Приложение 6.6.4. H295R in vitro тест на стероидогенез с использованием человеческой клеточной линии адренокарциномы

Приложение 6.6.4

H295R in vitro тест на стероидогенез с использованием человеческой клеточной линии адренокарциномы

Идентичен международному документу OECD TG N 456 "H295R Steroidogenesis Assay" (ОЭСР Руководство N 456 "H295R in vitro тест на стероидогенез"). Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает требования к выполнению исследований по изучению влияния веществ и продукции на их основе (далее - вещество) на стероидогенез, в частности на продукцию (Е2) и тестостерона (Т), в тесте H295R in vitro с использованием человеческой клеточной линии адренокарциномы.

1.2. Н295R-тест предназначен для идентификации ксенобиотиков, мишенями которых являются эндогенные компоненты внутриклеточных биохимических путей, обеспечивающих синтез Е2 и/или Т из холестерина. H295R-текст не предназначен для идентифиции веществ, влияющих на стероидогенез посредством воздействия на механизмы "гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой" оси. Целью данного теста является получение качественного ДА/НЕТ-ответа относительно способности вещества индуцировать или ингибировать продукцию Т и Е2.

1.3. Результаты тестирования с использованием настоящего метода могут быть представлены в виде относительного изменения синтеза гормона по сравнению с контрольным значением, полученным в параллельном контроле без добавления тестируемого вещества.

1.4. Исследование не предназначено для получения информации относительно механизмов взаимодействия тестируемого вещества с эндокринной системой.

2. Общие положения

2.1. Метод H295R позволяет обнаружить как увеличение, так и уменьшение продукции Т и Е2.

2.2. Метод H295R позволяет проводить прямую оценку возможного воздействия вещества на жизнеспособность/цитотоксичность клетки. Это является важной особенностью, поскольку позволяет различать цитотоксичность от эффектов, возникающих в результате прямого взаимодействия веществ на механизмы и пути стероидогенеза, что невозможно в системах с использованием образцов тканей, которые состоят из многих типов клеток различной чувствительности и функциональности.

2.3. Метод H295R не требует использования животных.

2.4. Клеточная линия H295R коммерчески доступна.

2.5. Принципиальными ограничениями метода H295R являются следующие:

- Его метаболические способности неизвестны, но вероятно довольно ограничены; поэтому, вещества, которые должны быть метаболически активированы, вероятно, не будут выявлены в этом исследовании.

- Будучи полученными из ткани надпочечников, клетки H295R обладают ферментами, способными к производству глюко- и минерало-кортикоидов, так же как и половых гормонов; поэтому изменение уровня глюко- и минерало-кортикоидов может повлиять на уровни Т и Е2, наблюдаемые в исследовании.

- Метод не выявляет наличие дигидротестостерона, поэтому нельзя ожидать, что он обнаружит вещества, которые ингибируют , в этом случае следует использовать тест Хершбергера.

- Н295R-тест не будет обнаруживать вещества, которые воздействуют на стероидогенез, затрагивая гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось, поскольку этот путь может изучаться только в опытах на животных.

3. Принцип метода

3.1. Цель исследования - выявление веществ, которые влияют на синтез Т и Е2. Гормон Т является также промежуточным продуктом при синтезе Е2. Тестирование позволяет обнаружить вещества, которые, как правило, ингибируют или индуцируют ферменты системы стероидогенеза.

3.2. Пять ферментов катализируют шесть различных реакций, ответственных за биосинтез половых стероидных гормонов. Ферментативное преобразование холестерина в прегненолон осуществляется цитохромом (CYP11A) и является начальным шагом в ряде биохимических реакций, которые завершаются образованием стероидных гормонов в качестве конечных продуктов. В зависимости от очередности двух следующих реакций стероидогенный путь биосинтеза подразделяется на два: и пути, которые завершаются образованием андростендиона (рис. 6.6.4.1). Андростендион преобразуется в тестостерон (Т) с помощью дегидрогеназы . Тестостерон одновременно является и промежуточным, и конечным гормональным продуктом. У мужчин Т может быть преобразован в дигидротестостерон (DHT) при помощи , которая найдена в клеточной и ядерной мембранах, а также в эндоплазматическом ретикулуме органов-мишеней действия андрогенных гормонов, таких как простата и семенные пузырьки. DHT является значительно более мощным андрогеном, чем Т, и он также считается конечным гормоном.

3.3. Н295R-тест не измеряет DHT. Ароматаза (CYP19) преобразовывает андрогены в эстрогены - Т в (Е2) и андростендион в эстрон. Конечными продуктами стероидогенеза являются Е2 и Т.

3.4. Специфика лиазной активности CYP17 различается для промежуточных субстратов у разных биологических видов. У человека - прегненолон, в то время как у крыс - прогестерон. Такие различия в лиазной активности CYP17 могут объяснять некоторые видоспецифические различия ответа на действие веществ, которые изменяют стероидогенез in vivo.

3.5. Клетки Н295, как было показано, наиболее близко отражают экспрессию ферментов и характер синтеза стероидов в надпочечниках взрослого человека. Но они экспрессируют ферменты, характерные для обоих путей синтеза андрогенов, как , так и .

3.6. Человеческая клеточная линия адренокарциномы-Н295R служит удобной моделью для in vitro исследования воздействия на синтез стероидных гормонов веществ. Клеточная линия H295R экспрессирует все гены, которые кодируют ключевые ферменты образования стероидных гормонов, упоминавшиеся выше (рис. 6.6.4.1). Это является уникальной особенностью, потому что экспрессия этих генов in vivo определяется стадией развития и, кроме того, является тканеспецифичной, так что ни в одной ткани и ни на одном этапе развития гены, вовлеченные в стероидогенез, не экспрессируются одновременно.

3.7. Клетки H295R имеют физиологические характеристики зонально недифференцированных человеческих эмбриональных клеток надпочечников. Эти клетки представляют уникальную систему для исследования in vitro, поскольку они способны производить все стероидные гормоны коры надпочечников и гонад взрослого человека, позволяя исследовать воздействие как на синтез кортикостероидов, так и на продукцию половых стероидных гормонов, таких как андрогены и эстрогены, хотя описываемый тест был валидизирован только для анализа Т и Е2.

