Приложение 6.7.3. Исследование нейротоксичности на грызунах

Приложение 6.7.3

Исследование нейротоксичности на грызунах

Идентичен международному документу OECD TG N 424 "Neurotoxicity Study in Rodents" (ОЭСР Руководство N 424 "Исследование нейротоксичности на грызунах"). Принят 21 июля 1997 г. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. При исследовании и количественной оценке токсикологических характеристик химических веществ важно рассматривать потенциальные нейротоксические эффекты. Руководства по испытанию токсичности повторной дозы уже включают наблюдения для оценки нейротоксичности. Настоящий метод исследования может быть использован для проведения исследований по получению дополнительной информации или для подтверждения наличия нейротоксических реакций, наблюдаемых при исследовании соматической токсичности повторной дозы. Однако в ряде случаев (при рассмотрении вопроса о возможной нейротоксичности некоторых классов химических веществ) можно предположить, что нейротоксичность более уместно оценивать только с помощью настоящего руководства без предварительного выявления потенциальной нейротоксичности при испытаниях системной токсичности при повторном воздействии вещества. Подобные случаи включают:

1.1.1. Наблюдение неврологических симптомов или нейропатологических поражений в испытаниях токсичности, за исключением исследований токсичности повторных доз.

1.1.2. Наличие структурных особенностей или иных сведений, позволяющих отнести исследуемые вещества к известным нейротоксикантам.

1.1.3. Могут быть и другие случаи, когда использование настоящего метода является приемлемым; более подробная информация представлена в Рекомендациях по стратегиям и методам испытания нейротоксичности.

1.2. Настоящий метод по испытанию нейротоксичности предназначен для выявления основных нейроповеденческих и нейропатологических реакций у половозрелых особей грызунов.

1.3. Исследования, представленные в настоящем методе, предназначены для получения характеристики и количественного описания нейротоксических реакций и включают в себя определенные гистопатологические и поведенческие процедуры, результаты которых могут в дальнейшем дополнительно подтверждаться электрофизиологическими и/или биохимическими исследованиями.

1.4. В настоящем исследовании нейротоксичности, при использовании отдельно или в сочетании с другими испытаниями, может быть получена информация, позволяющая:

- определить, является ли поражение нервной системы в результате воздействия химического вещества обратимым;

- получить характеристику изменений нервной системы, связанных с воздействием химического вещества, и понимание основного механизма воздействия;

- получить описание зависимостей доза-эффект и время-эффект для оценки NOAEL (который может быть использован для установления критериев безопасности химического вещества).

2. Общие положения

2.1. Настоящий метод исследования разработан с учетом возможности их адаптации к проведению конкретных процедур, необходимых для подтверждения специфической гистопатологической и поведенческой нейротоксичности химического вещества, а также для получения характеристики и количественного описания нейротоксических реакций.

2.2. В прошлом нейротоксичность приравнивалась к нейропатии, включающей нейропатологические поражения или неврологические нарушения, такие как припадки, параличи или тремор. Несмотря на то что нейропатия является важным проявлением нейротоксичности, в настоящее время понятно, что существует множество других признаков токсического поражения нервной системы (например: потеря координации движений, дефицит сенсорных реакций, дисфункции способности к обучению и памяти), которые могут не выявляться в испытаниях на нейропатию и других исследованиях.

2.3. В то время как поведенческие реакции, даже при отсутствии морфологических изменений, могут отражать негативное воздействие на организм, не все изменения в поведении характерны для нервной системы. Таким образом, любые наблюдаемые изменения следует оценивать в сочетании с соответствующими гистопатологическими, гематологическими и биохимическими данными, а также данными о других видах соматической токсичности.

2.4. Нейротоксиканты могут воздействовать на несколько мишеней в нервной системе с разным механизмом действия. Поскольку ни один набор тестов не способен полностью оценить потенциальное нейротоксическое действие всех веществ, может быть необходимо использование другие in vivo или in vitro методов, специфичных для наблюдаемого или ожидаемого типа нейротоксичности.

