Межгосударственный стандарт ГОСТ 31769-2012 "Мед. Метод определения частоты встречаемости пыльцевых зерен" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1649-ст)

Honey. Determination of the relative frequency of pollen

Дата введения - 1 июля 2013 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Рабочей группой, состоящей из представителей Общества с ограниченной ответственностью "Тенториум" и Общества с ограниченной ответственностью "Центр исследований и сертификации "Федерал"

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. N 51)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Молдова	MD	Молдова-Стандарт
Россия	RU	Росстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4 Настоящий стандарт соответствует национальному немецкому стандарту DIN 10760:2002 Analysis of honey - Determination of the relative frequency of pollen (Анализ меда. Определение относительной частоты пыльцы).

Степень соответствия - неэквивалентная (NEQ).

Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52940-2008

5 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1649-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31769-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

6 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения частоты встречаемости пыльцевых зерен в меде.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ ISO 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ ISO 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 11293-89 Желатин. Технические условия

ГОСТ 19792-2001 Мед натуральный. Технические условия

ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия

ГОСТ 24104-2001* Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31766-2012 Меды монофлорные. Технические условия

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ ISO 5725-1, а также следующий термин с соответствующим определением:

3.1 частота встречаемости пыльцевых зерен (relative frequencies of the pollen): Доля пыльцевых зерен отдельного вида, выраженная в процентах от общего числа учитываемых пыльцевых зерен.

Примечание - Допускается определение принадлежности пыльцевых зерен к группе видов с морфологически сходными пыльцевыми зернами; совокупностям неопределяемых (деформированных) и неопределенных пыльцевых зерен; совокупности пыльцевых зерен, не принадлежащих к определенному(ым) виду(ам).

4 Отбор и подготовка пробы

Репрезентативную пробу меда массой не менее 200 г отбирают по ГОСТ 31766, ГОСТ 19792. Закристаллизованный мед размягчают в термостате по 6.8 или на термостатируемой водяной бане.

Мед с примесями процеживают через сито. Крупные механические частицы удаляют вручную.

Сотовый мед (без перговых ячеек) отделяют от сот при помощи сита без нагревания. Пробу интенсивно и тщательно перемешивают не менее 3 мин.

5 Сущность метода

Пыльцевые зерна концентрируют из раствора меда центрифугированием, готовят препарат для световой микроскопии, идентифицируют определенное количество пыльцевых зерен и вычисляют процентную долю пыльцевых зерен отдельных видов от общего числа учтенных пыльцевых зерен.

6 Средства измерения, вспомогательные устройства и материалы

Обычная лабораторная аппаратура, а также указанная в 6.1 - 6.12.

6.1 Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более 0,01 г.

6.2 Дозатор пипеточный или механический одноканальный с объемом дозирования до 1  или пипетка стеклянная градуированная номинальной вместимостью 1,0  по ГОСТ 29227.

6.3 Цилиндр мерный стеклянный вместимостью 50 - 100  по ГОСТ 1770.

6.4 Микроскоп световой общего назначения, микроскоп биологический с увеличением .

6.5 Центрифуга, позволяющая получать центростремительное ускорение 1000 g.

Примечание Центростремительное ускорение при измерении в единицах рассчитывают по формуле:

,

(1)

где r - расстояние от оси вращения до точки осаждения (дно центрифужной пробирки в рабочем положении), см;

f - частота вращения (число оборотов), .

Необходимую частоту вращения f при работе на центрифуге конкретной модели вычисляют по формуле

.

(2)

6.6 Сито из нержавеющей стали, диаметр отверстий 0,5 мм.

6.7 Водяная баня.

6.8 Термостат или другое устройство, позволяющее производить равномерный нагрев до 40°С.

6.9 Пробирки стеклянные центрифужные вместимостью не менее 40  по ГОСТ 25336.

6.10 Стекло предметное по ГОСТ 9284.

6.11 Стекло покровное по ГОСТ 6672.

6.12 Стакан стеклянный номинальной вместимостью 50 - 100  по ГОСТ 25336.

Допускается использование других средств измерений и лабораторного оборудования по метрологическим, техническим характеристикам и качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.

7 Реактивы

7.1 Глицериновый желатин для микроскопии или глицериновый желатин, приготовленный по 8.1.1.

