Приложение 6.6.3. Исследование транскрипционной активации, опосредованной стабильно трансфицированным человеческим а-рецептором эстрогена, для выявления эстроген-агонистической активности веществ

Приложение 6.6.3

Исследование транскрипционной активации, опосредованной стабильно трансфицированным человеческим а-рецептором эстрогена, для выявления эстроген-агонистической активности веществ

Идентичен международному документу OECD TG N 455 "Stably Transfected Human Estrogen Transcriptional Activation Assay for Detection of Estrogenic Agonist-Activity of Chemicals" (ОЭСР Руководство N 455 "Исследование транскрипционной активации, опосредованной стабильно трансфицированным человеческим эстрогена, для выявления эстроген-агонистической активности веществ"). Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий документ устанавливает требования к методам транскрипционной активации, опосредованной связыванием вещества с человеческим эстрогена, для выявления эстроген-агонистической активности химических веществ и продукции на их основе (далее - веществ).

1.2. Концептуальные основы ОЭСР для оценки и тестирования потенциальных веществ - разрушителей эндокринной системы были заложены в 1998 г. и пересмотрены в 2012 г. Исходные и пересмотренные Руководства представлены в качестве приложений к Руководящему Документу ОЭСР N 150. Концептуальная основа ОЭСР включает пять уровней, каждый из которых соответствует различному уровню биологической сложности. Тестирование на активацию транскрипции (ТА), описанное в настоящем методе рекомендациях, относится к уровню 2 - "in vitro анализ, позволяющий получить информацию об определенных эндокринном(ых) механизме(ах)".

1.3. Настоящим документом описывают методологию in vitro трансактивации стабильно трансфицированных репортеров для выявления агонистов рецептора эстрогена (ER ТА-анализ). Они включают в себя несколько механистически и функционально подобных методов тестирования для идентификации агонистов рецепторов эстрогена (например, агонистов и/или ERP) и должны способствовать развитию новых подобных или модифицированных методов испытаний в соответствии с принципами валидизации, изложенными в Руководящем документе ОЭСР N 34. Основу данного документа составляют два полностью валидизированных метода, приведенных в прилож. 6.6.3.1 и 6.5.3.2:

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо "6.5.3.2" имеется в виду "6.6.3.2"

- анализ активации стабильно трансфицированных конструктов (STTA) с использованием клеточной линии ;

- BG1Luc ER ТА-анализ с использованием клеточной линии BG1Luc-4E2, экспрессирующей в основном hERa с незначительным .

1.4. Имеющиеся функциональные требования (Performance standards PS) позволят облегчить разработку и проверку аналогичных методов тестирования, а также своевременно вводить изменения и добавлять другие аналогичные методы тестирования в настоящий документ. Однако сходные методы испытаний можно будет добавлять только после всестороннего рассмотрения и проверки соответствия стандартам эффективности. Методы тестирования, включенные в настоящие методические рекомендации, можно будет использовать взаимозаменяемо в зависимости от условий и требований разных стран к проведению тестирования трансактивации рецептора эстрогена, сохраняя при этом возможность взаимного признания данных.

2. Общие положения

2.1. Взаимодействие эстрогенов с ER может влиять на ТА генов, находящихся под контролем эстрогена, что может приводить к индукции или ингибированию клеточных процессов, в том числе необходимых для пролиферации клеток, нормального развития плода, и нормальной репродуктивной функции. Нарушения нормального функционирования эстрогенной системы могут вызывать нежелательное воздействие на нормальный ход развития (онтогенез), репродуктивное здоровье и согласованность действия эндокринной системы в целом.

