Национальный стандарт РФ ГОСТ Р 54496-2011 (ИСО 8692:2004) "Вода. Определение токсичности с использованием зеленых пресноводных одноклеточных водорослей" (утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 14 ноября 2011 г. N 542-ст)

Национальный стандарт РФ ГОСТ Р 54496-2011 (ИСО 8692:2004)
"Вода. Определение токсичности с использованием зеленых пресноводных одноклеточных водорослей"
(утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 14 ноября 2011 г. N 542-ст)

Water. Determination of toxicity with use of green freshwater unicellular algae

Дата введения - 1 января 2013 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Обществом с ограниченной ответственностью "Протектор" (ООО "Протектор") и Федеральным государственным унитарным предприятием "Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии" (ФГУП "ВНИРО") на основе аутентичного перевода на русский язык указанного в пункте 4 международного стандарта, находящегося в Федеральном информационном фонде

2 Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 343 "Качество воды"

3 Утвержден и введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 14 ноября 2011 г. N 542-ст

4 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ИСО 8692:2004 "Качество воды. Испытание на торможение роста водорослей в пресной воде с применением одноклеточных зеленых водорослей" (ISO 8692:2004 "Water quality - Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green algae") путем:

- введения дополнительных положений, фраз и слов в текст настоящего стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделенных в тексте настоящего стандарта курсивом; за исключением наименований тест-организмов;

- изменения структуры. Сравнение структуры настоящего стандарта со структурой указанного международного стандарта приведено в дополнительном приложении ДЛ;

- исключения отдельных пунктов указанного международного стандарта. Полный текст исключенных пунктов с обоснованиями исключения приведен в дополнительном приложении ДМ.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5-2004 (подраздел 3.5).

Сведения о соответствии ссылочных национальных и межгосударственных стандартов международным стандартам, использованным в качестве ссылочных в примененном международном стандарте, приведены в дополнительном приложении ДП

5 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на природные пресные воды (поверхностные и подземные); питьевые воды (централизованного и нецентрализованного питьевого водоснабжения); сточные воды (в том числе очищенные), а также на растворимые в воде вещества; отработанные буровые растворы; водные вытяжки донных отложений, твердых промышленных отходов, грунтов и почв и устанавливает методы лабораторного биологического тестирования воды и водных вытяжек (далее - тестирование) для определения их токсичности с использованием зеленых пресноводных одноклеточных водорослей по изменению:

- плотности (численности) клеток водорослей при тестировании в условиях переменного воздействия света и постоянной температуры (метод А);

- плотности (численности) клеток водорослей при тестировании в условиях постоянного воздействия света и постоянной температуры (метод Б);

- интенсивности флуоресценции клеток водорослей при тестировании в условиях переменного воздействия света и постоянной температуры (метод В).

Примечания

1 Метод Б применим для оценки токсичности сточных вод, не содержащих тяжелых металлов, так как комплексообразующая способность трилона Б, содержащегося в питательной среде искажает возможность тестирования сточных вод, загрязненных тяжелыми металлами.

2 Используемые в настоящем стандарте водоросли являются планктонными одноклеточными зелеными водорослями, принадлежащими к порядку Chlorococcales (Chlorophyta, Chlorophyceae).

Методы позволяют определять токсичность исследуемых объектов и следующие токсикологические показатели (относительно контрольной пробы):

- эффективную кратность разбавления () пробы при которой плотность (численность) клеток водорослей (интенсивность флуоресценции) снижается на 50%, а также безвредную кратность разбавления пробы (), при которой плотность (численность) клеток водорослей (интенсивность флуоресценции) снижается не более 10% за 72 ч (96 ч) тестирования;

- эффективную концентрацию () растворов веществ, вызывающую снижение плотности (численности) клеток водорослей (интенсивности флуоресценции) на 50%, и безвредную концентрацию () растворов веществ, вызывающую снижение плотности (численности) клеток водорослей (интенсивности флуоресценции) не более 10% за 72 ч тестирования.

Примечания

1 Продолжительность тестирования 96 ч используют при определении токсичности и токсикологических показателей анализируемых проб отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов, донных отложений, грунтов и почв (методы А и В).

2 Определение токсичности и токсикологических показателей для сточной воды по методу Б рекомендуется проводить при продолжительности тестирования не менее 48 ч. Пример приведен в приложении А.

3 Полученные в лабораторных условиях значения ЭКР и ЭК являются токсикологическими показателями и указывают на потенциальную опасность исследуемых объектов, но не могут быть использованы непосредственно для прогнозирования их воздействия на окружающую среду. Однако определенные свойства водорослей, установленные на основе тестирования (например, замедление начала роста клеток; хороший начальный рост, который не сохраняется), позволяют определить степень воздействия конкретного вещества.

4 Эффективную кратность разбавления () за 72 ч тестирования обозначают как 72 ч , за 96 ч тестирования - соответственно 96 ч за 48 ч тестирования - 48 ч ; эффективную концентрацию () за 72 ч тестирования - как 72 ч . При этом в протоколе испытаний допускается указывать унифицированное обозначение для эффективной кратности разбавления и для эффективной концентрации как .

5 Тестирование должен выполнять обученный персонал.

6 Настоящий стандарт не предусматривает ознакомление персонала со всеми проблемами безопасности, связанными с его использованием. Пользователь стандарта несет ответственность за обеспечение соответствующих требований стандарта при проведении тестирования.

В помещении лаборатории, где проводят тестирование:

- окружающая среда не должна содержать пара или пыли, токсичной для водорослей;

- температура окружающего воздуха должна быть (232)°С (только для помещения с регулируемой температурой по методу Б);

- относительная влажность воздуха должна быть не более 80%;

- атмосферное давление должно быть 84 - 106 кПа (630 - 800 мм рт. ст.);

- должно быть обеспечено постоянное равномерное белое освещение в диапазоне 6000 - 10000 лк (только для помещения с регулируемой температурой по методу Б).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ Р 51568-99 (ИСО 3310-1-90) Сита лабораторные из металлической проволочной сетки. Технические условия

ГОСТ Р 51592-2000 Вода. Общие требования к отбору проб

ГОСТ Р 51593-2000 Вода питьевая. Отбор проб

ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) Вода для лабораторного анализа. Технические условия

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р 53857-2010 Классификация опасности химической продукции по воздействию на окружающую среду. Основные положения

ГОСТ Р 53858-2010 Классификация опасности смесевой химической продукции по воздействию на окружающую среду

ГОСТ Р 53910-2010 (ИСО 10253:2006) Вода. Методы определения токсичности по замедлению роста морских одноклеточных водорослей Phaeodactylum tricornutum Bohlin и Sceletonema costatum (Greville) Cleve

ГОСТ 17.1.5.01-80 Охрана природы. Гидросфера. Общие требования к отбору проб донных отложений водных объектов для анализа на загрязненность

ГОСТ 17.1.5.05-85 Охрана природы. Гидросфера. Общие требования к отбору проб поверхностных и морских вод, льда и атмосферных осадков

ГОСТ 17.4.3.01-83 Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб

ГОСТ 17.4.4.02-84 Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа

ГОСТ 612-75 Реактивы. Марганец (II) хлористый 4-водный. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2493-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3773-72 Реактивы. Алюминий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4147-74 Реактивы. Железо (III) хлорид 6-водный. Технические условия

ГОСТ 4167-74 Реактивы. Медь двухлористая 2-водная. Технические условия

ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия

ГОСТ 4201-79 Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия

ГОСТ 4209-77 Реактивы. Магний хлористый 6-водный. Технические условия

ГОСТ 4217-77 Реактивы. Калий азотнокислый. Технические условия

ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия

ГОСТ 4234-77 Реактивы. Калий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4461-77 Реактивы. Кислота азотная. Технические условия

ГОСТ 4523-77 Реактивы. Магний сернокислый 7-водный. Технические условия

ГОСТ 4525-77 Реактивы. Кобальт хлористый 6-водный. Технические условия

ГОСТ 4529-78 Реактивы. Цинк хлористый. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 10652-73 Реактивы. Соль динатриевая этилендиамин-N,N,,-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б). Технические условия

ГОСТ 10931-74 Реактивы. Натрий молибденовокислый 2-водный. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 12071-2000 Грунты. Отбор, упаковка, транспортирование и хранение образцов

ГОСТ 19126-2007 Инструменты медицинские металлические. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 27065-86 Качество вод. Термины и определения

ГОСТ 27753.1-88 Грунты тепличные. Методы отбора проб

ГОСТ 27753.2-88 Грунты тепличные. Метод приготовления водной вытяжки

ГОСТ 28168-89 Почвы. Отбор проб

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-1981) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть I. Общие требования

ГОСТ 30416-96 Грунты. Лабораторные испытания. Общие положения

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 27065, а также следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 плотность (численность) клеток (cell density): Количество клеток в единице объема питательной среды или анализируемой пробы.

