Приложение 6.8.4. Метод оценки хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих

Приложение 6.8.4

Метод оценки хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих

Идентичен международному документу OECD TG N 475 "Mammalian Bone Marrow Chromosome Aberration Test" (ОЭСР Руководство N 475 "Метод оценки хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих"). Принят 21 июля 1997 года. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает порядок проведения испытания химических веществ с помощью метода оценки хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих. Метод оценки хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих (обычно грызунов) in vivo используют для анализа структурных аберраций хромосом, индуцированных исследованным соединением. Имеется два типа аберраций хромосом: хроматидные и хромосомные. Возрастание полиплоидии указывает на возможность индукции веществом нарушений числа хромосом. Подавляющее большинство химических мутагенов индуцирует аберрации хроматидного типа. В то же время возможно увеличение аберраций хромосомного типа. Хромосомные мутации и связанные с ними события являются причиной многих генетических болезней человека. Имеются четкие данные, что хромосомные мутации и связанные с ними события, вызывающие нарушения в онкогенах и генах опухолевых супрессорах, вовлечены в процесс канцерогенеза у человека и экспериментальных тест-систем.

2. Общие положения

2.1. Обычно опыты ставят на грызунах. Тканью-мишенью является костный мозг, поскольку это высоко васкулизированная ткань, содержащая популяцию быстро делящихся клеток, которые можно легко выделить и с которыми легко работать. Другие виды животных и ткани-мишени не являются предметом рассмотрения в данном документе.

2.2. Данный метод особенно подходит при оценке опасности мутагенов, т. к. опыт in vivo позволяет учесть такие факторы, как метаболизм, фармакокинетика и процессы репарации ДНК, хотя они могут варьировать между видами и между тканями. Тест in vivo также полезен при дальнейшей оценке мутагенного эффекта, выявленного в тест-системах in vitro.

2.3. Если известно, что вещество или активный метаболит не достигают ткани-мишени, этот тест не подходит для оценки мутагенности.

3. Принцип метода

3.1. Животных подвергают воздействию исследуемого соединения при соответствующем пути введения и умерщвляют через определенное время после введения. Перед умерщвлением животным вводят вещество, блокирующее митоз на стадии метафазы (т.е. колхицин или колцемид). Затем готовят препараты клеток костного мозга, окрашивают и анализируют хромосомные аберрации в метафазах.

4. Описание метода

4.1. Материалы

Выбор животных

4.1.1. Обычно используют крыс, мышей и китайских хомячков, хотя можно использовать и другие виды млекопитающих. Наиболее часто опыты проводят на молодых, здоровых взрослых животных лабораторных штаммов. В начале эксперимента колебания массы животных должны быть минимальны, не превышая средней массы животных каждого пола.

Условия содержания и кормления

4.1.2. Температура в экспериментальных комнатах вивария должна быть . Относительная влажность должна быть не ниже 30% и не превышать 70% во время уборки, оптимально 50-60%. Освещение искусственное. Световой режим: 12 ч освещения, 12 ч темноты. Может быть использована стандартная лабораторная диета без ограничения питьевой воды. На выбор диеты может влиять необходимость приготовления особой смеси корма при введении вещества с кормом. Животных содержат в клетках индивидуально или небольшими группами одного пола.

Подготовка животных к исследованию

4.1.3. Методом случайного отбора формируют контрольные и экспериментальные группы животных. Клетки располагают таким образом, чтобы минимизировать возможные эффекты вследствие перемещения клеток. Каждое животное идентифицируют. Животных акклиматизируют к лабораторным условиям, по крайней мере, в течение 5 дней.

Приготовление исследуемых соединений

4.1.4. Твердые соединения растворяют или суспендируют в соответствующем растворителе или разбавителе и разводят, если необходимо, перед введением животным. Жидкие вещества можно вводить непосредственно или разводить перед введением. Пока стабильность растворов исследуемого вещества при соответствующем хранении не будет показана, следует использовать свежие растворы.

4.2. Условия испытания

Растворитель/разбавитель

4.2.1. Растворитель/разбавитель не должен вызывать токсические эффекты при использованных уровнях доз и не должен вступать в реакцию с исследуемым веществом. Если используют малоизвестный растворитель/разбавитель, его включение должно быть обосновано данными, указывающими на совместимость с исследуемым веществом. По возможности рекомендуется использовать водные растворы.

Контроли

4.2.2. Соответствующие положительные и отрицательные (растворитель/разбавитель) контроли должны быть в каждом опыте для каждого пола. Исключая обработку животных тестируемым веществом, животные контрольных групп должны находиться в тех же условиях, что и животные экспериментальных групп.

4.2.3. Соединения положительного контроля при выбранных уровнях экспозиции должны индуцировать значимое повышение уровня хромосомных аберраций над контролем. Дозы положительного контроля следует подбирать так, чтобы был четкий эффект, но в то же время его уровень не позволял исследователю определить зашифрованный препарат группы положительного контроля. Допускают введение положительного контроля способом, отличающимся от введения исследуемого вещества, и использование одного срока введения. Дополнительно, если это необходимо, в качестве положительного контроля можно использовать вещество, по химическому классу сходное с веществом положительного контроля. Примеры веществ положительного контроля приведены ниже.