2.2. In vitro ТА-анализ основан на связывании исследуемого вещества с определенным рецептором, приводящим к последующей активации транскрипции и экспрессии репортерного гена. Давно используется ТА-анализ активации репортерных генов для скрининга и оценки экспрессии конкретных генов, регулируемых специфическими ядерными рецепторами, такими как рецепторы эстрогена (ERs). Этот тип анализа был предложен для выявления эстрогенной трансактивации, регулируемой ER. Существует, по крайней мере, два основных подтипа ядерных ER - и , кодируемых отдельными генами и отличающихся своей тканевой локализацией, относительной аффинностью и биологическими функциями. Ядерный опосредует классический эстрогенный ответ, поэтому модели, используемые в настоящее время для измерения активации ER, в основном задействуют . Предлагаемые методы основаны на том, что вещество-ER-агонист способно связываться с ER, образовавшийся лиганд-рецепторный комплекс связывается со специфическим ER-эффекторным участком ДНК и трансактивирует репортерный ген, что приводит к увеличению экспрессии белка-репортера. Для детекции ER ТА могут использовать различные репортерные системы. В системе с использованием люциферазы, фермент люцифераза превращает субстрат люциферин в люминесцентный продукт, который можно количественно определить на люминометре. Другими примерами обычно используемых репортеров являются флюоресцентные белки и LacZ ген, кодирующий , фермент, трансформирующий бесцветный субстрат X-gal (5-бромо-4-хлоро-индолил-галактопиранозид) в продукт синего цвета, который можно количественно измерить на спектрофотометре. Имеются коммерческие наборы для малозатратного и быстрого определения данных репортеров.

2.3. Валидизационные исследования STTA и BG1Luc ТА-тестирования продемонстрировали их применимость и надежность для предлагаемой области применения. Функциональные требования к тестам ER ТА с использованием люминесценции и клеточных линий производных от клеток яичников включены в ICCVAM Отчет по оценке метода тестирования (BG1Luc ER ТА): in vitro метод для определения химических веществ - hER агонистов и антагонистов. Эти функциональные требования подверглись модификации, чтобы быть применимыми в обоих методах тестирования: STTA и BG1Luc ТА.

3. Назначение и ограничения ТА-анализа

3.1. Данные методы тестирования предложены для скрининговой оценки веществ и выбора приоритетных для дальнейших исследований. Методы основаны на ТА, вызванной связыванием тестируемого вещества с эстрогеновыми рецепторами (ER) in vitro. Соответственно, результаты тестирования нельзя напрямую переносить на передачу сигналов и регуляцию в интактной эндокринной системе in vivo.

3.2. Активация транскрипции (ТА), опосредованная ER, считается одним из ключевых механизмов действия эндокринных разрушителей (ЭР) на организм, хотя существуют и другие пути действия ЭР. Они включают:

- действие через другие ядерные рецепторы, связанные с эндокринной системой и сте- роидогенными ферментами;

- метаболическую активацию или инактивацию гормонов;

- распределение гормонов в тканях-мишенях;

- элиминацию гормонов.

Ни один из методов тестирования, представленных в настоящем документе, не предназначен для рассмотрения этих возможных механизмов действия.

3.3. Настоящий документ рассматривает выявление веществ, способных активировать (т.е. действовать в качестве агонистов), а не подавлять ER-зависимую транскрипцию (т.е. действовать в качестве антагонистов). Поэтому вещества, классифицированные как отрицательные рассматриваемыми методами тестирования, необходимо протестировать на связывание с ER или использовать тест, способный определять ER-антагонистов, прежде чем полагать, что вещество не связывается с рецептором. Вдобавок, данные методы, вероятнее всего, позволят оценить ER-агонистическую активность только исходного вещества, поскольку способности in vitro клеточных систем метаболизировать исходное вещество сильно ограничены. При валидизации метода использовались только индивидуальные вещества, пригодность метода для тестирования смесей веществ не изучалась.

