Приложение 6.7.3. Исследование нейротоксичности на грызунах

Приложение 6.7.3

Исследование нейротоксичности на грызунах

Идентичен международному документу OECD TG N 424 "Neurotoxicity Study in Rodents" (ОЭСР Руководство N 424 "Исследование нейротоксичности на грызунах"). Принят 21 июля 1997 г. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. При исследовании и количественной оценке токсикологических характеристик химических веществ важно рассматривать потенциальные нейротоксические эффекты. Руководства по испытанию токсичности повторной дозы уже включают наблюдения для оценки нейротоксичности. Настоящий метод исследования может быть использован для проведения исследований по получению дополнительной информации или для подтверждения наличия нейротоксических реакций, наблюдаемых при исследовании соматической токсичности повторной дозы. Однако в ряде случаев (при рассмотрении вопроса о возможной нейротоксичности некоторых классов химических веществ) можно предположить, что нейротоксичность более уместно оценивать только с помощью настоящего руководства без предварительного выявления потенциальной нейротоксичности при испытаниях системной токсичности при повторном воздействии вещества. Подобные случаи включают:

1.1.1. Наблюдение неврологических симптомов или нейропатологических поражений в испытаниях токсичности, за исключением исследований токсичности повторных доз.

1.1.2. Наличие структурных особенностей или иных сведений, позволяющих отнести исследуемые вещества к известным нейротоксикантам.

1.1.3. Могут быть и другие случаи, когда использование настоящего метода является приемлемым; более подробная информация представлена в Рекомендациях по стратегиям и методам испытания нейротоксичности.

1.2. Настоящий метод по испытанию нейротоксичности предназначен для выявления основных нейроповеденческих и нейропатологических реакций у половозрелых особей грызунов.

1.3. Исследования, представленные в настоящем методе, предназначены для получения характеристики и количественного описания нейротоксических реакций и включают в себя определенные гистопатологические и поведенческие процедуры, результаты которых могут в дальнейшем дополнительно подтверждаться электрофизиологическими и/или биохимическими исследованиями.

1.4. В настоящем исследовании нейротоксичности, при использовании отдельно или в сочетании с другими испытаниями, может быть получена информация, позволяющая:

- определить, является ли поражение нервной системы в результате воздействия химического вещества обратимым;

- получить характеристику изменений нервной системы, связанных с воздействием химического вещества, и понимание основного механизма воздействия;

- получить описание зависимостей доза-эффект и время-эффект для оценки NOAEL (который может быть использован для установления критериев безопасности химического вещества).

2. Общие положения

2.1. Настоящий метод исследования разработан с учетом возможности их адаптации к проведению конкретных процедур, необходимых для подтверждения специфической гистопатологической и поведенческой нейротоксичности химического вещества, а также для получения характеристики и количественного описания нейротоксических реакций.

2.2. В прошлом нейротоксичность приравнивалась к нейропатии, включающей нейропатологические поражения или неврологические нарушения, такие как припадки, параличи или тремор. Несмотря на то что нейропатия является важным проявлением нейротоксичности, в настоящее время понятно, что существует множество других признаков токсического поражения нервной системы (например: потеря координации движений, дефицит сенсорных реакций, дисфункции способности к обучению и памяти), которые могут не выявляться в испытаниях на нейропатию и других исследованиях.

2.3. В то время как поведенческие реакции, даже при отсутствии морфологических изменений, могут отражать негативное воздействие на организм, не все изменения в поведении характерны для нервной системы. Таким образом, любые наблюдаемые изменения следует оценивать в сочетании с соответствующими гистопатологическими, гематологическими и биохимическими данными, а также данными о других видах соматической токсичности.

2.4. Нейротоксиканты могут воздействовать на несколько мишеней в нервной системе с разным механизмом действия. Поскольку ни один набор тестов не способен полностью оценить потенциальное нейротоксическое действие всех веществ, может быть необходимо использование другие in vivo или in vitro методов, специфичных для наблюдаемого или ожидаемого типа нейротоксичности.

2.5. Настоящий метод может использоваться в сочетании с руководством по стратегиям и методам испытания нейротоксичности для разработки исследований, направленных на получение подробной характеристики или повышения чувствительности количественного определения доза-ответ для более точной оценки уровня воздействия, при котором не наблюдается никаких неблагоприятных эффектов (NOAEL), или обоснования известных или предполагаемых опасностей химических веществ. Например, исследования могут быть проведены для определения и оценки нейротоксических механизмов или дополнения уже имеющихся данных с использованием основных нейроповеденческих и нейропатологических процедур наблюдения. Такие исследования не требуют повторного получения данных, которые могут быть получены с использованием стандартных процедур, рекомендованных в настоящем руководстве, если такие данные уже существуют и не являются необходимыми для интерпретации результатов исследования.

