические данные по ответным реакциям на эталонные эстрогены, такие как эстрадиол, должны также сохраняться. Кроме того, лаборатории могут тестировать ответную реакцию слабых агонистов эстрогенов. Все эти данные можно сравнить с опубликованными данными и убедиться в чувствительности методов лаборатории.

7.7. Изменения веса блоттированной матки по результатам данных исследований OECD, менее выражены, чем изменения веса сырой матки. Однако наличие ответной реакции в любой степени выраженности указывает на положительную эстрогенную активность тестируемого вещества.

7.8. Утеротропная реакция не связана полностью с эстрогенным механизмом, однако положительный результат "утеротропного биотеста" должен, как правило, интерпретироваться как свидетельство эстрогенного потенциала in vivo и инициировать действия для дальнейших разработок (см. п. 5.3.1 и "Концептуальная основа ОЭСР тестирования и оценки химических веществ, повреждающих эндокринную систему ("OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals"), Приложение).