Приложение 6.8.1. Метод оценки обратных мутаций на бактериях

Приложение 6.8.1

Метод оценки обратных мутаций на бактериях

Идентичен международному документу OECD TG N 471 "Bacterial Reverse Mutation Test" (ОЭСР Руководство N 471 "Метод оценки обратных мутаций на бактериях"). Принят 21 июля 1997 года. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD)).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает порядок проведения испытания химических веществ в тесте оценки обратных мутаций на бактериях с применением прокариотных клеток, которые отличаются от клеток млекопитающих такими особенностями, как поступление, метаболизм, структура хромосомы и процессы репарации ДНК. Тестирование in vitro, как правило, требует использования экзогенных источников метаболической активации. Системы метаболической активации in vitro не могут полностью имитировать условия метаболизма у млекопитающих in vivo. Таким образом, метод не дает прямой информации по мутагенному и канцерогенному потенциалу химического вещества в отношении млекопитающих.

1.2. Метод оценки обратных мутаций на бактериях обычно используется на начальном этапе скрининга генотоксической активности, в особенности при оценке индукции точковых мутаций. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что большинство химических веществ, у которых выявлен мутагенный эффект в данном тесте, показывают мутагенную активность в других тестах. В то же время имеются примеры мутагенных соединений, которые не были выявлены в данном тесте. Причина этого явления может быть связана со специфической природой определяемого события, различиями в метаболической активации и биодоступности. С другой стороны, факторы, которые повышают чувствительность метода оценки обратных мутаций у бактерий, могут привести к переоценке мутагенного потенциала тестируемого соединения.

1.3. Метод оценки обратных мутаций у бактерий может не подходить для оценки определенных классов химических веществ, например, веществ с сильной бактерицидной активностью (некоторые антибиотики) или веществ, которые специфически воздействуют на систему репликации в клетках млекопитающих (ряд ингибиторов топоизомераз и ряд аналогов нуклеозидов). В таких случаях более адекватны тесты оценки мутагенности на млекопитающих.

1.4. Хотя многие соединения, которые показали мутагенный эффект в данном тесте, являются канцерогенами для млекопитающих, корреляция между двумя видами эффектов не абсолютна. Это связано с классом химического вещества. Имеются канцерогены, которые не выявляются в данном тесте, поскольку они действуют через другие негенотоксические механизмы или эти механизмы отсутствуют в бактериальных клетках.

2. Общие положения

2.1. Тест оценки обратных мутаций на бактериях проводят на зависимых от аминокислот штаммах Salmonella typhimurium и Escherichia coli для оценки точковых мутаций, возникающих вследствие замены пар оснований, вставки или делеции одной или нескольких пар оснований. Принцип метода - определение обратных мутаций у исследуемых штаммов, которые позволяют микроорганизмам синтезировать необходимую аминокислоту. Ревертантные бактерии выявляются по их способности расти на среде в отсутствии аминокислоты, необходимой для роста исходного штамма бактерии.

2.2. Точковые мутации - причина многих генетических заболеваний человека. Имеются убедительные данные, что точковые мутации в онкогенах и генах опухолевой супрессии соматических клеток вовлечены в процесс онкогенеза у человека и экспериментальных животных. Тест оценки обратных мутаций на бактериях не требует много времени, является недорогим и относительно несложным для проведения. Многие тест-штаммы несут изменения, которые делают их более чувствительными для выявления мутаций. Они включают: большую чувствительность последовательностей ДНК в сайтах реверсии, повышенную клеточную проницаемость, элиминацию систем репарации ДНК или повышение процесса склонной к ошибкам репарации ДНК. Специфичность тест-штаммов может дать полезную информацию по типам мутаций, индуцируемых генотоксическим агентом. Накопленные данные по результатам исследования широкого спектра структур показывают возможность использования метода оценки обратных мутаций на бактериях. Разработаны методики для исследования химических соединений с различными физико-химическими свойствами, включая летучие соединения.

