Приложение 6.6.3. Исследование транскрипционной активации, опосредованной стабильно трансфицированным человеческим а-рецептором эстрогена, для выявления эстроген-агонистической активности веществ

Приложение 6.6.3

Исследование транскрипционной активации, опосредованной стабильно трансфицированным человеческим а-рецептором эстрогена, для выявления эстроген-агонистической активности веществ

Идентичен международному документу OECD TG N 455 "Stably Transfected Human Estrogen Transcriptional Activation Assay for Detection of Estrogenic Agonist-Activity of Chemicals" (ОЭСР Руководство N 455 "Исследование транскрипционной активации, опосредованной стабильно трансфицированным человеческим эстрогена, для выявления эстроген-агонистической активности веществ"). Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий документ устанавливает требования к методам транскрипционной активации, опосредованной связыванием вещества с человеческим эстрогена, для выявления эстроген-агонистической активности химических веществ и продукции на их основе (далее - веществ).

1.2. Концептуальные основы ОЭСР для оценки и тестирования потенциальных веществ - разрушителей эндокринной системы были заложены в 1998 г. и пересмотрены в 2012 г. Исходные и пересмотренные Руководства представлены в качестве приложений к Руководящему Документу ОЭСР N 150. Концептуальная основа ОЭСР включает пять уровней, каждый из которых соответствует различному уровню биологической сложности. Тестирование на активацию транскрипции (ТА), описанное в настоящем методе рекомендациях, относится к уровню 2 - "in vitro анализ, позволяющий получить информацию об определенных эндокринном(ых) механизме(ах)".

1.3. Настоящим документом описывают методологию in vitro трансактивации стабильно трансфицированных репортеров для выявления агонистов рецептора эстрогена (ER ТА-анализ). Они включают в себя несколько механистически и функционально подобных методов тестирования для идентификации агонистов рецепторов эстрогена (например, агонистов и/или ERP) и должны способствовать развитию новых подобных или модифицированных методов испытаний в соответствии с принципами валидизации, изложенными в Руководящем документе ОЭСР N 34. Основу данного документа составляют два полностью валидизированных метода, приведенных в прилож. 6.6.3.1 и 6.5.3.2:

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо "6.5.3.2" имеется в виду "6.6.3.2"

- анализ активации стабильно трансфицированных конструктов (STTA) с использованием клеточной линии ;

- BG1Luc ER ТА-анализ с использованием клеточной линии BG1Luc-4E2, экспрессирующей в основном hERa с незначительным .

1.4. Имеющиеся функциональные требования (Performance standards PS) позволят облегчить разработку и проверку аналогичных методов тестирования, а также своевременно вводить изменения и добавлять другие аналогичные методы тестирования в настоящий документ. Однако сходные методы испытаний можно будет добавлять только после всестороннего рассмотрения и проверки соответствия стандартам эффективности. Методы тестирования, включенные в настоящие методические рекомендации, можно будет использовать взаимозаменяемо в зависимости от условий и требований разных стран к проведению тестирования трансактивации рецептора эстрогена, сохраняя при этом возможность взаимного признания данных.

2. Общие положения

2.1. Взаимодействие эстрогенов с ER может влиять на ТА генов, находящихся под контролем эстрогена, что может приводить к индукции или ингибированию клеточных процессов, в том числе необходимых для пролиферации клеток, нормального развития плода, и нормальной репродуктивной функции. Нарушения нормального функционирования эстрогенной системы могут вызывать нежелательное воздействие на нормальный ход развития (онтогенез), репродуктивное здоровье и согласованность действия эндокринной системы в целом.

