Приложение 3. Методика определения микотоксина зеараленона (Ф-2) в фуражном зерне и комбикормах

Приложение 3

Методика определения микотоксина зеараленона (Ф-2) в фуражном зерне и комбикормах
(утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 28 февраля 1980 г.)

1. Принцип метода

Метод определения микотоксина Ф-2 в фуражном зерне и комбикормах основан на извлечении зеараленона ацетоном, очистке экстракта на колонке с окисью алюминия, элюировании токсина 0,005 н водным раствором щелочи с последующим хроматографированием элюата в тонком слое силикагеля и обработкой хроматограмм красителем прочным красным ЖЖ. Чувствительность определения Ф-2 на пластинках "Силуфол" составляет 0,1 мкг. Минимально определяемое количество Ф-2 в исследуемом материале по данной методике составляет 250 мкг/кг. Время проведения анализа - 7 часов.

2. Реактивы и растворы

Ацетон оп. 2 осч 9-5, ТУ 6-09-3513-75 (при использовании других марок ацетон следует перегнать).

Вода дистиллированная по ГОСТ 5955-68.

Гексан, ч.д.а., МРТУ 6-09-6518-70.

Окись алюминия для хроматографии, ч., МРТУ 6-09-5296-68.

Прочный красный ЖЖ, стабилизированная соль (п-нитрофенилдиазония тетрафтороборат).

0,05-процентный раствор красного прочного ЖЖ (п-нитрофенилдиазония тетрафтороборат, стабилизированная соль) в 50-процентном этиловом спирте готовят перед использованием.

Стандартный раствор зеараленона в бензоле или ацетоне концентрацией 1 мг/мл, из которого путем разбавления готовят стандартные растворы концентрацией 100 и 10 мкг/мл (раствор устойчив при хранении на холоде в течение 6 месяцев).

Система растворителей для тонкослойной хроматографии, состоящая из гексана и диэтилового эфира в соотношении 1:3 по объему.

Смесь ацетона и дистиллированной воды, взятых в соотношении 99:1.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67.

Спирт этиловый, разбавленный до 50-процентной концентрации дистиллированной водой.

Эфир диэтиловый, х.ч., по ГОСТ 3160-51.

Гидроокись натрия (NaOH) по ГОСТ 4328-66.

0,005 н водный раствор гидроокиси натрия.

3. Приборы, материалы и посуда

Аппарат для встряхивания (шуттель-аппарат).

Баня водяная электрическая.

Вата гигроскопическая медицинская.

Весы аналитические лабораторные АДВ-200.

Весы рычажные общего назначения (химико-технические с точностью до 0,01 г).

Воронки стеклянные диаметром 80 мм по ГОСТ 8613-75.

Камера для тонкослойной хроматографии объемом 2 л.

Колбы плоскодонные конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл по ГОСТ 10394-72.

Колонка для хроматографии размером 50 см х 1,5 см (в качестве колонок можно использовать нижнюю часть бюретки объемом 100 мл).

Мельница лабораторная.

Пластины для тонкослойной хроматографии без флюоресцентного красителя "Силуфол" KAV, ЧССР.

Фильтры обеззоленные, ТУ 6-0946-1678-72.

ФЭН.

Чашки фарфоровые выпарительные N 10 и N 5.

Примечание: посуда, используемая в опыте, должна быть обработана хромовой смесью, тщательно вымыта и высушена.

4. Ход определения

4.1. Экстракция микотоксина. Из средней пробы тщательно измельченного фуражного зерна, отрубей и комбикорма (последний без измельчения) берут образец массой 10 г, который помещают в колбу емкостью 250 мл с притертой пробкой. В колбу вносят 60 мл ацетона и экстрагируют, встряхивая на шуттель-аппарате в течение 2-х часов. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в фарфоровую чашку N 10. Извлечение токсина повторяют еще раз, используя еще 60 мл ацетона. Полученный экстракт выпаривают на водяной бане досуха.

4.2. Очистка экстракта с помощью колоночной хроматографии. В нижнюю часть колонки помещают тампон ваты высотой 1 см, вносят 7 г окиси алюминия и пропускают через колонку 20 мл ацетона. Остаток в чашке растворяют в 20 мл ацетона и вносят в колонку. После того как экстракт опустится до верхней поверхности столбика адсорбента, через колонку пропускают последовательно 300 мл ацетона и 100 мл смеси ацетон - дистиллированная вода, взятых в соотношении 99:1, для удаления примесей. Токсин элюируют 200 мл 0,005 н водного раствора гидроокиси натрия (NaOH) в фарфоровую чашку и элюат выпаривают на кипящей водяной бане досуха.

4.3. Определение количества Ф-2 хроматографией в тонком слое.

Полученный после выпаривания щелочного раствора остаток в чашке тщательно смывают (3-4 раза) порциями ацетона по 10 мл и фильтруют через бумажный фильтр в фарфоровую чашку N 5. Фильтрат выпаривают на водяной бане досуха. Остаток растворяют в 0,5-1,0 мл ацетона и переносят в пробирку небольшого объема. Из этого раствора на пластину "Силуфол" наносят 50-100 мкл пробы и стандартный раствор Ф-2 в количестве 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10 мкг, используя ФЭН. Объем нанесенной пробы должен соответствовать объему наносимого стандартного раствора. Места нанесения проб располагают на расстоянии 1,5-2,0 см друг от друга и от нижнего и боковых краев пластины. Диаметр пятен не должен превышать 0,5 см.

В камеру для хроматографирования вносят 100 мл системы растворителей, состоящей из гексана и диэтилового эфира (1:3). Спустя 30 минут в камеру помещают пластину в вертикальном положении. После того как фронт растворителя поднимется на высоту 10-12 см, пластину вынимают, отмечают фронт растворителя и помещают в сушильный шкаф на 3 минуты при 110°. Затем пластину опрыскивают свежеприготовленным раствором красного прочного ЖЖ и помещают в сушильный шкаф на 5-7 минут. Микотоксин проявляется в виде желтых пятен на белом фоне с .

Количество токсина в пробе определяют, сравнивая интенсивность окраски и площадь пятен свидетеля и образца. В случае если содержание микотоксина в исследуемом образце превышает 10 мкг, тонкослойную хроматографию повторяют, уменьшая наносимый объем исследуемого раствора.

4.4. Расчет результатов анализа. Концентрацию микотоксина Ф-2 в пробе вычисляют по формуле:

, где:

Х - содержание Ф-2 в исследуемой пробе в мкг/кг;

А - объем пробы, наносимый на пластину "Силуфол" при хроматографировании, в мкл;

В - концентрация Ф-2 в объеме пробы, нанесенном на пластину, в мкг;

С - общий объем пробы в мкл;

Д - навеска исследуемой пробы в г;

2 - коэффициент, учитывающий потери вещества в ходе анализа.