Межгосударственный стандарт ГОСТ 33643-2015 "Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды. Хищные клещи: репродуктивный тест в почве" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 ноября 2015 г. N 1864-ст)

Межгосударственный стандарт ГОСТ 33643-2015
"Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды. Хищные клещи: репродуктивный тест в почве"
(введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 ноября 2015 г. N 1864-ст)

Testing of chemicals of environmental hazard.
Predatory mite (Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer) reproduction test in soil

Дата введения - 1 сентября 2016 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Федеральным государственным унитарным предприятием "Всероссийский научно-исследовательский институт стандартизации материалов и технологий" (ФГУП "ВНИИ СМТ") на основе аутентичного перевода на русский язык документа, указанного в пункте 5

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 октября 2015 г. N 81-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Казахстан	KZ	Госстандарт Республики Казахстан
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Россия	RU	Росстандарт
Таджикистан	TJ	Таджикстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 ноября 2015 г. N 1864-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33643-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 сентября 2016 г.

5 Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному документу OECD, Test No. 226:2008 Predatory mite (Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer) reproduction test in soil (Хищные клещи: репродуктивный тест в почве) путем изменения структуры. Сравнение структуры международного документа со структурой настоящего стандарта приведено в приложении ДА.

Перевод с английского языка (en).

Степень соответствия - модифицированная (MOD)

6 Введен впервые

1 Область применения

1.1 Данный стандарт устанавливает метод оценки влияния химических веществ, находящихся в почве, на репродуктивную активность почвенных клещей вида Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer Canestrini (клещи: Laelapidae) и тем самым оценить ингибирование специфической скорости роста в популяции клещей [1], [2]. В данном случае репродуктивная активность представляет количество неполовозрелых особей в конце периода испытания. Н. aculeifer представляет собой трофический уровень, дополнительный к видам, для которых уже существуют стандарты. Репродуктивный тест, в который не входит дифференциация и количественная оценка различных стадий репродуктивного цикла, считается приемлемым для целей настоящего стандарта по проведению исследования. Могут быть подходящими другие подходы для веществ с другим протоколом воздействия, чем через почву [3].

1.2 Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer считается типичным представителем почвенной фауны и, в частности, хищных клещей.

1.3 Он распространен по всему миру [5], и его легко собрать и культивировать в лабораторных условиях. Краткая информация по биологии Н. aculeifer приводится в приложении Е. Имеющаяся информация по экологии видов клещей и использовании в экотоксикологических испытаниях представлена в [4] - [12].

2 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями:

2.1 репродуктивная активность (reproductive output): Количество неполовозрелых особей в конце периода испытания.

2.2 NOEC (no observed effect concentration): Неэффективная наблюдаемая концентрация представляет собой концентрацию испытуемого вещества, при которой не наблюдается эффекта. В настоящем испытании концентрация, соответствующая NOEC, не имеет статистически значимого эффекта (р < 0,05) в течение определенного периода воздействия по сравнению с контролем.

2.3 LOEC (lowest observed effect concentration): Наименьшая наблюдаемая эффективная концентрация представляет собой самую низкую концентрацию испытуемого вещества, которая имеет статистически значимый эффект (р < 0,05) в течение определенного периода воздействия по сравнению с контролем.

2.4 (effect concentration for x% effect): Эффективная концентрация для х%-го эффекта представляет собой концентрацию, которая вызывает х%-ный эффект на тестовые организмы в течение определенного периода воздействия по сравнению с контролем. Например, представляет концентрацию, вызывающую эффект в конечной точке испытания в 50% популяции, подвергшейся воздействию в течение определенного периода воздействия.

3 Принцип метода

Взрослые самки подвергаются воздействию различных концентраций испытуемого вещества, смешанного с почвой. Испытание начинается с внесения 10 взрослых самок на повторность. Самцы не используются в испытании, поскольку было показано, что самки спариваются сразу же или вскоре после выхода со стадии дейтонимфы, если присутствуют самцы. Кроме того, включение самцов приведет к удлинению испытания, поскольку в этом случае потребуется определение возрастных стадий. Таким образом, само спаривание не входит в испытание. Самки включаются в испытание через 28 - 35 сут после начала яйцекладки в синхронизации (см. приложение В), поскольку тогда самок можно считать уже спаренными и прошедшими стадию, предшествующую яйцекладке. При температуре 20°С испытание завершается на 14-е сутки после внесения самок (день 0), что позволяет первому потомству в контроле достичь стадии дейтонимфы (см. приложение В). В качестве основного измеряемого параметра определяют количество неполовозрелых особей на испытуемый сосуд и, кроме того, количество выживших самок. Репродуктивную активность клещей, подвергшихся воздействию испытуемого вещества, сравнивают с контролем для определения (например , ) или концентрации, не вызывающей видимого эффекта (NOEC), в зависимости от дизайна опыта (см. п. 8.5.1.2). Общая схема испытания приведена в приложении Ж.