2.2. In vitro ТА-анализ основан на связывании исследуемого вещества с определенным рецептором, приводящим к последующей активации транскрипции и экспрессии репортерного гена. Давно используется ТА-анализ активации репортерных генов для скрининга и оценки экспрессии конкретных генов, регулируемых специфическими ядерными рецепторами, такими как рецепторы эстрогена (ERs). Этот тип анализа был предложен для выявления эстрогенной трансактивации, регулируемой ER. Существует, по крайней мере, два основных подтипа ядерных ER - и , кодируемых отдельными генами и отличающихся своей тканевой локализацией, относительной аффинностью и биологическими функциями. Ядерный опосредует классический эстрогенный ответ, поэтому модели, используемые в настоящее время для измерения активации ER, в основном задействуют . Предлагаемые методы основаны на том, что вещество-ER-агонист способно связываться с ER, образовавшийся лиганд-рецепторный комплекс связывается со специфическим ER-эффекторным участком ДНК и трансактивирует репортерный ген, что приводит к увеличению экспрессии белка-репортера. Для детекции ER ТА могут использовать различные репортерные системы. В системе с использованием люциферазы, фермент люцифераза превращает субстрат люциферин в люминесцентный продукт, который можно количественно определить на люминометре. Другими примерами обычно используемых репортеров являются флюоресцентные белки и LacZ ген, кодирующий , фермент, трансформирующий бесцветный субстрат X-gal (5-бромо-4-хлоро-индолил-галактопиранозид) в продукт синего цвета, который можно количественно измерить на спектрофотометре. Имеются коммерческие наборы для малозатратного и быстрого определения данных репортеров.

2.3. Валидизационные исследования STTA и BG1Luc ТА-тестирования продемонстрировали их применимость и надежность для предлагаемой области применения. Функциональные требования к тестам ER ТА с использованием люминесценции и клеточных линий производных от клеток яичников включены в ICCVAM Отчет по оценке метода тестирования (BG1Luc ER ТА): in vitro метод для определения химических веществ - hER агонистов и антагонистов. Эти функциональные требования подверглись модификации, чтобы быть применимыми в обоих методах тестирования: STTA и BG1Luc ТА.

3. Назначение и ограничения ТА-анализа

3.1. Данные методы тестирования предложены для скрининговой оценки веществ и выбора приоритетных для дальнейших исследований. Методы основаны на ТА, вызванной связыванием тестируемого вещества с эстрогеновыми рецепторами (ER) in vitro. Соответственно, результаты тестирования нельзя напрямую переносить на передачу сигналов и регуляцию в интактной эндокринной системе in vivo.

3.2. Активация транскрипции (ТА), опосредованная ER, считается одним из ключевых механизмов действия эндокринных разрушителей (ЭР) на организм, хотя существуют и другие пути действия ЭР. Они включают:

- действие через другие ядерные рецепторы, связанные с эндокринной системой и сте- роидогенными ферментами;

- метаболическую активацию или инактивацию гормонов;

- распределение гормонов в тканях-мишенях;

- элиминацию гормонов.

Ни один из методов тестирования, представленных в настоящем документе, не предназначен для рассмотрения этих возможных механизмов действия.

3.3. Настоящий документ рассматривает выявление веществ, способных активировать (т.е. действовать в качестве агонистов), а не подавлять ER-зависимую транскрипцию (т.е. действовать в качестве антагонистов). Поэтому вещества, классифицированные как отрицательные рассматриваемыми методами тестирования, необходимо протестировать на связывание с ER или использовать тест, способный определять ER-антагонистов, прежде чем полагать, что вещество не связывается с рецептором. Вдобавок, данные методы, вероятнее всего, позволят оценить ER-агонистическую активность только исходного вещества, поскольку способности in vitro клеточных систем метаболизировать исходное вещество сильно ограничены. При валидизации метода использовались только индивидуальные вещества, пригодность метода для тестирования смесей веществ не изучалась.

