Национальный стандарт РФ ГОСТ Р 54414-2011 "Рыба и продукция из нее. Видовая идентификация рыбы методом электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле" (утв. и введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 сентября 2011 г. N 334-ст)

Fish and products from it. Species identification of fish by electrophoresis with sodium dodecyl sulphate in polyacrylamide gel method

ОКС 67.120.30
Н29
ОКСТУ 9209

Дата введения - 1 января 2013 г.
Введен впервые

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 Разработан Открытым акционерным обществом "Научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт по развитию и эксплуатации флота" (ОАО "Гипрорыбфлот")

2 Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 299 "Консервы и пресервы из рыбы и нерыбных объектов, тара, методы контроля"

3 Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 сентября 2011 г. N 334-ст

4 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на отварную, копченую, соленую продукцию с массовой долей поваренной соли не более 5,5% и фаршевые изделия из рыбы, а также рыбу-сырец, охлажденную, мороженую, используемую для приготовления этой продукции, и устанавливает метод электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле (далее - SDS-электрофорез) для видовой идентификации рыбы.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 52840-2007 Рыба и продукция из нее. Видовая идентификация рыбы методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле.

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть первая. Метрологические и технические требования.

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 83-79 Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия

ГОСТ 244-76 Натрия тиосульфат кристаллический. Технические условия

ГОСТ 1277-75 Реактивы. Серебро азотнокислое. Технические условия

ГОСТ 1625-89 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 19814-74 Кислота уксусная синтетическая и регенерированная. Технические условия

ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31339-2006 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 SDS-электрофорез: Метод электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.

3.2 маркерные белки: Основные белки, характерные (видоспецифичные) для каждого вида анализируемого объекта. [ГОСТ Р 52840-2007, статья 3.2]

3.3 стандартные белки: Белки с известной молекулярной массой (ММ).

3.4 референс-образец: Образец продукции, используемый в качестве стандарта при оценке результатов идентификации.

4 Сущность метода

Метод основан на видовой специфичности белков мышечной ткани рыб и заключается в переводе белков исследуемого образца в раствор с помощью додецилсульфата натрия и дальнейшем разделении белковых молекул в соответствии с их молекулярной массой в градиентном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Идентификацию проводят путем сравнения картин электрофоретического распределения белковых фракций анализируемого образца с соответствующим референс-образцом.

5 Требования к оборудованию, материалам и реактивам

Для проведения анализа используют следующее оборудование, материалы и реактивы:

- универсальную модульную автоматизированную систему для разделения белков с использованием готовых гелевых сред в программируемом режиме и автоматической обработкой гелей (фиксация, окрашивание, отмывка), с контролем условий разделения (температуры, параметров тока) со следующими программными параметрами: напряжение от 10 до 2000 В, сила тока от 0,1 до 50,0 мА, мощность 7,0 Вт, температура от 0°С до 70°С или иное электрофоретическое оборудование для разделения белков методом SDS-электрофореза (далее - система);

- центрифугу рефрижераторную с частотой вращения не менее 12000 ;

- рН-метр - милливольтметр лабораторный рН - 673 М;

- пробирки центрифужные вместимостью 10 ;

- аппликатор с капиллярными отверстиями объемом 1 мкл для внесения образцов в гель;

- микродозатор с переменным объемом дозирования: от 0,5 до 10,0 (шаг - 0,1 , точность (1,5-5,0)%, воспроизводимость от 1,0% до 5,0%);

- наконечники для микродозаторов (микропипеток) с переменным объемом дозирования жидкостей;

- ступку фарфоровую по ГОСТ 9147;

- штамп для образца с лунками вместимостью не менее 1,5 мкл;

- весы неавтоматического действия II класса точности с допускаемой погрешностью взвешивания не более г по ГОСТ Р 53228;

- холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда по ГОСТ 26678;

- колбы стеклянные мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2 по ГОСТ 1770;

- цилиндры стеклянные мерные лабораторные 1-50-2, 1-100-2 по ГОСТ 1770;

- пипетки стеклянные 1-1-2-5, 1-1-2-10 по ГОСТ 29227;

- полоски буферные из агарозы;

- гели градиентные полиакриламидные с додецилсульфатом натрия, 10%-15%;

- пленку парафиновую;

- бумагу фильтровальную лабораторную по ГОСТ 12026;

- кислоту уксусную по ГОСТ 19814, х.ч,;

- спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, х.ч.;

- глицерин по ГОСТ 6259, ч.д.а.;

- 2-меркаптоэтанол, ч.д.а;

- додецилсульфат натрия, х.ч.;

- краситель бромфеноловый синий, ч.д.а;

- краситель кумасси R 250, ч.д.а;

- трис (гидроксиметил) аминометан гидрохлорид, х.ч.;

- трис (гидроксиметил) аминометан, х.ч.;

- воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

- альдегид глутаровый с содержанием основного компонента не менее 25%;

- серебро азотнокислое по ГОСТ 1277;

- натрий углекислый 12,5%-ный;

- натрия тиосульфат кристаллический по ГОСТ 244;

- формальдегид 37%-ный по ГОСТ 1625;

- набор стандартных белков для градуировки с известными молекулярными массами в диапазоне от 14400 до 97000 а.е.м.

Допускается использование других средств измерений и вспомогательного оборудования по метрологическим, техническим характеристикам и качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.

Допускается использование других реактивов, в том числе импортных, по качеству и чистоте не ниже вышеуказанных.

6 Отбор проб

Отбор проб проводят по ГОСТ 31339.