3. Принцип метода

3.1. Суспензию бактериальных клеток экспонируют с исследуемым веществом в присутствии или отсутствии экзогенной системы метаболической активации. В варианте введения вещества на чашку (plate incorporation method) эту суспензию смешивают с верхним агаром и сразу выливают на чашку с минимальной средой. В преинкубационном варианте теста смесь предварительно инкубируют, затем смешивают с верхним агаром и выливают на слой минимальной среды. В обоих вариантах теста через два или три дня инкубации подсчитывают колонии ревертантов и сравнивают с числом колоний ревертантов на чашку в контроле с растворителем.

3.2. Описаны несколько вариантов оценки частоты обратных мутаций у бактерий. Среди них наиболее часто используют метод введения вещества на чашку, преинкубационный тест, флуктуационный тест и суспензионный метод.

3.3. Данный метод в основном касается вариантов введения вещества на чашку и преинкубационного. Оба подходят для проведения экспериментов в присутствии или в отсутствии метаболической активации. Некоторые вещества более корректно исследовать в преинкубационном тесте. Эти вещества относятся к химическим классам, которые включают короткие цепи алифатических нитрозаминов, бивалентные металлы, альдегиды, азокрасители и диазосоединения, пиролизидиновые алкалоиды, аллилсодержащие соединения и нитросоединения. Также показано, что некоторые классы мутагенов не всегда можно выявить используя стандартные процедуры, такие как метод введения вещества на чашку и преинкубационный тест. Они должны быть рассмотрены как "особые случаи" и для их определения строго рекомендуется использование альтернативных методов. К таким "особым случаям" могут быть отнесены (вместе с перечнем методов, которые могут использоваться для их определения): азокрасители и диазосоединения, газообразные и летучие химические вещества и гликозиды. Отклонение от стандартной процедуры должно быть научно обосновано.

4. Описание метода

4.1. Материалы

Бактерии

4.1.1. Свежие культуры бактерий должны быть выращены до состояния поздней экспоненциальной или ранней стабильной фазы роста (приблизительно клеток на мл). Культуры в поздней стабильной фазе не используются. Необходимо, чтобы культуры, используемые в эксперименте, содержали высокий титр жизнеспособных бактерий. Титр может быть установлен или из ранее установленных данных кривой роста, или в каждом опыте путем определения числа жизнеспособных клеток в экспериментальном посеве.

4.1.2. Рекомендуемая инкубационная температура 37°С.

4.1.3. Необходимо использовать минимум пять штаммов бактерий. Они должны включать четыре штамма Salmonella typhimurium (ТА1535; ТА1537 или ТА97; ТА98; ТА 100) для которых показано, что они дают надежный и воспроизводимый ответ в разных лабораториях. Эти четыре штамма Salmonella typhimurium имеют GC пары оснований в первичном сайте реверсии. Это значит, что они не могут выявлять ряд окисляющих мутагенов, соединения, вызывающие перекрестные сшивки, и гидразины. Такие вещества могут быть обнаружены в опытах на Escherichia coli WP2 или Salmonella typhimurium ТА 102, у которых есть АТ-пара оснований в первичном сайте реверсии.

4.1.4. Таким образом, рекомендуемая комбинация штаммов включает:

- Salmonella typhimurium ТА 1535;

- Salmonella typhimurium ТА 1537 или ТА97, или ТА97а;

- Salmonella typhimurium ТА98;

- Salmonella typhimurium ТА100;

- Escherichia coli WP2 uvrA или Escherichia coli WP2 uvrA (pKM101), или Salmonella typhimurium TA102.

4.1.5. Для определения мутагенов, вызывающих перекрестные сшивки, можно использовать штамм Salmonella typhimurium ТА102 или профицитные по репарации штаммы Escherichia coli (например, Escherichia coli WP2 или Escherichia coli WP2 (pKM101).

4.1.6. Необходимо использовать стандартные процедуры для ведения, хранения и проверки генотипов исходных штаммов. Потребность аминокислоты для роста следует проверять для каждой замороженной исходной культуры (гистидин для Salmonella typhimurium и триптофан для Escherichia coli). Также должны быть проверены другие фенотипические характеристики: присутствие или отсутствие плазмид R-фактора для соответствующих штаммов (резистентность к ампициллину у штаммов ТА98, ТА100 и ТА97а или ТА97, WP2 uvrA и WP2 uvrA (pKM101) и резистентность к ампициллину + тетрациклину у штамма ТА 102); присутствие специфических мутаций (rfa мутаций у штаммов Salmonella typhimurium по контролю чувствительности к кристаллическому фиолетовому (crystal violet) и uvrA мутации у Escherichia coli или uvrB мутации у Salmonella typhimurium по контролю чувствительности к ультрафиолетовому светлому (ultra-violet light). Также для каждого штамма нужно определять спонтанный уровень количества колоний ревертантов на чашку; он должен быть в пределах колебаний показателя в историческом контроле лаборатории и желательно в пределах колебания показателя по данным литературы.