2.5. Настоящий метод может использоваться в сочетании с руководством по стратегиям и методам испытания нейротоксичности для разработки исследований, направленных на получение подробной характеристики или повышения чувствительности количественного определения доза-ответ для более точной оценки уровня воздействия, при котором не наблюдается никаких неблагоприятных эффектов (NOAEL), или обоснования известных или предполагаемых опасностей химических веществ. Например, исследования могут быть проведены для определения и оценки нейротоксических механизмов или дополнения уже имеющихся данных с использованием основных нейроповеденческих и нейропатологических процедур наблюдения. Такие исследования не требуют повторного получения данных, которые могут быть получены с использованием стандартных процедур, рекомендованных в настоящем руководстве, если такие данные уже существуют и не являются необходимыми для интерпретации результатов исследования.

2.6. Основное внимание уделяется пероральному способу введения, как наиболее распространенному. Другие пути поступления (например, накожный и ингаляционный) могут быть более приемлемыми, но это потребует изменения экспериментальных процедур. Выбор пути введения (поступления) исследуемого вещества в организм животного зависит от пути воздействия на человека и имеющихся токсикологических и кинетических данных.

3. Описание тестового метода

3.1. Принципы

3.1.1. Исследуемое вещество вводят перорально нескольким группам лабораторных животных в определенном диапазоне доз. Обычно требуется также введение повторных доз, и период дозирования может составлять 28 дней, 90 дней для испытания подострой токсичности или 1 год и более для испытания хронической токсичности. Процедуры, изложенные в настоящем стандарте, также могут использоваться для испытания острой нейротоксичности. Животных испытывают для обнаружения и описания характеристик поведенческих и/или неврологических отклонений. В течение каждого периода наблюдения оценивается целый ряд моделей поведения, которые могут быть обусловлены действием нейротоксикантов. По окончании испытания выборку животных каждого пола из каждой группы подвергают перфузии in situ, и отделы головного мозга, спинного мозга и периферических нервов препарируют и исследуют.

3.1.2. Когда испытание проводится как отдельное исследование для выявления нейротоксичности или получения характеристик нейротоксического действия, животные из каждой группы, не используемые для перфузии и последующего гистопатологического обследования (табл. 6.7.3.1), могут использоваться для проведения определенных нейроповеденческих, нейропатологических, нейрохимических и электрофизиологических процедур, позволяющих дополнить данные, полученные в стандартных испытаниях. Данные дополнительные процедуры могут быть особенно полезными, когда эмпирические наблюдения и ожидаемые реакции указывают на конкретный тип нейротоксичности или воздействие на определенный орган-мишень. В ином случае, остальные животные могут быть использованы для оценок, подобных предусмотренным руководствами по проведению испытаний токсичности повторных доз на грызунах.

3.1.3. В случае, когда процедуры, предусмотренные в настоящем методе, проводятся в сочетании с другими испытаниями, необходимо использовать количество животных, достаточное для удовлетворения требований к проведению всех испытаний.

3.2. Животные

Выбор вида

3.2.1. Необходимо использовать молодых здоровых особей из обычно используемых лабораторных линий. Предпочтительно использовать крыс. В случае использования других видов необходимо привести обоснование.

Подготовка

3.2.2. Следует использовать животных обоих полов. Самки должны быть нерожавшими и небеременными. Испытание, как правило, начинают как можно раньше после прекращения грудного вскармливания. На день экспозиции испытываемого препарата животные должны быть в возрасте до 9 недель (предпочтительно - 6 недель), диапазон колебания массы животных для каждого пола не должен превышать от средней массы животных. Животные отбираются в случайном порядке и маркируются, что позволит идентифицировать каждое из них. Животных следует содержать в клетках в течение не менее 5 дней до начала испытания, чтобы позволить им адаптироваться к лабораторным условиям.

Содержание

3.2.3. Температура в помещении, где содержатся экспериментальные животные, должна составлять , оптимальный уровень относительной влажности - 50-60%, допустимый - 30-70%, превышение данного уровня допустимо во время уборки помещения. Животных можно содержать отдельно или размещать в клетках небольшими группами одного пола, но число животных в клетке не должно затруднять возможность наблюдать за каждым из них, а также должно сократить вероятность потерь из-за каннибализма и борьбы. Допустимо использование стандартных лабораторных режимов питания. На выбор диеты (при получении исследуемого вещества с пищей) может повлиять необходимость обеспечения подходящего содержания исследуемого вещества в пище. Освещение должно быть искусственным в режиме 12 часов при свете, 12 часов в темноте. Громкий переменный шум необходимо свести к минимуму.