3.4. В порядке информации в табл. 6.6.3.1 представлены результаты для 34 веществ, проанализированных в ходе валидизации обоих методов тестирования, описанных в настоящих методических рекомендациях. Из этих веществ 26 классифицируются как безусловные ER-агонисты и 8 - как отрицательные на основании данных опубликованных отчетов, в том числе in vitro анализов связывания вещества с ER, результатов ТА и/или утеротропного анализа. Относительно веществ, представленных в табл. 6.6.3.1, имелось 100%-е соответствие между двумя методами тестирования применительно к классификации всех веществ. Каждое вещество было правильно классифицировано как ER-агонист, или как ER-антагонист. Дополнительная информация по этой группе веществ, равно как и других дополнительных веществ, протестированных методами STTA и BG1Luc ER ТА в ходе валидизационных исследований, представлена в Стандартах эффективности для ER ТА [Performance Standards for the ERTA] и в прилож. 6.6.3.1 (табл. 6.6.3.1.1, 6.6.3.1.2 и 6.6.3.1.3).

4. Описание ER ТА-метода тестирования

4.1. Необходимые составляющие метода тестирования

Настоящий документ применим к методам тестирования, использующим стабильно трансфицированный или эндогенный и стабильно трансфицированный конструкт, содержащий ген-репортер под контролем одного или нескольких эстроген-эффекторных элементов, тем не менее могут присутствовать и другие рецепторы, такие как . Перечисленные являются необходимыми составляющими метода тестирования.

4.2. Контрольные вещества

Должны быть представлены основания для одновременно используемых контролей и референсного эстрогена. Одновременные контроли (отрицательный, положительный и контроль растворителя) служат для подтверждения того, что метод тестирования работает в данной конкретной постановке, и служат основой для сравнения проводимых тестирований друг с другом. Обычно контроли являются одним из критериев проверки приемлемости каждого конкретного тестирования.

4.3. Стандартная процедура контроля качества

Стандартная процедура контроля качества должна выполняться в соответствии с протоколом при каждом тестировании, чтобы гарантировать, что клеточная линия продолжает оставаться стабильной на протяжении многих пассажей, остается незараженной микоплазмой и сохраняет способность выдавать ожидаемый ER-опосредованный ответ. Соответствие характеристик клеточной линии должно подтверждаться дополнительными проверками, также необходимы проверки на отсутствие других заражений (например, грибами, дрожжами и вирусами).

4.4. Подтверждение технической компетентности лаборатории

Прежде чем приступить к тестированию неизвестных веществ любым из методов каждая лаборатория должна продемонстрировать необходимое владение используемым методом путем тестирования 14 веществ из списка оценки технической компетентности (табл. 6.6.3.2). Даная проверка технической компетентности также служит подтверждением чувствительности тест-системы. Вещества для оценки технической компетентности являются выборкой из списка "Референсных веществ", представленных в стандартах эффективности для ER ТА-анализа. Эти вещества коммерчески доступны, представляют классы химических веществ, обычно связанных с ER-агонистической активностью, попадают в подходящий диапазон активности ER-aгoнистов: от сильных до слабых и до отрицательных. Тестирование этих веществ должно проводиться, как минимум, в двух независимых повторностях, причем в различные дни. Техническая компетентность заключается в правильной классификации (положительное/отрицательное) каждого из 14 веществ. Каждый работник при обучении методам тестирования должен проходить подтверждение технической компетентности.

Таблица 6.6.3.1

Сравнение результатов STTA и BG1Luc ER ТА-анализа для веществ, проверенных обоими методами тестирования и классифицированных как положительные (ER-агонисты) или как отрицательные