Среды

4.1.7. Используют адекватные минимальный агар (например: содержащий Vogel-Bonner минимальную среду Е и глюкозу) и верхний агар, содержащий гистидин и биотин или триптофан, позволяющий бактериям пройти несколько клеточных делений.

Метаболическая активация

4.1.8. Бактерии должны подвергаться воздействию испытуемого вещества в вариантах с присутствием и отсутствием системы метаболической активации.

4.1.9. Обычно используется система, включающая кофакторы и постмитохондриальную фракцию печени крыс грызунов, которым вводят активирующие ферменты соединения, такие как Ароклор 1254 или комбинацию фенобарбитала и . Постмитохондриальную фракцию обычно используют в диапазоне концентраций от 5 до 30 объемных процентов смеси S9.

4.1.10. Выбор и условия использования системы метаболической активации может зависеть от класса испытуемого химического вещества. В некоторых случаях возможно использование более одной концентрации. Для азокрасителей и диазосоединений использование редуцированной системы метаболической активации может быть более подходящим.

Испытуемое вещество/подготовка препарата

4.1.11. Перед исследованием твердые испытуемые вещества должны быть растворены или суспендированы в подходящих растворителях или средах и разбавлены, если это необходимо. Жидкие испытуемые вещества можно добавлять непосредственно в тест-системы и/или разбавлять перед воздействием на бактерии. Следует использовать свежие препараты при отсутствии данных об их стабильности при хранении.

4.1.12. Растворитель/среда не должны допускать химической реакции с испытуемым веществом и не должны влиять на выживаемость бактерий и активность S9. Если помимо стандартных растворителей/сред используют другие, должны быть получены данные об их совместимости. Рекомендуется, по возможности, использование воды в качестве растворителя/среды. При исследовании нестабильных в воде веществ используемые органические растворители не должны содержать воду.

4.2. Условия испытания

Исследуемые концентрации

4.2.1. Важными критериями, принимаемыми во внимание при определении максимального количества испытуемого вещества, являются цитотоксичность и растворимость в смеси. Полезно в предварительном эксперименте определить токсичность и растворимость. Цитотоксичность можно оценить по снижению числа колоний ревертантов на чашку, отсутствию или уменьшению фонового газона или степенью выживаемости обработанных культур. Цитотоксичность вещества может меняться в присутствии системы метаболической активации. Нерастворимость выявляется как преципитация в конечной смеси в реальных условиях, выявляемая невооруженным глазом.

4.2.2. Рекомендуемая максимальная концентрация для растворимых нецитотоксичных веществ - 5 мг на чашку или 5 мкл на чашку. Для нецитотоксичных веществ, которые не растворимы в концентрациях 5 мг на чашку или 5 мкл на чашку, одна или более испытуемых концентраций должны быть нерастворимы в конечной тестируемой смеси. Вещества, которые цитотоксичны в концентрациях менее 5 мг на чашку или 5 мкл на чашку, должны быть испытаны в концентрации, ниже цитотоксичной. Преципитат не должен мешать подсчету.

4.2.3. Как минимум 5 разных анализируемых концентраций испытуемого вещества следует испытывать с шагом приблизительно в половину между тестируемыми точками для начального эксперимента. Меньшие интервалы могут быть использованы в тех случаях, когда исследуют зависимость концентрация-эффект.

4.2.4. Исследование концентраций выше 5 мг/чашка или 5 мкл/чашка может быть проведено, если тестируемые вещества содержат значительное количество потенциально мутагенных примесей.