3.8. Изменения, зарегистрированные тестовой системой в виде изменения синтеза Т и Е2, могут быть результатом множества различных воздействий тестируемого вещества на стероидогенные механизмы, действующие в клетках H295R. Эти воздействия включают модуляцию экспрессии, синтеза или функции ферментов, вовлеченных в синтез, взаимопревращение или элиминацию стероидных гормонов. Ингибирование синтеза гормонов может произойти из-за прямого конкурентоспособного связывания с ферментом, путем воздействия на кофакторы, такие как NADPH (никотинамид аденинфосфат динуклеотид) и сАМР (циклический аденозин монофосфат), и/или усиления метаболизма стероидов или супрессии генов, кодирующих определенные ферменты в путях метаболизма стероидов.

3.9. В то время как ингибирование может быть следствием непосредственных или косвенных процессов, связанных с синтезом гормонов; индукция обычно имеет косвенную природу, в результате, например, влияния на кофакторы, такие как NADPH и сАМР (в случае с форсколином), или снижения метаболизма стероидов, или увеличения экспрессии генов стероидогенеза.

3.10. Анализ обычно выполняют на 24-луночных планшетах при стандартных условиях культивирования клеток. Можно использовать плашки другого формата, но посев клеток и условия эксперимента потребуют соответствующей модификации для соблюдения всех требуемых критериев.

3.11. После 24-часовой акклиматизации на многолуночном планшете клетки подвергают 48-часовой экспозиции с тестируемым веществом в семи различных концентрациях, по крайней мере, в трех повторностях каждая. Растворитель, известный ингибитор и индуктор синтеза гормона в заданных концентрациях используют в качестве положительного и отрицательного контролей. По окончании периода экспозиции среду собирают из каждой лунки. Жизнеспособность клеток проверяют сразу после удаления среды. Концентрацию гормонов в среде можно измерить, используя различные методы, включая коммерчески доступные наборы для измерения и/или инструментальные методы (LC-MS).

3.12. Данные отображают в виде кратности изменения относительно контроля растворителя (SC) и в виде минимальной концентрации наблюдаемого эффекта (LOEC).

3.13. Если результат исследования полностью отрицательный, наивысшая использовавшаяся концентрация фиксируется как концентрация отсутствия эффекта (NOEC).

3.14. Заключения относительно влияния вещества на стероидогенез должны основываться, по крайней мере, на двух независимых раундах тестирования. Первый раунд тестирования используют для предварительной оценки диапазона концентраций, которая будет скорректирована для последующего 2-го раунда и, при необходимости, для 3-го раунда, если обнаружатся проблемы с растворимостью или цитотоксичностью, или активность вещества наблюдается в конце диапазона исследуемых концентраций.

4. Описание метода

4.1. Работа с культурой клеток

4.1.1. Клеточная линия*.

Из-за изменения способности клеток продуцировать Е2 с увеличением возраста/пассажей, клетки должны культивироваться согласно определенному протоколу, прежде чем они будут использоваться для тестирования; должно указываться и фиксироваться число пассажей с момента размораживания клеток, а также номер пассажа, когда клетки были заморожены и помещены на хранение в жидком азоте. Первое число указывает на текущий номер пассажа клеток, а второе число - номер пассажа, на котором клетки были заморожены и помещены на хранение. Например, клетки, которые были заморожены после пятого пассажа, а затем разморожены и пересевались три раза (т.е. прошли еще 4 пассажа, считая культивирование после размораживания за первый пассаж), тогда их текущая маркировка будет 4.5. Пример схемы нумерации проиллюстрирован в Приложении I отчета о валидизации.

Основную среду используют в качестве основы для полной среды и среды для замораживания. Полная среда необходима для культивирования клеток. Среда для замораживания специально разработана для снижения стрессового воздействия на клетки при замораживании для длительного хранения. Перед использованием, Nu-serum (или аналогичная сыворотка с такими же свойствами, для которой показано соответствие требованиям контроля качества QC), являющейся компонентом дополненной среды, необходимо тестирование на присутствие фоновых количеств Т и Е2. Приготовление этих растворов описано в Приложении II отчета о валидизации.

После инициирования клеточной культуры H295R из оригинальной партии АТСС, клетки должны пройти пять пассажей (т.е. клетки должны пересеваться 4 раза). Клетки пятого пассажа замораживают в жидком азоте для хранения. До замораживания клеток, образец клеток предыдущего, 4-го пассажа, тестируют на контрольном планшете (QC), чтобы убедиться, что базовый уровень продуцируемых гормонов и ответ на вещества положительного контроля соответствует критериям контроля качества, представленным в табл. 6.6.4.5.

Клетки H295R культивируют, замораживают и хранят в жидком азоте, чтобы всегда иметь в наличии клетки подходящего пассажа и возраста, пригодные для использования. Максимальное число пассажей клеток, допустимое для использования в Н295R-тестировании, после перевода новой или замороженной партии клеток в культуру, не должно превышать 10. Так, к использованию в Н295R-тестировании из культуры, восстановленной из клеток, замороженных на пассаже 5, разрешены только пассажи от 4.5 до 10.5. Для культур, восстановленных из клеток, замороженных на 5 пассаже, клетки культивируют, по крайней мере, в четырех дополнительных пассажах перед их использованием для тестирования.

"Новая партия" - свежая партия клеток, полученная из АТСС.

"Замороженная партия" - клетки, которые ранее культивировались и были заморожены в какой-либо лаборатории, а не в АТСС.

