Приложение 6.6.3.1. Выявление эстроген-агонистической активности веществ методом транскрипционной активации, опосредованной стабильно трансфецированным человеческим альфа-рецептором эстрогена в клеточной линии hERa-HeLa-9903

Приложение 6.6.3.1

Выявление эстроген-агонистической активности веществ методом транскрипционной активации, опосредованной стабильно трансфецированным человеческим эстрогена в клеточной линии hERa-HeLa-9903

1. Общие положения и ограничения (см. также п.п. 1.3 и 1.4)

1.1. В данном методе трансактивационного анализа используется клеточная линия для выявления hER-опосредованной активации транскрипции веществами с ER-агонистической активностью. Валидизация ТА (Stably Transfected Transactivation Assay/STTA/), проведенная Научно-исследовательским институтом изучения веществ Японии (CERI) с использованием клеточной линии , продемонстрировала надежность анализа и соответствие предполагаемой цели применения - выявлению эстроген-агонистической активности веществ с помощью стабильно трансфецированного человеческого альфа-рецептора эстрогена [2].

1.2. Этот метод анализа специально разработан для выявления ТА путем измерения хемилюминесценции по конечной точке. Однако при тестировании фитоэстрогена в концентрациях более 1 была зафиксирована люминесценция в результате гиперактивации люциферазного репортера, не связанная с взаимодействием лиганда с рецептором [10, 11]. Кривая доза-эффект показала, что истинная активация ER системы происходит при более низких концентрациях. Экспрессия люциферазы, наблюдаемая при высоких концентрациях фитоэстрогенов или подобных веществ в связи со сверх активацией репортерного гена люцефиразы, нуждается в более осторожном подходе при исследовании в условиях данной тест-системы (Дополнение 6.6.3.1.1).

1.3. Перед использованием этого метода в регуляторных целях Область применения (п. 1) и Описание ER ТА-метода тестирования (п. 4) в основном документе должны быть внимательно изучены.

2. Принцип метода тестирования (см. также п.п. 1.3 и 1.4)

2.1. Метод используется для выявления связывания рецептора эстрогена с лигандом. После связывания лиганда с рецептором эстрогена сформировавшийся лиганд-рецепторный комплекс перемещается в ядро, где связывается со специфическим регуляторным участком ДНК, что приводит к трансактивации репортерного гена, кодирующего фермент люциферазу и к увеличению экспрессии люциферазы. Люцифераза действует на свой субстрат, вещество люциферин, трансформируя его в биолюминесцентный продукт, который может быть количественно измерен с помощью люминометра. Активность люциферазы можно быстро и недорого определить с помощью коммерчески доступных тестовых наборов.

2.2. Тестовая система с использованием клеточной линии создана на основе человеческой цервикальной опухоли методом стабильной трансфекции. Для трансфекции были использованы следующие конструкты: 1) конструкт, экспрессирующий (содержащий полноразмерную кодирующую последовательность человеческого рецептора), и 2) репортерный конструкт, кодирующий люциферазу светлячка под ТАТА-элементом промотера гена мышиного металлотионина (МТ) с пятью тандемно повторяющимися эстроген-эффекторными элементами (ERE) из гена вителлогенина. Конструкты на основе МТ ТАТА-элемента обеспечивают наилучшие результаты, и потому широко используются. Таким образом, используя клеточную линию , можно измерять способность тестируемого вещества вызывать трансактивацию гена люциферазы.

2.3. Интерпретация результатов данного анализа основана на определении эквивалентности максимального ответа, вызванного тестируемым веществом, 10% величины ответа, вызванного концентрацией (1 nМ) эстрадиола (Е2), используемого в качестве положительного контроля (PC) (т.е. PC 10). Более детально анализ и интерпретация результатов описаны в пп. 4.2-4.12.

3. Описание метода

Клеточные линии

3.1. В данном тестировании используют стабильно трансфецированную клеточную линию . Клеточная линия может быть получена из Клеточного Банка (Cell Bank) Японской Коллекции исследовательских биоресурсов (JCRB)* после подписания соответствующего соглашения о передаче биологических материалов - Material Transfer Agreement (МТА).

