Приложение 6.7.1. Исследование отдаленного нейротоксического действия фосфорорганических соединений после острого воздействия

Приложение 6.7.1

Исследование отдаленного нейротоксического действия фосфорорганических соединений после острого воздействия

Идентичен международному документу OECD TG N 418 "Delayed Neurotoxicity of Or- ganophosphorus Substances Following Acute Exposure" (ОЭСР Руководство N 418 "Исследование отдаленного нейротоксического действия фосфорорганических соединений после острого воздействия"). Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования обеспечивает получение информации об отдаленном нейротоксическом действии фосфорорганических соединений после их острого воздействия на лабораторных животных и позволяют оценить и классифицировать вещество в соответствии с СГС по данному виду воздействия.

2. Общие положения

2.1. Исследование нейротоксичности химических веществ и продукции на их основе вследствие ингибирования эстеразы (нейротоксичная эстераза - далее НТЭ) для определения последствий в течение 21 дня адекватно высокой дозы без повторного введения.

2.2. Метод позволяет дать оценку специфическим типам нейротоксичности, которые не могут быть обнаружены в других токсикологических исследованиях.

2.3. Ингибирование НТЭ в головном и спинном мозге в течение 24-48 часов после введения препарата хорошо коррелирует с клиническими и морфологическими эффектами отдаленного нейротоксического действия, наблюдаемого в течение 10-20 дней после воздействия. Также НТЭ является актуальной моделью тестирования для всех фосфорорганических эфиров, являющихся причиной отдаленных невропатий человека.

2.4. Количественные данные об ингибировании НТЭ позволяют значительно повысить точность определения неоднозначных результатов, которые могут наблюдаться в поведенческих реакциях и результатах гистологических исследований, возникающих вследствие отдаленной нейроинтоксикации.

2.5. До проведения эксперимента необходимо рассмотреть всю доступную об исследуемом веществе информацию. Такая информация включает данные о составе и химическом строении вещества; его физико-химические свойства; результаты токсикологических испытаний in vivo и in vitro; токсикологические данные по структурно родственным веществам и предполагаемые пути использования вещества. Эта информация необходима для подтверждения того, что испытание является важным для защиты здоровья человека и способствует обоснованному выбору начальной дозы.

3. Принцип метода

3.1. Исследуемое вещество вводят перорально однократно домашним курам, которые при необходимости были защищены от острых холинергических эффектов.

3.2. Животных наблюдают в течение 21 дня для изучения нарушений поведенческих реакций, атаксии и параличей.

3.3. Биохимический анализ, в частности НТЭ, проводят на курах, выбранных случайным образом из каждой группы, как правило, через 24 и 48 часов после введения препарата.

3.4. Через двадцать один день после введения исследуемого вещества оставшихся кур подвергают эвтаназии и их нервные ткани подвергают гистологическому исследованию (п. 4.3.9).

4. Описание метода

4.1. Подопытные животные

4.1.1. Выбор видов животных.

Для проведения эксперимента рекомендуются молодые самки яйценосной породы кур (Gallus gallus domesticus) в возрасте от 8 до 12 месяцев.

В исследовании используются животные (куры) стандартных размеров породы и линии, выращенные в условиях свободного передвижения.

4.1.2. Содержание и условия кормления.

Экспериментальных животных содержат в достаточно больших клетках или вольерах, которые позволяют курам свободно передвигаться и дают возможность наблюдать за их движениями.

В помещениях с искусственным освещением необходимо соблюдать последовательность 12 часов света, 12 часов темноты.

Животные должны содержаться с использованием соответствующей диеты и с неограниченным потреблением питьевой воды.

4.1.3. Подготовка животных.

Молодые и здоровые взрослые куры, без вирусных заболеваний, без применения лекарственных препаратов и без нарушения движений должны быть случайно выбраны в группу тестирования и в контрольную группу.

Все животные должны пробыть в лабораторных условиях для акклиматизации, по крайней мере, в течение 5 дней до начала исследования.

4.2. Способ введения и дозы препарата

Как правило, тестируемое вещество вводится перорально либо с использованием зондового питания, в желатиновых капсулах или другим аналогичным методом.