Примечание - Плотность (численность) клеток выражается количеством клеток на кубический сантиметр ().

3.2 скорость роста (specific growth rate): Увеличение плотности (численности) клеток водорослей в единицу времени.

Примечания

1 Термин в [1] указан как "удельная скорость роста" и для него приведена следующая формула

,

(1)

где х - плотность (численность) клеток, ;

t - время, сут.

2 Удельная скорость роста выражается в обратных сутках ().

3.3 питательная среда (growth medium): Смесь дистиллированной (деионизированной) воды и питательных веществ, которая используется для культивирования водорослей и приготовления контрольной пробы.

3.4 испытуемая проба (test specimen): Проба воды (например, сточной воды), проба вещества, донных отложений, отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов, грунтов и почв, для которой определяется ингибирующее действие на рост плотности (численности) клеток водорослей.

3.5 анализируемая проба (sample analyzed): Смесь дистиллированной (деионизированной) воды, питательной среды и испытуемой пробы, засеянная водорослями.

3.6 контрольная проба (control): Смесь питательной среды, засеянная водорослями, без испытуемой пробы.

3.7 эффективная концентрация, [effective concentration ()]: Концентрация вещества в анализируемой пробе, которая приводит к х %-ному снижению плотности (численности) клеток водорослей (замедлению скорости роста клеток водорослей) или изменению интенсивности флуоресценции клеток водорослей относительно контрольной пробы.

Примечания

1 Для термина "эффективная концентрация" в [1] указано обозначение .

2 Безвредная концентрация - эффективная концентрация вещества в анализируемой пробе, при которой плотность (численность) клеток водорослей (интенсивность флуоресценции) изменяется относительно контрольной пробы не более 10% за 72 ч тестирования.

3.8 эффективная кратность разбавления, ЭКР (effective multiplicity of dilution): Степень разбавления пробы (например, сточной воды) питательной средой при подготовке анализируемой пробы, которая приводит к х %-ному снижению плотности (численности) клеток водорослей (замедлению скорости роста клеток водорослей или изменению интенсивности флуоресценции клеток водорослей) относительно контрольной пробы.

Примечание - Безвредная кратность разбавления - эффективная кратность разбавления анализируемой пробы, при которой плотность (численность) клеток водорослей (интенсивность флуоресценции) изменяется относительно контрольной пробы не более 10% за 72 ч тестирования (или 96 ч тестирования в зависимости от исследуемого объекта).

4 Отбор проб

4.1 Отбор проб природной, питьевой и сточной воды проводят в соответствии с требованиями ГОСТ Р 51592, ГОСТ Р 51593, ГОСТ 17.1.5.05-85, [2] и [3], при этом объем пробы воды должен быть не менее 500 .

Условия и сроки хранения отобранных проб - по ГОСТ Р 51592 и ГОСТ Р 51593.

Примечание - Если отобранную пробу воды перед тестированием требуется отстаивать или фильтровать, то отстаивание и фильтрование должны предшествовать ее замораживанию.

4.2 Отбор проб донных отложений проводят в соответствии с требованиями ГОСТ Р 51592, ГОСТ 17.1.5.01 и [4] массой не менее 2 кг.

Срок хранения проб донных отложений - не более 12 ч после их отбора до проведения тестирования.

Допускается хранение отобранных проб до проведения их тестирования:

- не более 48 ч - при температуре от 0°С до 4°С;

- не более 14 сут - при температуре минус 18°С.

4.3 Отбор проб отработанных буровых растворов проводят в соответствии с требованиями технической документации предприятия, на котором образуются отработанные буровые растворы, массой не менее 5,0 кг, при этом под крышкой емкости, в которую отобрана проба, должен оставаться слой воздуха высотой 2 см.

Отобранные пробы отработанных буровых растворов хранят в емкостях-холодильниках при температуре от 0°С до 4°С не более 3 мес.

После вскрытия емкостей-холодильников для подготовки проб отработанных буровых растворов к тестированию срок хранения не должен превышать 14 сут.

4.4 Отбор проб твердых промышленных отходов проводят в соответствии с требованиями технической документации предприятия, на котором образуются отходы, массой не менее 2 кг.

Срок хранения отобранных проб твердых промышленных отходов в емкостях с притертой или плотно закрытой крышкой при температуре от 0°С до 4°С - не более 7 сут.

4.5 Отбор проб веществ, условия и сроки их хранения должны соответствовать требованиям стандартов и другой документации на конкретную продукцию (группу однородной продукции).

4.6 Отбор проб грунтов проводят по ГОСТ 12071, ГОСТ 27753.1; почв - по ГОСТ 17.4.3.01, ГОСТ 17.4.4.02, ГОСТ 28168, [2], массой не менее 2 кг.

Срок хранения отобранных проб грунтов (почв) в емкостях с притертой или плотно закрытой крышкой при температуре от 0°С до 4°С - не более 7 сут.

4.7 Для отбора проб природной воды, отработанных буровых растворов, донных отложений используют емкости из полиэтилена, полиэтилентерефлата или политетрафторэтилена, а при наличии в воде нефтепродуктов, поверхностно-активных веществ и пестицидов - емкости из темного стекла.

Для отбора проб сточных вод, твердых промышленных отходов, грунтов и почв используют емкости из темного стекла или нержавеющей стали, при этом не допускается использовать емкости с хромовым покрытием.

Для отбора проб веществ используют емкости из полиэтилена, полиэтилентерефлата, политетрафторэтилена или темного стекла.

4.8 Сроки и условия хранения отобранной пробы указывают в протоколе испытаний.

4.9 Консервацию отобранных проб не проводят.

5 Метод А

5.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в регистрации изменения плотности (численности) клеток зеленых пресноводных одноклеточных водорослей в анализируемой пробе исследуемого объекта относительно контрольной пробы, определении ее токсичности и токсикологических показателей при тестировании в течение 72 ч (96 ч) при переменном воздействии света и при постоянной температуре.

Продолжительность тестирования 72 ч указана для определения токсичности и токсикологических показателей анализируемых проб природной и сточной воды, а также анализируемых проб веществ.

Продолжительность тестирования 96 ч указана для определения токсичности и токсикологических показателей анализируемых проб отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов, донных отложений, грунтов и почв.

5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы, материалы

Флуориметр, спектрофлуориметр или люминесцентный анализатор жидкости (далее - прибор) с кварцевой кюветой 10 мм и детектором, позволяющим проводить измерения при возбуждении флуоресценции хлорофилла водорослей в диапазоне длин волн от 400 до 500 нм и регистрацию флуоресценции хлорофилла водорослей в диапазоне длин волн от 650 до 750 нм. Предел детектирования прибора - не менее 1000 водорослей.

Климатостат любого типа, обеспечивающий поддержание температуры (202)°С и белое люминесцентное освещение в диапазоне 3000 - 6000 лк.

Весы лабораторные высокого класса точности с ценой деления (дискретностью отсчета) не более 0,01 г, пределом взвешивания не более 210 г по ГОСТ Р 53228.

рН-метр любого типа, обеспечивающий измерения рН в диапазоне от 3 до 10 ед рН с допускаемой погрешностью 0,1 ед рН.

Кондуктометр любого типа, обеспечивающий измерения удельной электропроводности дистиллированной (деионизированной) воды с допускаемой погрешностью 2,0 мкСм/см.