3.3. Группы доз и дозировка

Количественный и гендерный состав групп

3.3.1. При проведении самостоятельного испытания в каждой группе дозирования и контрольной группе необходимо использовать, как минимум, по 20 животных (10 женских и 10 мужских особей) для проведения подробного клинического обследования и функциональных тестов. По крайней мере, 5 мужских и 5 женских особей, отобранных из данных 10 мужских и 10 женских особей, подвергают перфузии in situ и используют для подробного нейрогистопатологического исследования в конце испытания. В случаях, когда только ограниченное число животных из данной группы дозирования наблюдают на наличие признаков нейротоксического действия, следует рассмотреть вопрос о включении данных животных группы для перфузии. Когда исследование проводится в сочетании с испытанием токсичности повторной дозы, необходимо использовать достаточное количество животных для достижения целей обоих исследований. Минимальное количество животных в группе для различных комбинаций исследований приведено в табл. 6.7.3.1. Если планируется проводить промежуточные умерщвления животных, наблюдения обратимости нейротоксических эффектов в группах восстановления или сохранения/появления отложенных эффектов после воздействия или иные дополнительные наблюдения, количество животных должно быть увеличено для возможности проведения соответствующих наблюдений и гистопатологического обследования.

Опытные и контрольные группы

3.3.2. Необходимо использовать, как минимум, три группы дозирования и контрольную группу, но если на основании оценки имеющихся данных появление какой-либо реакции при повторной дозе 1 000 мг/кг массы тела/сутки не ожидается, может быть проведено тестирование с использованием предельной дозы. Если соответствующие данные не доступны, проводится исследование по выбору диапазона доз, которые будут использоваться в основном испытании. За исключением введения исследуемого вещества, с животными из контрольной группы следует обращаться также, как с животными из экспериментальных групп. Если для введения исследуемого вещества используется растворитель, контрольная группа должна получать его в максимальном используемом объеме.

Проверка достоверности тестирования

3.3.3. Лаборатория, проводящая испытание, должна представить данные, подтверждающие возможность проводить подобные исследования и оценивать чувствительность используемых процедур. Такие данные должны свидетельствовать о возможности выявления и, при необходимости, количественной оценки изменений в различных объектах исследования испытания, рекомендуемых для наблюдения, таких как автономные признаки, сенсорные реакции, сила сцепления конечностей и двигательная активность.

3.3.4. Информация о химических веществах, которые вызывают различные виды нейротоксических реакций и могут использоваться в качестве положительного контроля, представлена в документах по ссылкам 9-16. Данные предыдущих исследований могут быть использованы, если основные аспекты экспериментальных процедур остаются неизменными. Рекомендуется проводить периодическое обновление информации предыдущих исследований. Новые данные, подтверждающие чувствительность экспериментальных процедур, должны разрабатываться, когда некоторые основные элементы проведения испытания или процедуры были изменены испытательной лабораторией.

Выбор доз

3.3.5. Уровни доз должны подбираться с учетом любых полученных ранее данных о токсичности и кинетических данных для исследуемого вещества или родственных соединений. Максимальный уровень дозы должен быть выбран с целью индуцирования нейротоксического действия или очевидного соматического токсического эффекта. Таким образом, убывающая последовательность доз должна быть выбрана таким образом, чтобы продемонстрировать любой эффект, зависимый от дозы, и при наименьшей дозе - уровень воздействия, при котором не наблюдается никаких неблагоприятных эффектов (NOAEL). В общем случае, уровень дозы должен быть установлен таким образом, чтобы основное токсическое воздействие на нервную систему можно было отличить от признаков, относящихся к соматической токсичности. Наиболее оптимальными являются двух- и трехкратные интервалы, и добавление четвертой тестовой группы часто предпочтительнее использования значительных интервалов между уровнями доз (например, более чем десятикратных). В случае, когда существует обоснованная оценка воздействия на человека, ее следует также принимать во внимание.