Если новая партия клеток изымается из хранилища с жидким азотом с целью культивирования и использования в тесте, должна соблюдаться процедура восстановления культуры клеток из замороженного. Детали этой процедуры изложены в Приложении III отчета о валидизации. Замороженные клетки извлекают из жидкого азота, быстро оттаивают и переносят в дополненной среде в центрифужную пробирку, центрифугируют при комнатной температуре, ресуспендируют в дополненной среде, и переносят в культуральный флакон. На следующий день среду во флаконе необходимо сменить. Клетки H295R культивируют в инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% , культуральную среду меняют 2-3 раза в неделю. По достижении 85-90% конфлюэнтности клетки необходимо пересеять. Пересев с клеток необходим для поддержания роста и физиологического состояния клеток и поддержания достаточного количества клеток, пригодных для проведения тестирований. Клетки три раза промывают забуференным физраствором (PBS, без Са2+ Mg2+), затем промывают раствором соответствующего фермента, например трипсина в PBS (без Са2+ Mg2+), для отделения прикрепленных клеток от пластика. Как только клетки отделились от пластика, действие фермента останавливают путем добавления полной среды в количестве 3Х от объема раствора фермента, использовавшегося для отделения клеток. Клетки переносят в центрифужную пробирку, центрифугируют при комнатной температуре, удаляют супернатант и осадок клеток ресуспендируют в дополненной среде. Надлежащий объем клеточной суспензии помещают в культуральный флакон. Количество пересеваемых клеток должно быть таким, чтобы клетки достигали конфлюэнтности через 5-7 дней. Рекомендуемое разведение культуры при пересеве клеток составляет 1:3-1:4. Планшеты тщательно маркируют. Подготовленные клетки готовы к использованию в H295R тесте, оставшиеся при пересеве клетки замораживают в жидком азоте.

Для подготовки клеток H295R к замораживанию следуют процедуре для пересева клеток, описанной выше до того этапа, когда получают осадок клеток на дне центрифужной пробирки. Тогда осадок клеток ресуспендируют в среде для замораживания. Суспензию клеток раскапывают по ампулам для криогенного хранения, маркированным надлежащим образом, и замораживают при -80°С в течение 24 часов, после чего ампулы переносят в жидкий азот для хранения. Детали для этой процедуры приведены в Приложении III отчета о валидизации.

4.1.2. Посев клеток на планшет и предварительная инкубация клеток для тестирования.

Число 24-луночных планшетов, необходимых для тестирования, определяют количеством тестируемых веществ и степенью конфлюэнтности клеток. Как правило, один культуральный флакон (75 ) при конфлюэнтности клеток 80-90% содержит достаточное количество клеток, чтобы приготовить полтора 24-луночных планшета при плотности 200,000-300,000 клеток на миллилитр среды, достигающих через 24 часа приблизительно 50-60% конфлюэнтности (рис. 6.6.4.2). Обычно это является оптимальной плотностью клеток для синтеза гормонов при проведении теста. При более высокой плотности наблюдаются изменения продуцирования клетками гормонов Т и Е2. Прежде чем проводить тестирование в первый раз, рекомендуется проверить различную плотность посева между 200,000 и 300,000 клеток на миллилитр, и плотность посева, обеспечивающую 50-60% конфлюэнтности лунок через 24 часа, используют для дальнейших экспериментов.

Из культурального флакона удаляют среду, и клетки промывают 3 раза стерильным PBS (без Ca2+ Mg2+). Добавляют раствор фермента (в PBS) для отделения клеток от пластика. Как только клетки отделились от пластика, действие фермента останавливают путем добавления полной среды в количестве 3Х от объема раствора фермента, использовавшегося для отделения клеток. Клетки переносят в центрифужную пробирку, центрифугируют при комнатной температуре, удаляют супернатант и осадок клеток ресуспендируют в дополненной среде. Определяют концентрацию клеток, например, используют гемоцитометр или счетчик клеток. Клетки доводят до необходимой для посева плотности и тщательно перемешивают, чтобы суспензия клеток была строго однородной. Клетки высаживают по 1 мл суспензии в каждую лунку планшета, планшет и лунки должны быть соответствующим образом подписаны. Свежеприготовленные планшеты инкубируют при 37°С в атмосфере 5% в течение 24 часов, чтобы клетки могли прикрепиться ко дну лунок.

4.1.3. Контроль качества.

Исключительно важно при нанесении образцов и дозировании веществ максимально точно выдержать необходимые объемы, поскольку этим определяется точность концентраций, используемых при обработке результатов тестирования.

Еще до выращивания клеточной культуры и прежде проведения последующего тестирования, каждая лаборатория должна продемонстрировать чувствительность используемой системы определения концентрации гормонов.

При определении гормонов с использованием антител до начала эксперимента тестируемые вещества проверяют на их возможное влияние на тестовую систему, которая будет использована для измерения количеств Т и Е2.

Рекомендуемым для использования растворителем является ДМСО. Если используется альтернативный растворитель, определяют следующее:

- растворимость тестируемых веществ, форсколина и прохлораза в этом растворителе;

- цитотоксичность как функцию концентрации растворителя.

Рекомендованная максимально допустимая используемая концентрация растворителя как минимум, в 10 раз ниже наименьшей цитотоксической концентрации для этого растворителя.

До начала проведения тестов проводят предварительный квалификационный эксперимент, демонстрирующий, что лаборатория способна вести клеточную культуру, обеспечить получение клеточной культуры надлежащего качества и необходимые условия проведения эксперимента по тестированию веществ.

Инициируя новую культуру из новой партии клеток, ставят планшет контроля качества QC этой новой партии клеток, чтобы оценить качество клеток.

4.1.4. Эффективность системы измерения концентрации гормонов.