Оксиметр любого типа, с допускаемой погрешностью измерения не более 0,5 мг /.

Термометры жидкостные стеклянные с диапазоном измерения от 0°С до 50°С с ценой деления шкалы 0,5°С по ГОСТ 28498.

Пипетки автоматические (дозаторы) любого типа вместимостью 0,1 - 0,2  с относительной погрешностью измерений не более 1,0%.

Пипетки 1-1(2)-2-1, 1-1(2)-2-2, 1-1(2)-2-5, 1-1 (2)-2-10 по ГОСТ 29227.

Микропипетки вместимостью 0,1; 0,2  с ценой деления 0,01 .

Колбы мерные 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2 по ГОСТ 1770.

Колбы стеклянные (конические) лабораторные вместимостью 0,25, 1 и 2 по ГОСТ 25336.

Счетная камера (камера Горяева).

Микроскоп биологический типа МБР или МБИ, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз.

Мешалка магнитная.

Устройство для встряхивания любого типа (например, орбитальный шейкер, качалка-мешалка).

Сушильный электрический шкаф общелабораторного назначения, поддерживающий температуру от 50°С до 200°С с погрешностью не более 5°С.

Аквариумный микрокомпрессор любого типа, например АЭН-4.

Шпатели металлические по ГОСТ 19126.

Холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от минус 18°С до минус 20°С и от 2°С до 4°С.

Ступки и пестики фарфоровые по ГОСТ 9147.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Фильтры обеззоленные "белая лента".

Фильтровальная установка любого типа.

Фильтры мембранные с диаметром пор 0,45 и 3,5 мкм.

Пробирки стеклянные вместимостью 10  по ГОСТ 25336.

Цилиндры мерные вместимостью 25, 50, 100, 1000 , второго класса точности исполнений 1, 2, 2а, 3, 4 или 4а по ГОСТ 1770.

Сито с отверстиями диаметром 1 мм по ГОСТ Р 51568.

Насос водоструйный по ГОСТ 25336.

Баня водяная любого типа.

Стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 50, 100, 500, 1000  по ГОСТ 25336.

Вода для лабораторного анализа по ГОСТ Р 52501 или дистиллированная вода по ГОСТ 6709, или деионизированная вода с удельной электропроводностью не более 10 мкСм/см (далее - дистиллированная вода).

Модельный токсикант: калий двухромовокислый по ГОСТ 4220, ч.д.а.

Питательная среда [среда Прата, приготовленная в соответствии с требованиями ДА.1 (приложение ДА)].

Примечания

1 Емкости, используемые для приготовления питательной среды, должны быть изготовлены из стекла.

2 Питательную среду используют для культивирования водорослей, приготовления контрольной пробы и разбавления анализируемых проб.

Тест-объекты (тест-организмы): зеленые пресноводные одноклеточные водоросли Chlorella vulgaruis Beijer и Scenedesmus quadhcauda (Turp) Breb.

Примечания

1 Методы культивирования водорослей приведены в ДБ.1 (приложение ДБ).

2 Допускается хранение водорослей Chlorella vulgaruis Beijer и Scenedesmus quadhcauda (Turp) Breb на агаризованной питательной среде Прата при температуре от 2°С до 4°С не более 12 мес без потери их жизнеспособности.

Калий азотнокислый по ГОСТ 4217, х.ч.

Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493, х.ч.

Кальций хлористый, безводный, х.ч.

Магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523, х.ч.

Натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч.

Хлорид железа 6-водный по ГОСТ 4147, х.ч.

Кислота азотная по ГОСТ 4461, х.ч.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.

5.3 Подготовка к тестированию

5.3.1 Подготовка посуды

5.3.1.1 Емкости, используемые для тестирования, должны быть химически чистыми.

Для проведения тестирования используют только стеклянную посуду.

5.3.1.2 Стеклянную посуду для тестирования осторожно промывают 10%-ным раствором азотной кислоты и выдерживают 2 - 3 ч при комнатной температуре, затем тщательно промывают водопроводной водой, обрабатывают 10%-ным раствором натрия углекислого кислого, промывают водопроводной водой, после чего не менее трех раз ополаскивают дистиллированной водой.

При сильном загрязнении посуды, а также новую посуду промывают водопроводной водой, заполняют 10%-ным раствором азотной кислоты и выдерживают в течение суток, после чего обрабатывают 10%-ным раствором углекислого кислого натрия, затем тщательно промывают водопроводной водой и не менее трех - четырех раз ополаскивают дистиллированной водой.

5.3.1.3 Емкости и посуду для тестирования сушат на воздухе при комнатной температуре, за тем стеклянную посуду за исключением мерной, помещают в сушильный шкаф и выдерживают в течение одного часа при температуре 150°С.

Чистую посуду (емкости) закрывают стеклянными притертыми пробками или крышками и хранят в шкафах или на полках.

5.3.1.4 Мембранные фильтры перед применением должны быть промыты и стерилизованы кипячением в дистиллированной воде не менее 10 мин.

5.3.2 Подготовка проб

Перед тестированием предварительно охлажденные или замороженные пробы доводят до температуры (205)°С.

5.3.2.1 Подготовка исходных проб природной и питьевой воды

Отобранные пробы природной и питьевой воды непосредственно перед тестированием фильтруют через мембранные фильтры с порами диаметром 3,5 мкм или через обеззоленные фильтры "белая лента", после чего измеряют рН отфильтрованной пробы.

Не допускается для фильтрования использовать фильтр "синяя лента".

Примечание - Фильтр "синяя лента" задерживает коллоидные вещества, что занижает результаты тестирования.

5.3.2.2 Подготовка исходных проб сточной воды

Отобранные пробы сточной воды непосредственно перед тестированием фильтруют через мембранный фильтр с порами диаметром 3,5 мкм или через обеззоленный фильтр "белая лента", после чего измеряют рН и концентрацию растворенного кислорода отфильтрованной пробы.

5.3.2.3 Подготовка исходных проб отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов, донных отложений, грунтов и почв

Из отобранных проб отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов, донных отложений, грунтов и почв готовят водные вытяжки, затем измеряют рН и концентрацию растворенного кислорода подготовленных водных вытяжек.

Подготовка водных вытяжек из проб отработанных буровых растворов

Перед приготовлением водной вытяжки из пробы отработанных буровых растворов отобранную пробу тщательно перемешивают на магнитной мешалке со скоростью вращения 17 (1000 об/мин) в течение 5 мин и определяют рН отработанного бурового раствора. Пробу отработанного бурового раствора считают не пригодной для тестирования, если:

- рН пробы отработанного бурового раствора более 9,0 или ниже 6,0;

- на стенках сосуда с пробой отработанного бурового раствора появились черные пятна;

- проба отработанного бурового раствора имеет неприятный запах.

После перемешивания пробу отработанного бурового раствора смешивают с дистиллированной водой (см. 5.2) в соотношении 1:9 по объему и снова перемешивают на магнитной мешалке со скоростью вращения 17 (1000 об/мин) в течение 5 мин.

После окончания перемешивания смесь выдерживают при температуре (205)°С в течение 1 ч, затем жидкость над осадком (водную вытяжку бурового раствора) осторожно переливают за один прием в другую колбу и перемешивают в течение 5 мин, после чего используют ее для подготовки анализируемой пробы.

Если отстоявшаяся смесь не имеет четкого раздела фаз, то весь объем подготовленной пробы используют для приготовления анализируемой пробы.

Не допускаются консервация и хранение подготовленных водных вытяжек проб отработанных буровых растворов.

Подготовка водных вытяжек из проб твердых промышленных отходов

Перед приготовлением водной вытяжки из твердых промышленных отходов отобранную пробу твердых промышленных отходов разрыхляют и тщательно осматривают. В случае обнаружения частиц размером более 10 мм их измельчают с помощью металлического шпателя до размера менее 10 мм. Не допускается измельчать смесь с помощью механизированных устройств.

Измельченную пробу отходов высушивают на воздухе при температуре (205)°С до воздушно-сухого состояния в вытяжном шкафу или в хорошо проветриваемом помещении.

Водную вытяжку из высушенной пробы отходов готовят в соотношении - твердые промышленные отходы дистиллированная вода, соответственно 1:10, следующим способом.