4 Информация об испытуемом веществе

4.1 Предпочтительно располагать информацией о растворимости в воде, коэффициенте распределения в системе "октанол-вода", log Kow, коэффициенте распределения в почве и воде, и давлении паров испытуемого вещества. Желательна дополнительная информация о поведении испытуемого вещества в почве, например скорости биотической и абиотической деградации.

4.2 Данный стандарт может использоваться для испытания растворимых или нерастворимых в воде веществ. Однако способ внесения испытуемого вещества соответственно будет различаться. Стандарт не распространяется на летучие вещества, т.е. вещества, для которых постоянная Генри или коэффициент распределения воздух/вода больше единицы, или вещества, для которых давление пара превышает 0,0133 Па при температуре 25°С.

5 Достоверность испытания

Для того чтобы результаты испытаний считались достоверными, в необработанных контролях должны выполняться следующие критерии достоверности:

- средняя смертность взрослых самок не должна превышать 20% в конце испытания;

- среднее число неполовозрелых особей на повторность (с 10 внесенными взрослыми самками) должно составлять не менее 50 особей в конце испытания;

- коэффициент вариации, рассчитанный для числа неполовозрелых клещей на повторность, не должен превышать 30% в конце определенного испытания.

6 Стандартные вещества

Определяют и/или NOEC стандартного вещества для подтверждения того, что условия лабораторных испытаний являются адекватными и реакция испытуемых организмов не изменяется с течением времени. Диметоат (CAS 60-51-5) является подходящим стандартным веществом, которое, как было показано, оказывает влияние на численность популяции [4]. В качестве альтернативного стандартного вещества используют борную кислоту (CAS 10043-35-3). С этим веществом имеется меньший опыт использования. Возможны два варианта дизайна:

- стандартное вещество испытывают параллельно с определением токсичности каждого испытуемого вещества в одной концентрации, которая приводит к уменьшению потомства более чем на 50% по данным заранее проведенного опыта по изучению зависимости "доза - эффект". В данном случае количество повторностей должно быть таким же, как в контрольной группе (см. 8.5.1.2);

- в альтернативном варианте, стандартное вещество испытывается 1 - 2 раза в год при определении зависимости "доза - эффект". В зависимости от выбранного дизайна различается количество концентраций и повторностей и интервал между концентрациями (см. 8.5.1.2), но следует добиваться 10% - 90% эффекта (интервал между концентрациями 1,8). Значение для диметоата по количеству неполовозрелых особей должно находиться в диапазоне 3,0 - 7,0 мг ДВ/кг сухой почвы). На основании данных, полученных для борной кислоты, значение по количеству неполовозрелых особей, должно находиться в диапазоне 100 - 500 мг/кг сухой почвы.

7 Описание метода

7.1 Испытуемые сосуды и оборудование

7.1.1 Используются испытуемые сосуды диаметром 3 - 5 см (высота слоя почвы должна быть не менее 1,5 см), изготовленные из стекла или другого химически инертного материала, с плотно прилегающими крышками. Завинчивающиеся крышки являются предпочтительными, и в таком случае сосуды аэрируют два раза в неделю. В качестве альтернативы можно использовать колпачки, обеспечивающие прямой газообмен между субстратом и атмосферой (например, марлевые). Поскольку во время испытания содержание влаги должно поддерживаться на достаточно высоком уровне, то важно контролировать массу каждого испытуемого сосуда во время тестирования и при необходимости доливать воду. Это особенно важно, если отсутствуют завинчивающиеся крышки. Если используется непрозрачный испытуемый сосуд, то крышка должна быть изготовлена из материала, обеспечивающего доступ света (например, с перфорированным прозрачным покрытием), одновременно предупреждающего выход клещей. Размер и тип испытуемого сосуда зависят от способа выделения клещей (подробное описание приведено в приложении Г). Если применяется выделение с тепловой обработкой непосредственно в испытуемом сосуде, то используют сетчатое дно с соответствующим размером отверстий (герметично закрытое до выделения), и высота слоя почвы должна быть достаточной для обеспечения градиента температуры и влажности.

7.1.2 Требуется стандартное лабораторное оборудование, в частности, следующее:

- предпочтительно стеклянные сосуды с завинчивающимися крышками;

- сушильный шкаф;

- стереомикроскоп;

- кисточки для переноса клещей;

- рН-метр и люксметр;

- подходящие точные весы;

- соответствующее оборудование для контроля температуры;

- соответствующее оборудование для контроля влажности воздуха (не имеет особого значения, если испытуемые сосуды покрыты крышками);

- термостат или камера с регулируемой температурой;

- оборудование для выделения клещей (см. приложение Г) [13];

- верхняя световая панель с функцией контроля освещенности;

- банки для сбора выделенных клещей.

