Межгосударственный стандарт ГОСТ 31765-2012 "Вина и виноматериалы. Определение синтетических красителей методом капиллярного электрофореза" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1686-ст)

Wines and wine materials. Determination of synthetic dyes by capillary electrophoresis method

Дата введения - 1 июля 2013 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Государственным научным учреждением "Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства" Россельхозакадемии (ГНУ "СКЗНИИСиВ" Россельхозакадемии)

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 15 ноября 2012 г. N 42)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Казахстан	KZ	Госстандарт Республики Казахстан
Кыргызстан	KG	Кыргызстандарт
Молдова	MD	Молдова-Стандарт
Российская Федерация	RU	Росстандарт
Таджикистан	TJ	Таджикстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1686-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31765-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 года

5 Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53154-2008

6 Введен впервые

Введение

Настоящий стандарт разработан в целях установления требований к проведению испытания по определению массовой концентрации синтетических красителей в винодельческой продукции методом капиллярного электрофореза.

Метод определения массовой концентрации синтетических красителей с использованием капиллярного электрофореза обеспечивает необходимую точность и позволяет отказаться от длительного процесса пробоподготовки и использования специфической аппаратуры, применяемой при решении подобных задач другими аналитическими методами, в частности, методами тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Метод обеспечивает получение сопоставимых результатов и повышает достоверность информации для потребителя.

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на винодельческую продукцию и устанавливает метод определения массовой концентрации синтетических красителей в диапазоне измерений от 0,002 до 0,200 на основе измерения их массовых концентраций посредством капиллярного электрофореза.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ ИСО 5725-2-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3652-69 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия

ГОСТ 3956-76 Силикагель технический. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 10652-73 Реактивы. Сольдинатриевая этилендиамин-N, N, N`, N`-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б). Технические условия

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31730-2012 Продукция винодельческая. Правила приемки и методы отбора проб

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Требования безопасности

Требования электробезопасности при работе с приборами - по ГОСТ 12.1.019.

При выполнении анализов необходимо выполнять требования безопасности при работе с химическими реактивами согласно ГОСТ 12.1.007.

К выполнению измерений методом капиллярного электрофореза допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера, прошедшего соответствующий курс обучения.

4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы

Прибор капиллярного электрофореза, оснащенный кварцевым капилляром длиной не менее 50 см до детектора, внутренним диаметром 75 мкм, фотометрическим детектором, работающим на длине волны 254 нм или спектрофотометрическим детектором в интервале длин волн от 200 до 300 нм и блоком высокого напряжения отрицательной полярности и электронно-вычислительная машина (компьютер) с программным обеспечением для регистрации и обработки электрофореграмм.

Спектрофотометр, позволяющий измерять оптическую плотность растворов, с диапазоном измерения длин волн от 400 до 700 нм.

Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания 0,0001 г.

Шкаф сушильный с диапазоном температур в рабочей камере от 40°С до 200°С и основной погрешностью стабилизации температуры 1°С.

Термометр жидкостный стеклянный с диапазоном измерения от 0°С до 100°С и ценой деления 1°С по ГОСТ 28498.

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1, 2, 5, 10  по ГОСТ 29227.

Колбы мерные 2-250-2, 2-100-2, 2-50-2, 2-25-2 по ГОСТ 1770.

Стаканы химические по ГОСТ 25336.

Стаканчик СВ-14/8 по ГОСТ 25336.

Водяная баня.

Эксикатор по ГОСТ 25336.

Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.

Центрифуга лабораторная с частотой вращения ротора не менее 6000 об/мин.

Пробирки одноразовые (типа Эппендорфа) вместимостью 1,5 .

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Кислота соляная по ГОСТ 3118.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

Кислота лимонная безводная по ГОСТ 3652.

Тетраметилэтилендиамин (N,N,N,N-tetramethylethylenediamine) с содержанием основного вещества 99,5%.

Трилон Б по ГОСТ 10652.

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии с содержанием основного вещества не менее 99%.

Силикагель по ГОСТ 3956.

Красители синтетические стандартные в соответствии с приложением А.

Допускается применение средств измерений и вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов по качеству не хуже указанных.

5 Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 31730.

6 Сущность метода

Метод капиллярного электрофореза для определения массовых концентраций синтетических пищевых красителей основан на разделении их под действием электрического поля в капилляре в условиях, способствующих подавлению влияния посторонних веществ. Идентификацию и количественное определение анализируемых красителей проводят, регистрируя поглощение при длине волны 254 или 215 нм.

7 Метрологические характеристики

7.1 Диапазон измерения

Диапазон измеряемых концентраций с учетом разбавления от 0,002 до 0,200 .

7.2 Прецизионность метода

Показатели прецизионности метода определены в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-2 и представлены в таблице 1.