Отрицательные и положительные контроли

4.2.5. Соответствующие штамм-специфичные положительные и отрицательные (растворитель/среда) контроли как в присутствии, так и без метаболической активации должны быть включены в каждое исследование. Должны быть отобраны концентрации положительных контролей, которые показывают эффективность ответа соответствующего штамма бактерий и системы метаболической активации.

4.2.6. Для вариантов с использованием системы метаболической активации, соединение положительного контроля следует отбирать с учетом типа бактериального штамма.

Примеры веществ для положительного контроля в вариантах с метаболической активацией

Вещество	Номер CAS	Номер EINECS
9,10-диметилантрацен	781-43-1	212-308-4
7,12-диметилбенз[а]антрацен	57-97-6	200-359-5
бензо[а]пирен	50-32-8	200-028-5
2-аминоантрацен	613-13-8	210-330-9
циклофосфамид	50-18-0
моногидрат циклофосфамида	6055-19-2	200-015-4

Примеры штамм-специфичных соединений для положительного контроля в вариантах без метаболической активации

Вещество	Номер CAS	Номер EINECS	Штамм
азид натрия	26628-22-8	247-852-1	ТА 1535 и ТА 100
2-нитрофлуарен	607-57-8	210-138-5	ТА 98
9-аминоакридин	90-45-9	201-995-6	ТА 1537, ТА 97 и ТА 97а
ICR 191	17070-45-0	241-129-4	ТА 1537, ТА 97 и ТА 97а
гидропероксид кумена	80-15-9	201-254-7	ТА 102
Митомицин С	50-07-7	200-008-6	WP2 uvrA H TA102
N-этил-N-нитро-N-нитрозогуанидин	70-25-7	200-730-1	WP2, WP2uvrA и WP2uvrA(pKM101)
4-нитрохинолин-1-оксид	56-57-5	200-281-1	WP2, WP2uvrA и WP2uvrA(pKM101)
Фурилфурамид (AF2)	3688-53-7		Плазмидосодержащие штаммы

Для положительного контроля могут быть использованы другие адекватные вещества. Использование в качестве положительного контроля других химических соединений родственных классов, если таковые имеются, допустимо.

Следует использовать отрицательные контроли с растворителем/средой без исследуемого вещества при введении тем же способом, что и экспериментальные варианты. К тому же отрицательные контроли при сравнении с историческим контролем, полученным в предыдущих экспериментах, могут показать, что побочные или мутагенные эффекты не индуцированы выбранным растворителем.

4.3. Проведение эксперимента

4.3.1. В методе введения вещества на чашку в варианте без метаболической активации обычно смешивают 0,05 мл или 0,1 мл раствора исследуемого вещества, 0,1 мл свежей бактериальной культуры (содержащей приблизительно жизнеспособных клеток) и 0,5 мл стерильного буферного раствора с 2,0 мл верхнего агара. В варианте с метаболической активацией обычно смешивают 0,5 мл микросомальной активирующей смеси, содержащей адекватное количество постмитохондриальной фракции (в диапазоне от 5 до 30% объема общей микросомальной активирующей смеси) с верхним агаром (2,0 мл) вместе с бактериями и раствором исследуемого вещества. Содержимое каждой пробирки смешивают и выливают на чашку на поверхность минимального агара. Верхнему агару нужно дать затвердеть перед инкубацией.

4.3.2. В преинкубационном варианте раствор вещества предварительно инкубируют с опытным штаммом бактерий (содержащим приблизительно жизнеспособных клеток) и стерильным буфером или микросомальной активирующей смесью (0,5 мл). Обычно смесь инкубируют в течение 20 мин или более при 30-37°С перед смешиванием с верхним агаром и выливанием на поверхность минимального агара. Обычно 0,05 или 0,1 мл раствора испытуемого вещества, 0,1 мл бактерий и 0,5 мл смеси S9 или стерильного буферного раствора смешивают с 2,0 мл верхнего агара. Пробирки должны быть аэрированы во время прединкубации с помощью аппарата для встряхивания.

4.3.3. Для адекватной оценки изменчивости следует использовать для каждого уровня доз по 3 чашки. Использование 2 чашек возможно при соответствующем научном обосновании. Случайная потеря чашки не обязательно делает опыт недействительным.

4.3.4. Газообразные или летучие вещества должны быть испытаны подходящими методами, например, в закрытом сосуде.