В колбу вместимостью 1500  вносят 100 г сухой массы пробы твердых промышленных отходов, добавляют 1000  дистиллированной воды (см. 5.2) и перемешивают в течение 6 - 7 ч с использованием магнитной мешалки (или орбитального шейкера) с минимальной скоростью перемешивания, при которой проба твердых промышленных отходов поддерживается во взвешенном состоянии.

Примечание - Для приготовления 900  водной вытяжки обычно требуется 100 г сухой массы пробы отходов.

Не допускается использовать для приготовления водной вытяжки менее 20 г сухой массы пробы отходов и менее 200  дистиллированной воды.

После окончания перемешивания смесь выдерживают при температуре от 2°С до 4°С в течение 12 - 14 ч, затем жидкость над осадком осторожно переливают в другую колбу, после чего используют ее для подготовки анализируемой пробы.

Примечание - Жидкие промышленные отходы тестируют без разбавления, а также при разбавлениях в 10, 100, 1 000 и 10 000 раз.

Допускается хранение подготовленных водных вытяжек из твердых промышленных отходов при температуре от 2°С до 4°С не более 48 ч.

Подготовка водных вытяжек из проб донных отложений

Перед приготовлением водной вытяжки из донных отложений отобранную пробу донных отложений высушивают на воздухе при температуре (205)°С до воздушно-сухого состояния, удаляют остатки растений, камешки и т.п., затем измельчают в ступке и просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

После просеивания навеску пробы донных отложений вносят в колбу (стакан) и заливают дистиллированной водой (см. 5.2) в соотношении 1:4 по объему, перемешивают с использованием орбитального шейкера (или качалки-мешалки) в течение 2 ч. После окончания перемешивания смесь выдерживают в течение 1 ч при температуре (205)°С, а затем в течение 12 - 14 ч выдерживают при температуре от 2°С до 4°С. Затем жидкость над осадком осторожно переливают в другую колбу и фильтруют, после чего используют для подготовки анализируемой пробы.

Допускается хранение подготовленных водных вытяжек донных отложений при температуре от 2°С до 4°С не более 72 ч.

Подготовка водных вытяжек из проб грунтов и почв

Перед приготовлением водной вытяжки из проб грунтов и почв отобранную пробу грунтов подготавливают в соответствии с требованиями ГОСТ 30416, ГОСТ 21753.2, почв - ГОСТ 17.4.4.02.

Водную вытяжку из пробы грунта (почвы) готовят следующим способом:

В колбу вместимостью 1000  вносят 100 - 200 г высушенной подготовленной пробы грунта (почвы), заливают дистиллированной водой (см. 5.2) в соотношении 1:4 по объему и перемешивают с использованием орбитального шейкера (или качалки-мешалки) в течение 2 ч.

После окончания перемешивания смесь выдерживают при температуре (205)°С в течение 30 мин, затем жидкость над осадком осторожно переливают в другую колбу и фильтруют.

Оставшуюся часть осадка в колбе встряхивают до взмучивания взвешенных частиц пробы и фильтруют через обеззоленные фильтры "белая лента" с применением вакуумного водоструйного (или электрического) насоса при вакууме не более 2666,448 Па (20 мм рт. ст.). При этом, если первые порции фильтрата будут мутными, их несколько раз фильтруют через новый фильтр до получения прозрачного раствора.

Полученные фильтраты объединяют, после чего используют для подготовки анализируемой пробы.

Примечания

1 При наличии повышенной мутности отфильтрованных водных вытяжек их выдерживают при температуре 2°С - 4°С в течение 24 ч, затем жидкость над осадком осторожно переливают в другую колбу, фильтруют и только после этого используют для приготовления анализируемой пробы.

2 При наличии в отфильтрованной водной вытяжке диоксида углерода вытяжку кипятят на водяной бане в течение 30 мин, охлаждают до температуры (205)°С и только после этого используют для приготовления анализируемой пробы.

Допускается хранение подготовленных водных вытяжек из грунтов (почв) при температуре от 2°С до 4°С не более 72 ч.

5.3.2.4 Подготовка исходных растворов веществ

Исходные растворы веществ, в зависимости от заданной концентрации, готовят в мерной колбе путем растворения определенного количества исследуемой пробы вещества в определенном объеме дистиллированной воды.

Исходные растворы веществ готовят непосредственно перед их тестированием, при этом, если известно, что вещества стабильны в растворе, исходные растворы допускается готовить заранее, но не более чем за 2 сут до тестирования.

Примечания

1 Для веществ, трудно растворимых в воде, при приготовлении их исходных растворов могут быть использованы ультразвуковые или другие устройства (шейкеры) для облегчения растворимости или диспергирования веществ.

2 Допускается использовать органические растворители, обладающие малой токсичностью в отношении тест-организмов (например, ацетон), при условии, что концентрация растворителя в анализируемой пробе не превышает 0,1 , при этом параллельно с основным тестированием проводят два контрольных тестирования, одно без растворителя и другое с максимальной концентрацией растворителя.

Для приготовления исходного раствора вещества заданной концентрации невозможно рекомендовать какую-либо единую методику. Например, используют следующую процедуру: в мерную колбу вместимостью 1000  (или 100, 50, 25 ) вносят 1 г вещества (или другое его количество, в зависимости от заданной концентрации раствора), затем осторожно добавляют небольшое количество дистиллированной воды (см. 5.2) и перемешивают до полного растворения вещества, затем содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой, снова перемешивают. Перед тестированием приготовленный раствор выдерживают при температуре (205)°С не менее 2 ч.

Измеряют рН в исходном растворе вещества.

5.3.2.5 Исходные пробы (см. 5.3.2.1 - 5.3.2.3) и исходные растворы веществ (см. 5.3.2.4) должны иметь следующие характеристики:

a) Значение рН 7,0 - 8,3

Если значение рН исходной пробы (раствора) выше указанного предела, то в пробу (раствор) добавляют раствор соляной кислоты молярной концентрацией 1 , если ниже - раствор гидроокиси натрия молярной концентрацией 1 . После этого пробу (раствор) аэрируют с помощью аквариумного компрессора в течение 10 - 20 мин для стабилизации рН.

Примечание - Обычно тестирование должно выполняться без регулировки рН среды после добавления испытуемой пробы. Однако некоторые вещества могут оказывать токсическое действие вследствие повышенной кислотности или щелочности. Для определения токсичности пробы (если она не зависит от рН) регулируют значение рН исходной пробы (исходного раствора) до значения рН питательной среды.

Для исходных проб природной и питьевой воды проводят тестирование при имеющихся значениях рН.

Для исходных проб водных вытяжек из твердых промышленных отходов регулирование рН не допускается.

b) Концентрация растворенного кислорода не ниже 7 мг /.

Если концентрация растворенного кислорода исходной пробы ниже указанного значения, пробу аэрируют с помощью аквариумного компрессора.

с) Минерализация менее 6,0 , при этом:

- если исходная проба (раствор) имеет минерализацию выше 3,0 , то проводят адаптацию культуры водорослей [см. ДБ.3 (приложение ДБ)] на приготовленной питательной среде минерализацией от 1,0 до 5,0 ,

- если исходная проба (раствор) имеет минерализацию 6,0 и выше, то используют тест-организмы по ГОСТ Р 53910.

Примечание - Зеленые пресноводные одноклеточные водоросли по 5.2 хорошо переносят осолонение (адаптацию к повышенной минерализации) до 6,0 .

5.3.2.6 Подготовка анализируемых проб

Анализируемой пробой природной воды является подготовленная по 5.3.2.1 исходная проба природной воды.