7.2 Приготовление искусственной почвы

7.2.1 Для данного испытания используется искусственная почва. Искусственная почва состоит из следующих компонентов (все значения на основе сухой массы):

- 5% сфагнового торфа, высушенного на воздухе и мелко измельченного (приемлемый размер частиц (21) мм);

- 20% каолиновой глины (содержание каолинита предпочтительно выше 30%);

- примерно 74% высушенного на воздухе промышленного песка (в зависимости от необходимого количества ), преимущественно это мелкозернистый песок, в котором более чем 50% частиц имеет размер в диапазоне от 50 до 200 мкм (микрон). Точное количество песка зависит от количества (см. ниже), совместно доводятся до 75%;

- менее 1,0% карбоната кальция (измельченный ч.д.а) для получения рН 6,00,5; добавляемое количество карбоната кальция может зависеть преимущественно от качества/источника торфа (см. примечание 1).

Примечание 1 - Требуемое количество зависит от компонентов почвенного субстрата и его определяют по измерению рН в дополнительных пробах почвы непосредственно перед испытанием [14].

Примечание 2 - Содержание торфа в искусственной почве отличается от других стандартов ОЭСР по почвенным организмам, где в большинстве случаев используется 10% торфа (например, [15]). Однако согласно ЕОКЗР [16] обычная сельскохозяйственная почва содержит не более 5% органического вещества, и снижение содержания торфа, таким образом, отражает уменьшение способности природной почвы адсорбировать испытуемое вещество к органическому углероду.

Примечание 3 - При необходимости, например для определенных целей испытания, природные почвы из незагрязненных мест могут также служить в качестве испытуемого и/или культурального субстрата. Однако если используется природная почва, то ее следует охарактеризовать по меньшей мере по источнику (месту сбора), рН, текстуре (распределению частиц по размеру) и содержанию органического вещества. По возможности должна быть информация о типе и названии почвы согласно классификации почв, и почва должна быть свободна от любых загрязнений. Если испытуемое вещество представляет собой металл или металлорганическое соединение, то также должна быть определена емкость катионного обмена (СЕС) природной почвы. Особое внимание должно быть обращено на соответствие критериям достоверности, поскольку справочная информация о природных почвах в этом отношении обычно бывает редко.

7.2.2 Сухие компоненты почвы тщательно перемешивают (например, в большом лабораторном смесителе). Для определения рН используют смесь почвы и раствор 1 М хлорида калия (KCI) или 0,01 М хлорида кальция () в соотношении 1:5 (см. [14] и приложение Б). Если почва кислее чем требуемый диапазон (см. 7.2.1), то ее рН корректируют добавлением соответствующего количества . Если почва слишком щелочная, то рН корректируют добавлением большего количества смеси, содержащей первые три компонента, описанные в 7.2.1, но исключив .

7.2.3 Максимальную водоудерживающую способность (WHC) искусственной почвы определяют в соответствии с методиками, описанными в приложении А. За 2 - 7 сут до начала испытания сухую искусственную почву предварительно увлажняют добавлением достаточного количества дистиллированной или деионизированной воды для получения примерно половины от конечного содержания воды, что составляет 40% - 60% максимальной WHC. Содержание влаги доводят до 40% - 60% максимальной WHC добавлением раствора испытуемого вещества и/или добавлением дистиллированной или деионизированной воды (см. 7.4.2.1 - 7.4.4.1). Проводят дополнительный грубый контроль необходимой влажности почвы, мягко сжимают почву в руке, и если содержание влаги требуемое, то между пальцами появляются мелкие капли воды.

7.2.4 В начале и конце испытания определяют влажность почвы высушиванием до постоянной массы при температуре 105°С в соответствии с [17] и рН почвы в соответствии с приложением Б или [14]. Эти измерения проводят на дополнительных образцах почвы без клещей для контрольной почвы и почвы с каждой концентрацией испытуемого вещества. рН почвы не следует доводить, когда испытывают кислые или основные вещества. Содержание влаги должно контролироваться в течение всего испытания периодическим взвешиванием сосудов (см. 8.1.2 и 8.2.3).

7.3 Выбор и подготовка тестовых организмов

Используемым в испытании видом является Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer (Canestrini, 1883). Для начала испытания требуются взрослые самки клещей, полученные из синхронной культуры. Клещей вносят примерно через 7 - 14 сут после созревания взрослых особей, 28 - 35 сут после начала яйцекладки в синхронизации (см. 3.1 и приложение В). Регистрируют источник клещей или поставщика и поддержание лабораторной культуры. Если поддерживается лабораторная культура, то рекомендуется подтверждать видовую идентичность не менее одного раза в год. Идентификационный лист приведен в приложении Д.

