Межгосударственный стандарт ГОСТ 33428-2015 "Корма, премиксы. Определение содержания лизина, метионина и треонина" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 2 октября 2015 г. N 1445-ст)

Feeds, premixtures. Determination of lysine, methionine and threonine

Дата введения - 1 января 2017 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (ОАО "ВНИИКП") основе официального перевода на русский язык английской версии международного стандарта, указанного в пункте 5

2 Внесен Межгосударственным техническим комитетом по стандартизации МТК 4 "Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы"

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 августа 2015 г. N 79-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по MK (ИСО 3166) 004-97	Код страны по MK (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения Беларусь Киргизия Россия	AM BY KG RU	Минэкономики Республики Армения Госстандарт Республики Беларусь Кыргызстандарт Росстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 2 октября 2015 г. N 1445-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33428-2015 (ISO 17180:2013) введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.

5 Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному стандарту ISO 17180:2013 "Корма для животных. Определение содержания лизина, метионина и треонина в коммерческих аминокислотных продуктах и премиксах" ("Animal feeding stuffs - Determination of lysine, methionine and threonine in commercial amino acid products and premixtures", MOD) путем изменения его структуры для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.5).

Международный стандарт разработан подкомитетом ISO/ТС 34/SC 10 "Корма для животных" технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).

Уточненные отдельные слова, фразы, абзацы внесены в текст межгосударственного стандарта для приведения в соответствие с отраслевой терминологией и выделены курсивом. Дополнительные примечания, разделы и таблица выделены полужирным курсивом.

В настоящем стандарте заменены единицы измерения объема "литр" на "дециметр кубический", "миллилитр" на "сантиметр кубический" для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5-2001 (пункт 4.14.1).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта в соответствии с требованиями межгосударственной системы стандартизации и общепринятой отраслевой терминологией.

В настоящем стандарте ссылки на международные стандарты, используемые в примененном международном стандарте, заменены на межгосударственные стандарты, гармонизированные с международными.

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов.

Сравнение структуры настоящего стандарта со структурой указанного международного стандарта приведено в дополнительном приложении ДА

6 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод количественного определения свободных (не входящих в состав белков) лизина, метионина и треонина (далее - аминокислот) в комбикормовой продукции и комбикормовом сырье, содержащих более 10% массовой доли соответствующей аминокислоты.

Метод не позволяет различить D- и L-формы.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3652-69 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80* Комбикорма, комбикормовое сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 25336-82 посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 28311-89 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Сущность метода

Пробы обрабатывают раствором соляной кислоты, разбавляют цитратным буфером и добавляют внутренний стандарт норлейцина. Аминокислоты разделяют на аминокислотном анализаторе или высокоэффективной жидкостной хроматографией с использованием катионообменной смолы и цитратного буфера в качестве элюента, проводят дериватизацию нингидрином или ортофталдиальдегидом (ОРА) и детектируют с помощью фотометрического или флуоресцентного детектора соответственно.

4 Оборудование

4.1 Стаканы В(Н)-1(2)-100(250, 1000) ТХС по ГОСТ 25336.

4.2 Колбы мерные 1(2)-50(100, 1000)-2 по ГОСТ 1770.

4.3 Цилиндры мерные 1(2)-100(1000) по ГОСТ 1770.

4.4 Пипетки градуированные 1(2, 3, 5)-1(1а, 2, 2а)-1-5(10) по ГОСТ 29227.

4.5 Мешалка магнитная или блендер механический.

4.6 Фильтры мембранные из ацетата целлюлозы или PVDF с размером пор 0,2 мкм.

4.7 Дилютор для объемного разведения.

Если дериватизацию проводят с нингидрином, то используют разбавление в соотношении 1:20. Для ОРА дериватизации используют более высокий коэффициент разбавления. Необходимо регулярно проверять коэффициент вариации CV при разведении; CV должен быть не менее 1%.

4.8 рН-метр

рН-метр или иономер с диапазоном измерений активности водородных ионов от 0 до 14ед. рН и пределом допускаемой абсолютной погрешности измерения не более 0,05 ед. рН.

4.9 Весы неавтоматического действия специального класса точности с пределами допускаемой погрешности не более 0,0005 г (100,0 0,5) мг по ГОСТ R OIML 76-1.