Каждая лаборатория для анализа продукции Т и Е2 клетками H295R использует систему измерения гормонов по своему выбору, если он соответствует критериям, включая предельно определяемое количество (LOQ). Номинально LOQ составляет 100 пг/мл для Т и 10 пг/мл для Е2, эти значения основаны на базальном уровне продукции гормонов, наблюдаемых в исследованиях по валидизации. Реальные значения могут оказаться высокими или низкими, в зависимости от соответствующих от базального уровня продукции гормонов, наблюдаемых в конкретной лаборатории, выполняющей исследования. Еще до постановки контроля качества QC и начала проведения тестов, лаборатория должна продемонстрировать, что используемая тест-система определения гормонов измеряет концентрации гормонов в культуральной среде с достаточной чувствительностью и точностью и соответствует критериям качества QC, приведенным в табл. 6.6.4.1 и 6.6.4.5. Для этого проводят анализ полной среды с добавленным внутренним контролем концентрации гормона. Полная среда, используемая для поверки, содержит, по крайней мере, три концентрации добавленного внутреннего контроля для каждого гормона, например: 100, 500 и 2 500 пг/мл Т; 10, 50 и 250 пг/мл Е2; или используют более низкие концентрации Т и Е2 в соответствии с пределами измерения проверяемой тест-системы. Измеренные концентрации гормонов в не экстрагированных образцах не должны отличаться от номинальных концентраций более чем на 30%, вариация между повторными измерениями одного и того же образца не должна превышать 25% (см. табл. 6.6.4.8 для дополнительных QC критериев). Если все эти критерии QC соблюдены, считают, что выбранная тест-система определения концентрации гормонов достаточно аккуратна, точна и не подвержена влиянию компонентов питательной среды, содержащей гормон, в такой мере, чтобы это оказывало существенное влияние на результаты определения. В этом случае не требуется экстракции образцов перед измерением гормонов.

Если критерии контроля качества QC (табл. 6.6.4.1 и 6.6.4.8) не выполняются, проводят эксперимент с экстракцией среды, содержащей добавленный внутренний контроль. Пример процедуры экстракции приведен в Приложении II отчета о валидизации. Измерение концентрации гормона в экстрагированных образцах проводят в 3-х повторностях**. Если после экстракции компоненты среды не влияют на результаты метода определения гормонов, и результаты соответствуют критериями QC, все последующие эксперименты проводят с экстракцией образцов. Если и после экстракции не достигнуто соответствия критериям QC, используемая тест-система определения гормонов не подходит для применения в Н295R-тесте на стероидогенез. Необходимо использовать другой метод определения гормонов.

Концентрации гормонов в контроле растворителя (SC) должны быть в пределах линейной части стандартной кривой. Предпочтительно, чтобы SC значения находились ближе к центру линейной части, чтобы гарантировать измерение уровня гормонов при индукции и ингибировании их синтеза. Необходимо подобрать подходящее разведение среды (или экстракта) для измерения концентрации гормонов. Линейность зависимости определяют с помощью подходящего статистического метода.

Если для измерения уровня гормонов предполагается использовать анализ на основе связывания антител, например, иммуноферментный анализ (ELISA) или радиоиммунный анализ (RIA), то каждое из тестируемых веществ сначала проверяют на возможное воздействие на систему измерения уровня гормона, прежде чем использовать ее непосредственно для тестирования веществ (Приложение III отчета о валидизации), поскольку некоторые вещества могут мешать определению уровня гормона этими методами. В случае, если оказываемое влияние составляет более 20% от базового уровня гормонов Т и/или Е2, определенного методом с использованием антител, необходимо исследование гормонов, как описано в Приложении III раздела 5.0 отчета о валидизации, для всех разведений исходных растворов тестируемых веществ, чтобы определить пороговую дозу, при которой наблюдается существенное (более 20%) воздействие на правильность определения уровня гормона. Если подобное влияние составляет менее 30%, результаты корректируют с учетом этого воздействия. Если подобное влияние превышает 30%, то соответствующие данные считают недостоверными, и результаты для соответствующих концентраций тестируемого химиката не используют при анализе. Если существенное воздействие тестируемого вещества на точность системы определения гормона выявлено при более чем одной не цитотоксической концентрации, то используют другую систему измерения гормона. Чтобы избежать воздействия загрязняющих веществ, гормоны экстрагируют из культуральной среды с использованием подходящих растворителей, методы могут быть найдены в отчете о валидизации.

Таблица 6.6.4.1

Критерии соответствия качеству для систем измерения уровня гормона

Параметр	Критерий
Чувствительность метода измерения	Предел количественного определения (LOQ) Т: 100 pg/mL; Е2: 10 pg/mL (а)
Эффективность экстракции гормона (только когда экстракция необходима)	Средний уровень извлечения (по результатам трех повторов) добавленного меченого гормона не должен отличаться от его реально внесенного количества более, чем на 30%
Влияние тестируемого вещества (только систем с использованием антител)	Отсутствие существенного (более 30% от базового уровня продукции соответствующего гормона) воздействия на определение любого из продуцируемых клетками гормонов (b, с)
Примечание: а - Диапазон измерений используемого метода определяется базовым уровнем продукции гормонов (табл. 6.6.4.5). Чем выше будет базовый уровень продукции гормона, тем шире будут пределы диапазона измерений. b - Некоторые используемые Т и Е2 антитела могут перекрестно взаимодействовать с андростероном и эстроном соответственно при повышении концентраций. В таких случаях будет невозможно точно определить влияние химиката на . Однако данные все же могут дать полезную информацию о влиянии на продукцию эстрогенов или андрогенов в целом. В таких случаях данные должны быть выражены как изменение уровня андрогенов/эстрогенов, а не уровня Е2 и Т. с - Следующие гормоны: холестерин, прегненолон, прогестерон, 11-дезоксикортикостерон, кортикостерон, альдостерон, , , дезоксикортизол, кортизол, DHEA, андростендион, эстрон

4.1.5. Подтверждение квалификационного уровня владения методом.

Для тестирования неизвестных веществ лаборатория проводит предварительную проверку, подтверждающую уровень квалификации. Поскольку выполнение исследования непосредственно зависит от лабораторного персонала, проводящего испытание, соответствующие части проверки уровня квалификации повторяют, если в лаборатории происходит смена персонала.

Проверку уровня квалификации проводят при экспозиции клеток в семи увеличивающихся концентрациях сильных, умеренных и слабых индукторов и ингибиторов, а также нейтральных веществ (табл. 6.6.4.2). Вещества, предназначенные для тестирования, включают сильный индуктор форсколин (CAS N 66575-29-9), сильный ингибитор прохлораз (CAS N 67747-09-5), умеренный индуктор атразин (СAS N 1912-24-9), умеренный ингибитор аминоглютетимид (CAS нет. 125-84-8), слабый индуктор (продукции Е2), и при этом слабый ингибитор (продукции Т) бисфенол (CAS N 80-05-7) и нейтральный человеческий хорионический гонадотропин (HCG) (CAS N 9002-61-3) в соответствии с табл. 6.6.4.2. Отдельные планшеты используют для каждого вещества, используя формат, представленный в табл. 6.6.4.6. Один QC-планшет (табл. 6.6.4.4) используют для ежедневной постановки контроля с референсными веществами.