7.4 Подготовка испытуемых концентраций

7.4.1 Испытуемое вещество смешивают с почвой. Органические растворители, которые используются для упрощения обработки почвы испытуемым веществом, выбирают с учетом их низкой токсичности для клещей, и в дизайн испытания включают соответствующий контроль на растворитель (см. 8.5.1.2).

7.4.2 Испытуемое вещество, растворимое в воде

Раствор испытуемого вещества готовят в деионизированной воде в количестве, достаточном для всех повторностей для каждой испытуемой концентрации. Используют соответствующее количество воды для обеспечения необходимого содержания влаги, т.е. 40% - 60% от максимальной WHC (см. 7.2.3). Каждый раствор испытуемого вещества тщательно перемешивают с партией предварительно увлажненной почвы перед внесением в испытуемый сосуд.

7.4.3 Испытуемое вещество, нерастворимое в воде

Испытуемые химические вещества, нерастворимые в воде, но растворимые в органических растворителях, растворяют в минимальном объеме подходящего растворителя (например, ацетона). Используют только летучие растворители. Если используются такие растворители, то растворы всех испытуемых концентраций и контроль должны содержать одинаковое минимальное количество растворителя. Растворитель наносится распылением или смешивается с небольшим количеством, например 10 г, мелкого кварцевого песка. Общее содержание песка в субстрате должно быть скорректировано с учетом этого количества. Растворитель удаляют выпариванием под вытяжкой в течение не менее одного часа. Приготовленную смесь кварцевого песка и испытуемого вещества добавляют к предварительно увлажненной почве и тщательно перемешивают, добавляя соответствующее количество деионизированной воды для получения требуемой влажности. Конечную смесь помещают в испытуемые сосуды. Следует отметить, что некоторые растворители могут быть токсичными для клещей. Таким образом, рекомендуется сделать дополнительный контроль на воду без растворителя, если токсичность растворителя для клещей не известна. Если обоснованно показано, что растворитель (в используемых концентрациях) не является токсичным для клещей, то контроль на воду может быть исключен.

7.4.4 Испытуемое вещество, слаборастворимое в воде и органических растворителях

Для веществ, слаборастворимых в воде и органических растворителях, порцию 2,5 г мелко измельченного кварцевого песка в испытуемом сосуде (например, 10 г мелкого кварцевого песка на четыре повторности) смешивают с количеством испытуемого вещества с получением требуемой испытуемой концентрации. Общее содержание песка в субстрате должно быть скорректировано с учетом этого количества. Приготовленную смесь кварцевого песка и испытуемого вещества добавляют к предварительно увлажненной почве и тщательно перемешивают после добавления соответствующего количества деионизированной воды для получения требуемого содержания влаги. Конечную смесь распределяют между испытательными сосудами. Процедуру повторяют для каждой испытуемой концентрации и также готовят соответствующий контроль.

8 Проведение испытания

8.1 Опытные группы и контроли

8.1.1 Для каждого контрольного и испытуемого сосуда используют десять взрослых самок в 20 г искусственной почвы по сухой массе. Тестовые организмы вносят в течение двух часов после подготовки конечного испытуемого субстрата (т.е. после внесения испытуемого объекта). В отдельных случаях (например, когда созревание, как полагают, является определяющим фактором) период времени между подготовкой конечного испытуемого субстрата и внесением клещей может быть увеличен (подробнее такое созревание см. [18]). Однако в таких случаях должно быть предоставлено научное обоснование.

8.1.2 После внесения клещей в почву насекомых кормят и измеряют первоначальную массу каждого испытуемого сосуда в качестве показателя контроля содержания влаги в почве в течение всего испытания, как описано в 8.2.3. Затем испытуемые сосуды закрывают, как описано в 7.1.1, и помещают в испытуемую камеру.

8.1.3 Готовят соответствующие контроли для каждого способа внесения испытуемого вещества, описанного в 7.4.1 - 7.4.4. Соответствующие описанные процедуры используются для приготовления контролей, где исключается внесение испытуемого вещества. Таким образом, при необходимости органические растворители, кварцевый песок или другие растворители используют для контролей в концентрациях/количествах, аналогичных в опыте. При использовании растворителя или другого носителя для внесения испытуемого вещества должен быть также приготовлен и испытан дополнительный контроль без растворителя или испытуемого вещества в случае, если токсичность растворителя не известна (см. 7.4.3.1).

8.2 Условия испытаний

8.2.1 Температура при испытании должна составлять (202)°С. Температуру контролируют по меньшей мере ежедневно и при необходимости регулируют. Испытание проводят при контролируемых циклах свет - темнота (предпочтительно 16 ч свет и 8 ч темнота) с освещенностью в пределах от 400 до 800 лк в непосредственной близости от испытательных сосудов. Для сопоставления эти условия являются такими же, как в других экотоксикологических испытаниях с почвой [15].