Анализируемые пробы сточной воды для предварительного тестирования (см.5.4.1) готовят следующим способом:

a) проводят разбавление исходной пробы сточной воды следующим способом: в конические колбы вместимостью 250  вносят исходную пробу сточной воды (см. 5.3.2.2) и питательную среду Прата [см. ДА.1.2 (приложение ДА)] в следующих объемах:

- 100  исходной пробы сточной воды (проба без разбавления);

- 50  исходной пробы сточной воды и 50  питательной среды (кратность разбавления: 50%, в два раза);

- 10  исходной пробы сточной воды и 90  питательной среды (кратность разбавления 10%, в 10 раз);

- 1  исходной пробы сточной воды и 99  питательной среды (кратность разбавления: 1%, в 100 раз);

- 0,1  исходной пробы сточной воды и 99,9  питательной среды (кратность разбавления: 0,1%, в 1000 раз);

b) затем в колбы с разбавленными пробами сточной воды добавляют исходные растворы питательной среды [см. таблицу ДА.1 (приложение ДА)], как указано ниже:

в колбы без разбавления исходной пробы последовательно добавляют исходные растворы питательной среды в следующих объемах: раствор N 1 - 0,2 ; раствор N 2 - 0,05 ; раствор N 3 - 0,1 ; раствор N 4 - 0,1 ;

в колбы с разбавлением исходной пробы сточной воды в два раза добавляют в той же последовательности (но в два раза меньше) исходные растворы питательной среды, соответственно: 0,1; 0,025; 0,05; 0,05 ;

в колбы с разбавлением исходной пробы в 10 раз - соответственно: 0,02; 0,005; 0,01; 0,01 ;

в колбы с разбавлениями исходной пробы в 100 и 1000 раз исходные растворы питательной среды не добавляют.

Анализируемые пробы отработанных буровых растворов, донных отложений, твердых промышленных отходов, грунтов и почв для предварительного тестирования (см. 5.4.1) готовят из их водных вытяжек (см. 5.3.2.3) путем разбавления водных вытяжек исходным раствором питательной среды, аналогично указанным в перечислениях а) и b) для анализируемой пробы сточной воды.

Анализируемые пробы вещества для предварительного тестирования (см.5.4.1) готовят следующим способом: в конические колбы вместимостью 250  вносят по 100  питательной среды Прата [см. ДА.1.2 (приложение ДА)], затем добавляют рассчитанные объемы исходного раствора вещества (см. 5.3.2.4) дня получения заданных концентраций вещества, отвечающих требованиям, установленным в 5.4.1.

5.3.2.7 Измеряют и регистрируют рН с анализируемой пробой.

5.3.3 Если для определения плотности (численности) клеток водорослей (интенсивности флуоресценции) используют прибор (см. 5.2) или, например, исследуемые пробы воды прозрачные, окрашенные или мутные, то для каждой анализируемой пробы готовят в отдельных колбах пробы контроля фона, представляющие собой концентрации анализируемого вещества (разбавлений проб) по 5.3.2.6, но без добавления водорослей (фоновый раствор), которые будут служить фоном при проведении измерений (тестировании).

5.3.4 Подготовку водорослей к тестированию проводят в соответствии с требованиями ДБ.1 (приложение ДБ) с учетом требований 5.3.5.

5.3.5 Проверка физиологической чувствительности тест-организмов

Периодически (не реже одного раза в месяц), а также непосредственно перед тестированием, культуру водорослей в экспоненциальной фазе роста проверяют на физиологическую чувствительность. Для этого определяют эффективную концентрацию (48 ч ) модельного токсиканта (см. 5.2) в следующей последовательности:

5.3.5.1 Готовят исходный раствор модельного токсиканта массовой концентрацией 1 следующим способом: в мерную колбу вместимостью 1000  вносят 1 г двухромовокислого калия и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды (см. 5.2), затем доводят содержимое кол бы до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают.

Срок хранения исходного раствора модельного токсиканта - не более 7 сут.

5.3.5.2 Готовят анализируемые растворы модельного токсиканта (калия двухромовокислого) заданной концентрации в следующей последовательности:

- приготавливают растворы двухромовокислого калия с массовой концентрацией от 0,1 до 2,5  следующим способом: в семь мерных колб вместимостью 200  вносят небольшое количество питательной среды Прата [см. ДА.1.2 (приложение ДА)], затем добавляют исходный раствор двухромовокислого калия массовой концентрацией 1 (см. 5.3.5.1), соответственно, в первую колбу - 0,02 , во вторую колбу - 0,05 , в третью колбу - 0,1 , в четвертую колбу - 0,2 , в пятую колбу - 0,3 , в шестую - 0,4 , в седьмую - 0,5 , доводят содержимое каждой колбы до метки питательной средой и перемешивают. При этом в каждой колбе массовая концентрация приготовленного раствора модельного токсиканта (двухромовокислого калия) составляет соответственно: 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5, 2,0 и 2,5 ;

- затем для каждой приготовленной концентрации модельного токсиканта (двухромовокислого калия) готовят в трех колбах вместимостью 100  анализируемые растворы следующим образом: в каждую колбу добавляют по 50  конкретного раствора модельного токсиканта (двухромовокислого калия), после чего вносят определенный объем суспензии водорослей, рассчитанный на объем 50 .

Анализируемые растворы двухромовокислого калия каждой концентрации готовят непосредственно перед определением физиологической чувствительности водорослей.

Для приготовления контрольной пробы используют среду Прата [см. ДА.1.2 (приложение ДА)].

Плотность (численность) клеток водорослей в начале тестирования должна находиться в пределах - .

5.3.5.3 Тестирование анализируемых растворов заданных концентраций модельного токсиканта (см. 5.3.5.2) проводят, как указано в 5.4.3, в течение 48 ч.

5.3.5.4 Подсчитывают плотность (численность) клеток водорослей одним из методов, приведенных в приложении ДВ, и на основании полученных результатов определяют по 5.5.4 значение 48 ч модельного токсиканта (двухромовокислого калия), при этом:

- если значение 48 ч данного модельного токсиканта находится в диапазоне от 1,3 до 2,5 , то считают, что подготовленные водоросли пригодны для тестирования;

- если значение 48 ч данного модельного токсиканта не входит в указанный диапазон, то считают, что подготовленные водоросли не пригодны для тестирования. Проверяют соблюдение правильности процедуры тестирования, условия подготовки водорослей к тестированию и, при необходимости, повторяют тестирование с использованием обновленной культуры водорослей.

Пример приведен в приложении ДГ

Примечание - Значение 48 ч раствора модельного токсиканта указывают в протоколе испытаний, имея в виду, что это значение в установленном диапазоне концентраций характеризует токсичность модельного токсиканта только для использованных водорослей, характеризует их физиологическую чувствительность, что позволяет (или не позволяет) проводить тестирование с данными водорослями.

5.3.5.5 Если по результатам тестирования не удалось получить конкретное значение 48 ч , то для определения 48 ч модельного токсиканта используют пробит-анализ. Аналогичный пример приведен в приложении ДД.

5.4 Проведение тестирования

Тестирование проводят в два этапа: предварительное и окончательное.

Примечание - Тестирование проб природной и питьевой воды проводят в один этап без предварительного тестирования.

5.4.1 Предварительное тестирование

Предварительное тестирование проводят для установления диапазона разбавлений (концентраций) проб, в пределах которого необходимо провести окончательное тестирование для определения значения 72 ч (96 ч ) или 72 ч в зависимости от анализируемых проб.

При предварительном тестировании исследуют широкую область разбавлений (не менее пяти) сточных вод, водных вытяжек и концентрации растворов вещества, выбираемых в геометрической прогрессии, при этом, как правило, используют коэффициент 10 между разбавлениями (концентрациями).

При предварительном тестировании применяют не менее двух колб на каждую заданную кратность разбавления (концентрацию) анализируемой пробы.

Процедура предварительного тестирования - по 5.4.3.

Пример проведения предварительного тестирования и установления диапазона концентраций вещества, в пределах которого необходимо проводить окончательное тестирование, приведен в приложении ДЕ.

5.4.2 Окончательное тестирование

По результатам предварительного тестирования (см. 5.4.1) по установлению диапазона разбавлений (концентраций) подготавливают анализируемые пробы для окончательного тестирования аналогично подготовке анализируемых проб по 5.3.2.6 для предварительного тестирования, но с использованием коэффициента между разбавлениями (концентрациями), как правило, 2,0 или 2,5.