Таблица 6.6.4.2

Исследуемые концентрации референсных веществ

Вещество	Используемые концентрации
Прохлораз	0 а, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10
Форсколин	0 а, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30
Атразин	0 а, 0.03, 0.1, 1, 3, 10, 30, 100
Аминоглютетимид	0 а, 0.03, 0.1, 1, 3, 10, 30, 100
Бисфенол	0 а, 0.03, 0.1, 1, 3, 10, 30, 100
HCG	0 а, 0.03, 0.1, 1, 3, 10, 30, 100
а (ДМСО) контроль (0), 1 мкл DMSO на лунку

В ходе лабораторной проверки уровня квалификации проводят экспозицию клеток H295R на 24-луночных планшетах с контрольными веществами. Концентрации указаны в для всех проверяемых доз. Вещества добавляют в виде раствора в DMSO, вносимое количество ДМСО одинаково для всех лунок и составляет 0,1% v/v. Все используемые концентрации проверяют троекратно, т.е. одновременно в трех лунках (табл. 6.6.4.6). Для каждого вещества используют отдельный планшет. Один QC-планшет используют для каждого из выполняемых за день тестов.

Пороговое значение (самая низкая концентрация, вызывающая наблюдаемый эффект, LOEC) и решение по классификации проверочного химиката представляют в отчете в сравнении с данными, приведенными в табл. 6.6.4.3. Результаты проверки считают приемлемыми, если они соответствуют LOEC и принятой классификации, приведенной в табл. 6.6.4.3.

4.1.6. Планшет для контроля качества.

Планшет контроля качества (QC) используют для проверки качества клеток H295R при стандартных условиях культивирования и сохранения в постоянно ведущейся базе данных по концентрации гормонов при контроле растворителя (QS), при постановке положительного и отрицательного контроля и для других дополнительных QC-мерах.

Таблица 6.6.4.3

Пороговые значения (LOEC) и классификация по исследуемым веществам

Вещество	CAS nо.	LOEC		Классификация
		Т	Е2	Т	Е2
Прохлораз	67747-09-5			+(а) (Ингибирование)	+ (Ингибирование)
Форсколин	66575-29-9			+ (Индукция)	+ (Индукция)
Атразин	1912-24-9			+ (Индукция)	+ (Индукция)
Аминоглютетимид	125-84-8			+ (Ингибирование)	+ (Ингибирование)
Бисфенол А	80-05-7			+ (Ингибирование)	+ (Индукция)
HCG	9002-61-3	n/а	n/а	Отрицательно	Отрицательно
(а) +, позитив; n/a: неприменимо, так как никаких изменений не должно наблюдаться при воздействии нецистостатических концентраций отрицательного контроля

Качество клеток H295R проверяют, используя QC-планшет для каждой новой партии клеток из коллекции АТСС или впервые используемых в работе клеток из ранее замороженного стока, если эта партия клеток еще не проверялась в тесте проверки качества.

Использование QC-планшета обеспечивает полную оценку условий проведения анализа при тестировании химикатов и обязательно является частью каждого тестирования. (Таких условий анализа, как жизнеспособность клеток, контроль растворителя, положительный и отрицательный контроль, вариабельность результатов внутри и между тестами.)

Проводят QC-тест на 24-луночных планшетах, следуя процедурам тестирования веществ: инкубация, дозирование, проверка на жизнеспособность и цитотоксичность, экстракция гормонов и определение концентрации гормонов. QC-планшет содержит пустые лунки, контроль растворителя, две концентрации известного индуктора (форсколин, 1 и 10 ) и ингибитора (прохлораз, 0,1 и 1 ) синтеза Е2 и Т. Кроме того, МеОН используется в отдельных лунках в качестве позитивного контроля для анализа жизнеспособности и цитотоксичности. Подробный шаблон для организации QC-планшета приведен в табл. 6.6.4.4. Критерии, которым должен соответствовать QC планшет, перечислены в табл. 6.6.4.5. Минимальное значение продуктов основного гормонального производства для Т и Е2 отмечают в обоих случаях: и в растворяющем контроле, и в чистых образцах.

4.2. Процедура исследования

4.2.1. Проведение химической экспозиции.

Предварительно инкубированные клетки вынимают из инкубатора и проверяют под микроскопом, чтобы убедиться, что они в хорошем состоянии (прикрепление, морфология) перед началом экспозиции.

Планшет с клетками переносят в ламинарный бокс; удаляют полную среду из лунок и заменяют ее новой полной средой (1 мл/на лунку). В данных MP ДМСО рассматривается в качестве предпочтительного растворителя. Если требуется использовать другой растворитель, предоставляют научное обоснование такой замены. Экспозицию клеток проводят путем добавления в лунку, содержащую 1 мл обогащенной среды, 1 мкл стокового раствора вещества в ДМСО. Конечная концентрация ДМСО составляет 0,1% (v/v) в каждой лунке. Предварительно отдельно смешивают соответствующий рабочий раствор вещества в ДМСО с полной средой для клеток, в соответствии с требуемой конечной концентрацией вещества для каждой дозы экспозиции. Приготовленную дозу добавляют в соответствующую лунку сразу после удаления из нее старой среды. Конечная концентрация ДМСО должна сохраняться неизменной, составляя 0,1% (v/v) для каждой лунки. Лунки, содержащие две самые высокие концентрации, визуально оценивают с помощью стереомикроскопа на предмет формирования осадка или образования мутности как признака неполной растворимости исследуемого вещества. Если наблюдаются мутность и выпадение осадка, проверяют образцы, содержащие последующие меньшие концентрации. После проверки растворимости планшет возвращают в и оставляют на 48 часов при 37°С и 5% атмосфере. Шаблон для планшета тестируемых веществ представлен в табл. 6.6.4.6. Образцы с 1-го по 7-й расположены в порядке увеличения дозы вещества.