3.2. Для тестирования используют только клетки, не зараженные микоплазмами. Предпочтительным методом для высокочувствительной детекции зараженности микоплазмой является RT PCR (ПЦР реального времени).

Стабильность клеточной линии

3.3. Для контроля стабильности клеточной линии в качестве референсных веществ используют Е2, , и кортикостерон. Значения для кривой доза-эффект в диапазоне используемых концентраций измеряют, по крайней мере, один раз при каждом проведении тестирования (приведены в табл. 6.6.3.1.1).

Таблица 6.6.3.1.1

Допустимые границы значений для четырех референсных веществ при проведении анализа (среднее SD)

Название	lgPC50	lgPC10	lgEC50	Коэфф. Хилла	Диапазон концентраций
(Е2) CAS N: 50-28-2		<-11			M
CAS N: 57-91-0					M
Кортикостерон CAS N: 50-22-6	-	-	-	-	M
CAS N: 58-18-4			-	-	M

Клеточная культура и условия посева

3.4. Клетки содержат в инкубаторе при 5% и в минимальной эссенциальной среде Игла (ЕМЕМ) без добавления фенолового красного с добавлением 60 мг/л антибиотика канамицина и 10% фетальной бычьей сыворотки, обработанной активированным углем и декстраном (DCC-FBS). По достижении 75-90% конфлюэнтности клетки пересевают на 100 мм чашки для клеточных культур в объеме 10 мл при клеток/мл. Клетки суспендируют в этой среде (10% DCC-FBS ЕМЕМ), затем инкубируют при 5% , в течение 3 часов перед внесением тестируемого вещества. Весь используемый пластик должен быть заведомо свободным от эстрогенной активности.

3.5. Для поддержания постоянного ответа, клетки выращивают более одного пассажа после разморозки из ампулы и не культивируют более 40 пассажей.

3.6. Для клеточной линии полный цикл составит меньше трех месяцев. DCC-FBS готовят, как описано в доп. 6.6.3.1.2, или получают из коммерческих источников.

Критерии приемлемости

Положительные и отрицательные контроли

3.7. До и во время исследования реактивность тест-системы проверяют с использованием подходящих концентраций сильного эстрогена Е2, слабого эстрогена , очень слабого агониста и антагониста (кортикостерон). Приемлемые диапазоны значений, полученные при валидизации метода, приведены в табл. 6.6.3.1.1 [2]. Эти 4 референсных вещества включают в каждый из экспериментов одновременно с тестируемым веществом; результаты для каждого из них должны находиться в указанных границах. В противном случае выявляют причину несоответствия контролен заданным критериям (например: правильность ведения клеточной культуры, качество и концентрация сыворотки и антибиотиков), после чего тестирование повторяют. Для соответствия критериям (табл. 6.6.3.1.1) и для обеспечения минимальной вариабельности значений ЕС50, РС50 и PC10 очень важным является тщательное соблюдение идентичности условий культивирования. Для гарантии достаточной чувствительности анализа четыре указанных референсных вещества используют одновременно в ходе каждого эксперимента (проводимого в одинаковых условиях, включая используемые материалы, число пассажей клеток и тот же самый технический персонал). Значения PC10, равно как и РС50 и ЕС50, для трех положительных референсных веществ должны попадать в диапазон приемлемых значений, приведенный в табл. 6.6.3.1.1.

Положительный контроль и контроль используемого носителя

3.8. Положительный контроль (PC) (1 nM Е2) проверяют на каждом планшете, по крайней мере, в трех повторностях. Контроль носителя (VC), используемого для растворения тестируемого вещества, проверяют на каждом планшете, по крайней мере, в трех повторностях. Кроме того, если для PC используется иной носитель, чем для тестируемого вещества, то VC для этого носителя также ставят на том же планшете, что и PC, по крайней мере, в трех повторностях.