Предельная доза

3.3.6. Если исследование с одним уровнем дозы не менее 1 000 мг/кг массы тела/сутки с использованием описанных процедур не приводит к появлению видимого нейротоксического действия и если, исходя из данных для структурно родственных веществ, появление признаков токсичности не ожидается, нет необходимости проводить полное исследование с использованием трех уровней доз. Ожидаемое воздействие на человека может указывать на необходимость использования в исследовании предельной дозы более высокой дозы при пероральном пути поступления. Для других путей поступления (ингаляционном и дермальном) максимально достижимый уровень дозы часто может определяться исходя из физико-химических свойств исследуемого вещества. В испытании острой токсичности при пероральном пути поступления предельная доза должна составлять не менее 2 000 мг/кг.

3.4. Введение исследуемого вещества

3.4.1. Тестовым животным вводят исследуемое вещество ежедневно (семь дней в неделю) в течение не менее 28 дней. Использование пятидневного режима дозирования или более короткого периода дозирования должно быть обосновано.

3.4.2. Если исследуемое вещество вводят через желудочный зонд, животным необходимо вводить однократную дозу с помощью желудочной трубки или подходящей интубационной канюли. Максимальный объем жидкости, который может быть введен за один раз, зависит от размера тестовых животных. Объем не должен превышать 1 мл на 100 г массы тела животного. В случае водных растворов, может быть приемлемо введение до 2 мл на 100 г массы тела. За исключением случаев раздражающих или едких веществ, которые, как правило, оказывают в высоких концентрациях раздражающее действие, изменения тестового объема должны быть минимизированы путем выравнивания концентраций для обеспечения постоянного объема для всех доз.

3.4.3. Для веществ, которые вводятся с пищей или питьевой водой, важно гарантировать, что вводимые количества исследуемого вещества не препятствуют нормальному питанию или не нарушают водный баланс.

3.4.4. Когда вещество вводится с пищей, то может использоваться либо постоянная пищевая концентрация (ррm), либо постоянный уровень дозы по отношению к массе животного; использование альтернативного варианта должно быть обосновано. Для веществ, вводящихся через зонд, доза должна вводиться в одно и то же время каждый день и обеспечивать поддержание постоянной дозы по отношению к массе животного. В случае, когда кратковременное испытание повторной дозы проводится в качестве предварительного перед долгосрочным исследованием, в обоих исследованиях необходимо использовать аналогичные диеты. В испытаниях острой токсичности, когда введение разовой дозы не представляется возможным, доза может вводиться более мелкими фракциями в течение не более 24 часов.

4. Наблюдение

4.1. Частота проведения наблюдений и тестов

4.1.1. В исследованиях повторной дозы период наблюдений должен охватывать весь период дозирования. В исследованиях острой токсичности наблюдения необходимо проводить в 14-дневный период после дозирования. Для животных в сопутствующих группах, находящихся без воздействия в период после дозирования, наблюдения должны охватывать этот период.

4.1.2. Наблюдения необходимо проводить с достаточной частотой так, чтобы вероятность обнаружения любого поведенческого и/или неврологического отклонения была максимальной. Желательно проводить наблюдения каждый день в одно и то же время с учетом возможного пикового периода ожидаемого эффекта после дозирования. Частота клинических наблюдений и функциональных тестов представлена в табл. 6.7.3.2. Если кинетические или другие данные, полученные в предыдущих испытаниях, указывают на необходимость использования других временных интервалов для проведения наблюдений, тестов или последующих периодов, в испытании используют альтернативный график в целях получения максимальной информации. Изменение графика испытаний должно быть обосновано.

4.2. Наблюдения за общим состоянием здоровья, смертностью, заболеваемостью

4.2.1. Подробное клиническое обследование необходимо проводить для всех животных, отобранных для этой цели (табл. 6.7.3.1) один раз перед первым введением исследуемого вещества (для проведения сравнений внутри группы) и в различные периоды после в зависимости от продолжительности испытания (табл. 6.7.3.2). Подробное клиническое обследование в сопутствующих группах восстановления должно проводиться по истечении периода восстановления, вне клетки содержания на стандартной площадке. Результаты обследования должны быть тщательно зарегистрированы с использованием системы подсчета, в которой предусмотрены критерии или количественные шкалы для каждого измерения в обследовании. Используемые критерии или шкалы должны быть четко определены испытательной лабораторией.