8.2.2 Газообмен обеспечивается аэрацией испытуемых сосудов по меньшей мере два раза в неделю в случае использования завинчивающихся крышек. Если используются марлевые колпачки, то особое внимание уделяют поддержанию влажности почвы (см. 7.1.1 и 8.2.3).

8.2.3 Содержание воды в почвенном субстрате в испытуемых сосудах поддерживается на протяжении всего испытания путем взвешивания сосудов и при необходимости периодически в испытуемые сосуды дополнительно заливают воду (например, раз в неделю). По мере необходимости потери за счет испарения восполняются деионизированной водой. Во время испытания содержание влаги не должно отличаться более чем на 10% от исходного значения.

8.3 Кормление

8.3.1 Сырные клещи (Tyrophagus putrescentiae (Schrank, 1781)) являются подходящим источником питания. Также можно использовать мелкие коллемболы (например, неполовозрелые особи Folsomia Candida Willem, 1902 или Onychiurus fimatus [19], [20], энхитреиды (например, Enchytraeus crypticus Westheide & Graefe, 1992) или нематоды (например, Turbatrix silusiae de Man, 1913)) [21]. Рекомендуется проверять корм, прежде чем использовать его в испытании. Тип и количество корма должны обеспечивать достаточное количество неполовозрелых особей для соответствия критериям достоверности (см. 5.1). Выбор кормового объекта следует делать с учетом механизма действия испытуемого вещества (например, акарицид может быть также токсичным для амбарных клещей (см. 8.3.2).

8.3.2 Корм дается вволю (т.е. каждый раз небольшое количество (на кончике шпателя)). Для этой цели можно также использовать слабо всасывающий аспиратор, как это предлагается в испытании с коллемболами, или также тонкую кисточку. Обычно достаточным является внесение корма в начале испытания и два - три раза в неделю. Если испытуемое вещество окажется токсичным для кормового объекта, то следует увеличить частоту кормления и/или перейти на альтернативный источник кормления.

8.4 Выбор испытуемых концентраций

Предварительная информация о токсичности испытуемого вещества облегчит выбор соответствующих испытуемых концентраций, например, проводятся с пятью концентрациями испытуемого вещества в диапазоне 0,1 - 1000 мг/кг сухой почвы с не менее одной повторностью в опыте и контроле. Продолжительность испытания по определению диапазона предельных концентраций составляет 14 сут, после чего определяется смертность взрослых клещей и количество неполовозрелых особей. Диапазон концентраций для конечного испытания предпочтительно выбирают таким образом, чтобы он включал концентрации, оказывающие отрицательное влияние на количество неполовозрелых особей и одновременно не действующие на выживаемость родительского поколения. Однако это не подходит для веществ, вызывающих летальный и сублетальный эффект практически в одинаковых концентрациях. Эффективная концентрация (например, , , ) и диапазон концентраций, в котором оценивается эффект испытуемого вещества, должны входить в диапазон концентраций, включенных в испытание. Экстраполяцию значительно ниже самой низкой концентрации, влияющей на тестовые организмы, или выше самой высокой испытанной концентрации следует выполнять только в исключительных случаях, и тогда приводят исчерпывающее обоснование в отчете.

8.5 Дизайн испытания

8.5.1 Определение зависимости "доза - эффект"

8.5.1.1 Предлагаются три дизайна испытания на основе рекомендаций, приведенных для другого кольцевого теста (репродуктивный тест с энхитреидами [22]). Общая применимость всех этих дизайнов была подтверждена результатами оценки достоверности для Н. Aculeifer.

8.5.1.2 При установлении диапазона концентраций должно учитываться следующее:

- для определения (например, , ) испытывают двенадцать концентраций. Рекомендуется использовать не менее двух повторностей для каждой испытуемой концентрации и шесть повторностей в контроле. Интервал между концентрациями может быть различным, т.е. ниже или равным 1,8 в предполагаемом диапазоне эффекта и выше 1,8 при более высоких и более низких концентрациях;

- для определения значения NOEC тестируют не менее пяти концентраций в геометрической прогрессии. Рекомендуется использовать четыре повторности для каждой испытуемой концентрации плюс восемь повторностей в контроле. Интервал между концентрациями не должен превышать 2,0;

- комбинированный подход позволяет определить значения NOEC и . В опыте используют восемь концентраций в геометрической прогрессии. Рекомендуется четыре повторности для каждой обработки плюс восемь повторностей в контроле. Интервал между концентрациями не должен превышать 1,8.

8.5.2 Определение диапазона предельных концентраций

Если в самой высокой концентрации при определении диапазона предельных концентраций (т.е. 1000 мг/кг сухой почвы) эффекты отсутствовали, то конечный репродуктивный тест проводится как испытание на предельные концентрации с использованием испытуемой концентрации 1000 мг/кг сухой почвы. Испытание на предельные концентрации обеспечит возможность показать, что значения NOEC или в отношении репродукции выше предельной концентрации, в то же время сводя к минимуму количество клещей, используемых в испытании. Следует использовать по восемь повторностей для обработанной и контрольной почвы.