3.4. В порядке информации в табл. 6.6.3.1 представлены результаты для 34 веществ, проанализированных в ходе валидизации обоих методов тестирования, описанных в настоящих методических рекомендациях. Из этих веществ 26 классифицируются как безусловные ER-агонисты и 8 - как отрицательные на основании данных опубликованных отчетов, в том числе in vitro анализов связывания вещества с ER, результатов ТА и/или утеротропного анализа. Относительно веществ, представленных в табл. 6.6.3.1, имелось 100%-е соответствие между двумя методами тестирования применительно к классификации всех веществ. Каждое вещество было правильно классифицировано как ER-агонист, или как ER-антагонист. Дополнительная информация по этой группе веществ, равно как и других дополнительных веществ, протестированных методами STTA и BG1Luc ER ТА в ходе валидизационных исследований, представлена в Стандартах эффективности для ER ТА [Performance Standards for the ERTA] и в прилож. 6.6.3.1 (табл. 6.6.3.1.1, 6.6.3.1.2 и 6.6.3.1.3).

4. Описание ER ТА-метода тестирования

4.1. Необходимые составляющие метода тестирования

Настоящий документ применим к методам тестирования, использующим стабильно трансфицированный или эндогенный и стабильно трансфицированный конструкт, содержащий ген-репортер под контролем одного или нескольких эстроген-эффекторных элементов, тем не менее могут присутствовать и другие рецепторы, такие как . Перечисленные являются необходимыми составляющими метода тестирования.

4.2. Контрольные вещества

Должны быть представлены основания для одновременно используемых контролей и референсного эстрогена. Одновременные контроли (отрицательный, положительный и контроль растворителя) служат для подтверждения того, что метод тестирования работает в данной конкретной постановке, и служат основой для сравнения проводимых тестирований друг с другом. Обычно контроли являются одним из критериев проверки приемлемости каждого конкретного тестирования.

4.3. Стандартная процедура контроля качества

Стандартная процедура контроля качества должна выполняться в соответствии с протоколом при каждом тестировании, чтобы гарантировать, что клеточная линия продолжает оставаться стабильной на протяжении многих пассажей, остается незараженной микоплазмой и сохраняет способность выдавать ожидаемый ER-опосредованный ответ. Соответствие характеристик клеточной линии должно подтверждаться дополнительными проверками, также необходимы проверки на отсутствие других заражений (например, грибами, дрожжами и вирусами).

4.4. Подтверждение технической компетентности лаборатории

Прежде чем приступить к тестированию неизвестных веществ любым из методов каждая лаборатория должна продемонстрировать необходимое владение используемым методом путем тестирования 14 веществ из списка оценки технической компетентности (табл. 6.6.3.2). Даная проверка технической компетентности также служит подтверждением чувствительности тест-системы. Вещества для оценки технической компетентности являются выборкой из списка "Референсных веществ", представленных в стандартах эффективности для ER ТА-анализа. Эти вещества коммерчески доступны, представляют классы химических веществ, обычно связанных с ER-агонистической активностью, попадают в подходящий диапазон активности ER-aгoнистов: от сильных до слабых и до отрицательных. Тестирование этих веществ должно проводиться, как минимум, в двух независимых повторностях, причем в различные дни. Техническая компетентность заключается в правильной классификации (положительное/отрицательное) каждого из 14 веществ. Каждый работник при обучении методам тестирования должен проходить подтверждение технической компетентности.

Таблица 6.6.3.1

Сравнение результатов STTA и BG1Luc ER ТА-анализа для веществ, проверенных обоими методами тестирования и классифицированных как положительные (ER-агонисты) или как отрицательные