2.6. Основное внимание уделяется пероральному способу введения, как наиболее распространенному. Другие пути поступления (например, накожный и ингаляционный) могут быть более приемлемыми, но это потребует изменения экспериментальных процедур. Выбор пути введения (поступления) исследуемого вещества в организм животного зависит от пути воздействия на человека и имеющихся токсикологических и кинетических данных.

3. Описание тестового метода

3.1. Принципы

3.1.1. Исследуемое вещество вводят перорально нескольким группам лабораторных животных в определенном диапазоне доз. Обычно требуется также введение повторных доз, и период дозирования может составлять 28 дней, 90 дней для испытания подострой токсичности или 1 год и более для испытания хронической токсичности. Процедуры, изложенные в настоящем стандарте, также могут использоваться для испытания острой нейротоксичности. Животных испытывают для обнаружения и описания характеристик поведенческих и/или неврологических отклонений. В течение каждого периода наблюдения оценивается целый ряд моделей поведения, которые могут быть обусловлены действием нейротоксикантов. По окончании испытания выборку животных каждого пола из каждой группы подвергают перфузии in situ, и отделы головного мозга, спинного мозга и периферических нервов препарируют и исследуют.

3.1.2. Когда испытание проводится как отдельное исследование для выявления нейротоксичности или получения характеристик нейротоксического действия, животные из каждой группы, не используемые для перфузии и последующего гистопатологического обследования (табл. 6.7.3.1), могут использоваться для проведения определенных нейроповеденческих, нейропатологических, нейрохимических и электрофизиологических процедур, позволяющих дополнить данные, полученные в стандартных испытаниях. Данные дополнительные процедуры могут быть особенно полезными, когда эмпирические наблюдения и ожидаемые реакции указывают на конкретный тип нейротоксичности или воздействие на определенный орган-мишень. В ином случае, остальные животные могут быть использованы для оценок, подобных предусмотренным руководствами по проведению испытаний токсичности повторных доз на грызунах.

3.1.3. В случае, когда процедуры, предусмотренные в настоящем методе, проводятся в сочетании с другими испытаниями, необходимо использовать количество животных, достаточное для удовлетворения требований к проведению всех испытаний.

3.2. Животные

Выбор вида

3.2.1. Необходимо использовать молодых здоровых особей из обычно используемых лабораторных линий. Предпочтительно использовать крыс. В случае использования других видов необходимо привести обоснование.

Подготовка

3.2.2. Следует использовать животных обоих полов. Самки должны быть нерожавшими и небеременными. Испытание, как правило, начинают как можно раньше после прекращения грудного вскармливания. На день экспозиции испытываемого препарата животные должны быть в возрасте до 9 недель (предпочтительно - 6 недель), диапазон колебания массы животных для каждого пола не должен превышать от средней массы животных. Животные отбираются в случайном порядке и маркируются, что позволит идентифицировать каждое из них. Животных следует содержать в клетках в течение не менее 5 дней до начала испытания, чтобы позволить им адаптироваться к лабораторным условиям.

Содержание

3.2.3. Температура в помещении, где содержатся экспериментальные животные, должна составлять , оптимальный уровень относительной влажности - 50-60%, допустимый - 30-70%, превышение данного уровня допустимо во время уборки помещения. Животных можно содержать отдельно или размещать в клетках небольшими группами одного пола, но число животных в клетке не должно затруднять возможность наблюдать за каждым из них, а также должно сократить вероятность потерь из-за каннибализма и борьбы. Допустимо использование стандартных лабораторных режимов питания. На выбор диеты (при получении исследуемого вещества с пищей) может повлиять необходимость обеспечения подходящего содержания исследуемого вещества в пище. Освещение должно быть искусственным в режиме 12 часов при свете, 12 часов в темноте. Громкий переменный шум необходимо свести к минимуму.