8.6 Продолжительность испытаний и измерения

8.6.1 Регистрируют любые различия, наблюдаемые в поведении и морфологии клещей в контрольных и обработанных сосудах.

8.6.2 На 14 сут выживших клещей выделяют из почвы с помощью тепловой/световой обработки или другим подходящим способом (см. приложение Г). Подсчитывается отдельно количество неполовозрелых особей (т.е. личинок, протонимф и дейтонимф) и взрослых особей. Все взрослые клещи, не обнаруженные на момент учета результатов, расцениваются как мертвые, полагая, что такие клещи пали и разложились до начала оценки. Эффективность выделения следует проверять один или два раза в год в контрольной группе с известным количеством взрослых и неполовозрелых клещей. В среднем эффективность должна быть более 90% для всех стадий развития (см. приложение Г). Количество взрослых и неполовозрелых особей не корректируется с учетом эффективности.

9 Данные и отчет о проведении испытания

9.1 Обработка результатов

9.1.1 Информация по статистическим методам, которые можно использовать для анализа результатов испытаний, приведена в 9.1.4.1 - 9.1.6.2. Кроме того, следует принять во внимание документ ОЭСР 54 "Современные подходы к статистическому анализу экотоксичности: руководство к применению".

9.1.2 Основной конечной точкой испытания является репродуктивная активность, в данном случае число неполовозрелых особей в пересчете на каждый параллельный испытуемый сосуд (с 10 внесенными взрослыми самками). Для статистического анализа требуется среднее арифметическое (X) и дисперсия () для репродуктивной активности на каждую обработку и контроль. X и используются для методов ANOVA таких как t-критерий Стьюдента, критерий Даннетта или критерий Вильямса, а также для вычисления 95%-ной доверительной вероятности интервалов.

Примечание - эта основная конечная точка эквивалентна фертильности, определенной как количество живых неполовозрелых особей, полученных в ходе испытания, деленное на число самок, внесенных в начале испытания.

9.1.3 Число выживших самок в необработанных контрольных сосудах является основным критерием достоверности, и он должен быть зарегистрирован. Как и в исследовании по определению диапазона предельных концентраций, в заключительном отчете приводятся все другие признаки негативного воздействия испытуемого вещества.

9.1.4

-значения, включая связанные с ними нижние и верхние 95%-ные пределы доверительного интервала для параметра, описанного в 9.1.2, вычисляют с использованием соответствующих статистических методов (например, пробит-анализа, логистического распределения или распределения Вейбулла, усеченного метода Спирмена - Карбера или простой интерполяцией). рассчитывают, подставляя значение, соответствующие х% средних значений в контроле в найденное уравнение. Для вычисления или любой другой средние значения обработки (х) должны быть подвергнуты регрессионному анализу.

9.1.5 NOEC/LOEC

9.1.5.1 Если статистический анализ предназначен, чтобы определить NOEC/LOEC, то необходима статистика на сосуд (отдельные сосуды рассматриваются в качестве повторностей). Используют подходящие статистические методы (в соответствии с документом ОЭСР 54 на "Современные подходы к статистическому анализу экотоксичности: Руководство к применению"). В общем, отрицательные эффекты испытуемого объекта по сравнению с контролем исследуются с помощью односторонней (более короткой) проверки гипотезы при р0,05. Примеры приведены в следующих пунктах.

9.1.5.2 Нормальное распределение данных можно проверить, например, с помощью критерия согласия Колмогорова - Смирнова, соотношения диапазон-стандартное отклонение (R/S-тест) или критерия Шапиро - Уилка (двустороннего, р0,05). Критерий Кохрана, критерий Левена или критерий Бартлетта (двусторонние, р0,05) могут использоваться для оценки однородности дисперсии. Если требования параметрических процедур испытания (нормальность, однородность дисперсии) выполняются, то проводят однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) и последующие многократные сравнительные критерии. Множественное сравнение (например, t-критерий Даннета) или понижающий тренд испытаний (например, критерий Вильямса в случае монотонной зависимости "доза - эффект") используют для того, чтобы вычислить, существуют ли значительные различия (р0,05) между контролями и различными концентрациями испытуемого вещества (выбор рекомендуемого теста в соответствии с документом ОЭСР 54 на "Современные подходы к статистическому анализу экотоксичности: Руководство к применению"). В противном случае используют непараметрические методы (например, U-критерий Бонферрони согласно Холма или Джонкхиера - Терпстра критериям тренда) для определения NOEC и LOEC.