N	Вещество	CASRN	STTA-анализ*(4)			BG1Luc ER ТА-анализ*(5)		Данные для классификации*(7)
			ER TA-активность	РС10 (М)	PC50*(2) (М)	ER TA-активность	ЕС50*(2), *(6) (М)	Другие ER TAs*(3)	ER-связы- вание	Утеротроп- ность
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
1	Эстрадиол*(1)	50-28-2	POS			POS		POS (227/227)	POS	POS
2	Эстрадиол*(1)	57-91-0	POS			POS		POS(11/11)	POS	POS
3	Этинилэстрадиол*(1)	57-63-6	POS			POS		POS(22/22)	POS	POS
4		10161-33-8	POS			POS		POS (2/2)	NT	NT
5	19-Нортестостерон*(1)	434-22-0	POS			POS		POS(4/4)	POS	POS
6	4-Кумилфенол*(1)	599-64-4	POS			POS		POS(5/5)	POS	NT
7	4-tert-Октилфенол*(1)	140-66-9	POS			POS		POS(21/24)	POS	POS
8	Апегинин*(1)	520-36-5	POS			POS		POS(26/26)	POS	NT
9	Атразин*(1)	1912-24-9	NEG	-	-	NEG	-	NEG (30/30)	NEG	NT
10	Бисфенол А*(1)	80-05-7	POS			POS		POS(65/65)	POS	POS
11	Бисфенол1 Б*(1)	77-40-7	POS			POS		POS(6/6)	POS	POS
12	Бутилбензил фталат*(1)	85-68-7	POS			POS		POS(12/14)	POS	NEG
13	Кортикостерон*(1)	50-22-6	NEG	-	-	NEG	-	NEG( 6/6)	NEG	NT
14	Куместрол*(1)	479-13-0	POS			POS		POS(30/30)	POS	NT
15	Даидзеин*(1)	486-66-8	POS			POS		POS(39/39)	POS	POS
16	Диэтилстилбестрол*(1)	56-53-1	POS			POS		POS(42/42)	POS	NT
17	Ди-н-бутилфталат	84-74-2	POS			POS		POS(6/11)	POS	NEG
18	Этилпарабен	120-47-8	POS		(по )	POS		POS		NT
19	Эстрон*(1)	53-16-7	POS			POS		POS(26/28)	POS	POS
20	Генистеин*(1)	446-72-0	POS			POS		POS(100/102)	POS	POS
21	Галоперидол	52-86-8	NEG	-	-	NEG	-	NEG (2/2)	NEG	NT
22	Кемпферол*(1)	520-18-3	POS			POS		POS(23/23)	POS	NT
23	Кепон*(1)	143-50-0	POS			POS		POS(14/18)	POS	NT
24	Кетоконазол	65277-42-1	NEG	-	-	NEG	-	NEG (2/2)	NEG	NT
25	Линурон*(1)	330-55-2	NEG	-	-	NEG	-	NEG (8/8)	NEG	NT
26	meso-Геесестрол*(1)	84-16-2	POS			POS		POS(4/4)	POS	NT
27	Метилтестостерон*(1)	58-18-4	POS			POS		POS(5/6)	POS	NT
28	Морин	480-16-0	POS			POS		POS(2/2)	POS	NT
29	Норэтинодрел*(1)	68-23-5	POS			POS		POS(5/5)	POS	NT
30	р,р'-Метоксихлор*(1)	72-43-5	POS		(no PC50)*(2)	POS		POS(24/27)	POS	POS
31	ФенобарбиталI*(1)	57-30-7	NEG	-	-	NEG	-	NEG(2/2)	NEG	NT
32	Резерпин	50-55-5	NEG	-	-	NEG	-	NEG(4/4)	NEG	NT
33	Спиронолактон*(1)	52-01-7	NEG	-	-	NEG	-	NEG(4/4)	NEG	NT
34	Тестостерон	58-22-0	POS			POS		POS(5/10)	POS	NT

Сокращения:

CAS RN = Chemical Abstracts Service Registry Number;

M = молярность;

EC50 = среднеэффективная концентрация исследуемого вещества;

NEG = отрицательный ответ;

POS = положительный ответ;

PC10 и РС50 = концентрация тестируемого вещества, при которой ответ составляет соответственно 10 или 50% от величины ответа, вызванного положительным контролем (Е2, 1nМ) на каждом планшете.

______________________________

*(1) Химические вещества, проверявшиеся методами STTA и BG1Luc ER ТА-анализа, которые были классифицированы как положительные (ER-агонисты) или отрицательные, и использовались в валидизационном исследовании BG1 Luc ER ТА-анализа для оценки точности метода (ICCVAM BG1Luc ER ТА Evaluation Report, Table 4-10 [3].