Таблица 6.6.4.4

Шаблон для нанесения реактивов на планшет контроля качества для проверки состояния и реакции H295R клеток: без экспозиции, экспозиция известным ингибитором (PRO = прохлораз) и индуктором (FOR = форсколин) синтеза Е2 и Т

	1	2	3	4	5	6
А	Blank*	Blank*	Blank*	Blank* (+MeOH)**	Blank* (+MeOH)**	Blank* (+MeOH)**
В	ДМСО*** 1	ДМСО*** 1	ДМСО*** 1	ДМСО*** 1 (+MeOH)**	ДМСО*** 1 (+МеОН)**	ДМСО*** 1 (+MeOH)**
С	FOR 1	FOR 1	FOR 1	PRO 0.1	PRO 0.1	PRO 0.1
D	FOR 10	FOR 10	FOR 10	PRO 1	PRO 1	PRO 1
* Blank - (пустой контроль) - клетки в среде без растворителя и химикатов. ** MeOH - 70% Метанол добавляется только после окончания экспозиции и удаления среды из этих лунок *** ДМСО - контроль растворителя (1 мкл DMSO на одну лунку)

После завершения экспозиции и удаления среды, во все лунки, помеченные +МеОН, необходимо добавить 70%-й раствор метанола для контроля цитотоксичности.

Таблица 6.6.4.5

Критерии оценки результатов планшета контроля качества

	Т	Е2
Базальная продукция гормона в растворе (SC)	раз от LOQ	раз от LOQ
Индукция (10 форсколин)	раз от SC	раз от SC
Ингибиция (1 прохлораз)	раз от SC	раз от SC

Таблица 6.6.4.6

Шаблон расположения дозировок для тестирования веществ на клетках H295R на 24-луночной плашке

	1	2	3	4	5	6
А	ДМСО	ДМСО	ДМСО	Раствор 4	Раствор 4	Раствор 4
В	Раствор 1	Раствор 1	Раствор 1	Раствор 5	Раствор 5	Раствор 5
С	Раствор 2	Раствор 2	Раствор 2	Раствор 6	Раствор 6	Раствор 6
D	Раствор 3	Раствор 3	Раствор 3	Раствор 7	Раствор 7	Раствор 7

После 48-часовой экспозиции планшеты вынимают из инкубатора, для каждой лунки под микроскопом проверяют состояние клеток (прикрепление, морфология, процент конфлюэнтности) и признаки цитотоксичности. Среда из каждой лунки делится на два равных объема (приблизительно по 490 каждый) и переносится в два отдельных флакона, маркированных соответствующим образом (для каждой лунки одна из аликвот является запасной). Для предотвращения высыхания клеток среду удаляют по одному ряду или колонке за один раз и заменяют средой для проверки жизнеспособности клеток и цитотоксичности. Если жизнеспособность и цитотоксичность не измеряется немедленно, то в каждую лунку добавляют 200 мкл PBS содержащий Са2+ и Mg2+. Пробирки с собранной средой для определения концентрации гормонов замораживают и хранят при -80°С до последующей обработки. Хотя Т и Е2 при хранении среды при -80°С, как правило, устойчивы в течение трех месяцев, стабильность гормонов во время хранения постоянно определяют и документирют. Сразу после удаления среды для каждого планшета определяют жизнеспособность клеток и цитотоксичность для каждой дозы экспозиции.

4.2.2. Определение жизнеспособности клеток.

Для определения возможного воздействия тестируемого вещества на клетки используют подходящий анализ жизнеспособности клеток и цитотоксичности. Анализ должен обеспечить достоверное определение процента живых клеток в лунке или должен быть напрямую сопоставим с Assay. Параллельно проводят визуальную оценку каждой лунки, цифровые снимки для SC двух самых больших не цитотоксических концентраций архивируют. Если визуальная оценка или анализ жизнеспособности клеток продемонстрировали увеличение числа клеток, то такое предполагаемое увеличение верифицируют. В случае подтверждения, увеличение числа клеток отмечают в отчете о проведении тестирования. Жизнеспособность клеток определяют относительно среднего ответа SC, который принимают за 100% и вычисляют в соответствии с используемым методом оценки жизнеспособности клеток. Для метода с окрашиванием МТТ используют следующую формулу:

% жизнеспособных клеток = (результат в лунке - средний результат МеОН обработанных лунок [= 100% мертвых клеток]) / (средний результат для SC лунок - средний результат МеОН обработанных лунок [= 100% мертвых клеток])

Лунки с жизнеспособностью ниже 80% относительно средней жизнеспособности в SC (=100% жизнеспособности) не включают в заключительный анализ данных. Ингибирование стероидогенеза в условиях почти 20%-й цитотоксичности тщательно проверяют, чтобы гарантировать, что цитотоксичность не является причиной ингибирования.

4.2.3. Измерение концентрации гормонов.

Каждая лаборатория использует систему измерения гормонов для анализа Т и Е2 по своему выбору. Аликвоту среды из каждой тестовой группы используют для приготовления разведений, имеющих концентрациями в пределах линейной части стандартной кривой. Каждая лаборатория должна продемонстрировать соответствие своей системы измерения гормонов (ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) критериям QC путем анализа полной питательной среды с добавленным внутренним контролем концентрации гормона, прежде чем проводить проверку QC или тестирование веществ. Чтобы гарантировать, что компоненты тестируемой среды не влияют на измерение гормонов, из культуральной среды экстрагируют гормоны перед их измерением.

Если для определения уровня гормона используется коммерческий набор, анализ проводят в соответствии с протоколом изготовителя набора. Разведения образцов готовят таким образом, чтобы ожидаемые концентрации гормонов для контролей растворителя CS попадали в центр линейного диапазона стандартной кривой для конкретного используемого анализа (Приложение III отчета о валидизации). Значения, выходящие за пределы линейной части стандартной кривой, при расчете не используют.