Жидкости могут быть даны как в неразбавленном виде, так и разведенные в соответствующих растворителях таких, как кукурузное масло. Твердые частицы должны быть суспендированы, если это возможно, так как большие дозы твердых веществ в желатиновых капсулах могут не оказать эффекта.

Токсикологические характеристики неводных растворителей должны быть заранее известны или определяться до начала исследования.

4.3. Процедура испытания

4.3.1. Количество животных и группы тестирования.

Дополнительно к экспериментальной группе должна быть группа контроля растворителя и группа позитивного контроля.

Группа тестирования и группа контроля растворителя должны содержать достаточное количество кур, так как шесть особей могут быть декапитированы для биохимического анализа (по три особи на каждую из двух временных точек) и шесть должны содержаться в течение 21-дневного периода наблюдений для гистопатологического исследования.

С группой контроля растворителя следует обращаться аналогичным образом, как с группой тестирования, за исключением введения тестируемого вещества.

Позитивная контрольная группа должна содержать, по крайней мере, шесть кур (три - для биохимических исследований и три - для гистопатологических исследований), которым должен вводиться известный нейротоксикант с отсроченным эффектом, например, широко используемый нейротоксикант три-о-крезиловый фосфат (ТОКФ).

Рекомендуется периодическое обновление литературных данных. При появлении новых данных для позитивного контроля должны быть разработаны новые параметры проведения лабораторных испытаний (например, порода, режим питания, условия содержания).

4.3.2. Предварительное исследование по подбору дозы.

Для подбора уровней доз, которые будут использоваться в основном исследовании, проводят предварительное исследование с использованием соответствующего количества кур и уровней доз.

Цель предварительного исследования заключается в установлении максимальной дозы для постановки основного эксперимента, поскольку полученные результаты будут также определять необходимость проведения 28-дневного наблюдения.

В предварительном исследовании необходима некоторая летальность, чтобы определить основную адекватную дозу исследования.

Для предотвращения гибели животных от острого холинергического эффекта, можно использовать атропин или другое известное защитное средство, не влияющее на отдаленные нейротоксические реакции. Различные методы тестирования могут быть применены для оценки максимально несмертельной дозы исследуемого вещества (см. ОЭСР Руководство N 420). Также полезны в процессе подбора дозы литературные данные о курах или другая токсикологическая информация.

4.3.3. Ограничения метода.

Если в ходе тестирования с использованием процедур, описанных в данном руководстве, установлено, что доза на уровне не менее 2 000 мг/кг массы тела в сутки не обладает отдаленным нейротоксическим действием, а ожидаемая токсичность основана на наличии данных о токсичности структурно родственных соединений, тогда исследования с более высокими дозами не проводятся.

Ограничение метода не применяется в случае, когда данные по воздействию вещества на человека указывают на необходимость использования более высоких уровней доз.

4.3.4. Основные исследования по выбору дозы.

Уровни доз тестируемого вещества в основном исследовании должны быть как можно выше с учетом результатов предварительного подбора дозы, но не выше 2 000 мг/кг массы тела.

Количество животных, участвующих в эксперименте, должно быть достаточным для биохимического (шесть) и гистологического исследования (шесть) в течение 21 дня наблюдения с учетом возможного летального исхода.

Для предотвращения гибели животных от острого холинергического эффекта необходимо использовать атропин или другое известное защитное средство, не влияющее на отдаленные нейротоксические реакции.

4.3.5. Замечания.

Наблюдение за экспериментальными животными начинается сразу после введения исследуемого вещества.

В течение первых 2 дней за всеми курами наблюдают несколько раз в день. В дальнейшем в течение 21 дня или до эфтаназии в соответствии с графиком наблюдение проводится не менее одного раза в сутки.

Все признаки интоксикации животных записываются, в том числе, время начала, тип, тяжесть и продолжительность нарушений поведенческих реакций.

Атаксия должна быть измерена в соответствии с градацией шкалы, состоящей, по меньшей мере, из четырех уровней, отдельно отмечаются случаи паралича.

Куры, отобранные для изучения патологии, не менее двух раз в неделю извлекаются из клеток и подвергаются вынужденной двигательной активности (движение вверх по лестнице) для облегчения выявления минимального токсического эффекта.

Любое умирающее животное должно быть удалено из группы, подвергнуто эвтаназии и общей некропсии.

4.3.6. Масса тела.