*(2) Максимальная концентрация, проверявшаяся в случае отсутствия цитотоксичности и нерастворимости вещества, составляла М (для STTA-анализа) и М (для BGlLuc ER ТА-анализа).

*(3) Число в скобках представляет количество результатов, классифицированных как положительные (POS) или отрицательные (NEG), из общего числа проведенных референсных исследований.

*(4) Значения, приведенные в черновом Отчете по пре-валидизации и в отчете по межлабораторной валидизации STTA-анализа для определения эстрогенной активности - Анализ трансактивации гена-репортера, опосредованный рецептором , с использованием клеточной линии hER-HeLa-9903 [30]

*(5) ICCVAM Отчет по оценке метода тестирования (BG1Luc ER ТА): In Vitro метод для определения ER-агонистов и антагонистов [3]

*(6) Средние значения ЕС50 рассчитывались на основе данных, предоставленных лабораториями, проводившими валидизацию BG1Luc ER ТА-анализа (XDS, ECVAM,and Hiyoshi) [3].

*(7) Классификация вещества как проявляющего положительный эффект (ER-агониста) (POS) или не проявляющего такой эффект (отрицательный) (NEG), основывалась на информации, содержащейся в ICCVAM Обзоре литературы по методам тестирования связывания с ER и по методам ТА [31, 32], а также на информации, полученной из публикаций, вышедших и рассматривавшихся после завершения ICCVAM BRDs [3, 18, 30, 32, 33, 34, 35].

Таблица 6.6.3.2

Список 14 референсных веществ для оценки технической компетентности*(8)

N*(7)	Химическое название	CAS RN	Ожидаемый эффект*(1)	STTA-анализ			BG1Luc ER ТА-анализ		Класс химического вещества по MeSH*(5)	Тип продукции*(6)
				РС10 значение (М)*(2)	РС50 значение (М)*(2)	Диапазон проверявшихся концентраций (М)	Bg1Luc ЕС50 значение (М)*(3)	Максимальная концентрация при оценке диапазона (М)*(4)
14	Диэтилстибестрол	56-53-1	POS						Углеводород (циклический)	Фармацевтическое, Ветеринарное средство
12		57-91-0	POS						Стероид	Фармацевтическое, Ветеринарное средство
15	meso-Гексестрол	84-16-2	POS						Углеводород (циклический), фенол	Фармацевтическое, Ветеринарное средство
11	4-tert-Октилфенол	140-66-9	POS						Фенол	Промежуточный химический продукт
9	Генистеин	446-72-0	POS						Флавоноид, Гетероциклическое соединение	Природное, Фармацевтическое средство
6	Бисфенол А	80-05-7	POS						Фенол	Промежуточный хи- мический продукт
2	Кемпферол	520-18-3	POS						Флавоноид, Гетероциклическое соединение	Природный продукт
3	Бутилбензилфталат	85-68-7	POS						Карбоновая кислота, Эфир, Фталевая кислота	Пластификатор, Промышленное вещество
4	р,р'-Метоксихлор	72-43-5	POS		-				Углеводород (галоге- нированный)	Пестицид, Ветеринарный препарат
1	Этилпарабен	120-47-8	POS		-				Карбоновая кислота, Фенол	Фармпрепарат, Консервант
17	Атразин	1912-24-9	NEG	-	-		-		Гетероциклическое соединение	Гербицид
20	Спиронолактон	52-01-7	NEG	-	-		-		Лактон, Стероид	Фармпрепарат
21	Кетоконазол	65277-42-1	NEG	-	-		-		Гетероциклическое соединение	Фармпрепарат
22	Резерпин	50-55-5	NEG	-	-		-		Гетероциклическое соединение, Индол	Фармацевтическое, Ветеринарное средство

Сокращения:

CAS RN = Chemical Abstracts Service Registry Number;

M = молярность;

ЕС50 = среднеэффективная концентрация исследуемого вещества;

NEG = отрицательный ответ;

POS = положительный ответ;

PC10 и РС50 = концентрация тестируемого вещества, при которой ответ составляет соответственно 10 или 50% от величины ответа, вызванного положительным контролем (Е2,1nМ) на каждом планшете.