7 Приготовление растворов

7.1 Экстрагирующий раствор

В мерную колбу вместимостью 100 вносят 2 г додецилсульфата натрия и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.2 Буферный раствор

В мерную колбу вместимостью 50 вносят 5 водного раствора трис-буфера по 7.2.1, добавляют 4 глицерина, 8 10%-ного водного раствора додецилсульфата натрия, 2 2-меркаптоэтанола и 2 0,1%-ного водного раствора бромфенолового синего.

7.2.1 Приготовление водного раствора трис-буфера: в мерную колбу вместимостью 100 вносят 3 раствора трис (гидроксиметил) аминометана молярной концентрацией 0,5 и доводят объем до метки водным раствором трис (гидроксиметил) аминометан гидрохлорида молярной концентрацией 0,5 . Значение рН водного раствора трис-буфера должно составлять .

7.2.1.1 Приготовление водного раствора трис (гидроксиметил) аминометан гидрохлорида молярной концентрацией 0,5 : в мерную колбу вместимостью 1000 вносят 78,5 г трис (гидроксиметил) аминометан гидрохлорида и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.2.1.2 Приготовление водного раствора трис (гидроксиметил) аминометана молярной концентрацией 0,5 : в мерную колбу вместимостью 1000 вносят 60,5 трис (гидроксиметил) аминометана и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.2.2 Приготовление 10%-ного водного раствора додецилсульфата натрия: в мерную колбу вместимостью 100 вносят 10 г додецилсульфата натрия и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.2.3 Приготовление 0,1%-ного водного раствора бромфенолового синего: в мерную колбу вместимостью 100 вносят 0,1 г бромфенолового синего и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.3 Растворы для обработки гелей при окрашивании раствором кумасси

7.3.1 Приготовление промывного раствора: в мерную колбу вместимостью 1000 вносят 300 96%-ного этилового спирта, добавляют 600 дистиллированной воды и 100 уксусной кислоты.

7.3.2 Окрашивающий раствор состоит из основного и рабочего.

7.3.2.1 Приготовление основного раствора: в мерную колбу вместимостью 300 помещают 0,4 г кумасси, добавляют 80 дистиллированной воды и перемешивают в течение 5-10 мин. Добавляют 120 96%-ного этилового спирта и перемешивают еще 2 мин.

7.3.2.2 Приготовление рабочего раствора: в мерной колбе вместимостью не менее 100 смешивают 50 основного раствора с 50 раствора 20%-ной уксусной кислоты.

7.3.2.3 Приготовление раствора 20%-ной уксусной кислоты: 20 уксусной кислоты растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 и доводят до метки.

7.3.3 Приготовление консервирующего раствора: в мерную колбу вместимостью 1000 вносят 40 глицерина, 40 уксусной кислоты и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.4 Растворы для обработки гелей при окрашивании серебром

7.4.1 Приготовление промывного раствора: в мерную колбу вместимостью 1000 вносят 100 96%-ного этилового спирта, добавляют 850 дистиллированной воды и 50 уксусной кислоты.

7.4.2 Приготовление окрашивающего раствора: в мерную колбу вместимостью 100 вносят () г азотнокислого серебра и доводят объем дистиллированной водой до метки.

7.4.3 Приготовление раствора, усиливающего окраску: в мерной колбе вместимостью 100 смешивают 30 25%-ного глутарового альдегида и 60 дистиллированной воды.

7.4.4 Приготовление раствора, развивающего окраску: в мерную колбу вместимостью 1000 вносят 200 12,5%-ного раствора углекислого натрия, 800 дистиллированной воды и 0,4 37%-ного формальдегида.

7.4.5 Приготовление раствора, останавливающего окраску: в мерную колбу вместимостью 100 вносят () г тиосульфата натрия и () г трис (гидроксиметил) аминометан гидрохлорида и доводят объем дистиллированной водой до метки.

7.4.6 Приготовление консервирующего раствора: в мерную колбу вместимостью 100 вносят 10 глицерина и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.5 Растворы могут храниться в течение месяца при комнатной температуре. Рабочий раствор готовят в день использования.

8 Референс-образцы

В качестве референс-образца для видовой идентификации рыбы, в том числе в составе рыбной продукции, в соответствии с областью применения настоящего стандарта могут быть использованы: соответствующий образец рыбы-сырца (для однокомпонентных продуктов) или образец, приготовленный по технологии аналогичной технологии изготовления анализируемого образца (для одно- и многокомпонентных продуктов).

9 Проведение анализа

9.1 Подготовка образцов к анализу

Пробы анализируемого образца и референс-образца готовят в идентичных условиях.

9.1.1 Мышечную ткань анализируемого образца массой не менее 1 г измельчают в ступке.

9.1.2 Пробу анализируемую образца по 9.1.1 отбирают массой () г в центрифужные пробирки вместимостью 10 и заливают 2 2%-ного водного раствора додецилсульфата натрия по 7.1, смесь периодически перемешивают в течение 30 мин.

9.1.3 Смесь, полученную по 9.1.2, центрифугируют при частоте вращения 12000  при температуре 20°С в течение 15 мин.

9.1.4 Надосадочную жидкость, полученную по 9.1.3, фильтруют через бумажный фильтр и отбирают в стеклянные пробирки вместимостью 10 по 0,25 фильтрата.

9.1.5 К раствору, полученному по 9.1.4, добавляют 1,5 буферного раствора, приготовленного по 7.2, и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, при необходимости фильтруют и используют для проведения электрофореза.

9.2 Приготовление раствора стандартных белков

9.2.1 Набор стандартных белков для градуировки с известной молекулярной массой растворяют в 1,5 буферного раствора, приготовленного по 7.2, и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры и используют для проведения электрофореза.

9.2.1.1 Для