N	Вещество	CASRN	STTA-анализ*(4)			BG1Luc ER ТА-анализ*(5)		Данные для классификации*(7)
			ER TA-активность	РС10 (М)	PC50*(2) (М)	ER TA-активность	ЕС50*(2), *(6) (М)	Другие ER TAs*(3)	ER-связы- вание	Утеротроп- ность
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
1	Эстрадиол*(1)	50-28-2	POS			POS		POS (227/227)	POS	POS
2	Эстрадиол*(1)	57-91-0	POS			POS		POS(11/11)	POS	POS
3	Этинилэстрадиол*(1)	57-63-6	POS			POS		POS(22/22)	POS	POS
4		10161-33-8	POS			POS		POS (2/2)	NT	NT
5	19-Нортестостерон*(1)	434-22-0	POS			POS		POS(4/4)	POS	POS
6	4-Кумилфенол*(1)	599-64-4	POS			POS		POS(5/5)	POS	NT
7	4-tert-Октилфенол*(1)	140-66-9	POS			POS		POS(21/24)	POS	POS
8	Апегинин*(1)	520-36-5	POS			POS		POS(26/26)	POS	NT
9	Атразин*(1)	1912-24-9	NEG	-	-	NEG	-	NEG (30/30)	NEG	NT
10	Бисфенол А*(1)	80-05-7	POS			POS		POS(65/65)	POS	POS
11	Бисфенол1 Б*(1)	77-40-7	POS			POS		POS(6/6)	POS	POS
12	Бутилбензил фталат*(1)	85-68-7	POS			POS		POS(12/14)	POS	NEG
13	Кортикостерон*(1)	50-22-6	NEG	-	-	NEG	-	NEG( 6/6)	NEG	NT
14	Куместрол*(1)	479-13-0	POS			POS		POS(30/30)	POS	NT
15	Даидзеин*(1)	486-66-8	POS			POS		POS(39/39)	POS	POS
16	Диэтилстилбестрол*(1)	56-53-1	POS			POS		POS(42/42)	POS	NT
17	Ди-н-бутилфталат	84-74-2	POS			POS		POS(6/11)	POS	NEG
18	Этилпарабен	120-47-8	POS		(по )	POS		POS		NT
19	Эстрон*(1)	53-16-7	POS			POS		POS(26/28)	POS	POS
20	Генистеин*(1)	446-72-0	POS			POS		POS(100/102)	POS	POS
21	Галоперидол	52-86-8	NEG	-	-	NEG	-	NEG (2/2)	NEG	NT
22	Кемпферол*(1)	520-18-3	POS			POS		POS(23/23)	POS	NT
23	Кепон*(1)	143-50-0	POS			POS		POS(14/18)	POS	NT
24	Кетоконазол	65277-42-1	NEG	-	-	NEG	-	NEG (2/2)	NEG	NT
25	Линурон*(1)	330-55-2	NEG	-	-	NEG	-	NEG (8/8)	NEG	NT
26	meso-Геесестрол*(1)	84-16-2	POS			POS		POS(4/4)	POS	NT
27	Метилтестостерон*(1)	58-18-4	POS			POS		POS(5/6)	POS	NT
28	Морин	480-16-0	POS			POS		POS(2/2)	POS	NT
29	Норэтинодрел*(1)	68-23-5	POS			POS		POS(5/5)	POS	NT
30	р,р'-Метоксихлор*(1)	72-43-5	POS		(no PC50)*(2)	POS		POS(24/27)	POS	POS
31	ФенобарбиталI*(1)	57-30-7	NEG	-	-	NEG	-	NEG(2/2)	NEG	NT
32	Резерпин	50-55-5	NEG	-	-	NEG	-	NEG(4/4)	NEG	NT
33	Спиронолактон*(1)	52-01-7	NEG	-	-	NEG	-	NEG(4/4)	NEG	NT
34	Тестостерон	58-22-0	POS			POS		POS(5/10)	POS	NT

Сокращения:

CAS RN = Chemical Abstracts Service Registry Number;

M = молярность;

EC50 = среднеэффективная концентрация исследуемого вещества;

NEG = отрицательный ответ;

POS = положительный ответ;

PC10 и РС50 = концентрация тестируемого вещества, при которой ответ составляет соответственно 10 или 50% от величины ответа, вызванного положительным контролем (Е2, 1nМ) на каждом планшете.

______________________________

*(1) Химические вещества, проверявшиеся методами STTA и BG1Luc ER ТА-анализа, которые были классифицированы как положительные (ER-агонисты) или отрицательные, и использовались в валидизационном исследовании BG1 Luc ER ТА-анализа для оценки точности метода (ICCVAM BG1Luc ER ТА Evaluation Report, Table 4-10 [3].

*(2) Максимальная концентрация, проверявшаяся в случае отсутствия цитотоксичности и нерастворимости вещества, составляла М (для STTA-анализа) и М (для BGlLuc ER ТА-анализа).