4.2.2. Необходимо обеспечить минимальное изменение условий проведения испытания (непосредственно не связанных с обработкой животных), обследование должно проводиться квалифицированными наблюдателями, не участвующими в настоящем испытании.

4.2.3. Рекомендуется проводить обследования структурированно, так чтобы четко определенные критерии (включая определение "нормального" состояния) систематически применялись для каждого животного в любое время обследования. "Нормальное" состояние должно быть надлежащим образом зарегистрировано. Все наблюдаемые признаки должны быть зарегистрированы. По возможности необходимо также сообщать величины наблюдаемых признаков. Клиническое обследование должно включать, но не ограничиваться, изучение изменений кожи, меха, глаз, слизистых оболочек, появление выделений и экскрементов и вегетативной активности (например: слезотечение, пилоэрекция, изменение размеров зрачка, необычный способ дыхания и/или дыхание через рот, любые нестандартные признаки мочеиспускания или дефекации, а также обесцвечивание мочи).

4.2.4. Любые необычные результаты в отношении положения тела, уровня активности (например, снижение или повышение интереса к исследованию стандартной площадки) и координации движений также необходимо регистрировать. Изменения в походке (например, раскачивающаяся походка, атаксия), позы (например, прогиб в спине) и реакции на обращение, размещение или другие раздражители окружающей среды, а также наличие клонических или тонизирующих движений, судорог и дрожи, стереотипии (например, чрезмерная чистоплотность, необычные движения головой, хождение по кругу), аномальное поведение (например, укусы или чрезмерное вылизывание, самоповреждение, хождение задом, вокализация) или агрессия должны быть зарегистрированы.

4.3. Функциональные тесты

4.3.1. Подобно детальным клиническим обследованиям, функциональные тесты необходимо проводить один раз до введения исследуемого вещества и с определенной частотой после введения исследуемого вещества для всех животных, отобранных для этой цели (табл. 6.7.3.1). Частота проведения функциональных тестов также зависит от продолжительности испытания (табл. 6.7.3.2). В дополнение к периодам наблюдения, указанным в табл. 6.7.3.2, функциональное обследование для сопутствующей группы восстановления также должно проводиться как можно ближе к запланированному времени умерщвления животных. Функциональные тесты должны включать в себя проверку сенсорной реакции на раздражители различных модальностей (например: слуховые, зрительные и проприоцептивные раздражители), оценку силы сцепления конечностей и оценку двигательной активности. Двигательная активность должна быть измерена с помощью автоматического устройства, способного обнаруживать как уменьшение, так и увеличение активности. Любая используемая система оценок должна быть количественной, должны быть подтверждены и продемонстрированы ее чувствительность и достоверность. Каждый используемый прибор должен быть проверен для гарантии надежности показаний во времени и согласованности с другими устройствами. Более подробная информация о процедурах, которые можно использовать, приведена в соответствующих документам (см. ссылки). Если существуют другие данные (например, о зависимости структуpa-активность, эпидемиологические данные других токсикологических исследований) для демонстрации потенциального нейротоксического действия, необходимо рассматривать включение в испытание специализированных тестов для сенсорных и моторных функций или обучения и памяти для изучения возможных подобных последствий. Более подробная информация о специализированных тестах и их использовании представлена в руководстве по стратегиям и методам проведения испытаний нейротоксичности.

4.3.2. В редких случаях животных, которые демонстрируют признаки токсичности в степени, оказывающей значительное влияние на результаты функциональных тестов, можно исключить из проведения функциональных тестов. Исключение животных из функциональных тестов должно быть обосновано.

