Приложение 2. Методика качественного определения микотоксина Т-2 в зернофураже

Приложение 2

Методика качественного определения микотоксина Т-2 в зернофураже
(утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 28 февраля 1980 г.)

Метод определения микотоксина Т-2 основан на извлечении токсина ацетоном, очистке экстракта от липидов и растительных пигментов гексаном, переэкстракции токсина в хлороформ с последующей дополнительной очисткой хлороформного экстракта на хроматографической колонке, концентрировании очищенного экстракта и двукратном хроматографировании его на пластинке "Силуфол". Чувствительность определения - 600 мкг/кг. Время проведения одного анализа - два дня.

1. Применяемые реактивы и стандарты

Алюминия окись для хроматографии 2-й степени активности по Брокману, МРТУ 6-09-5296-68, ч.

Ацетон, ГОСТ 2603-71, ч.д.а.

Бумага лабораторная фильтровальная, ГОСТ 7584-77

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72

Гексан, ТУ 6-09-3375-73, х.ч.

Кальция окись, ГОСТ 8677-76, х.ч.

Кальций хлористый плавленный, ГОСТ 4460-77, ч.

Кислота азотная, ГОСТ 4461-67, х.ч.

Кислота муравьиная, ГОСТ 5848-77, ч.д.а.

Кислота серная, ГОСТ 4204-77, х.ч.

Кислота уксусная ледяная, ГОСТ 61-75, х.ч.

Серебро азотнокислое, ГОСТ 1277-75, ч.д.а.

Силикагель марки "КСК"

Спирт этиловый ректификованный, ГОСТ 5962-67

Толуол, ГОСТ 5789-69, ч.д.а.

Хлороформ для наркоза

Хроматографические пластинки "Силуфол" марки KAV, ЧССР, размеры 15х15 см

Этилацетат, ГОСТ 51070-71, ч.д.а.

2. Подготовка реактивов

2.1. Реактив для обнаружения - 20-процентный спиртовой раствор серной кислоты. 11,5 мл серной кислоты небольшими порциями при осторожном перемешивании переносят в мерную колбу емкостью 100 мл с небольшим количеством этилового спирта (15-20 мл). После охлаждения раствора постепенно при постоянном перемешивании добавляют в колбу этиловый спирт до метки. Охлаждают при комнатной температуре и окончательно доводят раствор в колбе спиртом до метки.

2.2. Система растворителей: а) гексан смешивают с этилацетатом в соотношении 1:1. Высота слоя налитой в хроматографическую камеру жидкости не должна превышать 0,5 см. б) толуол смешивают с этилацетатом и муравьиной кислотой в соотношении 6:3:1 или хлороформ смешивают с этилацетатом и уксусной ледяной кислотой в соотношении 17:3:1.

2.3. 2-процентный водный раствор азотнокислого серебра.

2.4. Силикагель. Силикагель КСК размалывают на шаровой мельнице и заливают на 18-20 часов соляной кислотой, разбавленной водой 1:1. Затем кислоту сливают и силикагель промывают водой до отсутствия в промывных водах следов иона хлора*. После этого силикагель промывают ацетоном, просушивают под тягой до исчезновения запаха ацетона, а затем высушивают в сушильном шкафу при температуре 130° в течение 4-6 часов. Очищенный и высушенный силикагель просеивают через сито. Для заполнения хроматографической колонки используют фракцию, проходящую через сито с размером отверстий 0,105 мм и задерживающуюся на сите - 0,075 мм (120-200 меш). Силикагель хранят в плотно закрытых сосудах.

2.5. Окись кальция, силикагель и пластинки "Силуфол" перед употреблением активируют нагреванием в сушильном шкафу при температуре 100° в течение 1 часа. Окись кальция предварительно растирают в фарфоровой ступке.

3. Приготовление стандартного раствора микотоксина Т-2

0,0250 г (точная навеска) кристаллического микотоксина Т-2 взвешивают в стаканчике емкостью 25 мл, переносят с помощью этилового спирта или ацетона в мерную колбу емкостью 50 мл и доводят объем раствора спиртом или ацетоном до метки. В 1 мл раствора содержится 0,5 мг Т-2. Раствор устойчив в течение трех месяцев при хранении на холоде.

4. Посуда и оборудование

Аппарат Сокслета (объем экстрактора - 100 мл)

Баня водяная электрическая

Весы аналитические марки АДВ-200

Весы технохимические с точностью до 0,01 г

Воронки химические диаметром 4; 6; 8 см

Водоструйный насос

Колбы мерные емкостью 25; 50; 100 мл

Кофемолка

Люминесцентный осветитель ОИ-18

Микрошприц емкостью 10 мл

Набор сит

Перегонный аппарат

Пипетки химические градуированные емкостью 1; 2 мл

Пробирки центрифужные емкостью 10 мл

Сосуд для отсасывания под вакуумом диаметром 3 см, высотой 20 см

Стаканы химические емкостью 25; 50; 100 мл

Стеклянный распылитель (пульверизатор)

Ступка фарфоровая

Сушильный шкаф

Холодильник

Хроматографическая камера. В качестве камеры можно использовать цилиндрический сосуд диаметром 16 см, высотой 25 см

Хроматографическая колонка диаметром 1,8 см, высотой 18 см

Цилиндры измерительные емкостью 50; 100; 250 мл

Шаровая мельница

Штатив Бунзена

Шуттель-аппарат

Эксикатор диаметром 29 см.