Кратность индукции

3.9. Среднее значение активности люциферазы для PC (1 nM Е2) должно быть, по крайней мере, в 4 раза выше, чем среднее значение активности для VC на каждом планшете. Этот критерий установлен на основе проверки надежности замеров по конечной точке при исследовании валидности (традиционно - между 4- и 30-кратным).

3.10. Для контроля качества тестирования необходимо, чтобы кратность индукции, соответствующая значению PC10, параллельно поставленного PC (1 nM Е2) была больше, чем 1 + 2SD от значения кратности индукции одновременно поставленного VC (=1). Для установления приоритетности исследования веществ значение PC 10 позволяет упростить анализ данных по сравнению со статистическим анализом.

Вещества для подтверждения лабораторной компетентности

Вещества для демонстрации технической компетентности лаборатории описаны в п. 4.4 и табл. 6.6.3.1.2 в разделе "Составляющие ER ТА-метода тестирования" основного текста настоящего документа.

Растворитель

3.11. Для параллельного VC используют диметилсульфоксид (ДМСО) или другой соответствующий растворитель, взятый в той же концентрации для положительных и отрицательных контролей и тестируемых веществ. Тестируемое вещество должно быть растворено в таком растворителе, в котором оно растворяется и который смешивается с клетками. Вода, этанол (95-100% чистоты) и ДМСО являются подходящими носителями. Если используется ДМСО, его конечная концентрация не должна превышать 0,1% (v/v). Для любого носителя проводят проверку отсутствия цитотоксичности максимального используемого объема.

Подготовка тестируемых веществ

3.12. Обычно тестируемые вещества растворяют в ДМСО или другом подходящем растворителе, и готовят серию разведений в том же растворителе, как правило, в соотношении 1:10 для получения раствора требуемой концентрации и последующего разведения в культуральной среде.

Растворимость и цитотоксичность: рекомендации по определению диапазона концентраций

3.13. Перед экспозицией клеток проводят предварительную проверку, чтобы определить подходящий диапазон концентраций тестируемого вещества и проверить у этого вещества возможные проблемы с растворимостью и цитотоксичностью. Тестируемое вещество проверяют при максимальной концентрации в 1 мкл/мл, 1 мг/мл или 1 mМ. Первый цикл тестирования проводят при серийных разведениях, начиная с максимально допустимой концентрации (например: 1 mM, 100 , 10 , ...), основываясь на проявленной цитотоксичности или недостаточной растворимости. Концентрации, используемые во втором и, если необходимо, третьем цикле тестирования, должны быть подобраны так, чтобы наиболее полно и качественно охарактеризовать кривую концентрация-эффект и избежать концентраций, при которых наблюдается нерастворимость или проявляется избыточная цитотоксичность вещества.

3.14. В случае с ER-агонистами повышенные уровни цитотоксичности могут значительно или полностью изменить типичный сигмоидный характер ответа, и это необходимо учитывать при интерпретации данных. Должны применяться методы тестирования цитотоксичности, которые могут свидетельствовать о 80%-й жизнеспособности клетки, выбор конкретного анализа определяется в соответствии с опытом конкретной лаборатории.

3.15. Если результаты теста на цитотоксичность показывают, что используемая концентрация тестируемого вещества сократила количество жизнеспособных клеток на 20% или более, эта концентрация расценивается как цитотоксическая, и эта и более высокие концентрации должны быть исключены из эксперимента.

Химическая экспозиция и расположение на планшете

3.16. Процедуру растворения тестируемого вещества (этапы 1 и 2) и экспозиции клеток (этап 3) проводят следующим образом:

Этап 1

Каждое тестируемое вещество растворяют в ДМСО или соответствующем растворителе методом серийных разведений и вносят в лунки микротитровального планшета так, чтобы конечные концентрации серийных разведений соответствовали ранее определенным в предварительном тесте по определению диапазона концентраций (как правило, десятикратные серийные разведения, например: 1 мМ, 100 мкМ, 10 мкМ, 1 мкМ, 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 100 пМ и 10 пМ/ М/) с использованием трехкратных повторностей.

Этап 2

Предварительное растворение тестируемого вещества в культуральной среде. На отдельном планшете добавляют 1,5 мкл раствора тестируемого вещества требуемой концентрации в растворителе к 500 мкл культуральной среды.