4.4. Масса тела, потребление пищи/воды

При продолжительности эксперимента до 90 дней все животные должны взвешиваться, как минимум, раз в неделю. То же относится к измерению потребления пищи и воды (в случае поступления исследуемого вещества с водой). При исследовании большей продолжительности, как минимум, раз в неделю первые 13 недель и ежемесячно в дальнейшем. Измерения потребления пищи и воды следует производить еженедельно первые 13 недель и, как минимум, ежемесячно в дальнейшем. Измерения потребления пищи и воды следует проводить еженедельно первые 13 недель и затем примерно раз в 3 месяца, если состояние здоровья животных и изменений массы тела не предполагают другой периодичности.

4.5. Офтальмологическое обследование

4.5.1. В исследовании продолжительностью более 28 дней офтальмологический осмотр с использованием офтальмоскопа или другого подходящего инструмента следует проводить до первого введения исследуемого вещества и по окончании исследования всем животным или, как минимум, группам с высокими дозами и контрольной группе. Если обнаружены изменения, имеющие отношение к терапии, следует осмотреть всех животных. Если структурный анализ или другие данные говорят об офтальмологической токсичности, тогда частота офтальмологических осмотров должна быть увеличена. Для долгосрочных испытаний офтальмологическое обследование также должно проводиться на 13-й неделе испытания.

4.5.2. Офтальмологическое обследование не проводится, если подобные данные уже доступны из других исследований с аналогичной продолжительностью и для аналогичных доз.

4.6. Гематология и клиническая биохимия

4.6.1. В случае, когда испытание нейротоксичности проводится в сочетании с испытанием соматической токсичности повторной дозы, гематологические исследования и клиническая биохимия должны быть проведены в соответствии с руководством по испытанию соматической токсичности повторной дозы.

4.6.2. Отбор проб должен производиться таким образом, чтобы любые потенциальные нейроповеденческие эффекты были минимизированы.

4.7. Гистопатология

4.7.1. Нейропатологическое обследование должно быть разработано таким образом, чтобы дополнить и расширить результаты наблюдений, полученные во время стадии испытания in vivo. Ткани, по крайней мере, 5 животных/пола/группы (табл. 6.7.3.1) должны быть зафиксированы in situ, с использованием общепризнанных техник перфузии и методов фиксации. Любые изменения веса тканей должны быть зарегистрированы. Когда исследование проводится как отдельное испытание для выявления нейротоксичности или характеристики нейротоксического действия, остальные животные также могут быть использованы либо для проведения конкретных нейроповеденческих, нейропатологических, нейрохимических и электрофизиологических процедур, которые могут дополнить представленные в настоящем руководстве процедуры и обследования, либо для гистопатологических обследований. Проведение дополнительных процедур особенно полезно, когда эмпирические наблюдения и ожидаемые эффекты указывают на конкретный тип нейротоксичности или наличие органа-мишени. Кроме того, остальные животные могут также использоваться для стандартных патологических оценок, как описано в руководстве по испытанию токсичности повторной дозы.

4.7.2. Общая процедура окрашивания, например, гематоксилин-эозином, должна быть выполнена для всех образцов тканей, зафиксированных в парафине, затем должны быть проведены микроскопические обследования. Если наблюдается или ожидается появление признаков периферической нейропатии, должны быть обследованы закрепленные в пластике образцы периферической нервной ткани. Клинические признаки могут также свидетельствовать о необходимости осмотра дополнительных тканей или использования специальных процедур окрашивания.

4.7.3. Может быть полезным использование соответствующих специальных красителей для демонстрации конкретных видов патологических изменений.

4.7.4. Гистологическое исследование должно быть проведено для отделов центральной и периферической нервной системы. Обследуемые области, как правило, должны включать: передний мозг, центральный отдел головного мозга, в том числе рассечение гиппокампа, средний мозг, мозжечок, варолиев мост, продолговатый мозг, глаза, зрительный нерв, сетчатку, спинной мозг на шейном и поясничном отделах позвоночника, дорсальные корешковые ганглии, волокна дорсального и вентрального корешков, проксимальный конец седалищного нерва, проксимальный конец большеберцового нерва (в колене) и ветви большеберцового нерва в икроножных мышцах. Спинной мозг и отделы периферической нервной системы должны быть представлены в виде крестовых или поперечных и продольных срезов. Необходимо уделить внимание сосудам нервной системы. Также необходимо обследовать образец скелетных мышц, особенно икроножных мышц. Особое внимание следует уделить участкам с клеточной и волокнистой структурой и отделам ЦНС и ПНС, подверженным известному влиянию нейротоксинов.