Конечную концентрацию гормона вычисляют следующим образом:

Пример:

Экстрагировано из 450 мкл среды

Восстановлено в 250 мкл буфера для анализа

Разведение для анализа 1:10 (чтобы получить концентрации в пределах линейного диапазона стандартной кривой)

Концентрация определяемого гормона 150 пг/мл (в образце после экстракции и разведения)

Выход 89%

Конечная концентрация гормона в среде = (концентрация гормона (на мл) Выход) (Кратность разведения)

Конечная концентрация гормона в среде = (150 пг/мл) (0,89) х (250 мкл/450 мкл) х 10 = 936,3 пг/мл

4.2.4. Выбор тестируемых концентраций.

Проводят, как минимум, два независимых раунда тестирования. Если предварительная информация о пределах растворимости или цитотоксичности не ограничивает выбор используемых концентраций, используют log 10 разведения для первого раунда тестирования с максимальной концентрацией, равной 1mM. Если вещество хорошо растворимо, не цитотоксично в любой из проверенных концентраций, и первый раунд тестирования дал отрицательный ответ для всех использованных концентраций, подтверждают это во втором раунде тестирования, используя те же самые условия, что и в первом раунде (табл. 6.6.4.7). Если результаты первого раунда тестирования являются неоднозначными (т.е. уровень гормона статистически достоверно отличается от SC только при каком-то одном разведении химиката) или являются положительными (т.е. уровень гормона статистически достоверно отличается от SC в двух или более последовательных разведениях химиката), тест повторяют, как показано в табл. 6.6.4.7, с более точным подбором необходимых тестовых концентраций. Концентрации вещества во втором и третьем (если потребуется) раундах тестирования подбирают на основе результатов первого раунда, используя в качестве крайних концентрации, при которых наблюдался эффект, и используя 1/2-log разведения. Например, если в первом раунде из концентраций - 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1000 индукция наблюдалась при концентрациях 1 и 10 , то концентрации, проверяемые во втором раунде, должны составлять 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 , если не требуется использовать более низкие концентрации, чтобы достигнуть LOEC. В последнем случае, по крайней мере, пять концентраций ниже самой низкой концентрации, проверенной в первом раунде, используют во втором раунде, с 1/2-log разведения. Если второй раунд не подтверждает результаты первого (т.е. статистическая достоверность не достигнута при концентрации, ранее обнаружившей положительный эффект, ни при шаге концентраций), проводят третий раунд тестирования с использованием первоначальных условий тестирования. Неоднозначные результаты в первом раунде считают отрицательными, если наблюдаемый эффект не был подтвержден ни в одном из двух последующих раундов. Неоднозначные результаты считают положительными, если положительный эффект был подтвержден, по крайней мере, еще в одном раунде в пределах шага концентраций.

Таблица 6.6.4.7

Матрица решений для сценариев возможного исхода

1	2		3		Результат
Сценарий	Решение	Сценарий	Решение	Сценарий	Позитивный	Негативный
Негативный	Подтверждение*	Негативный	Stop			X
Негативный	Подтверждение*	Позитивный	Повтор**	Негативный		X
Эквивокальный***	Повтор**	Негативный	Подтверждение*	Негативный		X
Эквивокальный***	Повтор**	Негативный	Подтверждение*	Позитивный	X
Эквивокальный***	Повтор**	Позитивный			X
Позитивный	Повтор**	Негативный	Подтверждение*	Позитивный	X
Негативный	Подтверждение*	Позитивный	Повтор**	Позитивный	X
Позитивный	Повтор**	Позитивный	Stop		X
* Подтвердит предыдущий раунд, используя тот же самый дизайн эксперимента. ** Провести второй раунд используя 1/2-log интервал концентраций (покрывая те концентрации, при которых наблюдались достоверные отличия в предыдущем раунде). *** Уровень гормона при одной из концентраций статистически достоверно отличается от SC

4.2.5. Контроль качества испытательного планшета.

Помимо соответствия критериям качества для QC планшета, необходимо выполнение других критериев качества, представленных в табл. 6.6.4.8. К ним относятся: допустимая вариация значений между лунками с повторами, между повторными экспериментами, линейность и чувствительность систем измерения уровня гормонов, вариабельность между повторными измерениями уровня гормона одного и того же образца, процент выхода гормона при экстракции из среды. Для дальнейшей отработки данные должны находиться в пределах приемлемых диапазонов, которые определены для каждого параметра. Если эти критерии не выполняются, то в расчетной таблице указывают, что данный образец не соответствует QC-критериям, этот образец тестируют повторно или исключают из набора данных для анализа.

Таблица 6.6.4.8

Приемлемые диапазоны и/или вариации (%) параметров для тестового планшета Н295R-анализа

	Сравнение	Т	Е2
Базовый уровень продукции гормона в SC	Кратность превышения над LOQ	раз	раз
Эксперименты с экспозицией - CV в пределах планшета для SC (дупликаты лунок)	Абсолютная концентрация
Эксперименты с экспозицией - CV между планшетами для SC (повторные эксперименты)	Кратность изменения
Чувствительность системы измерения уровня гормона	Определяемое снижение к SC	раз	раз
Система измерения уровня гормона - дупликаты измерений СV для SC*	Абсолютная концентрация
Экстракция из среды - выход добавленного 3Н стандарта (если используется)	DPM	от исходного
* относится к повторным измерениям одного и того же образца. LOQ: Нижний предел чувствительности системы измерения уровня гормона; СV: Коэффициент вариации; SC: Контроль растворителя; DPM: Распады в минуту

5. Анализ и интерпретация данных

5.1. Анализ данных

Для оценки относительного увеличения/уменьшения продукции гормонов под действием тестируемых веществ, результаты нормализуют относительно среднего SC-значения для каждого тестового планшета и представляют как изменения гормона относительно SC для каждого тестового планшета. Все данные представляют как среднее значение стандартное отклонение (SD).

Только данные по гормонам для лунок, цитотоксичность в которых составляет менее 20%, используют для анализа данных. Относительные изменения вычисляют следующим образом:

Относительное изменение = (концентрация гормона в каждой лунке) / (среднее значение концентрации гормона для всех лунок с контролем растворителя).