3.3. Группы доз и дозировка

Количественный и гендерный состав групп

3.3.1. При проведении самостоятельного испытания в каждой группе дозирования и контрольной группе необходимо использовать, как минимум, по 20 животных (10 женских и 10 мужских особей) для проведения подробного клинического обследования и функциональных тестов. По крайней мере, 5 мужских и 5 женских особей, отобранных из данных 10 мужских и 10 женских особей, подвергают перфузии in situ и используют для подробного нейрогистопатологического исследования в конце испытания. В случаях, когда только ограниченное число животных из данной группы дозирования наблюдают на наличие признаков нейротоксического действия, следует рассмотреть вопрос о включении данных животных группы для перфузии. Когда исследование проводится в сочетании с испытанием токсичности повторной дозы, необходимо использовать достаточное количество животных для достижения целей обоих исследований. Минимальное количество животных в группе для различных комбинаций исследований приведено в табл. 6.7.3.1. Если планируется проводить промежуточные умерщвления животных, наблюдения обратимости нейротоксических эффектов в группах восстановления или сохранения/появления отложенных эффектов после воздействия или иные дополнительные наблюдения, количество животных должно быть увеличено для возможности проведения соответствующих наблюдений и гистопатологического обследования.

Опытные и контрольные группы

3.3.2. Необходимо использовать, как минимум, три группы дозирования и контрольную группу, но если на основании оценки имеющихся данных появление какой-либо реакции при повторной дозе 1 000 мг/кг массы тела/сутки не ожидается, может быть проведено тестирование с использованием предельной дозы. Если соответствующие данные не доступны, проводится исследование по выбору диапазона доз, которые будут использоваться в основном испытании. За исключением введения исследуемого вещества, с животными из контрольной группы следует обращаться также, как с животными из экспериментальных групп. Если для введения исследуемого вещества используется растворитель, контрольная группа должна получать его в максимальном используемом объеме.

Проверка достоверности тестирования

3.3.3. Лаборатория, проводящая испытание, должна представить данные, подтверждающие возможность проводить подобные исследования и оценивать чувствительность используемых процедур. Такие данные должны свидетельствовать о возможности выявления и, при необходимости, количественной оценки изменений в различных объектах исследования испытания, рекомендуемых для наблюдения, таких как автономные признаки, сенсорные реакции, сила сцепления конечностей и двигательная активность.

3.3.4. Информация о химических веществах, которые вызывают различные виды нейротоксических реакций и могут использоваться в качестве положительного контроля, представлена в документах по ссылкам 9-16. Данные предыдущих исследований могут быть использованы, если основные аспекты экспериментальных процедур остаются неизменными. Рекомендуется проводить периодическое обновление информации предыдущих исследований. Новые данные, подтверждающие чувствительность экспериментальных процедур, должны разрабатываться, когда некоторые основные элементы проведения испытания или процедуры были изменены испытательной лабораторией.

Выбор доз

3.3.5. Уровни доз должны подбираться с учетом любых полученных ранее данных о токсичности и кинетических данных для исследуемого вещества или родственных соединений. Максимальный уровень дозы должен быть выбран с целью индуцирования нейротоксического действия или очевидного соматического токсического эффекта. Таким образом, убывающая последовательность доз должна быть выбрана таким образом, чтобы продемонстрировать любой эффект, зависимый от дозы, и при наименьшей дозе - уровень воздействия, при котором не наблюдается никаких неблагоприятных эффектов (NOAEL). В общем случае, уровень дозы должен быть установлен таким образом, чтобы основное токсическое воздействие на нервную систему можно было отличить от признаков, относящихся к соматической токсичности. Наиболее оптимальными являются двух- и трехкратные интервалы, и добавление четвертой тестовой группы часто предпочтительнее использования значительных интервалов между уровнями доз (например, более чем десятикратных). В случае, когда существует обоснованная оценка воздействия на человека, ее следует также принимать во внимание.

Предельная доза

3.3.6. Если исследование с одним уровнем дозы не менее 1 000 мг/кг массы тела/сутки с использованием описанных процедур не приводит к появлению видимого нейротоксического действия и если, исходя из данных для структурно родственных веществ, появление признаков токсичности не ожидается, нет необходимости проводить полное исследование с использованием трех уровней доз. Ожидаемое воздействие на человека может указывать на необходимость использования в исследовании предельной дозы более высокой дозы при пероральном пути поступления. Для других путей поступления (ингаляционном и дермальном) максимально достижимый уровень дозы часто может определяться исходя из физико-химических свойств исследуемого вещества. В испытании острой токсичности при пероральном пути поступления предельная доза должна составлять не менее 2 000 мг/кг.

3.4. Введение исследуемого вещества

3.4.1. Тестовым животным вводят исследуемое вещество ежедневно (семь дней в неделю) в течение не менее 28 дней. Использование пятидневного режима дозирования или более короткого периода дозирования должно быть обосновано.