4.10 Анализатор аминокислотный или другое оборудование для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), включающее:

4.10.1 колонку с подготовленной катионообменной смолой;

4.10.2 предколонку;

4.10.3 инжектор автоматический или ручной с объемом ввода от 10 до 100 ;

4.10.4 ВЭЖХ насосы для буферов;

4.10.5 систему постколоночной дериватизации с нингидрином или ОРА;

4.10.6 УФ-детектор канальный, установленный на 440 и 570 нм для постколоночной дериватизации с нингидрином, или детектор флуоресцентный с длиной волны возбуждения 330 нм и длиной волны излучения 460 нм для постколоночной дериватизации с ОРА;

4.10.7 систему регистрации и обработки данных.

4.11 Дозаторы пипеточные одноканальные переменного объема 10 - 100, 100 - 1000, 1000 - 5000  по ГОСТ 28311.

4.12 Пробирки однократного применения (типа Эппендорф) вместимостью 1,5 .

4.13 Сито с размером стороны ячейки 0,25 мм.

4.14 Мельница лабораторная или ступка.

4.15 Колбы Кн-1(2)-500-34/35 ТХС по ГОСТ 25336.

5 Реактивы и материалы

5.1 Вода бидистиллированная или эквивалентного качества (проводимость менее 10 мкс/см).

5.2 Стандарты определяемых аминокислот с массовой долей основного вещества не менее 99%, высушенные под вакуумом в эксикаторе над пятиокисью фосфора в течение двух дней перед использованием.

5.2.1 Лизин HCI кристаллический.

5.2.2 Треонин кристаллический.

5.2.3 Метионин кристаллический.

5.3 Норлейцин кристаллический для использования в качестве внутреннего стандарта с массовой долей основного вещества не менее 99%, высушенный под вакуумом в эксикаторе нар, пятиокисью фосфора в течение двух дней перед использованием.

5.4 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

5.5 Кислота соляная по ГОСТ 3118.

5.6 Натрий лимоннокислый двуводный.

5.7 2,2'-Тиодитанол (тиодигликоль) с содержанием основного вещества не менее 95,0%

5.8 Фенол кристаллический с массовой долей основного вещества не менее 98,5%.

5.9 Буферы элюирующие для катионообменной колонки.

Используют имеющиеся в продаже готовые буферы или готовят их в соответствии с инструкцией к используемому анализатору. Обычно используют от трех до пяти буферных растворов, содержащих карбонат или цитрат натрия и небольшие количества добавок или консервантов.

5.10 Нингидрин или ОРА. Используют имеющиеся в продаже реактивы или готовят их в соответствии с инструкцией к используемому анализатору.

5.11 Оксид фосфора (V) с содержанием основного вещества не менее 98%.

5.12 Кислота лимонная по ГОСТ 3652.

5.13 Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

Примечание - Допускается использование реактивов аналогичной квалификации.

6 Приготовление растворов

6.1 Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 7,5

Гидроокись натрия массой 300,0 г растворяют в воде (см. 5.7) небольшими порциями при перемешивании и после охлаждения доводят объем раствора водой до 1000 .

Срок хранения раствора не ограничен.

6.2 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,1

В мерную колбу вместимостью 1000  (см. 4.3) помещают 8,2  соляной кислоты (см. 5.5), добавляют около 900  воды (см. 5.1), тщательно перемешивают и доводят водой (см. 5.1) объем раствора до метки.

Срок хранения раствора не ограничен.

6.3 Приготовление цитратного буфера 2,20 ед. рН

В стакан вместимостью 1000  помещают 19,61 г двуводного лимоннокислого натрия (см. 5.6), 1 г фенола (см. 5.8), 5 тиодигликоля (см. 5.7), 16,5  соляной кислоты (см. 5.5) и растворяют их в 800  бидистиллированной воды (фенол используют для сохранения буферного раствора). Доводят рН раствора до 2,20 ед. рН несколькими каплями раствора соляной кислоты (см. 5.5) или раствора гидроокиси натрия (см. 6.1).

Цитратный буфер может быть приготовлен из лимонной кислоты и хлорида натрия.

Срок хранения раствора при комнатной температуре в местах, защищенных от попадания прямых солнечных лучей, - 2 мес. При наличии в растворе помутнения и хлопьевидного осадка раствор следует заменить свежеприготовленным.