4.7.5. Рекомендуется проводить поэтапное изучение образцов тканей. Если при сравнении образцов тканей из групп с высокой дозой с контрольными образцами не выявляются никакие нейропатологические изменения, дальнейший анализ не требуется. Если нейропатологические изменения наблюдаются в группе с высокой дозой, образцы от каждой из потенциально пораженных тканей из групп со средней и низкой дозой должны быть отмечены и последовательно осмотрены.

4.7.6. Если какие-либо доказательства нейропатологических изменений получены при качественном осмотре, второй осмотр должен проводиться для всех отделов нервной системы, демонстрирующих такие изменения. Потенциально пораженные ткани из всех групп дозирования должны быть закодированы и осмотрены в случайном порядке без раскрытия кода. Частота и тяжесть каждого поражения должны быть зарегистрированы. После оценки всех тканей от всех групп дозирования код раскрывается, и проводится статистический анализ с целью получения описания зависимости доза-эффект. Примеры различных степеней тяжести каждого поражения должны быть описаны.

4.7.7. Нейропатологические результаты следует оценивать в контексте поведенческих наблюдений и измерений, а также с учетом других данных предыдущих и параллельных испытаний соматической токсичности исследуемого вещества.

5. Данные и отчет

5.1. Данные об испытании

5.1.1. Данные по каждому животному должны быть представлены по всем оцениваемым параметрам в табличной форме с указанием для каждой исследуемой группы: количества животных в начале исследования; количества животных, найденных мертвыми во время исследования, или умерщвлённых по гуманным соображениям, времени смерти или любого гуманного умерщвления; количества демонстрируемых признаков токсичности; описания наблюдаемых признаков токсичности, в том числе времени начала, продолжительности и тяжести любого токсического воздействия; количества животных с поражениями, типов поражений и процентов животных относительно каждого типа поражения.

5.1.2. Результаты исследования должны быть оценены с точки зрения частоты, тяжести и корреляции нейроповеденческих и нейропатологических эффектов (а также нейрохимических и электрофизиологических эффектов при проведении дополнительных наблюдений) и любых других наблюдаемых побочных эффектов.

5.1.3. При необходимости численные результаты должны быть оценены надлежащим и в целом приемлемым статистическим методом. Статистические методы и данные для анализа должны выбираться в ходе разработки исследования.

5.2 Отчет об испытании

Отчёт об исследовании должен содержать следующую информацию:

Исследуемое вещество:

- физическая природа, чистота и физико-химические свойства;

- идентификационные данные;

- источник вещества;

- номер партии;

- сертификат химического анализа.

Растворитель (при необходимости):

- обоснование выбора среды (если это не вода).

Подопытные животные:

- вид/род и обоснование сделанного выбора;

- число, возраст, пол в начале исследования;

- происхождение, условия содержания, питание и так далее;

- вес каждого животного в начале исследования.

Данные об условиях проведения исследования:

- обоснование метода введения и выбора дозы;

- по необходимости, статистические методики, используемые для анализа данных;

- подробное описание приготовления состава тестируемого вещества /пищи;

- аналитические данные по достигнутой концентрации, стабильности и гомогенности препарата;

- способ введения вещества и подробное описание введения исследуемого вещества;

- при ингаляционных исследованиях: был ли задействован только нос или все тело;

- фактическая доза (мг/кг в день) и переводной коэффициент от концентрации исследуемого вещества в пище/питьевой воде к фактической дозе, если возможно;

- качество пищи и воды.

Наблюдение и процедура испытания:

- подробная информация о распределении животных из каждой группы в подгруппы для перфузии;

- система подсчета, включая критерии и шкалы для каждого измерения в подробных клинических наблюдениях;

- сведения о функциональных испытаниях на сенсорную реакцию и раздражители различных модальностей (например, слуховые, зрительные и проприоцептивные); для оценки конечностей - сила сцепления; для оценки двигательной активности (в том числе описание автоматических устройств для обнаружения активности), а также другие используемые процедуры;

- подробная информация об офтальмологическом обследовании и, если необходимо, гематологических исследованиях и испытаниях по клинической биохимии с указанием соответствующих начальных значений;

- описание специальных нейроповеденческих, нейропатологических, нейрохимических и электрофизиологических процедур.