Этап 3

Химическая экспозиция клеток. Добавить 50 мкл соответствующего разведения вещества в культуральной среде (подготовленного на этапе 2), в лунку микропланшета, содержащую клетки/100 мкл/на лунку.

Рекомендуемый конечный объем среды в каждой лунке составляет 150 мкл.

Тестируемые образцы и референсные химические вещества могут вноситься в соответствии с рекомендациями табл. 6.6.3.1.2.

Таблица 6.6.3.1.2

Пример расположения разведений референсных веществ и контролей на микропланшете

Ряд

кортикостерон

Е2

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

А

conc 1 (10 )

100

1

10 nМ

В

conc 2 (1 )

10

100 nМ

1 nM

С

conc 3 (100 nМ)

1

10 nМ

100 рМ

D

conc 4 (10 nМ)

100 nМ

1 nМ

10 рМ

conc 5 (1 nМ)

10 nМ

100 рМ

1 рМ

F

conc 6 (100 рМ)

1 nМ

10 рМ

0.1 рМ

G

conc 7 (10 рМ)

100 рМ

1 рМ

0.01 рМ

Н

VC

PC

Контроли: VC - контроль носителя (растворителя) (ДМСО); РС - позитивный контроль (1 nM E2)

3.17. Референсные химические вещества (Е2, , и кортикостерон) тестируют на каждом этапе исследования (табл. 6.6.3.1.2). На каждом микропланшете для тестирования обязательно должны находиться лунки с 1 nМ концентрацией Е2 (PC), в которых может наблюдаться максимальная активация, и лунки, содержащие только ДМСО (VC) (или другой соответствующий растворитель) (табл. 6.6.3.1.3). Если в ходе одного и того же эксперимента используются клетки из различных источников (например: с различным числом пассажей, из разных партий и т.д.), тогда референсные химические вещества должны быть проверены на каждом из образцов клеток.

3.18. При отсутствии эффекта в крайних лунках расположение образцов на планшете меняют. Например, крайние лунки можно не использовать для тестирования веществ, но оставить заполненными средой с клетками.

3.19. После добавления веществ планшеты инкубируют в 5% инкубаторе при в течение 20-24 часов для индукции экспрессии гена-репортера.

3.20. Особое внимание следует обратить на тестирование высоко летучих веществ. В таких случаях контрольные лунки, расположенные рядом с тестируемыми, могут показывать ложные положительные результаты. В тех нечастых случаях, когда летучесть вещества может представлять проблему, заклеивание планшетов специально применяемыми мембранами поможет эффективно изолировать индивидуальные лунки во время тестирования, и настоятельно рекомендуется в таких случаях.

Таблица 6.6.3.1.3

Пример расположения разведений контролей и тестируемых веществ на микропланшете

Ряд

Тестируемое вещество 1

Тестируемое вещество 2

Тестируемое вещество 3

Тестируемое вещество 4

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

А

конц 1(10 )

1 mM

1

10 nМ

В

конц2 (1 )

100

100 nМ

1 nМ

С

конц 3 (100 nМ)

10

10 nМ

100 рМ

D

конц 4 (10 nМ)

1

1 nМ

10 рМ

Е

конц 5 (1 nМ)

100 nМ

100 рМ

1 рМ

F

конц 6 (100 рМ)

10 пМ

10 рМ

0.1 рМ

G

конц 7(10 рМ)

1 nМ

1 рМ

0.01 рМ

Н

VC

PC

3.21. Повторение обязательных тестов для одного и того же вещества проводят в различные дни, чтобы гарантировать получение независимых результатов.

Люциферазный анализ

3.22. В исследовании используют коммерческий реактив для люциферазного анализа [например, Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega E2510, или эквивалентные)] или стандартную систему анализа люциферазной активности (Promega E1500, или эквивалентные), если они соответствуют требуемым критериям. Реактивы для люциферазного анализа выбирают в соответствии с чувствительностью используемого люминометра. При использовании стандартной системы анализа люциферазной активности (Promega E1500) перед добавлением субстрата используют реагент для лизиса клеточной культуры (Promega E1531, или эквивалентный) до добавления субстрата. Реактивы для люциферазы применяют в соответствии с инструкциями изготовителей.