Инкубация

4.3.5. Все чашки в эксперименте должны быть инкубированы при 37°С в течение 48-72 ч. После инкубационного периода подсчитывают число колоний ревертантов на чашку.

5. Результаты и отчет

5.1. Обработка результатов

5.1.1. Результаты должны быть представлены как число колоний ревертантов на чашку. Следует привести число колоний ревертантов на чашку как в вариантах с отрицательным (контроль с растворителем и, если используется, необработанный контроль), так и с положительным контролем.

5.1.2. Число колоний ревертантов на каждую чашку, среднее число колоний на чашку и стандартное отклонение приводится для каждой дозы исследуемого вещества, положительного и отрицательного (необработанного и/или с растворителем) контролей.

5.1.3. Не требуется проверки четкого положительного результата. Сомнительные результаты следует уточнить в дальнейших исследованиях, используя модификацию условий тестирования. Отрицательные результаты нуждаются в подтверждении в каждом конкретном случае. В тех случаях, когда подтверждение отрицательного результата не требуется, должно быть предусмотрено научное обоснование.

5.1.4. Модификация параметров исследования, направленная на расширение предела условий, должна проводиться в последующих экспериментах. Параметры исследования, которые могут быть модифицированы, включают: интервал концентраций, метод обработки (введение вещества на чашку или прединкубация в жидкости) и условия метаболической активации.

Оценка и интерпретация результатов

5.1.5. Существует различные критерии для определения положительного результата, такие как зависимое от концентрации увеличение эффекта в исследуемом диапазоне концентраций и/или воспроизводимое увеличение числа колоний ревертантов на чашку при одной или более концентрациях, как минимум, на одном штамме с метаболической активацией или без нее. Биологическая значимость результатов должна быть рассмотрена в первую очередь. Статистические методы могут быть использованы как помощь при оценке результатов испытания. Однако статистическая значимость не должна быть единственным определяющим фактором для заключения о положительном эффекте.

5.1.6. Испытуемое вещество, результаты исследования которого не соответствуют вышеупомянутым критериям, рассматриваются как немутагенные в данном тесте.

5.1.7. Хотя в большинстве экспериментов получают четкие положительные или отрицательные результаты, в редких случаях совокупность данных не дает определенную оценку мутагенной активности испытуемого вещества. Результаты могут оставаться сомнительными или проблематичными независимо от числа повторов эксперимента.

5.1.8. Положительные результаты в тесте оценки обратных мутации на бактериях свидетельствуют о том, что вещество индуцирует точковые мутации типа замены пар оснований или сдвига рамки считывания в геноме Salmonella typhimurium и/или Escherichia coli. Отрицательные результаты показывают, что в условиях опыта испытуемое вещество не является мутагенным для тестируемых видов.

5.2. Отчет

Отчет испытания должен включать следующую информацию.

Исследуемое соединение:

- идентификационные данные и CAS по (если известны);

- физическая природа и степень химической очистки;

- физико-химические свойства, относящиеся к проведению исследования;

- стабильность соединения (если известна).

Растворитель/среда:

- обоснование выбора растворителя/среды;

- растворимость и стабильность испытуемого вещества в растворителе/среде (если известно).

Штаммы:

- используемые штаммы;

- число клеток на культуру;

- характеристики штаммов.

Условия испытания:

- количество испытуемого вещества на чашку (мг/чашка или мкг/чашка) с обоснованием выбора дозы и числа чашек на концентрацию;

- используемая среда;

- тип и состав системы метаболической активаций, включающей критерии ее использования;

- процедуры обработки.

Результаты:

- признаки токсичности;

- признаки преципитации;

- количество колоний ревертантов на каждую чашку;

- среднее число колоний ревертантов на чашку и стандартное отклонение;

- зависимость эффекта от дозы, где возможно;

- статистический анализ, если есть;

- результаты оценки по отрицательным (растворитель/среда) и положительным контролям с пределами колебаний, средними и стандартными отклонениями;

- данные по историческим (лабораторным) отрицательным (растворитель/среда) и положительным контролям с пределами колебаний, средними и стандартными отклонениями.

Обсуждение результатов.

Заключение.