Для окончательного тестирования используют не менее пяти разбавлений (концентраций) анализируемых проб, при этом кратность разбавления (концентрации) проб необходимо, по возможности, подбирать, основываясь на результатах предварительного тестирования, таким образом, чтобы обеспечить два уровня снижения плотности (численности) клеток водорослей ниже и выше предполагаемого значения ().

Для окончательного тестирования применяют не менее трех колб на каждую заданную кратность разбавления (концентрацию).

Процедура окончательного тестирования - по 5.4.3.

Пример проведения окончательного тестирования и установление значений эффективной концентрации 72 ч для вещества приведен в приложение ДЕ.

Примечание - Исходя из статистических данных, схема тестирования может быть изменена, например, уменьшено количество колб с анализируемыми пробами для каждого разбавления (концентрации) за счет увеличения количества тестируемых разбавлений (концентраций) пробы и сокращения коэффициента между разбавлениями (концентрациями) анализируемой пробы.

5.4.3 Процедура тестирования

5.4.3.1 В каждую колбу (см. 5.4.1 и 5.4.2) вместимостью 250  вносят по 100  анализируемой пробы, затем в каждую колбу добавляют рассчитанный объем суспензии водорослей в экспоненциальной фазе роста (см. 5.3.4), перемешивают, выдерживают 30 мин при температуре и освещенности по 5.4.3.4 и определяют плотность (численность) клеток водорослей, соответствующую началу тестирования, одним из методов, приведенным в приложении ДВ.

Плотность (численность) клеток водорослей в начале тестирования должна находиться в пределах - .

5.4.3.2 Для каждой анализируемой пробы (разбавлений, концентраций) подготавливают контрольную пробу следующим способом: в конические колбы вместимостью 250  вносят по 100  питательной среды Прата [см. ДА.1.2 (приложение ДА)], добавляют по 1,0  суспензии водорослей в экспоненциальной фазе роста (см. 5.3.4), перемешивают, выдерживают 30 мин при температуре и освещенности по 5.4.3.4 и определяют плотность (численность) клеток водорослей соответствующую началу тестирования одним из методов, приведенным в приложении ДВ.

Плотность (численность) клеток водорослей в контрольной пробе должна находиться в пределах - .

Примечания

1 Чтобы получить в начале тестирования плотность (численность) клеток водорослей в пределах от до , достаточно в каждую колбу внести 1,0  суспензии водорослей из культуры, плотность (численность) которой находится в пределах от до .

2 При проведении тестирования контрольные пробы готовят в двух колбах - для предварительного тестирования; в трех колбах - для окончательного тестирования.

5.4.3.3 Колбы с пробами, подготовленными по 5.4.3.1, 5.4.3.2, закрывают ватно-марлевыми пробками, встряхивают и помещают в климатостат.

Примечание - Колбы с водорослями должны быть закрытыми для предотвращения снижения испарения раствора; однако колбы не следует закрывать герметично, чтобы обеспечить воздухообмен, поэтому рекомендуется применять ватно-марлевые пробки.

5.4.3.4 Тестирование (в зависимости от анализируемой пробы) проводят в течение 72 ч или 96 ч (см. 5.1) в климатостате при температуре (202)°С и попеременном воздействии света и темноты:

- 16 ч - при равномерном белом освещении в диапазоне от 3000 до 6000 лк на расстоянии 0,35 м от поверхности проб в колбах,

- 8 ч - при отсутствии освещения.

Содержимое каждой колбы при проведении тестирования перемешивают один - два раза в сутки.

Примечание - Клетки водорослей необходимо поддерживать во взвешенном состоянии, путем легкого встряхивания каждой колбы (например, вручную), чтобы обеспечить единый уровень рН и газовый режим в различных слоях пробы.

5.4.3.5 Через каждые 24 ч тестирования определяют плотность (численность) клеток водорослей в каждой колбе (включая контрольную) одним из методов, приведенных в приложении ДВ.

5.4.3.6 После окончания тестирования:

- измеряют рН в каждой колбе с анализируемой и контрольной пробами, при этом значение рН контрольной пробы при тестировании не должно меняться более чем на 1,5 ед рН;

- визуально осматривают в каждой колбе состояние культуры водорослей (побурение, посветление, лизис и т.п.).

Любые обнаруженные отклонения регистрируют.

5.4.4 Результаты тестирования считают достоверными, если соблюдаются следующие условия:

a) плотность (численность) клеток водорослей в контрольной пробе в конце тестирования увеличилась не менее чем в три раза по сравнению с плотностью (численностью) клеток водорослей в начале тестирования;

b) коэффициент колебаний темпов роста клеток водорослей в контрольных пробах в каждой из трех колб тестируемой серии анализируемых проб в течение тестирования должен быть не более 5% относительно среднеарифметического значения плотности (численности) клеток водорослей;

c) уровень рН в контрольной пробе изменился не более чем на 1,5 ед рН в конце тестирования;

d) токсичность модельного токсиканта находится в пределах, указанных в 5.3.5.4.

Если условия перечислений а) - d) не соблюдаются, то находят причины, устраняют их и тестирование повторяют с новой культурой водорослей.

5.5 Обработка результатов

5.5.1 По результатам подсчета плотности (численности) клеток водорослей по ДВ.1 (приложение ДВ) для каждого заданного разбавления (концентрации) анализируемой пробы по трем колбам, в том числе контрольным, рассчитывают среднеарифметическое значение плотности (численности) клеток водорослей.

5.5.2 Определение токсичности анализируемых проб

5.5.2.1 Токсический эффект анализируемых проб определяют по снижению плотности (численности) клеток водорослей для каждого заданного разбавления (концентрации) анализируемой пробы, относительно контрольной пробы А, %, после 72 ч (96 ч) тестирования и рассчитывают по формуле

,

(2)

где - среднеарифметическое значение плотности (численности) клеток водорослей в контрольной пробе, ;

- среднеарифметическое значение плотности (численности) клеток водорослей для каждого заданного разбавления (концентрации) анализируемой пробы, .

5.5.2.2 Если по результатам тестирования за 72 ч (96 ч) получают данные, указывающие на стимуляцию роста плотности (численности) клеток водорослей, то стимуляцию отмечают в протоколе испытаний и проводят расчет по формуле (2), используя данные для другой продолжительности тестирования (например, за 24 ч), когда эффекта стимуляции роста не наблюдается.

5.5.3 Определение эффективной кратности разбавления (концентрации)

5.5.3.1 Для каждого заданного разбавления (концентрации) анализируемой пробы рассчитывают процент снижения плотности (численности) клеток водорослей после 72 ч (96 ч) тестирования по отношению к плотности (численности) клеток водорослей в контрольной пробе, используя полученные по 5.5.1 среднеарифметические значения и формулу (2).

По полученным значениям процентов снижения плотности (численности) клеток водорослей определяют конкретное значение эффективной кратности разбавления (концентрации) пробы, вызывающее 50%-ное снижение плотности (численности) клеток водорослей 72 ч (96 ч ) или 72 ч в зависимости от анализируемой пробы.

При необходимости определяют:

- минимальную кратность разбавления (концентрацию) пробы, соответствующую 100%-ному снижению плотности (численности) клеток водорослей;

- максимальную кратность разбавления (концентрацию) пробы, соответствующую 0%-ному снижению плотности (численности) клеток водорослей за 72 ч ( 96 ч).

Примечание - При тестировании сточных вод допускается определение коэффициента разбавления (LID). Коэффициент разбавления выражают в виде обратной величины объемной доли сточных вод в разбавлении, например, если разбавление проведено в соотношении сточная вода : питательная среда соответственно 1 : 4 (объемная доля 25%), то коэффициент разбавления равен 4.

Если при разбавлении сточных вод значение замедления роста [снижения плотности (численности)] клеток водорослей анализируемой пробы с наибольшей концентрацией питательной среды отличается менее, чем на 5% от контрольной пробы, то данное разбавление определяют как "наименьшее неэффективное разбавление".

5.5.3.2 Допускается определять значение эффективной кратности разбавления (концентрации) по замедлению скорости роста клеток водорослей как указано в 6.5.1 - 6.5.4. Аналогичный пример приведен в приложении ДЖ.