5. Подготовка хроматографической колонки

Колонку (d = 1,5 см, Н = 20 см) заполняют в следующем порядке: тампон гигроскопической ваты, 1 г силикагеля, 2 г окиси алюминия, 2 г окиси кальция. Силикагель и окись алюминия вносят небольшими порциями, слегка постукивая по колонке. Для удаления пузырьков воздуха колонку промывают небольшим количеством хлороформа (15-20 мл) при отсасывании водоструйным насосом. Окись кальция вносят в колонку в виде хлороформной суспензии при отсасывании водоструйным насосом.

6. Ход определения

6.1. Средний образец зерна измельчают на кофемолке и перемешивают. Из среднего образца измельченного зерна отбирают навеску в количестве 25 г в патрон, свернутый из полосы фильтровальной бумаги (12х13 см) в виде цилиндра. Патрон с навеской помещают в аппарат Сокслета, объем экстрактора которого равен 100 мл. В колбу аппарата заливают 125 мл ацетона и проводят экстракцию на кипящей водяной бане в течение 6-8 часов. По истечении этого времени из экстракта на водяной бане отгоняют ацетон. Отгонку ведут последовательно, вначале с помощью перегонного аппарата при температуре 100° до получения концентрата небольшого объема, а затем без перегонного аппарата при температуре 80° до получения остатка объемом 2-5 мл.

6.2. Остаток из колбы переносят в делительную воронку (емкостью 150-200 мл) с помощью 25 мл ацетона. Затем к ацетоновому экстракту в делительной воронке прибавляют 25 мл гексана, перемешивают 1-2 мин и к смеси добавляют 50 мл воды. После разделения слоев гексановую фракцию (верхний слой) удаляют, а нижний слой повторно экстрагируют 25 мл гексана при встряхивании воронки в течение 1-2 мин. Выделившийся после отстаивания смеси гексановый слой снова удаляют, а водно-ацетоновую фракцию экстрагируют 25 мл хлороформа. Содержимое перемешивают 1-2 мин. и оставляют для разделения слоев.

6.3. После разделения слоев хлороформную фракцию (нижний слой) пропускают через хроматографическую колонку при отсасывании водоструйным насосом. Скорость прохождения экстракта через колонку равна 1-2 каплям в секунду (в момент переноса экстракта в колонку вакуум не применяют). Очищенный от примесей экстракт собирают в колбе для отгона. Экстракцию водно-ацетоновой фракции хлороформом проводят еще два раза, используя каждый раз 20 мл и пропуская каждую порцию экстракта через хроматографическую колонку. Экстракты, очищенные на колонке, присоединяют к первому в колбе для отгона. Затем колонку три раза по 30 мл промывают хлороформом с последующим присоединением промывных порций к основному экстракту.

6.4. Колбу для отгона соединяют с перегонным аппаратом и содержимое ее концентрируют на кипящей водяной бане до 2-3 мл. Концентрированный хлороформный экстракт переносят в центрифужную пробирку. Колбу трехкратно по 1-1,5 мл ополаскивают хлороформом, присоединяя эти порции к основному раствору в пробирке. Пробирку нагревают на водяной бане до полного удаления хлороформа. Нагревание ведут вначале при температуре 80-85°, а затем по мере уменьшения объема раствора температуру снижают.

6.5. Остаток в пробирке растворяют в 0,1 мл ацетона и наносят микрошприцем на стартовую линию хроматографической пластинки "Силуфол". Пробы наносят по 10 мкл (по 2 мкл 5 раз в одну точку, на линии старта) на расстоянии 1,5 см друг от друга и нижнего края пластинки. Общий объем нанесенной пробы составляет 10 мкл. Одновременно с исследуемыми растворами на пластинку наносят 2 мкл стандартного спиртового или ацетонового раствора токсина Т-2. Содержание токсина в пробе должно быть равно 1 мкг. Пластинку с нанесенными пробами помещают в насыщенную парами растворителей хроматографическую камеру таким образом, чтобы стартовая линия располагалась на 0,5 см выше уровня подвижного растворителя. Первое хроматографирование проводят в системе этилацетат - гексан (1:1). Когда фронт растворителя продвинется на высоту 14,5 см от нижнего края пластинки, хроматограмму извлекают из камеры, 7-10 мин подсушивают на воздухе, а затем 1 мин в сушильном шкафу при температуре 100°. После высушивания хроматограмму повторно помещают в камеру с системой растворителей хлороформ - этилацетат - уксусная кислота (17:3:1) или толуол - этилацетат - муравьиная кислота (6:3:1).

6.6. Когда фронт смеси растворителей продвинется на высоту 14,5 см, хроматограмму извлекают из камеры, подсушивают на воздухе, обрабатывают 20-процентным спиртовым раствором серной кислоты и помещают в сушильный шкаф с температурой 120°. Пластинку выдерживают в сушильном шкафу 5-10 мин до небольшого потемнения ее. После этого пластинку извлекают из шкафа, охлаждают и просматривают в исследуемой пробе токсина Т-2, на хроматограмме обнаруживают пятно с голубой флуоресценцией, соответствующее по положению и флуоресценции пятну токсина Т-2 в стандартной пробе.

6.7. При использовании в повторном хроматографировании системы толуол - этилацетат - муравьиная кислота токсина Т-2 составляет 0,23-0,24, при применении системы хлороформ - этилацетат - уксусная кислота равен 0,20-0,23.

______________________________

* Примечание: К 1 мл промывных вод прибавляют 1 мл 2-процентного раствора азотнокислого серебра и 1 мл азотной кислоты. В присутствии иона хлора выпадает осадок белого цвета.