*(3) Число в скобках представляет количество результатов, классифицированных как положительные (POS) или отрицательные (NEG), из общего числа проведенных референсных исследований.

*(4) Значения, приведенные в черновом Отчете по пре-валидизации и в отчете по межлабораторной валидизации STTA-анализа для определения эстрогенной активности - Анализ трансактивации гена-репортера, опосредованный рецептором , с использованием клеточной линии hER-HeLa-9903 [30]

*(5) ICCVAM Отчет по оценке метода тестирования (BG1Luc ER ТА): In Vitro метод для определения ER-агонистов и антагонистов [3]

*(6) Средние значения ЕС50 рассчитывались на основе данных, предоставленных лабораториями, проводившими валидизацию BG1Luc ER ТА-анализа (XDS, ECVAM,and Hiyoshi) [3].

*(7) Классификация вещества как проявляющего положительный эффект (ER-агониста) (POS) или не проявляющего такой эффект (отрицательный) (NEG), основывалась на информации, содержащейся в ICCVAM Обзоре литературы по методам тестирования связывания с ER и по методам ТА [31, 32], а также на информации, полученной из публикаций, вышедших и рассматривавшихся после завершения ICCVAM BRDs [3, 18, 30, 32, 33, 34, 35].

Таблица 6.6.3.2

Список 14 референсных веществ для оценки технической компетентности*(8)

N*(7)	Химическое название	CAS RN	Ожидаемый эффект*(1)	STTA-анализ			BG1Luc ER ТА-анализ		Класс химического вещества по MeSH*(5)	Тип продукции*(6)
				РС10 значение (М)*(2)	РС50 значение (М)*(2)	Диапазон проверявшихся концентраций (М)	Bg1Luc ЕС50 значение (М)*(3)	Максимальная концентрация при оценке диапазона (М)*(4)
14	Диэтилстибестрол	56-53-1	POS						Углеводород (циклический)	Фармацевтическое, Ветеринарное средство
12		57-91-0	POS						Стероид	Фармацевтическое, Ветеринарное средство
15	meso-Гексестрол	84-16-2	POS						Углеводород (циклический), фенол	Фармацевтическое, Ветеринарное средство
11	4-tert-Октилфенол	140-66-9	POS						Фенол	Промежуточный химический продукт
9	Генистеин	446-72-0	POS						Флавоноид, Гетероциклическое соединение	Природное, Фармацевтическое средство
6	Бисфенол А	80-05-7	POS						Фенол	Промежуточный хи- мический продукт
2	Кемпферол	520-18-3	POS						Флавоноид, Гетероциклическое соединение	Природный продукт
3	Бутилбензилфталат	85-68-7	POS						Карбоновая кислота, Эфир, Фталевая кислота	Пластификатор, Промышленное вещество
4	р,р'-Метоксихлор	72-43-5	POS		-				Углеводород (галоге- нированный)	Пестицид, Ветеринарный препарат
1	Этилпарабен	120-47-8	POS		-				Карбоновая кислота, Фенол	Фармпрепарат, Консервант
17	Атразин	1912-24-9	NEG	-	-		-		Гетероциклическое соединение	Гербицид
20	Спиронолактон	52-01-7	NEG	-	-		-		Лактон, Стероид	Фармпрепарат
21	Кетоконазол	65277-42-1	NEG	-	-		-		Гетероциклическое соединение	Фармпрепарат
22	Резерпин	50-55-5	NEG	-	-		-		Гетероциклическое соединение, Индол	Фармацевтическое, Ветеринарное средство

Сокращения:

CAS RN = Chemical Abstracts Service Registry Number;

M = молярность;

ЕС50 = среднеэффективная концентрация исследуемого вещества;

NEG = отрицательный ответ;

POS = положительный ответ;

PC10 и РС50 = концентрация тестируемого вещества, при которой ответ составляет соответственно 10 или 50% от величины ответа, вызванного положит