Примечание - Рекомендуется использовать глицериновый желатин указанной марки, так как осмотические свойства среды заключения влияют на морфологию и достоверность идентификации пыльцевых зерен.

7.2 Глицерин по ГОСТ 6259, ч.

7.3 Желатин пищевой по ГОСТ 11293.

7.4 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

7.5 Фенол по ГОСТ 23519.

Допускается использование других реактивов по качеству и чистоте не ниже указанных в настоящем стандарте.

8 Проведение испытаний

8.1 Подготовка к испытаниям

8.1.1 Глицериновый желатин готовят следующим образом: 10 г желатина по ГОСТ 11293 заливают 60  дистиллированной воды по ГОСТ 6709 и выдерживают 2 - 3 ч для набухания (смесь 1); в 70  глицерина по ГОСТ 6259 растворяют 0,1 г фенола по ГОСТ 23519, вливают в смесь 1 и, перемешивая, нагревают на водяной бане до образования однородной массы. При этом следует избегать попадания в глицериновый желатин пузырьков воздуха.

8.2 Приготовление препарата меда

8.2.1 В стакане по ГОСТ 25336 взвешивают (10,00,1) г меда, подготовленного по разделу 4, растворяют в 20  дистиллированной воды, нагретой до температуры не выше 40°С, и переносят в центрифужную пробирку по ГОСТ 25336. Раствор центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 1000 g.

8.2.2 Надосадочную жидкость осторожно сливают, к осадку добавляют 20  дистиллированной воды и перемешивают. Полученную суспензию центрифугируют 5 мин при 1000 g. Надосадочную жидкость декантируют, центрифужную пробирку помещают на фильтровальную бумагу под углом 45° для удаления остатков жидкости.

8.2.3 Осадок тщательно перемешивают микробиологической петлей или с помощью дозатора со сменным наконечником**, переносят на предварительно прогретое до 40°С предметное стекло по ГОСТ 9284 и равномерно распределяют по площади 22 х 22 мм микрошпателем или гранью покровного стекла по ГОСТ 6672. Стекло с осадком прогревают при температуре не выше 40°С до полного высушивания осадка.

8.2.4 Глицериновый желатин по 8.1.1 расплавляют на водяной бане при температуре не выше 40°С. На предварительно прогретое до температуры 40°С покровное стекло наносят каплю глицеринового желатина и распределяют крестообразно по диагоналям. Покровное стекло медленно (во избежание появления воздушных пузырьков) опускают на подсушенный осадок. Для равномерного распределения глицеринового желатина и оптимального набухания пыльцы препарат прогревают в течение 5 мин при температуре не выше 40°С. Глицериновый желатин нельзя наносить непосредственно на высохший осадок.

Просмотр препарата под микроскопом проводят после застывания глицеринового желатина.

8.2.5 Если в препарате обнаружена низкая плотность пыльцевых зерен, то его готовят вновь из большего количества меда, сохраняя при этом пропорции, указанные в 8.2.1. В случае высокого содержания пыльцы препарат готовят из части осадка, полученного по 8.2.2. Для этого пипеткой по ГОСТ 29227 или дозатором перемешивают осадок в центрифужной пробирке с 0,5 - 1,0  воды. Необходимое количество суспензии равномерно распределяют по предметному стеклу и высушивают, как описано в 8.2.3.

8.3 Подсчет пыльцевых зерен

8.3.1 При предварительном просмотре под микроскопом по 6.4 оценивают плотность и разнообразие пыльцевых зерен в препарате, проводят идентификацию присутствующих морфологических типов пыльцевых зерен. Увеличение микроскопа должно быть достаточным для достоверной идентификации.

8.3.2 При подсчете пыльцевых зерен подбирают такое увеличение микроскопа, чтобы их число в каждом поле зрения было счетным. Скопления пыльцевых зерен, которые относятся к перге, не учитывают.

8.3.3 Поля зрения, в которых проводят подсчет (счетные поля), должны быть, по возможности, равномерно распределены по рядам. При смене счетного поля, во избежание субъективного выбора, препарат рекомендуется перемещать без наблюдения в окуляр микроскопа. Интервал между счетными полями зависит от плотности пыльцевых зерен в препарате. В случае анализа меда с низким содержанием пыльцы следует подсчитывать одну непрерывную линию.