5.5.3.3 Если по результатам, полученным по 5.5.3.1 (5.5.3.2), не удалось определить конкретное значение эффективной кратности разбавления (концентрации) пробы, вызывающей 50%-ное снижение плотности (численности) клеток водорослей за 72 ч (96 ч), то для определения этого значения используют пробит-анализ. Пример приведен в приложении ДД.

5.5.4 Определение степени токсичности анализируемых проб

5.5.4.1 Если значение токсического эффекта анализируемых проб, рассчитанное по формуле (2), составляет менее 10%, то эффективную кратность разбавления (эффективную концентрацию) анализируемой пробы, при которой плотность (численность) клеток водорослей изменилась относительно контрольной пробы не более 10% за 72 ч тестирования (или 96 ч тестирования в зависимости от исследуемого объекта), относят к безвредной кратности разбавления (безвредной концентрации).

5.5.4.2 Степень токсичности исследуемых объектов оценивают:

- природной и питьевой воды - по таблице 1;

- донных отложений - по таблице 2;

- отработанных буровых растворов - по таблице 3;

- химической продукции, смесевой химической продукции - по ГОСТ Р 53857, ГОСТ Р 53858; при необходимости оценки других водных растворов веществ - по таблице 4;

- сточной воды, твердых промышленных отходов, почв и грунтов - по стандартам и другим нормативным документам, утвержденным в установленном порядке.

Примечание - Под нормативным документом следует понимать документы, устанавливающие критерии отнесения исследуемых объектов к классу опасности для окружающей природной среды, разработанные в целях реализации федеральных законов (технических регламентов) в данной области.

Таблица 1 - Степень токсичности проб природной и питьевой воды

Степень токсичности проб природной и питьевой воды		Значение токсического эффекта (см. 5.5.2.1) для проб природной и питьевой воды без разбавления А, %
Общая	Детализированная
Токсичность отсутствует	Нетоксичная	До 10 включ.
Не обладает острой токсичностью	Слаботоксичная	Св. 10 " 25 "
	Малотоксичная	" 25 " 35 "
	Среднетоксичная	" 35 " 50 "
Обладает острой токсичностью	Высокотоксичная	" 50 " 100 "

Таблица 2 - Степень токсичности проб донных отложений

Степень токсичности проб водных вытяжек донных отложений		Значение токсического эффекта (см. 5.5.2.1) для проб донных отложений А, %
Общая	Детализированная
Токсичность отсутствует	Нетоксичная	До 10 включ.
Не обладает острой токсичностью	Слаботоксичная	Св. 10 " 35 "
	Среднетоксичная	" 35 " 50 "
Обладает острой токсичностью	Высокотоксичная	" 50 " 100 "
Примечание - При необходимости более детальной оценки токсичности загрязненных проб донных отложений степень токсичности определяют по значению кратности разбавления (см. 5.5.3) 96 ч , приведенным в таблице 3.

Таблица 3 - Степень токсичности проб отработанных буровых растворов, загрязненности проб донных отложений

Степень токсичности водных вытяжек проб отработанных буровых растворов (донных отложений)	Значение кратности разбавления (см. 5.5.3) водных вытяжек проб отработанных буровых растворов (донных отложений) 96 ч , разы
Нетоксичные	1,0
Слаботоксичная	Менее 100
Среднетоксичная	От 100 до 1000
Высокотоксичная	" 1000 " 10000
Гипертоксичная	Более 10000

Таблица 4 - Степень токсичности водных растворов веществ

Степень токсичности водных растворов веществ	Значение эффективной концентрации вещества (см. 5.5.3) 72 ч ,
Нетоксичные	Св. 1000
Практически нетоксичные	От 1000 до 100 включ.
Слаботоксичные	Менее 100 " 10 "
Среднетоксичные	" 10 " 1,0 "
Высокотоксичные	" 1,0 " 0,01 "
Гипертоксичные	" 0,01

5.6 Оформление результатов тестирования

5.6.1 Результаты тестирования регистрируют в протоколе испытаний в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025, при этом приводят:

a) ссылку на настоящий стандарт с указанием метода определения;

b) данные, необходимые для идентификации пробы или анализируемого вещества, прошедшего испытания;

c) тест-объекты (тест-организмы): род, вид, метод культивирования;

d) подробное описание тестирования:

- дата начала тестирования и продолжительность;

- для природной воды, сточных вод, водных вытяжек отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов, донных отложений, грунтов, почв-кратность разбавления, способ и продолжительность хранения проб и, при необходимости, условия, в которых проводились отстаивание, фильтрование, а также размораживание пробы;

- для веществ - анализируемые концентрации, способ их приготовления;

- наименование, состав питательной среды и способ культивирования водорослей;

- значение рН анализируемых проб перед тестированием и после тестирования;

e) токсичность исследуемого объекта с указанием степени токсичности и результатов определения токсического эффекта, эффективной кратности разбавления 72 ч (96 ч ), эффективной концентрации 72 ч в зависимости от анализируемой пробы, метод расчета (при необходимости);

f) обнаруженные негативные эффекты (например, обесцвечивание клеток водорослей), а также другие обстоятельства и условия, не предусмотренные настоящим стандартом, способные повлиять на результат тестирования.

Примечание - Допускается включать в протокол следующую информацию:

- метод определения плотности (численности) клеток водорослей;

- плотность (численность) клеток водорослей в каждой колбе после окончания любой заданной продолжительности тестирования;

- среднеарифметическое значение плотности (численности) клеток водорослей для каждой кратности разбавления (концентрации) е анализируемых и контрольных пробах после окончания любой заданной продолжительности тестирования;

- зависимость между кратностью разбавления (концентрации) пробы и значениями плотности (численности) клеток водорослей в процентах в табличной или графической форме.

5.6.2 Значения 72 ч (96 ч ), 72 ч выражают:

- в процентах (%) или в кратности разбавления (разы) - для природной воды, сточных вод и водных вытяжек;

- в миллиграммах на кубический дециметр () - для растворов веществ.

6 Метод Б

6.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в регистрации замедления скорости роста клеток зеленых пресноводных одноклеточных водорослей в анализируемой пробе исследуемого объекта относительно контрольной пробы, определении ее токсичности и токсикологических показателей при тестировании в течение 72 ч при постоянном воздействии света и температуры.

Примечание - Для проб сточных вод рекомендуемая процедура тестирования продолжительностью 48 ч приведена в приложении А.

6.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы, материалы - по 5.2 со следующими уточнениями:

Терморегулируемая камера (например, климатостат) или помещение с регулируемой температурой, обеспечивающее поддержание температуры (232)°С и постоянное равномерное белое освещение в диапазоне 6000 - 10000 лк.

Примечание - Для светоизмерительных приборов, калиброванных в других единицах:

- сила света на среднем уровне контрольной пробы должна быть однородной в пределах 10% и в диапазоне от 60 до 120 при измерении в фотосинтетически эффективном диапазоне длин волн от 400 до 700 нм. При этом метод измерения и, в частности, тип приемника прибора, оказывают влияние на измеренное значение интенсивности света. Приемники со сферической геометрией (которые реагируют на прямой и отраженный свет под всеми углами над плоскостью измерения и ниже ее), а также "косинусоидальные" приемники (которые реагируют на свет под всеми углами над плоскостью измерения) являются предпочтительными для однонаправленных приемников и дают более высокие значения для многоточечного источника света;

- требуемая освещенность может быть достигнута с использованием от четырех до шести люминесцентных ламп универсального белого (естественного) света, то есть номинальный цвет эталона цвета 2 (цветовая температура 4300 К).

Фильтры мембранные с диаметром пор 0,2 мкм.

Автоклав, обеспечивающий рабочее давление пара (0,110,02) МПа и температуру (1202)°С.

Тест-объекты (тест-организмы): зеленые пресноводные одноклеточные водоросли Desmodesmus subspicatus или Pseudokirchneriella subcapitata (Korshikov) Hindak.

Примечание - Методы культивирования водорослей приведены в ДБ.2 (приложение ДБ).

Модельный токсикант - по 5.2 или 3,5-дихлорфенол, х.ч.

Питательная среда, приготовленная в соответствии с требованиями ДА.2 (приложение ДА).