Если визуальная оценка или анализ жизнеспособности клеток продемонстрировали увеличение числа клеток, то наблюдаемое увеличение верифицируют. Подтверждение увеличения числа клеток отмечают в отчете о проведении тестирования.

До проведения статистического анализа оценивают предположения о нормальности распределения и однородности различий. Нормальность оценивают с использованием стандартных методов вычисления вероятности или другого соответствующего статистического метода (например, тест Шапиро-Уилка). Если данные (кратность изменения) не подчиняются закону нормального распределения, проводят преобразование данных для соответствия нормальному распределению. Если данные отвечают закону нормального распределения или аппроксимируются нормальным распределением, различия между группами концентраций вещества и SC анализируют с использованием параметрического теста (например, теста Даннетта) с концентрацией в качестве независимой переменной и ответом (кратностью изменения) в качестве зависимой переменной. Если данные не отвечают нормальному распределению, используют соответствующий непараметрический тест (например, тест Краскэла Уоллиса). Различия считают существенными, если . Статистические оценки делают на основе средних значений для лунок, которые представляют собой независимые повторы исследуемых точек. Предполагается, что из-за большого шага разведений в первом раунде тестирования (шкала lg) во многих случаях будет невозможно четко описать отношения концентрация-эффект, чтобы значения двух самых больших доз находились на линейной части сигмовидной кривой. Поэтому для первого раунда тестирования и в случае наборов данных, где наблюдается подобное положение (например, там, где невозможно дать оценку максимальной эффективности) применяют переменную статистику.

Если в линейной части кривой оказывается более двух значений, и при этом может быть вычислен максимальный эффект (что можно ожидать для некоторых вторых раундов тестирования, когда используется 1/2 lg шаг разведения), тогда применяют любую модель регрессии для вычисления эффективных концентраций (например, ЕС50 и ЕС20).

Результаты представляют в двух форматах: графически - в виде гистограммы средних значений с соответствующими +/- 1 SD) и в виде таблицы (LOEC/NOEC, направление эффекта и сила максимального ответа, который является частью дозы-эффекта, в различных форматах (см. рис. 6.6.4.3, для примера). Оценку данных считают валидной, только если она выполнена на основании, по крайней мере, двух независимо проведенных раундов тестирования. Эксперимент или раунд тестирования считаются независимыми, если они проводились в разные дни с использованием заново приготовленных разведений вещества и контроля. Диапазон концентраций, применявшихся в раундах 2 и 3 (если это было необходимо) с целью более точного попадания в диапазон доза-ответ, включающего LOEC, планируют на основе результатов раунда 1.

5.2. Процедура интерпретации данных

Вещество классифицируют как положительное, если кратность индукции статистически значимо отличается от контроля растворителя для двух соседних концентраций, по крайней мере, в двух независимых раундах тестирования (табл. 6.6.4.7). Вещество классифицируют как отрицательное после двух независимых раундов тестирования с отрицательным эффектом или после трех независимых раундов, два из которых дали отрицательный результат, а один раунд оказался положительным или неоднозначным. Если данные, полученные в трех независимых экспериментах, не соответствуют критериям классификации, приведенным в табл. 6.6.4.7, то результаты таких экспериментов считают не интерпретируемыми. Результаты для концентраций, превышающих пределы растворимости или имеющие цитостоксический эффект, не включают в анализ и интерпрентацию результатов.

6. Подготовка отчета

Отчет по тестированию химикатов должен содержать следующую информацию:

Лаборатория, проводившая тестирование:

- Название лаборатории и адрес;

- Ответственный исполнитель и другой персонал и их обязанности по проведению тестирования;

- Дата начала и конца тестирования.

Тестируемое вещество, реагенты и средства контроля:

- Идентичность (название, CAS номер, если имеется), источник, номер партии, чистота, поставщик; характеристики тестируемого вещества, реагентов и средств контроля;

- Физико-химические свойства тестируемого вещества;

- Условия хранения, методы и частота подготовки тестируемых веществ, реагентов и контролей;

- Стабильность тестируемого вещества.

Клетки:

- Источник и тип клеток;

- Число пассажей (идентификатор пассажа) для клеток используемых в конкретном тесте;

- Описание процедур хранения и ведения клеточных культур.

Необходимые дотестовые проверки (если применимо):

- Описание и результаты проверки по выявлению влияния тестируемого химиката на точность определение концентрации гормона;

- Описание и результаты определения эффективности (процента выхода) экстракции гормонов;

- Стандартные и калибровочные кривые для всех используемых аналитических методов;

- Чувствительность и диапазон измерения для всех используемых аналитических методов.

Условия проведения теста:

- Состав среды;

- Концентрация тестируемого химиката;

- Плотность клеток (оценочная или измеренная концентрация клеток через 24 и 48 часов инкубации);

- Растворимость химического теста (предел растворимости, если определялся);

- Длительность и условия инкубации.

Результаты тестирования:

- Исходные данные для каждой лунки контроля и тестируемого вещества - результат замера в каждом из повторов, представленных в виде оригинальных данных измерения концентрации гормона (например: OD, единицы флюоресценции, DPM, и т.д.);

- Проверка соответствия нормальному распределению или объяснение применявшегося преобразования данных;

- Средние значения +/- 1 SD для каждой лунки;

- Данные о цитотоксичности (концентрации тестируемого вещества, которые вызвали цитотоксичность);

- Подтверждение соответствия эксперимента требованиям контроля качества QC;

- Относительное изменение по сравнению с контролем растворителя SC с поправкой на цитотоксичность;

- Гистограмма величины относительного эффекта (кратность индукции) при каждой концентрации, с указанием SD и статистической достоверности в соответствии с параграфами N 49-54;

Интерпретация результатов:

- Применяется процедура интерпретации данных к полученным результатам.

Обсуждение:

- Есть ли какие-либо признаки, указывающие на возможность того, что механизмы глюко- и минералокортикоидных путей обмена могли оказать косвенное влияние на наблюдающиеся результаты продукции Т/Е2?