У всех животных определяют массу тела (взвешивают) перед введением тестируемого вещества и не менее одного раза в неделю в течение всего эксперимента.

4.3.7. Биохимические исследования.

В течение нескольких дней после введения тестируемого препарата по шесть животных, случайно выбранных из экспериментальной группы и группы контроля растворителя, а также по три особи из группы позитивного контроля подвергаются эвтаназии для определения активности НТЭ в нервной ткани мозга и поясничного отдела спинного мозга. Также может быть исследована активность НТЭ в ткани седалищного нерва.

По три птицы из контрольной, каждой экспериментальной и группы позитивного контроля подвергают эвтаназии через 24 часа и по три через 48 часов. Три птицы из группы позитивного контроля подвергают эвтаназии через 24 часа одновременно с экспериментальными животными.

Если наблюдаемые клинические признаки интоксикации (часто это можно оценить путем наблюдения за моментом начала холинергической атаки) указывают на то, что токсичный агент может быть отнесен к очень медленным, то предпочтительнее проводить забор образцов ткани (каждый раз от трех птиц) между 24 и 72 часами после введения препарата.

В полученных образцах при необходимости можно исследовать активность ацетил- холинэстеразы (AChE). Однако возможна спонтанная реактивация AChE in vivo, что может привести к недооценке исследуемого вещества как ингибитора AChE.

4.3.8. Вскрытие животных.

При вскрытии всех животных (плановозабитых и забитых умирающих) осуществляется оценка внешнего вида головного и спинного мозга.

4.3.9. Гистопатологические исследования.

Нервная ткань животных, выживших в течение всего периода наблюдения, не используемая для биохимических исследований, должна быть подвергнута микроскопическому исследованию.

Ткани должны быть зафиксированы in situ с помощью перфузионной техники.

Образцы должны включать ткани мозжечка (средний продольный уровень), продолговатого мозга, спинного мозга и периферических нервов.

Образцы спинного мозга должны быть взяты из верхних шейных сегментов средне- грудного и пояснично-крестцового отделов.

Необходимо также взять образцы из дистального отдела большеберцового нерва и его ответвлений в икроножной мышце и седалищного нерва.

Миелиновые оболочки и аксоны должны быть окрашены с использованием соответствующих специфических методик.

5. Данные и отчетность

5.1. Данные

Данные по каждому животному должны быть предоставлены индивидуально.

Все данные должны быть обобщены в табличной форме с указанием для каждой опытной группы количества животных в начале эксперимента, количества животных с нарушениями поведенческих или биохимических реакций, их типа и степени этих нарушений и процентного соотношения, отображающего каждый тип и тяжесть нарушения или реакции.

5.2. Оценка результатов

Результаты проведенного исследования оцениваются с точки зрения распространенности, тяжести и корреляции поведенческих, биохимических реакций с результатами гистопатологических исследований, а также с любыми другими наблюдаемыми эффектами в тестируемой и контрольных группах.

Численные результаты оцениваются с использованием надлежащих общепринятых статистических методов. Статистические методы должны быть выбраны на этапе планирования исследования.

5.3. Отчет об исследовании

Протокол испытаний должен содержать следующую информацию:

Тестируемое вещество:

- физическая природа (в том числе изомеризация, чистота и физико-химические свойства);

- идентификационные данные.

Растворитель (при необходимости):

- обоснование выбора растворителя, кроме воды.

Животные:

- используемая линия;

- количество и возраст животных;

- условия содержания, пищевой рацион и т.д.;

- индивидуальный вес животных в начале исследования.

Условия испытания:

- описание тестируемого действующего вещества препарата, его стабильность и гомогенность, при необходимости;

- способ введения тестируемого вещества;

- описание пищевого и питьевого рациона;

- обоснование выбора дозы;

- детализация введения дозы препарата с указанием растворителя, объема и физической формы вводимого препарата;

- детальное описание любого защитного средства.

Результаты:

- масса животного;

- токсикологические данные по группам, в том числе и по смертности;

- характер, тяжесть и продолжительность клинических наблюдений (независимо от того, обратимы они или нет);

- подробное описание биохимических методов и их результатов;

- результаты аутопсии;

- подробное описание всех гистологических результатов;

- статистическая обработка результатов, где это необходимо.

Обсуждение результатов.

Выводы.