______________________________

*(1) Классификация вещества как проявляющего положительный эффект (ER-агониста) (POS) или не проявляющего такой эффект (отрицательный) (NEG), основывалась на информации, содержащейся в ICCVAM Обзоре литературы по методам тестирования связывания с ER и по методам ТА [31, 32], а также на информации, полученной из публикаций, вышедших и рассматривавшихся после завершения ICCVAM BRDs [3, 18, 30, 32, 33, 34, 35].

*(2) Значения, приведенные в черновом отчете по пре-валидизации и в отчете по межлабораторной валидизации STTA-анализа для определения эстрогенной активности - Анализ трансактивации гена-репортера, опосредованный рецептором hERa, с использованием клеточной линии hER-HeLa-9903 [30].

*(3) Средние значения ЕС50 рассчитывались на основе данных, предоставленных лабораториями, проводившими валидизацию BG1Luc ER ТА-анализа (XDS, ECVAM, and Hiyoshi) [3].

*(4) Приведенные концентрации являлись наибольшими из проверявшихся в ходе валидизации BG1Luc ER ТА-анализа (при проверке диапазона действия). Если в разных лабораториях использовались разные концентрации, в таблице приводится наибольшая из концентраций. См. табл. 4-10 в ICCVAM Отчете по оценке метода тестирования (BG1Luc ER ТА): In Vitro метод для определения ER-агонистов и антагонистов [3]

*(5) Вещества относили к одному или нескольким химическим классам на основании MeSH (U.S. National Library of Medicine's Medical Subject Headings (MeSH), международно признанной стандартизированной системы классификации (доступна по адресу: http://www.nlm.nih.gov/mesh).

*(6) Вещества относили к одному или нескольким классам опасных продуктов на основании (U.S. National Library of Medicine's Hazardous Substances Database) (доступна по адресу: http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB).

*(7) Из табл. 1 - функциональные требования [6].

*(8) Если референсное вещество более коммерчески недоступно, можно использовать другое вещество с той же самой классификацией MeSH и токсичности, при условии сопоставимой силы и аналогичного механизма действия.

5. Анализ и интерпретация данных

5.1. Критерии приемлемости теста

Принятие или исключение теста из дальнейшего рассмотрения основывается на анализе результатов, полученных для референсного эстрогена и остальных контролен в каждом эксперименте. Значения оr для референсного эстрогена должны соответствовать критериям приемлемости соответствующего метода тестирования (см. прилож. 6.6.3.1 для STTA и прилож. 6.6.3.2 для В61Luc ER ТА), при этом в каждом эксперименте все положительные и отрицательные контроли должны быть классифицированы правильно. Способность воспроизводимо проводить тестирования должна подтверждаться данными долговременной базы результатов тестирования, содержащей данные по референсному эстрогену и контролям.

В качестве показателя внутрилабораторной воспроизводимости может использоваться стандартное отклонение (SD) или коэффициент вариации (CV) средних параметров кривой концентрация-ответ для референсного эстрогена по результатам многих экспериментов.

Кроме того, должны выполняться следующие условия:

- полученные данные должны быть достаточными для количественной оценки ER активации (эффективности и силы вещества);

- чтобы обеспечить необходимую чувствительность, средняя величина активности репортера для эталонных концентраций референсного эстрогена, рассматриваемая относительно контроля носителя (растворителя), должна быть не меньше указанной для используемых методов. Для STTA и BG1Luc ER-методов анализа это соответствует четырехкратному превышению над средней величиной для контроля носителя на каждом планшете;

- используемые концентрации тестируемого вещества не должны превышать пределов растворимости и не должны вызывать цитотоксичности.

5.2. Анализ данных

Для классификации положительного и отрицательного ответа должны использоваться строго определенные процедуры интерпретации данных.