4. Анализ и интерпретация данных

4.1. Для расчета относительной транскрипционной активности по сравнению с PC (1 нМ Е2) люминесценцию образцов с одного и того же планшета анализируют согласно следующим этапам (также допустимы другие эквивалентные математические методы):

Этап 1. Вычисляют среднее значение ответа VC.

Этап 2. Вычитают среднее значение ответа VC из ответа каждой лунки для нормализации данных.

Этап 3. Вычисляют среднее значение ответа для нормализованных PC.

Этап 4. Делят нормализованное значение ответа каждой лунки на среднее значение нормализованного ответа PC (PC = 100%).

(Полученное значение для каждой лунки - есть относительная транскрипционная активность для образца в этой лунке по сравнению с величиной ответа PC.)

Этап 5. Вычисляют среднее значение относительной транскрипционной активности для каждой группы концентраций тестируемого вещества. Есть два параметра, связанные с ответом на экспозицию: средняя транскрипционная активность (ответ), и концентрация, при которой происходит ответ (см. следующий раздел).

Параметры индукции - ЕС50, PC50 и РС10

4.2. Полная кривая концентрация-ответ необходима для расчета ЕС50, но это не всегда достижимо или не всегда имеет практический смысл из-за ограниченного диапазона используемых концентраций (например, из-за цитотоксичности или низкой растворимости). Однако, поскольку ЕС50 и максимальный уровень индукции (соответствующий максимальному значению уравнения Хилла) являются информативными параметрами, эти параметры следует определять всегда, когда это возможно. Для расчета ЕС50 и максимального уровня индукции используют соответствующее статистическое программное обеспечение (например, статистическую программу Graphpad Prism).

4.3. Если кривая концентрация-ответ описывается логистическим уравнением Хилла, тогда ЕС50 рассчитывают по следующей формуле [15]:

, где

Y = ответ (например, RLU);

X = логарифм концентрации;

Bottom = минимальный ответ;

Тор = максимальный ответ;

lg ЕС50 = десятичный логарифм концентрации в точке, где ответ равен половине величины между Тор и Bottom;

Hill slope (коэффициент Хилла) характеризует крутизну наклона кривой.

4.4. Для каждого тестируемого вещества определяют следующие параметры:

(1) - максимальный уровень ответа, вызванный тестируемым веществом и выраженный как процент от ответа на 1 нМ Е2 на том же самом планшете; а также (концентрация, при которой достигается );

(2) для положительных веществ - концентрация, которая соответствует PC10 и, если возможно, РС50.

4.5. Значение РСх вычисляют с помощью интерполяции между 2 точками, одна из которых лежит выше, другая ниже значения РСх на графике X-Y. Если эти значения, лежащие непосредственно выше и ниже значения РСх, имеют координаты (а, b) и (с, d) соответственно, тогда значение РСх вычисляют с помощью следующего уравнения:

log[PCx] = log[c] + (x - d) / (d - b).

4.6. Описания значений PC приведены ниже на рисунке.

4.7. Результаты должны базироваться на двух (или трех) независимых сериях теста. Если две независимые серии теста дают сопоставимые результаты и считаются воспроизводимыми, то третью серию теста не проводят. Чтобы быть приемлемыми, результаты должны отвечать следующим стандартным требованиям:

- среднее значение активности люциферазы для PC (1 нМ Е2) должно, по крайней мере, в 4 раза превышать VC на каждом планшете;

- кратность индукции, соответствующая значению PC 10 параллельно поставленного PC (1 нМ Е2), должна быть больше, чем 1 + 2SD от кратности индукции для VC (=1).

- результаты для 4 референсных веществ должны быть в пределах приемлемых диапазонов (табл. 6.6.3.1.1);

- результаты должны быть воспроизводимыми.