6.4 Приготовление стандартных растворов аминокислот

6.4.1 Приготовление основного раствора норлейцина молярной концентрации 2,5

В стакане вместимостью 100 (250) растворяют 0,328 г норлейцина (см 5.3) в растворе соляной кислоты (см. 6.2), количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000  и доводят объем до метки тем же раствором (см. 6.2).

Срок хранения раствора при температуре ниже 5°С - не более 6 мес.

6.4.2 Приготовление основных растворов аминокислот молярной концентрации 2,5 м

Готовят основные растворы для каждой аминокислоты.

Основные растворы должны содержать только анализируемые аминокислоты, т.е. лизин, треонин, метионин. Не рекомендуется использовать имеющиеся в продаже готовые смеси, например содержащие 18 аминокислот, т. к. они дают большую погрешность определения.

В три мерные колбы вместимостью 1000  помещают соответственно 0,456 г лизина гидрохлорида (см.. 5.2.1), 0,297 г треонина (см. 5.2.2), 0,373 г метионина (см. 5.2.3), доводят объем в колбах до метки раствором соляной кислоты (см. 6.2).

Срок хранения растворов при температуре ниже 5°С - не более 6 мес.

6.4.3 Приготовление градуировочных растворов аминокислот

6.4.3.1 Весовое разведение

В колбы вместимостью 50  взвешивают (см. 4.9) по 2,5  основного раствора каждой аминокислоты (см. 6.4.2) и 2,5  основного раствора норлейцина () (см. 6.4.1). Доводят объем раствора в колбе до метки цитратным буфером (см. 6.3).

Срок хранения раствора при температуре ниже 5°С - не более 1 нед.

6.4.3.2 объемное разведение

С помощью пипеточного дозатора (см. 4.11) или дилютора (см. 4.7) разбавляют равные объемы основных растворов аминокислот (см. 6.4.2) и основного раствора норлейцина (см. 6.4.1) цитратным буфером (см. 6.3). Например, 50  основного раствора норлейцина и 50  основного раствора аминокислоты разбавляют в пробирке однократного применения (типа Эппендорф) или дилюторе цитратным буфером до 1000 .

7 Отбор и подготовка проб

7.1 Отбор проб - по ГОСТ 13496.0.

7.2 Подготовка проб

Пробу измельчают на лабораторной мельнице или в ступке (см. 4.15) до прохода через сито с размером стороны ячейки 0,25 мм (см. 4.14) и тщательно перемешивают.

8 Проведение испытания

8.1 Количество испытаний

Для каждой пробы проводят два параллельных испытания в условиях повторяемости.

8.2 Приготовление анализируемых растворов с использованием весового разведения

8.2.1 Приготовление анализируемых растворов аминокислот

Взвешивают 0,45 - 0,47 г лизина гидрохлорида, 0,29 - 0,31 г треонина и 0,36 - 0,38 г метионина. Навески переносят во взвешенные конические колбы (см. 4.16) вместимостью 500  и добавляют примерно по 400  раствора соляной кислоты (см. 6.2). Колбы помещают на магнитную мешалку (см. 4.5) и перемешивают содержимое в течение 30 мин. Взвешивают колбы с растворами и вычисляют массу экстракционного раствора .

С помощью пипеточного дозатора (см. 4.12) берут аликвоту 1  в предварительно взвешенную мерную колбу вместимостью 50  и определяют массу аликвоты . В ту же колбу помещают 2,5  раствора норлейцина (см. 6.4.1), взвешивают колбу и вычисляют его массу , затем доводят объем раствора до метки цитратным буфером (см. 6.3) и тщательно перемешивают.

Если приготовленный раствор не был проанализирован в день приготовления, то он должен храниться при температуре ниже 5°С не более трех дней.

8.2.2 Приготовление анализируемых растворов премиксов и смесей аминокислот

Если в продукте ожидается низкое содержание аминокислот, то примерную массу навески продукта г, вычисляют по формуле

,

(1)

где - масса навески анализируемой аминокислоты, г;

100 - коэффициент пересчета из процентов;

- ожидаемое низкое значение массовой доли аминокислоты, %.