Соответствие критериям приемлемости теста (5.1) говорит только о том, что процедура тестирования проводится надлежащим образом, но это не гарантирует получения точных данных в каждом конкретном тестировании. Повторение результатов первого тестирования является наилучшим подтверждением правильности полученных результатов. Если два повтора дают воспроизводимые результаты (например, в обоих повторах вещество идентифицировано как положительное), то нет необходимости проводить тестирование в третий раз.

Если два повтора не дают воспроизводимых результатов (например, вещество идентифицировано как положительное в одном повторе и как отрицательное в другом) или требуется большая степень достоверности результатов тестирования, то следует провести как минимум три независимых повтора тестирования.

5.3. Общие критерии интерпретации данных

В настоящий момент не существует полного согласия по способу интерпретации данных ER ТА. Однако как качественные (например: положительный/отрицательный), так и количественные (например: , ) оценки ER-опосредованной активации, должны основываться на накопленных эмпирических данных и хорошо обоснованных научных суждениях. Насколько возможно, положительные результаты должны характеризоваться как величиной относительной активации по сравнению с носителем (растворителем) или по сравнению с референсным эстрогеном, так и характерной концентрацией, при которой данный эффект обнаруживается (например , , и т.п.).

6. Подготовка тестового отчета

Отчет по каждому тесту должен содержать следующую информацию:

Метод тестирования:

- используемый метод тестирования.

Тестируемое вещество:

- идентификационные данные и CAS-номер, если известно;

- физическая природа и чистота;

- физико-химические свойства, существенные для проводимого исследования;

- стабильность тестируемого вещества.

Растворитель/носитель:

- характеристика (природа вещества, поставщик и партия);

- обоснование выбора растворителя/носителя;

- растворимость и стабильность тестируемого вещества в растворителе/носителе, если известно.

Клетки:

- тип клеток и их источник:

- имеется ли экспрессия эндогенного ER? Если нет, какой (какие) рецептор(ы) были трансфицированы в клетки?

- используемые репортерные конструкты (с указанием организма - источника ДНК)

- метод трансфекции;

- метод селекции, используемый для поддержания стабильных трансфектантов (если необходимо);

- применимость метода трансфекции для получения стабильных клеточных линий;

- число пассажей клеток (после размораживания);

- номер пассажа размораживаемых клеток;

- методы ведения клеточных культур.

Условия проведения теста:

- ограничения растворимости тестируемого вещества;

- описание используемого метода оценки жизнеспособности клеток;

- состав питательной среды, концентрация ;

- концентрация тестируемого вещества;

- объемы добавляемого носителя и тестируемого вещества;

- температура инкубации и влажность;

- продолжительность воздействия;

- плотность клеток в начале и во время теста;

- положительные и отрицательные референсные химические вещества;

- реактивы для определения активации (название, поставщик и партия);

- критерии приемлемости теста и интерпретации результатов (положительные, отрицательные или неопределенные).

Проверка надежности:

- кратность индукции для каждого планшета, а также соответствие минимально достаточной для используемого метода тестирования;

- фактические значения , , и коэффициента Хилла для параллельно используемых контролей/референсных веществ.

Результаты:

- исходные и нормализованные данные;

- максимальная кратность индукции;

- данные по цитотоксичности;

- минимальная эффективная концентрация (LEC), если существует;

- , , и/или , если определены;

- данные по зависимости концентрация-эффект, где это возможно;

- статистический анализ, если использовался, вместе с оценкой ошибки (например SEM, SD, CV или 95%-й доверительный интервал) и описанием способа расчета этих значений.

Обсуждение результатов.

Заключение.

______________________________

* Michael S. Denison, Ph.D. Professor, Dept. of Environmental Toxicology, 4241 Meyer Hall, One Shields Ave, University of California, Davis, CA 95616, E: msdenison@ucdavis.edu, (530) 754-8649

** Xenobiotic Detection Systems Inc. 1601 East Geer Street, Suite S, Durham NC, 27704 USA, email: info@dioxins.com, Tel.: 919-688-4804, Fax: 919-688-4404