8.3.4 По каждому ряду подсчитывают не менее 100 пыльцевых зерен. Первые пять рядов распределяют равномерно по площади препарата, как изображено на рисунке 1. Таким образом, сумма подсчитанных пыльцевых зерен должна составлять не менее 500.

8.3.5 В каждом счетном поле подсчитывают количество пыльцевых зерен искомого(ых) вида(ов) растений , а также общее количество пыльцевых зерен , принадлежащих:

- всем видам растений;

- видам растений, выделяющих нектар, без подсчета пыльцевых зерен видов, не выделяющих нектар (перечень не выделяющих нектар растений приведен в приложении А);

- видов растений, выделяющих нектар, без подсчета пыльцевых зерен отдельного(ых) вида(ов).

"Рисунок 1 - Схема расположения счетных полей при подсчете пыльцевых зерен под микроскопом"

Вариант подсчета числа пыльцевых зерен выбирает исполнитель в зависимости от целей исследования.

8.3.6 Если для интерпретации результатов недостаточно 500 учтенных пыльцевых зерен, следует подсчитывать не менее 1000 пыльцевых зерен. Для этого дополнительные пять рядов счетных полей размещают между первыми пятью рядами, как изображено на рисунке 1.

9 Обработка и представление результатов испытаний

9.1 Частоту встречаемости пыльцевых зерен отдельного вида растений , %, рассчитывают по формуле

,

(3)

где - число пыльцевых зерен отдельного вида во всех счетных полях;

n = - общее количество подсчитанных пыльцевых зерен во всех счетных полях;

100 - коэффициент пересчета относительных долей в проценты.

9.2 При представлении результатов испытаний относительно пыльцевых зерен видов растений, выделяющих нектар, следует указать частоту встречаемости этих пыльцевых зерен относительно общего количества пальцевых зерен всех видов.

9.3 За результат испытаний принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, полученных в условиях повторяемости, если расхождение между ними не превышает предел повторяемости r по ГОСТ ISO 5725-6. Значение предела повторяемости r приведено в таблице 1.

При превышении предела повторяемости r целесообразно произвести дополнительное определение частоты встречаемости пыльцевых зерен и получить еще один результат. Если при этом расхождение () результатов трех определений не превосходит значения критического диапазона (3), то в качестве окончательного результата принимают среднеарифметическое значение результатов трех определений. Значение критического диапазона (3) приведено в таблице 1.

Таблица 1

Общее количество подсчитанных пыльцевых зерен n	Предел повторяемости r	Критический диапазон для трех результатов (3)	Предел воспроизводимости R
500 и более	0,15	0,18	0,30

При невыполнении этого условия проводят повторные испытания.

9.4 Расхождение между результатами испытаний, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости R по ГОСТ ISO 5725-6. При выполнении этого условия приемлемы оба результата испытания и в качестве окончательного результата может быть использовано их среднеарифметическое значение. Значение предела воспроизводимости R приведено в таблице 1.

9.5 Результат испытаний представляют в виде значения, округленного до сотых долей в диапазоне частоты встречаемости от 0,1% до 1,0%; десятых долей - от 1,0% до 10,0%; целых чисел - от 10,0% до 100,0%.

9.6 Пример определения числа пыльцевых зерен, частоты встречаемости пыльцевых зерен отдельных видов представлен в приложении Б; примеры расчета повторяемости и воспроизводимости при определении частоты встречаемости пыльцевых зерен - в приложении В.

10 Характеристика погрешности испытаний

10.1 Погрешность результатов испытаний, получаемых согласно данному методу, не превышает 0,21, при доверительной вероятности Р = 0,95.

_______________________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

** Рекомендуется применять дозатор со сменным наконечником, чтобы избежать попадания в препарат пыльцы из других образцов меда.

Библиография

[1]	Маевский П.Ф.	Основы и методы. - М.: Изд-во МГУ, 2004, 312 с. Флора средней полосы европейской части России. 10-е изд. Москва: Товарищество научных изданий КМК, 2006, 600 с.
[2]	Louveaux J., Maurizio A., VorwohlG	Methods of melissopalinology. Bee World, v. 59 (1978), p. 139 - 57