3.4.2. Если исследуемое вещество вводят через желудочный зонд, животным необходимо вводить однократную дозу с помощью желудочной трубки или подходящей интубационной канюли. Максимальный объем жидкости, который может быть введен за один раз, зависит от размера тестовых животных. Объем не должен превышать 1 мл на 100 г массы тела животного. В случае водных растворов, может быть приемлемо введение до 2 мл на 100 г массы тела. За исключением случаев раздражающих или едких веществ, которые, как правило, оказывают в высоких концентрациях раздражающее действие, изменения тестового объема должны быть минимизированы путем выравнивания концентраций для обеспечения постоянного объема для всех доз.

3.4.3. Для веществ, которые вводятся с пищей или питьевой водой, важно гарантировать, что вводимые количества исследуемого вещества не препятствуют нормальному питанию или не нарушают водный баланс.

3.4.4. Когда вещество вводится с пищей, то может использоваться либо постоянная пищевая концентрация (ррm), либо постоянный уровень дозы по отношению к массе животного; использование альтернативного варианта должно быть обосновано. Для веществ, вводящихся через зонд, доза должна вводиться в одно и то же время каждый день и обеспечивать поддержание постоянной дозы по отношению к массе животного. В случае, когда кратковременное испытание повторной дозы проводится в качестве предварительного перед долгосрочным исследованием, в обоих исследованиях необходимо использовать аналогичные диеты. В испытаниях острой токсичности, когда введение разовой дозы не представляется возможным, доза может вводиться более мелкими фракциями в течение не более 24 часов.

4. Наблюдение

4.1. Частота проведения наблюдений и тестов

4.1.1. В исследованиях повторной дозы период наблюдений должен охватывать весь период дозирования. В исследованиях острой токсичности наблюдения необходимо проводить в 14-дневный период после дозирования. Для животных в сопутствующих группах, находящихся без воздействия в период после дозирования, наблюдения должны охватывать этот период.

4.1.2. Наблюдения необходимо проводить с достаточной частотой так, чтобы вероятность обнаружения любого поведенческого и/или неврологического отклонения была максимальной. Желательно проводить наблюдения каждый день в одно и то же время с учетом возможного пикового периода ожидаемого эффекта после дозирования. Частота клинических наблюдений и функциональных тестов представлена в табл. 6.7.3.2. Если кинетические или другие данные, полученные в предыдущих испытаниях, указывают на необходимость использования других временных интервалов для проведения наблюдений, тестов или последующих периодов, в испытании используют альтернативный график в целях получения максимальной информации. Изменение графика испытаний должно быть обосновано.

4.2. Наблюдения за общим состоянием здоровья, смертностью, заболеваемостью

4.2.1. Подробное клиническое обследование необходимо проводить для всех животных, отобранных для этой цели (табл. 6.7.3.1) один раз перед первым введением исследуемого вещества (для проведения сравнений внутри группы) и в различные периоды после в зависимости от продолжительности испытания (табл. 6.7.3.2). Подробное клиническое обследование в сопутствующих группах восстановления должно проводиться по истечении периода восстановления, вне клетки содержания на стандартной площадке. Результаты обследования должны быть тщательно зарегистрированы с использованием системы подсчета, в которой предусмотрены критерии или количественные шкалы для каждого измерения в обследовании. Используемые критерии или шкалы должны быть четко определены испытательной лабораторией.

4.2.2. Необходимо обеспечить минимальное изменение условий проведения испытания (непосредственно не связанных с обработкой животных), обследование должно проводиться квалифицированными наблюдателями, не участвующими в настоящем испытании.

4.2.3. Рекомендуется проводить обследования структурированно, так чтобы четко определенные критерии (включая определение "нормального" состояния) систематически применялись для каждого животного в любое время обследования. "Нормальное" состояние должно быть надлежащим образом зарегистрировано. Все наблюдаемые признаки должны быть зарегистрированы. По возможности необходимо также сообщать величины наблюдаемых признаков. Клиническое обследование должно включать, но не ограничиваться, изучение изменений кожи, меха, глаз, слизистых оболочек, появление выделений и экскрементов и вегетативной активности (например: слезотечение, пилоэрекция, изменение размеров зрачка, необычный способ дыхания и/или дыхание через рот, любые нестандартные признаки мочеиспускания или дефекации, а также обесцвечивание мочи).

4.2.4. Любые необычные результаты в отношении положения тела, уровня активности (например, снижение или повышение интереса к исследованию стандартной площадки) и координации движений также необходимо регистрировать. Изменения в походке (например, раскачивающаяся походка, атаксия), позы (например, прогиб в спине) и реакции на обращение, размещение или другие раздражители окружающей среды, а также наличие клонических или тонизирующих движений, судорог и дрожи, стереотипии (например, чрезмерная чистоплотность, необычные движения головой, хождение по кругу), аномальное поведение (например, укусы или чрезмерное вылизывание, самоповреждение, хождение задом, вокализация) или агрессия должны быть зарегистрированы.