Результаты:

- Общие:

- данные о выживших;

- масса/изменения массы;

- потребление пищи, подсчёт энергетической ценности, если проведён, и потребление воды, если возможно;

- токсикокинетические данные (если возможно);

- офтальмология (если возможно);

- гематология (если возможно);

- клиническая биохимия (если возможно).

- Клинические результаты:

- признаки токсичности;

- охват (и, если выявлена, тяжесть) любой аномалии;

- характер, точность и продолжительность клинических наблюдений (были они промежуточными или постоянными);

- подробное описание всех функциональных результатов испытания;

- подробное описание всех нейроповеденческих, нейропатологических и нейрохимических и электрофизиологических результатов (при наличии);

- данные об абсорбции и метаболизме (при наличии);

Данные аутопсии, гистопатология;

Статистическая обработка результатов (при необходимости).

Изучение результатов:

- соотношение зависимости доза-эффект;

- отношение любых других токсических эффектов к выводу о нейротоксическом потенциале исследуемого вещества;

- определение NOAEL.

Выводы:

- конкретный вывод об общей нейротоксичности исследуемого вещества (рекомендуется).

6. Таблицы для определения минимального количества животных в группах и частоты проведения клинических обследований и функциональных тестов

Таблица 6.7.3.1

Минимальное количество животных в группе при проведении испытания нейротоксичности отдельно или в сочетании с другими исследованиями

	Испытание нейротоксичности проводится
	как отдельное испытание	в сочетании с 28-дневным испытанием	в сочетании с 90-дневным испытанием	в сочетании с испытанием хронической токсичности
Общее количество животных в группе	По 10 самцов и самок	По 10 самцов и самок	По 15 самцов и самок	По 25 самцов и самок
Количество животных, отобранных для проведения функциональных тестов, в том числе подробного клинического обследования	По 10 самцов и самок	По 10 самцов и самок	По 10 самцов и самок	По 10 самцов и самок
Количество животных, отобранных для перфузии in situ и нейрогистопатологии	По 5 самцов и самок	По 5 самцов и самок	По 5 самцов и самок	По 5 самцов и самок
Количество животных, отобранных для испытаний токсичности повторной дозы, субхронической и хронической токсичности, гематологии, клинической биохимии, гистопатологии и прочого согласно соответствующим руководящим документам		По 5 самцов и самок	По 10* самцов и самок	По 20* самцов и самок
Дополнительные наблюдения, при необходимости	По 5 самцов и самок
* В том числе 5 животных, отобранных для функциональных тестов и клинических обследований как части испытания нейротоксичности

Таблица 6.7.3.2

Частота проведения клинических обследований и функциональных тестов

Тип наблюдений		Продолжительность исследования
		острое	28-дневное	90-дневное	хроническое
На всех животных	Общее состояние здоровья	ежедневно	ежедневно	ежедневно	ежедневно
	Смертность/агония	два раза в день	два раза в день	два раза в день	два раза в день
На животных, отобранных для функциональных наблюдений	Подробные клинические обследования	- перед первым воздействием; - в течение 8 часов воздействия в планируемое время пика воздействия; -на 7-й и 14-й дни после воздействия	- перед первым воздействием; - затем один раз в неделю	- перед первым воздействием; - один раз в течение первой или второй недели воздействия; - затем ежемесячно	- перед первым воздействием; - один раз по окончании первого месяца воздействия; - затем каждые три месяца
	Функциональные тесты	- перед первым воздействием; - в течение 8 часов воздействия в планируемое время пика воздействия; - на 7-й и 14-й дни после воздействия	- перед первым воздействием; - во время четвертой недели воздействия как можно ближе к концу периода воздействия	- перед первым воздействием; - один раз в течение первой или второй недели воздействия; - затем ежемесячно	- перед первым воздействием; - один раз по окончании первого месяца воздействия; - затем каждые три месяца