Например, для премикса с массовой долей DL-метионина 20% требуется навеска в размере от 1,8 до 1,9 г.

Рассчитанные навески взвешивают в предварительно взвешенные конические колбы (см. 4.16) вместимостью 500 . Добавляют примерно по 400  раствора соляной кислоты (см. 6.2). Колбы помещают на магнитную мешалку (см. 4.5) и перемешивают содержимое в течение 30 мин. Взвешивают колбы с растворами и вычисляют массу экстракционного раствора .

С помощью пипеточного дозатора (см. 4.12) берут аликвоту 1  в предварительно взвешенную мерную колбу вместимостью 50  и определяют массу аликвоты . В ту же колбу помещают 2,5  раствора норлейцина (см. 6.4.1), взвешивают колбу и вычисляют его массу , затем доводят объем раствора до метки цитратным буфером (см. 6.3) и тщательно перемешивают.

Если в продукте ожидается высокое содержание аминокислот, то можно готовить разведения, используя аликвоту менее 1  экстракционного раствора плюс 2,5  раствора норлейцина .

Если анализируемый раствор не был использован вдень приготовления, то он должен храниться при температуре ниже 5°С - не более 3 дней.

8.3 Приготовление анализируемых растворов с использованием объемного разведения

8.3.1 Приготовление анализируемых растворов аминокислот

Взвешивают 0,45 - 0,47 г лизина HCI, 0,29 - 0,31 г треонина, 0,36 - 0,38 г метионина. Навеску аминокислоты количественно переносят с раствором соляной кислоты (см. 6.2) в мерную колбу вместимостью 1000 , добавляют раствор соляной кислоты до объема примерно 900 и перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин. Доводят объем раствором кислоты до метки и тщательно перемешивают.

Разведение полученного раствора и добавление раствора норлейцина проводят по 6.4.3.2.

Если анализируемый раствор не был использован в день приготовления, то он должен храниться при температуре ниже 5°С не более 3 дней.

8.3.2 Приготовление анализируемых растворов премиксов и смеси аминокислот

Если в продукте ожидается низкое содержание аминокислот, то примерную массу навески продукта г, рассчитывают, как описано в 8.2.2. Для экстракции используют такие навески, чтобы гарантировать, что площади пиков всех аминокислот войдут в линейный диапазон градуировки. Навеску количественно переносят с раствором соляной кислоты (см. 6.2) в мерную колбу вместимостью 1000 , добавляют раствор соляной кислоты до объема примерно 900  и перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин. Доводят объем раствором кислоты до метки и тщательно перемешивают.

Разведение полученного раствора и добавление раствора норлейцина проводят по 6.4.3.2.

Если в продукте ожидается высокое содержание аминокислот, то можно готовить разведения, используя аликвоту менее 1  экстракционного раствора плюс 2,5  раствора норлейцина.

Если анализируемый раствор не был использован в день приготовления, то он должен храниться при температуре ниже 5°С - не более 3 дней.

8.4 Хроматография

Необходимый объем анализируемого раствора фильтруют через мембранный фильтр (см. 4.6) в виалу автосэмплера и вводят в аминокислотный анализатор или систему ВЭЖХ (см. 4.10). Вводимый объем, как правило, составляет 20 - 50 .

Хроматографическая система должна разделять аминокислоты друг от друга и от других компонентов (например, аммония, аминов, пептидов или аминосахаров).

Пики анализируемых аминокислот должны быть разделены полностью до базовой линии ото всех других полученных пиков, для того чтобы избежать ошибочных результатов, вызванных наложением пиков. Хроматографическая система должна обеспечивать линейную зависимость в диапазоне концентраций градуировочных растворов.

9 Обработка результатов

9.1 Градуировка и контроль стабильности градуировочной характеристики

Содержание аминокислот в анализируемых пробах определяют с использованием градуировочных растворов (см. 6.4.3). Для того чтобы убедиться в отсутствии дрейфа, для контроля стабильности вводят градуировочный раствор после каждых четырех определений. Если при этом полученные результаты определения массовой концентрации аминокислоты в градуировочном растворе не укладываются в диапазон от 99% до 101%, то градуировку проводят заново.

Определяют площади пиков градуировочных растворов и анализируемых растворов испытуемых проб и рассчитывают массовую долю аминокислоты в пробе по 9.2 или 9.3.