Вещество и номер CAS

Триэтиленмеламин [CAS N 51-18-3]

Этилметансульфонат [CAS N 62-50-0]

Этилнитрозомочевина [CAS N 759-73-9]

Митомицин С [CAS N 50-07-7]

Циклофосфамид (моногидрат) [CAS N 50-18-0 (CAS N 6055-19-2)]

4.2.4. Пока приемлемая вариабельность частоты клеток с аберрациями хромосом не будет показана по данным исторического контроля, в группе отрицательного контроля (контроль с растворителем/разбавителем) обработку животных проводят тем же путем и в том же режиме, что и обработку экспериментальных групп животных. Если в группе отрицательного контроля проводят однократное введение, наиболее подходящим является первый срок забоя. Дополнительно следует формировать контрольную группу без обработки, пока исторические или опубликованные данные не покажут, что выбранный растворитель не индуцирует вредный или мутагенный эффект.

4.3. Проведение эксперимента

Число и пол животных

4.3.1. В каждой экспериментальной и контрольной группе должно быть как минимум 5 животных каждого пола. Если ко времени проведения исследования имеются данные работ на том же виде животных и при той же схеме введения, которые указывают на отсутствие существенных различий в токсичности между полами, тогда достаточно проведения опыта на животных одного пола. Если экспозиция человека веществом специфична для разных полов, например для некоторых лекарств, эксперимент может быть проведен на животных соответствующего пола.

Схема введения

4.3.2. Применяют преимущественно схему однократного введения вещества. Исследуемое вещество может быть введено в дробных дозах, т.е. два введения в тот же день, разделенных не больше, чем на несколько часов, чтобы ввести большой объем материала. Другие дозовые режимы должны быть научно обоснованы.

4.3.3. Забой животных следует проводить через 2 интервала времени после введения препарата. Для грызунов первый забой после введения вещества проводят через интервал, равный 1,5-кратной продолжительности нормального клеточного цикла, длительность которого в норме составляет 12-18 ч. Так как время, требуемое для поступления и метаболизма исследуемого вещества, а также возможный эффект на кинетику клеточного цикла могут влиять на оптимальное время для выявления аберраций хромосом, рекомендуется второй забой проводить через 24 ч после первого забоя. Если используется больше, чем однодневный дозовый режим, рекомендуется один срок забоя после последнего введения вещества через интервал времени, равный 1,5-кратной продолжительности нормального клеточного цикла.

4.3.4. Перед забоем животным вводят внутрибрюшинно соответствующую дозу вещества, блокирующую митоз на стадии метафазы (т.е. колцемид или колхицин). Через определенный интервал времени животных забивают. Для мышей этот интервал составляет 3-5 ч, для китайских хомячков - 4-5 ч. Клетки отбирают из костного мозга, готовят препараты и анализируют хромосомные аберрации.

Уровни доз

4.3.5. Если проведен ряд исследований и отсутствуют подходящие данные, то эксперимент должен быть проведен в той же лаборатории, используя те же виды, линии, пол, режим обработки, которые были в основном исследовании. Если выявлена токсичность, то для первого срока забоя тестируют 3 дозы. Диапазон доз должен быть в пределах от максимальной до минимальной токсичности или отсутствия токсичности. При более поздних сроках забоя необходимо использовать лишь максимальную дозу. Наибольшая доза определяется как доза, вызывающая такие признаки токсичности, которые при повышении уровня доз при том же режиме затравки указывают на возможность летального эффекта. Вещества со специфической биологической активностью в низких нетоксичных дозах (такие как гормоны и митогены) могут быть исключением для критериев установления дозы, и дозы должны устанавливаться для каждого конкретного случая. Наибольшая доза может также быть определена как доза, вызывающая ряд признаков токсичности в костном мозге (т.е. снижение митотического индекса более чем на 50%).

Ограничения теста

4.3.6. Если доза около 2 000 мг/кг массы тела при однократном режиме воздействия или двух введениях в один день не оказывает токсического действия, и если не предполагают генотоксичность по результатам исследований со структурно связанными соединениями, то полную схему исследований с использованием 3 уровней доз можно не проводить. Для опытов с длительным введением максимальная доза составляет 2 000 мг на кг массы тела в день при длительности введения до 14 дней и 1 000 мг на кг массы тела в день при длительности введения более 14 дней. Ожидаемая экспозиция для человека может указывать на необходимость использования более высоких доз в опытах по установлению порогов.

Введение вещества

4.3.7. Исследуемое вещество обычно вводят внутрижелудочно, используя желудочный зонд или подходящую интубационную канюлю, или внутрибрюшинно. Возможно применение других способов введения при их обосновании. Максимальный объем жидкости, который вводят внутрижелудочно или путем иньекции, зависит от размеров экспериментальных животных. Объем не должен превышать 2 мл на 100 г массы тела. Использование больших объемов должно быть обосновано. Исключение составляют раздражающие и разъедающие вещества, которые вызывают раздражающий эффект в высоких концентрациях. Вариации вводимых объемов должны быть минимизированы путем приготовления концентраций растворов, позволяющих вводить постоянный объем для всех 3 уровней доз.

Приготовление препаратов метафазных хромосом

4.3.8. Сразу после забоя выделяют костный мозг, проводят гипотоническую обработку клеток и фиксацию. Затем клетки раскапывают на стекла и окрашивают.

Микроскопический анализ

4.3.9. Следует оценить митотический индекс, как показатель цитотоксичности, анализируя минимум по 1 000 клеток на каждое экспериментальное животное, включая положительный и отрицательный контроль.

4.3.10. Для анализа аберраций хромосом следует анализировать минимум по 100 метафаз на каждое животное. Число клеток может быть уменьшено, если наблюдают высокое число аберраций. Все стекла, включая положительный и отрицательный контроль, перед микроскопическим анализом должны быть зашифрованы. При п