Таблица 1

Предел повторяемости r, %, Р = 0,95	11
Предел воспроизводимости R, %, Р = 0,95	15
Границы относительной погрешности 5 при вероятности Р = 0,95, %	18

8 Требования к условиям выполнения измерений

Подготовку проб и измерения проводят в лабораторных условиях при температуре окружающего воздуха (235)°С, атмосферном давлении от 87 до 107 кПа, относительной влажности воздуха не более 80%, частоте переменного тока (500,4) Гц, напряжении в сети 220 В.

9 Подготовка к выполнению измерений

9.1 Приготовление буферных и вспомогательных растворов

9.1.1 Раствор гидроксида натрия массовой долей 4%

В 50 - 60  дистиллированной воды растворяют 4 г гидроксида натрия. По окончании растворения разбавляют дистиллированной водой до объема 100 .

Срок хранения в сосуде из полиэтилена с плотно завинчивающейся крышкой - 2 мес.

9.1.2 Раствор соляной кислоты массовой долей 3,5%

В мерную колбу вместимостью 100  помещают 8,3  соляной кислоты плотностью 1,18 , затем добавляют дистиллированную воду до метки и перемешивают. Срок хранения не ограничен.

9.1.3 Раствор лимонной кислоты молярной концентрации 0,05

В стакан вместимостью 25  отбирают навеску (0,2400,001) г безводной лимонной кислоты. В стакан добавляют 15  дистиллированной воды и перемешивают стеклянной палочкой до полного растворения. Затем раствор количественно переносят в мерную колбу (с пришлифованной пробкой) вместимостью 25 , доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - одна неделя.

9.1.4 Раствор тетраметилэтилендиамина молярной концентрации 0,05

В стакан вместимостью 25  отбирают навеску (0,1450,001) г тетраметилэтилендиамина. В стакан добавляют 10  дистиллированной воды (хранившейся с момента приготовления не более 4 сут) и перемешивают стеклянной палочкой. Затем раствор переносят в мерную колбу (с пришлифованной пробкой) вместимостью 25 , доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора в плотно закупоренной емкости при комнатной температуре - две недели.

9.1.5 Раствор трилона Б молярной концентрации 0,05

В стакан вместимостью 25  отбирают навеску (0,4650,001) г трилона Б. В стакан добавляют 15  дистиллированной воды и перемешивают стеклянной палочкой до полного растворения. Затем раствор количественно переносят в мерную колбу (с пришлифованной пробкой) вместимостью 25 , доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - 1 мес.

9.1.6 Рабочий буферный раствор

Раствор лимонной кислоты по 9.1.3, раствор тетраметилэтилендиамина по 9.1.4, раствор трилона Б по 9.1.5 и ацетонитрил смешивают в объемных соотношениях 4:3:1:1. Не допускают хранение рабочего буферного раствора более 2 сут с момента приготовления при нормальных условиях в плотно закупоренной емкости с пришлифованной или полиэтиленовой пробкой. Полученный рабочий буферный раствор помещают в пробирки типа Эппендорф в количестве 0,8  и центрифугируют 4 мин при 6000 об/мин.

9.2 Подготовка прибора и порядок проведения анализа

9.2.1 Прибор подготавливают к работе в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают следующие рабочие параметры:

- длина волны - 254 нм или 215 нм;

- напряжение "минус 25 кВ";

- дозирование пробы - пневматическое при 30 мБар в течение 5 с при напряжении 0 кВ;

- время анализа - 12 мин;

- рекомендуется термостатирование капилляра при температуре 25°С.

Перед измерениями подготавливают капилляр к работе, промывая его 3,5% раствором соляной кислоты (см. 9.1.2) в течение 3 мин, затем дистиллированной водой - 3 мин, затем 4%-ным раствором гидроокиси натрия (см. 9.1.1) в течение 3 мин, затем дистиллированной водой в течение 3 мин и далее рабочим буферным раствором (см. 9.1.6) в течение 3 мин. Капилляр промывают каждый раз при включении прибора. Между анализами капилляр промывают рабочим буфером в течение 2 мин. При сильном загрязнении капилляра, что проявляется в искажении электрофореграммы, допускается повторение начальной промывки.

9.2.2 Определение синтетических красителей в градуировочном растворе или исследуемой пробе проводится путем пневматического дозирования проб (30 мБар, 5с) и регистрации полученных данных в течение 12 мин в виде электрофореграмм. Процедуры градуировки и анализа исследуемых проб должны проводиться на одной длине волны.

Первое измерение на каждой порции буфера повторяют не менее двух раз. При сильном расхождении результатов первый отбрасывают. Содержимое одной пробирки с рабочим буферным раствором можно использовать для выполнения не более пяти измерений.

9.3 Приготовление градуировочных растворов

9.3.1 Приготовление исходных растворов синтетических красителей

В необходимое число стаканов вместимостью 50  каждый отбирают навески стандартных синтетических красителей с записью результата до четвертого знака.

Массу навески стандартного синтетического красителя m, г, рассчитывают с учетом массовой доли основного красящего вещества в образце по формуле

,

(1)

где 0,1 - масса основного красящего вещества, содержащегося в навеске стандартного синтетического красителя, г;

100 - коэффициент пересчета в проценты;

X - массовая доля основного красящего вещества в стандартном синтетическом красителе, %.