9.2 Вычисление результатов при весовом разведении

Вычисляют коэффициент чувствительности для каждой аминокислоты по формуле

,

(2)

где - площадь пика норлейцина в градуировочном растворе;

- масса 2,5  основного раствора аминокислоты, г;

- площадь пика аминокислоты в градуировочном растворе;

- масса 2,5  основного раствора норлейцина, г.

Вычисляют массовую долю аминокислоты в пробе , %, используя формулу

,

(3)

где - площадь пика аминокислоты в анализируемом растворе;

- коэффициент чувствительности аминокислоты;

- концентрация аминокислоты в основном растворе, , предполагая, что 1000  раствора весит 1 кг, г/кг;

- масса 2,5  основного стандартного раствора норлейцина в анализируемом растворе, г;

- масса экстракционного раствора, г;

100 - коэффициент перевода результата в проценты;

- площадь пика норлейцина в анализируемом растворе;

- масса навески, г;

- масса используемой аликвоты экстракционного раствора, г.

1000 - коэффициент согласования единиц массы.

9.3 вычисление результатов при объемном разведении

Вычисляют коэффициент чувствительности для каждой аминокислоты по формуле

,

(4)

где - площадь пика нейролицина в градуировочном растворе;

- площадь пика аминокислоты в градуировочном растворе.

Вычисляют массовую долю аминокислоты в анализируемой пробе , %, по формуле

,

(5)

где - площадь пика аминокислоты в анализируемом растворе;

- коэффициент чувствительности аминокислоты;

- концентрация аминокислоты в основном растворе, , предполагая, что 1000  раствора весит 1 кг, г/кг;

- площадь пика норлейцина в анализируемом растворе;

- масса навески, г.

Примечание - Массовую долю аминокислоты вычисляют в продукте естественной влажности. Для определения содержания аминокислоты на сухое вещество продукта необходимо вычислить массовую долю влаги и произвести пересчет массовой доли аминокислоты с учетом этого показателя. Если продукт перед анализом был высушен, то результат, полученный по формуле (3), соответствует содержанию аминокислоты на сухое вещество.

Полученная массовая доля лизина гидрохлорида может быть пересчитана в массовую долю лизина , %, по формуле

,

(6)

где - массовая доля лизина гидрохлорида, %;

1,25 - коэффициент пересчета лизина гидрохлорида в лизин.

10 Прецизионность

10.1 Межлабораторные испытания

Подробная информация о межлабораторных испытаниях на точность метода приведена в приложении А.

10.2 Повторяемость

Выполняют два параллельных испытания.

Рассчитывают относительную погрешность D, %, по формуле

,

(7)

где , - значения массовой доли аминокислоты в анализируемой навеске двух параллельных испытаний, %;

- среднее арифметическое значение результатов двух параллельных испытаний;

100 - коэффициент пересчета в проценты.

Принимают среднее арифметическое значение результатов двух испытаний, если D меньше 1,5%.

Если относительная погрешность больше, выполняют третье испытание анализируемой пробы и определяют среднее арифметическое значение трех испытаний. Если CV меньше или равен 3%, записывают среднее арифметическое значение трех испытаний.

Если CV выше 3%, повторяют испытание, начиная с гомогенизации лабораторных проб.

Если результаты двух новых испытаний снова не удовлетворяют условию D меньше 1,5%, то ошибка происходит при хроматографировании. Необходимо проверить анализатор и повторить все сомнительные испытания.

10.3 Воспроизводимость

Абсолютное расхождение между результатами двух отдельных испытаний, полученными одним и тем же методом, на идентичных пробах, в разных лабораториях, разными операторами, на различных экземплярах оборудования, не должно превышать более чем в 5% случаев предел воспроизводимости R, приведенный в приложении А.

11 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен содержать, по меньшей мере, следующую информацию:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

b) использованный метод отбора проб, если он известен;

c) использованный метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

d) все детали работы, не установленные в настоящем стандарте или считающиеся необязательными, наряду с подробностями всех случаев, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;

e) полученный(е) результат(ы) испытаний;

f) если повторяемость была проверена, полученный окончательный результат.

_____________________________

* В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 6497-2011 "Корма для животных. Отбор проб".