Критерии для интерпретации результатов

4.8. Критерии для интерпретации результатов приведены в табл. 6.6.3.1.4. Положительные результаты характеризуются двумя величинами: величиной эффекта и концентрацией, при которой наблюдается эффект. Представление результатов в виде концентраций, при которых достигаются 50% (РС50) или 10% (PC10) от величины PC, удовлетворяет этим требованиям. Тестируемое вещество считается соответствующим положительному критерию, если максимальный ответ, вызванный этим вещество (RPCMax), равен или превышает 10% от величины положительного контроля PC, по крайней мере, в двух из двух или в двух из трех сериях. Тестируемое вещество считается соответствующим негативному критерию, если максимальный ответ, вызванный этим веществом (RPCMax), не достигает 10% от величины положительного контроля PC, по крайней мере, в двух из двух или в двух из трех серий.

Таблица 6.6.3.1.4

Критерии для положительного и отрицательного ответа по активности тестируемых веществ

Положительный	Если равен или превышает 10% от величины положительного контроля, по крайней мере, в двух из двух или в двух из трех серий
Отрицательный	Если не достигает 10% от величины положительного контроля, по крайней мере, в двух из двух или в двух из трех серий

4.9. Расчеты PC10, РС50 и могут быть сделаны при помощи программы, доступной на сайте ОЭСР**.

4.10. Достаточно иметь значения PC10 или РС50, полученные, по крайней мере, в двух сериях. Однако, если значения для одной и той же концентрации обнаруживают разброс с неприемлемо высоким коэффициентом вариации (CV; %), такие данные не считаются достоверными. Для дальнейшей работы выявляют и устраняют причину такой высокой вариабельности. Величина CV исходных данных для трех серий (т.е. данные по интенсивности люминесценции) в ряду значений, используемых для вычисления PC10, должна быть меньше, чем 20%.

4.11. Соответствие результатов критериям качества тестирования свидетельствует, что тестовая система работает должным образом, но это еще не гарантирует, что каждый из последующих тестов даст такие же результаты. Воспроизведение результатов первой серии является подтверждением достоверности полученных данных (см. п. 4.9, 4.10).

4.12. Если необходима дополнительная информация для скрининговых целей или приоритезации веществ, для положительных тестовых веществ, в особенности для РС10-РС49, а также для веществ, предположительно гиперактивирующих люциферазу, используют (см. доп. 6.6.3.1.1), что позволяет подтвердить, что наблюдаемая люциферазная активность является исключительно ответом.

5. Подготовка тестового отчета

5.1. Смотри п. 6 "Подготовка тестового отчета" основного текста настоящего документа.

Дополнение 6.6.3.1.1

Ложноположительные результаты: оценка люминесцентного сигнала, не опосредованного действием через ER

1) Ложноположительные сигналы могут появиться в результате активации гена люциферазы в результате ER-независимых механизмов или прямой активации люциферазы, или наличия побочной флюоресценции. На такой эффект указывает неполный или необычный вид кривой доза-эффект. Если предполагается наличие подобных эффектов, проверяют влияние антагониста ER (например, 4-гидрокситамоксифен (ОНТ) при нетоксичной концентрации). Чистый антагонист ICI 128780 для этого не подходит, поскольку использование ICI 128780 в достаточной концентрации может уменьшить величину VC, а это повлияет на анализ данных.

2) Чтобы гарантировать валидность этого подхода, проводят следующие тесты на одном и том же планшете (в трех повторностях каждый):

- агонистическая активность тестируемого вещества в присутствии и в отсутствии 10 мкМ 4-Гидрокситамоксифеена (ОНТ);

- VC (в трех повторностях);

- ОНТ (в трех повторностях);

- 1 нМ Е2 в качестве агониста PC (в трех повторностях);

- 1 нМ Е2 + ОНТ (в трех повторностях).

3) Критерии интерпретации данных.

Примечание: Для всех лунок используют одну и ту же концентрацию носителя.

- Если агонистическая активность тестируемого вещества не поддается воздействию ER-антагониста, такое вещество классифицируется как "Отрицательное".