9.1.6 Определение диапазона предельных концентраций

9.1.6.1 Если было проведено определение предельных концентраций (сравнение контроля и только одной обработки) и выполняются требования для параметрических методов испытания (нормальность, однородность) то метрические отклики оцениваются с помощью критерия Стьюдента (t-критерий). Неодинаковая дисперсия, t-критерий (t-критерий Уэлча) или непараметрический критерий, например U-критерий Манна-Уитни, используются, если данные требования не будут вы полнены.

9.1.6.2 Для определения значимых различий между контролями (контроль и контроль на растворитель) повторности каждого контроля проверяют, как описано для определения диапазона предельных концентраций. Если существенные различия не выявляются, то все повторности контроля и контроля растворителя можно объединить. В противном случае все обработки следует сравнивать с контролем на растворитель.

9.2 Отчет о проведении испытания

Отчет о проведении испытания должен включать в себя следующую информацию.

9.2.1 Испытуемое вещество:

- идентификация испытуемого вещества, наименование, партия, серия и CAS-номер, чистота;

- физико-химические свойства испытуемого вещества (например, log Kow, растворимость в воде, давление пара, постоянная Генри (Н) и предпочтительно информация о поведении исследуемого вещества в почве).

9.2.2 Тестовые организмы:

- идентификация и поставщик тестовых организмов, описание условий культивирования;

- возраст тестовых организмов.

9.2.3 Условия испытания:

- описание дизайна и методов, используемых в эксперименте;

- подробная информация о подготовке почвы к испытанию;

- подробная спецификация, если используется природная почва (источник, описание, распределение частиц по размеру, рН, содержание органического вещества и при возможности классификация почвы);

- максимальная водоудерживающая способность почвы;

- описание метода, используемого для внесения испытуемого вещества в почву;

- сведения о вспомогательных веществах, используемых для внесения испытуемого вещества;

- размер испытуемых сосудов и сухая масса испытуемой почвы на сосуд;

- условия испытания: интенсивность света, продолжительность циклов свет - темнота, температура;

- описание режима кормления, тип и количество корма, используемого в испытании, график кормления;

- рН и содержание воды в почве в начале и конце испытания (контроль и каждая обработка);

- подробное описание метода экстракции и эффективности экстракции.

9.2.4 Результаты испытания:

- число неполовозрелых, определенных в каждом испытуемом сосуде в конце испытания;

- число взрослых самок и смертность взрослых особей (в процентах) в каждом испытуемом сосуде в конце испытания;

- описание наблюдаемых симптомов или отдельных изменений в поведении;

- результаты, полученные с эталонным испытуемым веществом;

- сводные статистические данные ( и/или NOEC), включая 95%-ную доверительную вероятность интервалов и описание метода расчета;

- график зависимости "доза - эффект";

- отклонения от процедур, описанных в настоящем стандарте, и любых необычных происшествий (редких явлений) во время испытания.