Массовую долю основного красящего вещества Х в стандартном синтетическом красителе определяют в соответствии с приложением Б.

В каждый стакан с навеской стандартного синтетического красителя прибавляют 20  дистиллированной воды и перемешивают стеклянной палочкой до полного растворения. Для интенсификации растворения допускается нагревание раствора в стакане на водяной бане до температуры не более 90°С. Затем раствор охлаждают до 20°С, количественно переносят в мерную колбу (с пришлифованной пробкой) вместимостью 100 , доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.

Полученный раствор контрольного образца синтетического красителя имеет массовую концентрацию основного красящего вещества 1 .

Срок хранения растворов контрольных образцов синтетических красителей в плотно закрытых склянках при температуре 2°С - 8°С - 3 мес.

9.4 Градуировка прибора

9.4.1 Рабочие градуировочные растворы (массовой концентрацией 0,025 и 0,050 ) готовят из растворов контрольных образцов синтетических красителей по 9.3.1. Для этого вносят в две мерные колбы (с пришлифованными пробками) вместимостью 100  пипетками по 2,5 и 5  раствора контрольных образцов синтетического красителя соответственно, затем доводят объемы растворов в колбах до метки дистиллированной водой, закрывают колбы пробками и тщательно перемешивают.

Срок хранения растворов в плотно закрытых склянках не более двух недель при температуре 2°C - 8°С.

9.4.2 Градуировочные растворы концентрацией 0,025, 0,050 отбирают мерной пипеткой в объеме 0,8  в пробирку Эппендорфа и центрифугируют 4 мин при 6000 об/мин для удаления растворенного воздуха. Проводят измерение (см. 9.2). Градуировочную характеристику получают, обрабатывая полученные экспериментальные данные при помощи программного обеспечения. Градуировка признается удовлетворительной, если коэффициент корреляции, рассчитанный программой, будет не менее 0,99. Градуировка прибора обязательно проводится заново в следующих случаях:

при замене капилляра;

при замене хотя бы одного из компонентов буферного раствора;

при изменении рабочего напряжения;

при изменении времени ввода пробы и давления ввода;

при отрицательных результатах контроля стабильности градуировочной характеристики. Пример электрофореграммы приведен в приложении В.

9.4.3 Приготовление раствора для контроля стабильности градуировочной характеристики

В мерную колбу вместимостью 100  вносят по 1  контрольных образцов синтетических красителей кармуазин (азорубин, Е122) и красный очаровательный AC (Е129), разбавляют до метки дистиллированной водой и перемешивают. Действительное значение массовой концентрации синтетических красителей составляет 0,010 .

Срок хранения раствора в плотно закрытых склянках из темного стекла не более двух недель при комнатной температуре. Контрольный раствор используется для проверки работоспособности прибора и для контроля стабильности градуировочной характеристики.

10 Приготовление пробы и проведение измерений

Исследуемые пробы разбавляют в 10 - 50 раз дистиллированной водой до концентрации анализируемых синтетических красителей не более 0,050 и центрифугируют 4 мин при 6000 об/мин. Измерение проводят по 9.2.

В случае затруднения идентификации какого-либо красителя рекомендуется использовать метод добавок. Для этого в анализируемую пробу вносится этот краситель с расчетом на увеличение концентрации на (10050)%, и измерение повторяется. Увеличение высоты соответствующего пика свидетельствует о правильной идентификации.

11 Обработка и оформление результатов измерений

11.1 Используя электрофореграмму подготовленных проб (см. раздел 10), при помощи программного обеспечения к прибору рассчитывают массовую концентрацию соответствующих синтетических красителей по установленным градуировочным зависимостям (см. 9.4.2). Массовую концентрацию синтетических красителей в исследуемой пробе X, , вычисляют по формуле

Х = kС,

(2)

где k - коэффициент разбавления пробы (раздел 10);

С - концентрация красителя, найденная по градуировочному графику, .

11.2 За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение , , двух параллельных определений массовой концентрации красителя, полученных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

,

(3)

где - максимальная массовая концентрация красителя в пробе, ;

- минимальная массовая концентрация красителя в пробе, ;

- среднее значение двух параллельных измерений массовой концентрации красителя в пробе, ;

r - значение предела повторяемости (см. таблицу), %.

11.3 Результат анализа представляют в виде

(),приР=0,95,,

где - среднеарифметическое значение двух определений массовой концентрации красителя в пробе, признанных приемлемыми, ;

- границы абсолютной погрешности определения, , при доверительной вероятности Р = 0,95.

11.4 Границы абсолютной погрешности вычисляют по формуле

,

(4)

где - границы относительной погрешности измерения (см. таблица 1), %;

X - среднеарифметическое значение двух определений массовой концентрации синтетических красителей в исследуемой пробе, .

Числовое значение результата определения должно оканчиваться цифрой того же разряда, что и значение границы абсолютной погрешности.