4.3. Функциональные тесты

4.3.1. Подобно детальным клиническим обследованиям, функциональные тесты необходимо проводить один раз до введения исследуемого вещества и с определенной частотой после введения исследуемого вещества для всех животных, отобранных для этой цели (табл. 6.7.3.1). Частота проведения функциональных тестов также зависит от продолжительности испытания (табл. 6.7.3.2). В дополнение к периодам наблюдения, указанным в табл. 6.7.3.2, функциональное обследование для сопутствующей группы восстановления также должно проводиться как можно ближе к запланированному времени умерщвления животных. Функциональные тесты должны включать в себя проверку сенсорной реакции на раздражители различных модальностей (например: слуховые, зрительные и проприоцептивные раздражители), оценку силы сцепления конечностей и оценку двигательной активности. Двигательная активность должна быть измерена с помощью автоматического устройства, способного обнаруживать как уменьшение, так и увеличение активности. Любая используемая система оценок должна быть количественной, должны быть подтверждены и продемонстрированы ее чувствительность и достоверность. Каждый используемый прибор должен быть проверен для гарантии надежности показаний во времени и согласованности с другими устройствами. Более подробная информация о процедурах, которые можно использовать, приведена в соответствующих документам (см. ссылки). Если существуют другие данные (например, о зависимости структуpa-активность, эпидемиологические данные других токсикологических исследований) для демонстрации потенциального нейротоксического действия, необходимо рассматривать включение в испытание специализированных тестов для сенсорных и моторных функций или обучения и памяти для изучения возможных подобных последствий. Более подробная информация о специализированных тестах и их использовании представлена в руководстве по стратегиям и методам проведения испытаний нейротоксичности.

4.3.2. В редких случаях животных, которые демонстрируют признаки токсичности в степени, оказывающей значительное влияние на результаты функциональных тестов, можно исключить из проведения функциональных тестов. Исключение животных из функциональных тестов должно быть обосновано.

4.4. Масса тела, потребление пищи/воды

При продолжительности эксперимента до 90 дней все животные должны взвешиваться, как минимум, раз в неделю. То же относится к измерению потребления пищи и воды (в случае поступления исследуемого вещества с водой). При исследовании большей продолжительности, как минимум, раз в неделю первые 13 недель и ежемесячно в дальнейшем. Измерения потребления пищи и воды следует производить еженедельно первые 13 недель и, как минимум, ежемесячно в дальнейшем. Измерения потребления пищи и воды следует проводить еженедельно первые 13 недель и затем примерно раз в 3 месяца, если состояние здоровья животных и изменений массы тела не предполагают другой периодичности.

4.5. Офтальмологическое обследование

4.5.1. В исследовании продолжительностью более 28 дней офтальмологический осмотр с использованием офтальмоскопа или другого подходящего инструмента следует проводить до первого введения исследуемого вещества и по окончании исследования всем животным или, как минимум, группам с высокими дозами и контрольной группе. Если обнаружены изменения, имеющие отношение к терапии, следует осмотреть всех животных. Если структурный анализ или другие данные говорят об офтальмологической токсичности, тогда частота офтальмологических осмотров должна быть увеличена. Для долгосрочных испытаний офтальмологическое обследование также должно проводиться на 13-й неделе испытания.

4.5.2. Офтальмологическое обследование не проводится, если подобные данные уже доступны из других исследований с аналогичной продолжительностью и для аналогичных доз.

4.6. Гематология и клиническая биохимия

4.6.1. В случае, когда испытание нейротоксичности проводится в сочетании с испытанием соматической токсичности повторной дозы, гематологические исследования и клиническая биохимия должны быть проведены в соответствии с руководством по испытанию соматической токсичности повторной дозы.

4.6.2. Отбор проб должен производиться таким образом, чтобы любые потенциальные нейроповеденческие эффекты были минимизированы.

4.7. Гистопатология

4.7.1. Нейропатологическое обследование должно быть разработано таким образом, чтобы дополнить и расширить результаты наблюдений, полученные во время стадии испытания in vivo. Ткани, по крайней мере, 5 животных/пола/группы (табл. 6.7.3.1) должны быть зафиксированы in situ, с использованием общепризнанных техник перфузии и методов фиксации. Любые изменения веса тканей должны быть зарегистрированы. Когда исследование проводится как отдельное испытание для выявления нейротоксичности или характеристики нейротоксического действия, остальные животные также могут