Библиография

[1]	Casanueva, M.E. (1993). Phylogenetic studies of the free-living and arthropod associated Laelapidae (Acari: Mesostigmata). Gayana Zool. 57, 21 - 46
[2]	Tenorio, J.M. (1982). Hypoaspidinae (Acari: Gamasida: Laelapidae) of the Hawaiian Islands. Pacific Insects 24, 259 - 274
[3]	Bakker, F.M., Feije, R., Grove, A.J., Hoogendorn, G., Jacobs, G, Loose, E.D. and van Stratum, P. (2003). A laboratory test protocol to evaluate effects of plant protection products on mortality and reproduction of the predatory mite Hypoaspis aculeifer Canestrini (Acari: Laelapidae) in standard soil. JSS - Journal of Soils and Sediments 3, 73 - 77
[4]	Karg, W. (1993). Die freilebenden Gamasina (Gamasides), Raubmilben. 2nd edition In: Dahl, R (Hrsg.): Die Tierwelt Deutschlands 59. Teil, G. Fischer, Jena, 523 pp
[5]	Ruf, A. (1991). Do females eat males? : Laboratory studies on the popualation development of Hypoaspis aculeifer (Acari: Parasitiformes). In: F. Dusbabek & V. Bukva (eds.): Modern Acarology. Academia Prague & SPD Academic Publishing bv, The Hague, Vol. 2, 487 - 492
[6]	Ruf, A. (1995). Sex ratio and clutch size control in the soil inhabiting predatory mite Hypoaspis aculeifer (Canestrini 1883) (Mesostigmata, Dermanyssidae). Proc. 2nd Symp. EURAAC: p. 241 - 249
[7]	Ruf, A. (1996). Life-history patterns in soil-inhabiting mesostigmatid mites. Proc. IXth Internat. Congr. Acarol. 1994, Columbus, Ohio: p. 621 - 628
[8]	Krogh, P.H. and Axelsen, J.A. (1998). Test on the predatory mite Hypoaspis aculeifer preying on the collembolan Folsomia fimetaria. In: Lokke, H. and van Gestel, C.A.M.: Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley Sons, Chichester, p. 239 - 251
[9]	Lokke, H., Janssen, C.R., Lanno, R.P, Rmbke, J., Rundgren, S. and Van Straalen, N.M. (2002). Soil Toxicity Tests - Invertebrates. In: Test Methods to Determine Hazards of Sparingly Soluble Metal Compounds in Soils. Fairbrother, A., Glazebrook, P.W., Van Straalen, N.M. and Tarazona, J.V. (eds.). SETAC Press, Pensacola, USA. 128 pp
[10]	Schlosser, H.-J. and Riepert, F. (1991/92). Entwicklung eines Prfverfahrens fr Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina). Teil 1: Biologie der Bodenraubmilbe Hypoaspis aculeifer Canestrini, 1883 (Gamasina) unter Laborbedingungen. Zool. Beitrge, 34, 395 - 433
[11]	Schlosser, H.-J. and Riepert, F (1992). Entwicklung eines Prfverfahrens fr Chemikalien an Boden-raubmilben (Gamasina). Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. N.F. 34, 413 - 433
[12]	Heckmann, L.-H., Maraldo, K. and Krogh, P.H. (2005). Life stage specific impact of dimethoate on the predatory mite Hypoaspis aculeifer Canestrini (Gamasida: Laelapidae). Environmental Science & Technology 39, 7154 - 7157
[13]	Petersen, H. (1978). Some properties of two high-gradient extractors for soil microarthropods, and an attempt to evaluate their extraction efficiency. Natura Jutlandica 20, 95 - 122
[14]	ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality - Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve
[15]	OECD (1984). Guideline for testing of chemicals. No 207. Earthworm acute toxicity tests. Organization for Economic Cooperation and Development, Paris
[16]	EPPO (2003): EPPO Standards. Environmental risk assessment scheme for plant protection products. Chapter 8. Soil Organisms and Functions. Bull. OEPP/EPPO Bull. 33, 195 - 209
[17]	ISO (International Organization for Standardization) (1993). Soil Quality - Determination of dry matter and water content on a mass basis - Gravimetric method, No. 11465. ISO, Geneve
[18]	Fairbrother, A., Glazebrock, P.W., Van Straalen, N.M. and Tarazona, J.V. 2002. Test methods to determine hazards of sparingly soluble metal compounds in soils. SETAC Press, Pensacola, FL, USA
[19]	Chi, H. 1981. Die Vermehrungsrate von Hypoaspis aculeifer Canestrini (Acarina, Laelapidae) bei Ernhrung mit Onychiurus fimatus Gisin (Collenbola). Ges. allg. angew. Ent. 3: 122 - 125
[20]	Schlosser, H.J., und Riepert, F. 1992. Entwicklung eines Prfverfahrens fr Chemikalien an Bodenraubmilden (Gamasina). Zool. Beitr. N.F. 34(3): 395 - 433
[21]	Heckmann, L.-H., Ruf, A., Nienstedt, K.M. and Krogh, P.H. 2007. Reproductive performance of the generalist predator Hypoaspis aculeifer (Acari: Gamasida) when foraging on different invertebrate prey. Applied Soil Ecology 36, 130 - 135
[22]	OECD (2004). Guidelines for the testing of chemicals. No. 220. Enchytraeid reproduction test. Organization for Economic Cooperation and Development, Paris
[23]	ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality - Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve
[24]	Southwood, T.R.E. (1991). Ecological methods. With particular reference to the study of insect populations. (2nd ed.). Chapman & Hall, London, 524 pp
[25]	Dunger, W. and Fiedler, H.J. (1997). Methoden der Bodenbiologie (2nd ed.). G. Fischer, Jena, 539 pp
[26]	Lesna, I. and Sabelis, M.W. (1999). Diet-dependent female choice for males with "good genes" in a soil predatory mite. Nature 401, 581 - 583
[27]	Ruf, A. (1989). Die Bedeutung von Arrhenotokie und Kannibalismus fr die Populationsentwicklung von Hypoaspis aculeifer(Canestrini 1883) (Acari, Gamasina). Mitt. Deut. Ges. Allg. Angew. Ent. 7, 103 - 107
[28]	Ruf, A. (1993). Die morphologische Variabilitt und Fortpflanzungsbiologie der Raubmilbe Hypoaspis aculeifer (Canestrini 1883) (Mesostigmata, Dermanyssidae). Dissertation, Universitt Bremen
[29]	Ignatowicz, S. (1974). Observations on the biology and development of Hypoaspis aculeifer Canestrini, 1885 (Acarina, Gamasides). Zoologica Poloniae 24, 11 - 59
[30]	Kevan, D.K. McE. and Sharma, G.D. (1964). Observations on the biology of Hypoaspis aculeifer (Canestrini, 1884), apparently new to North America (Acarina : Mesostigmata : Laelaptidae). Acarologia 6, 647 - 658