Приложение 6.8.6. Генетическая токсикология: Метод оценки сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций у Drosophila melanogaster

Приложение 6.8.6

Генетическая токсикология: Метод оценки сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций у Drosophila melanogaster

Идентичен международному документу OECD TG N 477 "Genetic Toxicology: Sex-Linked Recessive Lethal Test in Drosophila melanogaster" (ОЭСР Руководство N 477 "Генетическая токсикология: Метод оценки сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций у Drosophila melanogaster"). Принят 4 апреля 1984 г. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает порядок проведения испытания химических веществ методом оценки сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций у Drosophila melanogaster (СПРЛ). Метод СПРЛ используют для выявления как точечных мутаций, так и небольших делеций в половых клетках насекомых. Это прямой тест выявления мутаций, охватывающий примерно 800 локусов Х-хромосомы, что составляет около 80% всех локусов на Х-хромосоме. Х-хромосома представляет приблизительно 1/5 полного генома дрозофилы.

2. Общие положения

2.1. По изучаемому соединению представляют следующие данные:

- твердое, жидкое, парообразное или газообразное вещество;

- химическая идентификация вещества;

- чистота (примеси) вещества;

- растворимость;

- температура плавления/кипения вещества;

- рН (где необходимо);

- давление паров (если имеются данные).

3. Принцип метода

3.1. Мутации в Х-хромосоме Drosophila melanogaster фенотипически экспрессируются у самцов, несущих мутантный ген. Когда мутация летальна в гемизиготном состоянии, ее наличие проявляется как отсутствие в потомстве одного из двух классов самцов, которые нормально появляются у гетерозиготных самок.

3.2. Метод СПРЛ имеет преимущество в том, что проводится со специально маркированными и перестроенными хромосомами.

4. Описание метода

4.1. Методы проведения СПРЛ-теста на Drosophila melanogaster описаны в литерауре. Самцов дикого типа обрабатывают исследуемым веществом и скрещивают с определенными самками. Самок потомства скрещивают индивидуально с их братьями. В следующей генерации потомства от каждого индивидуального скрещивания фенотипически подсчитывают самцов дикого типа. Отсутствие этих самцов указывает на то, что рецессивные сцепленные с полом летальные мутации возникли в половых клетках самцов.

4.1. Материалы

Линии

4.1.1. Могут использоваться самцы хорошо определяемого дикого типа и самки линии Muller-5. Также возможно использование других соответственно маркированных линий самок с множественными инверсиями Х-хромосомы.

Тестируемое вещество

4.1.2. Исследуемое вещество растворяют в воде. Нерастворимые в воде вещества можно растворять или суспендировать в подходящих растворителях (например, смеси этанола и Tween-60 или Tween-80), а затем перед введением разводить в воде или физиологическом растворе. Следует избегать использования в качестве растворителя диметилсульфоксида.

Контроли

4.1.3. Примеры веществ, которые могут быть использованы как положительные контроли:

- этилметансульфонат;

- N-нитрозодиметиламин.

4.1.4. Необходимо включать негативный контроль с растворителем. Однако, если в лаборатории накоплен большой исторический контроль, то нет необходимости ставить конкурентные контроли.

4.2. Условия испытания

Путь введения

4.2.1. Возможно введение оральное, инъекционное или ингаляционное с газом или парами. Кормление с исследуемым веществом может быть проведено в растворе сахара. При необходимости вещество можно растворить в 0,7% растворе NaCl и инъецировать в грудную клетку или живот.

Уровни экспозиции

4.2.2. В начале оценки мутагенности используют одну экспозицию (дозу) исследуемого вещества, которая является максимально переносимой концентрацией или вызывает ряд признаков токсичности. Если метод используют для верификации, то применяют, по крайней мере, два дополнительных уровня экспозиции.

4.3. Проведение эксперимента

4.3.1. Самцов дикого типа (в возрасте 3-5 дней) обрабатывают исследуемым веществом и скрещивают индивидуально с избытком виргинных самок линии Muller-5 или самками других, соответственно маркированных (с множественными инверсиями Х-хромосомы) линий. Каждые 2-3 дня самок заменяют на новых виргинных самок, проводя таким образом анализ полного цикла половых клеток. Потомство этих самок позволяет учитывать летальные эффекты при воздействии на зрелую сперму, сперматиды на средней и поздней стадии, ранние сперматиды, сперматоциты и сперматогонии.

4.3.2. Гетерозиготных самок предыдущих скрещиваний индивидуально (т.е. одну самку на пробирку) спаривают с их братьями. В генерации в каждой культуре определяют отсутствие самцов дикого типа. Если самка несет летальную Х-хромосому отца (т.е. наблюдается отсутствие самцов с обработанной хромосомой), дочерей этих самок с тем же генотипом следует исследовать, чтобы оценить передается ли летальность следующим генерациям.

4.3.3. Для теста должна быть заранее установлена чувствительность и сила. Число особей в каждой группе должно определяться этими параметрами. Спонтанная частота мутантов, наблюдаемая в соответствующем контроле, сильно влияет на число обработанных хромосом, которое необходимо проанализировать, чтобы выявить вещества, индуцирующие частоту мутаций, близкую к таковой в контроле.

4.3.4. Результаты теста должны быть подтверждены в отдельном эксперименте.

5. Результаты и отчет

5.1. Обработка результатов

5.1.1. Данные следует представлять в табличной форме, указывая число тестируемых хромосом, число нефертильных самок, число летальных хромосом для каждой концентрации вещества, каждого периода скрещивания на каждого обработанного самца. Число кластеров разных размеров на самца следует представить.

5.1.2. Для оценки сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций используют различные статистические методы. Кластеры рецессивных леталей от одного самца следует учитывать и оценивать соответствующими статистическими приемами.

Оценка результатов

5.1.3. Имеются разные критерии определения позитивного результата, одним из которых является статистически значимое повышение частоты сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций с возрастанием дозы. Другой критерий - воспроизводимый, статистически значимый положительный эффект хотя бы на одной экспериментальной точке.

5.1.4. Вещество, не вызывающее ни статистически значимого повышения частоты сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций с возрастанием дозы, ни статистически значимого положительного эффекта хотя бы на одной экспериментальной точке, считается не мутагеном в данной тест-системе.

5.1.5. Как биологическая, так и статистическая значимость должны оцениваться совместно при анализе результатов.

5.2. Отчет

5.2.1. Отчет должен содержать следующую информацию:

- сток: сток и линии используемых дрозофил; возраст насекомых; число обработанных самцов; число стерильных самцов; число поставленных культур; число культур без потомства; число исследованных хромосом; число хромосом, несущих летальные мутации для каждой стадии половых клеток;

- условия тестирования: детальное описание схемы обработки и проведения опыта; уровни экспозиции, данные по токсичности, негативные (растворитель) и позитивные контроли;

- критерии учета летальных мутаций;

- анализ зависимости экспозиция-эффект (там, где проводилась);

- статистическая оценка.

Интерпретация результатов

5.2.2. Положительный результат в тесте СПРЛ на дрозофиле показывает, что вещество индуцирует мутации в половых клетках насекомого. Отрицательный результат предполагает, что при данных условиях тестирования вещество не индуцирует мутации в половых клетках насекомого.