- Если агонистическая активность тестируемого вещества полностью подавляется, следует использовать критерии решения.

- Если агонистическая активность при самой низкой концентрации равна или превышает величину PC10, ответ тестируемого вещества считается равным или превышающим PC10-ответ. В этом случае определяют разницу в ответах между образцами содержащими и не содержащими ER-антагонист (ОНТ), эту разницу считают истинным ER-опосредованным ответом и используют для расчета параметров, позволяющих классифицировать тестируемое вещество.

4) Анализ данных

Проверяют соответствие критериям приемлемости.

Проверяют коэффициент вариации (CV) для лунок с теми же самыми условиями экспозиции.

Вычисляют:

- среднее значение VC;

- среднее значение VC из значения каждой лунки, не обработанной ОНТ;

- среднее значение для ОНТ;

- среднее значение VC из значения каждой лунки, обработанной ОНТ;

- среднее значение PC;

- относительную транскрипционную активность всех других лунок по отношению к PC.

Дополнение 6.6.3.1.2

Подготовка сыворотки, очищенной на активированном угле, покрытом декстраном (DCC)

1) Очистка сыворотки с помощью древесного угля, покрытого декстраном (DCC), является основным методом удаления эстрогеноподобных соединений из сыворотки, добавляемой к культуральной среде. Целью такой обработки является исключение искаженного ответа при тестировании, связанного с наличием остаточных эстрогенов в неочищенной сыворотке. Приведенная процедура очистки рассчитана на 500 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS).

2) Необходимые материалы и оборудование:

- активированный уголь;

- декстран;

- хлорид магния гексагидрат ;

- сахароза;

- 1 М HEPES буфер (рН 7,4);

- ультрачистая вода, очищенная системой ультрафильтрации;

- стерилизованная в автоклаве стеклянная емкость достаточного размера;

- лабораторная центрифуга (с охлаждением до 4°С).

3) Обработка сыворотки.

Данная процедура рассчитана на использование пробирок объемом 50 мл:

День 1 - Приготовьте суспензию покрытого декстраном угля в 1 л ультрачистой воды, содержащей: 1,5 мМ , 0,25 М сахарозы, 2,5 г угля, 0,25 г декстрана и 5 мМ HEPES. Оставить перемешиваться на ночь при 4°С.

День 2 - Разлейте суспензию в 50 мл центрифужные пробирки и центрифугируйте на 10 000 об./мин при 4°С в течение 10 минут. Удалите надосадочную жидкость и уберите половину пробирок с осадком в холодильник при 4°С для использования на следующий день. В оставшиеся пробирки с осадком добавьте FBS (предварительно оттаявшую при комнатной температуре, чтобы избежать образования осадка, а затем инактивированную при 56°С в течение 30 минут). Ресуспендируйте осадок в FBS и перенесите его в автоклавированную стеклянную емкость (в колбу Эрленмейера). Оставьте суспензию мягко перемешиваться при 4°С в течение ночи.

День 3 - Разлейте суспензию в 50 мл центрифужные пробирки и центрифугируйте на 10 000 об./мин при 4°С в течение 10 минут. Соберите FBS и перенесите в пробирки с осадком угля и декстрана, подготовленные в день 2 и хранившиеся при 4°С. Ресуспендируйте осадок в FBS, перенесите в автоклавированную стеклянную емкость и оставьте суспензию мягко перемешиваться при 4°С в течение ночи.

День 4 - Разлейте суспензию в 50 мл центрифужные пробирки и центрифугируйте на 10 000 об./мин при 4°С в течение 10 минут. Простерилизуйте супернатант фильтрацией через 0,2 мкм стерильный фильтр. Приготовленная DCC-FBS хранится при -20°С и может использоваться в течение года.

______________________________

* JCRB Cell Bank: National Institute of Biomedical Innovation, 7-6-8 Asagi Saito, Ibaraki-shi, Osaka 567-0085, Japan Fax: +81-72-641-9812.

** http://www.oecd.Org/env/ehs/testing/42720432.xls http://www.oecd.org/env/ehs/testing/section4software.htm.