Аммоний хлористый по ГОСТ 3773, х.ч.

Калий хлористый по ГОСТ 4234, х.ч.

Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, х.ч.

Кальций хлористый 2-водный, х.ч.

Кобальт хлористый 6-водный по ГОСТ 4525, х.ч.

Магний хлористый 6-водный, по ГОСТ 4209, х.ч.

Марганец (II) хлористый 4-водный по ГОСТ 612, х.ч.

Медь двухлористая 2-водная по ГОСТ 4167, х.ч.

Натрий молибденовокислый 2-водный по ГОСТ 10931, х.ч.

Цинк хлористый по ГОСТ 4529, х.ч.

Кислота борная по ГОСТ 9656, х.ч.

Соль динатриевая этилендиамин-N,N,,-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б) по ГОСТ 10652, х.ч.

6.3 Подготовка к тестированию - аналогично 5.3 с использованием питательной среды по ДА.2.2 (приложение ДА) и тест-организмов по 6.2.

Примечание - При необходимости определения физиологической чувствительности водорослей по отношению к модельному токсиканту 3,5-дихлорфенолу ее определяют аналогично модельному токсиканту калию двухромовокислому (см. 5.3.5) в условиях тестирования по 6.4, при этом используют данные, приведенные в таблице ДИ.1 (приложение ДИ).

6.4 Проведение тестирования - аналогично 5.4 со следующими уточнениями.

6.4.1 Тестирование проводят в течение (722) ч при температуре (232)°С в помещении с регулируемой температурой (или в терморегулируемой камере), при постоянном воздействии равномерного белого освещения в диапазоне 6000 - 10000 лк на расстоянии 0,35 м от поверхности анализируемых проб в колбах, при непрерывном и легком взбалтывании или встряхивании на шейкере анализируемых проб (включая контрольную пробу).

6.4.2 При предварительном тестировании анализируемой пробы используют по одной колбе для каждой заданной кратности разбавления (концентрации) пробы (включая контрольную).

6.4.3 Окончательное тестирование проводят с анализируемыми пробами, которые приготовлены с использованием коэффициента между разбавлениями (концентрациями) не более 3,2 (например, 1,0; 1,8; 3,2; 5,6 и 10,0 ).

Примечание - При предположении отсутствия токсичности у анализируемой пробы допускается проводить окончательное тестирование только при максимальной кратности разбавления (концентрации) анализируемой пробы. При этом тестирование проводят не в трех, а в шести колбах.

6.4.4 Количество добавленной во все колбы (включая контрольную пробу) суспензии водорослей в экспоненциальной фазе роста [см. ДБ.2.3 (приложение ДБ)] должно обеспечить начальную плотность (численность) клеток водорослей в пробе не более .

Примечания

1 Начальная плотность (численность) клеток водорослей в начале тестирования должна быть достаточно низкой, чтобы обеспечить экспоненциальный рост в контрольной пробе за период проведения всего тестирования.

2 Определение начальной плотности (численности) клеток водорослей проводят аналогично 5.4.3.1 с учетом условий тестирования по 6.4.1 и подготовки водорослей по ДБ.2.2 (приложение ДБ).

3 Номинальная плотность (численность) клеток водорослей может быть использована в качестве начальной плотности (численности) клеток водорослей, и в таком случае не требуется подсчет (измерение) начальной плотности (численности) клеток водорослей перед тестированием.

6.4.5 Для приготовления контрольной пробы используют питательную среду по ДА.2.2 (приложение ДА).

6.5 Обработка результатов тестирования - по 5.5 с учетом расчетов эффективной кратности разбавления (эффективной концентрации), как указано ниже.

6.5.1 Построение графической зависимости скорости роста клеток водорослей от продолжительности тестирования

Для каждой кратности разбавления (концентрации) анализируемой пробы (в том числе и контрольной) строят график скорости роста клеток водорослей в виде зависимости логарифма среднеарифметических значений плотности (численности) клеток водорослей от продолжительности тестирования.

6.5.2 Определение скорости роста клеток водорослей

Для каждой кратности разбавления (концентрации) анализируемой пробы рассчитывают скорость роста клеток водорослей , клеток/ч, по формуле

,

(3)

где - среднеарифметическое значение плотности (численности) клеток водорослей в анализируемой пробе в конце тестирования, ;

- среднеарифметическое значение плотности (численности) клеток водорослей в анализируемой пробе в начале тестирования, ;

t - продолжительность тестирования, ч.

Аналогично по формуле (3) рассчитывают среднеарифметическое значение скорости роста клеток водорослей в контрольной пробе .

6.5.3 Замедление скорости роста клеток водорослей , %, для каждой заданной кратности разбавления (концентрации) анализируемой пробы рассчитывают по формуле

,

(4)

где - среднеарифметическое значение скорости роста клеток водорослей в контрольной пробе, клеток/ч;

- среднеарифметическое значение скорости роста клеток водорослей в анализируемой пробе, клеток/ч.

6.5.4 Определение эффективной кратности разбавления (концентрации)

Для каждой заданной кратности разбавления (концентрации) анализируемой пробы рассчитывают по формуле (4) значение замедления скорости роста клеток водорослей в процентах, с использованием формулы (3) или, используя график скорости роста (см. 6.5.2), определяют значение 72 ч (72 ч ) в зависимости от анализируемой пробы.

Пример определения эффективной концентрации вещества по замедлению скорости роста клеток водорослей приведен в приложении ДЖ.

Если по полученным результатам не удалось определить конкретное значение 72 ч (72 ч ), то для определения этого значения используют пробит-анализ. Аналогичный пример приведен в приложении ДД.

6.5.5 Результаты тестирования считают достоверными, если соблюдаются следующие условия:

a) плотность (численность) клеток водорослей в контрольной пробе возросла не менее чем в 67 раз через 72 ч тестирования.

Примечание - Такое увеличение плотности (численности) клеток водорослей соответствует скорости роста клеток 1,4 ;

b) коэффициент колебаний темпов роста клеток водорослей в контрольных пробах в каждой из трех колб тестируемой серии анализируемых проб в течение тестирования должен быть не более 5% относительно среднеарифметического значения плотности (численности) клеток водорослей;

c) уровень рН в контрольной пробе изменился не более чем на 1,5 ед рН в конце тестирования;

d) токсичность модельного токсиканта находится в пределах, указанных в приложении ДИ.

Для сточных вод дополнительно учитывают результаты, полученные для пробы контроля фона на отсутствие интерферирующего воздействия анализируемой пробы на рост клеток водорослей (см. 5.3.3) в конце тестирования.

Если условия перечислений а) - d) не соблюдаются, то находят причины неудовлетворительных результатов, устраняют их и тестирование проводят с новой культурой водорослей.

6.5.6 Информация о проведенных межлабораторных испытаниях приведена в приложении ДИ.

6.5.7 Оформление результатов тестирования - по 5.6.

7 Метод В

7.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в регистрации изменения интенсивности флуоресценции клеток зеленых пресноводных одноклеточных водорослей в анализируемой пробе исследуемого объекта относительно контрольной пробы, определении ее токсичности и токсикологических показателей при тестировании в течение 72 ч (96 ч) в условиях переменного воздействия света и постоянной температуры.

Примечания

1 Метод применяют для определения токсичности исследуемого объекта, используя значения быстрой или замедленной флуоресценции клеток водорослей, которая отражает интенсивность фотосинтеза и прямо зависит от плотности (численности) клеток водорослей в анализируемой пробе.

2 Преимущество метода заключается в том, что метод флуоресценции позволяет определять токсичность быстро распадающихся и летучих веществ (в водных растворах веществ, сточной воде или водных вытяжках).

3 Продолжительность тестирования 72 ч указана для определения токсичности и токсикологических показателей анализируемых проб природной и сточной воды, а также анализируемых проб веществ; продолжительность тестирования 96 ч - для определения токсичности и токсикологических показателей анализируемых проб отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов, донных отложений, грунтов и почв.

7.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы, материалы, тест-объекты (тест-организмы) - по 5.2.

7.3 Порядок подготовки к измерению

7.3.1 Подготовка посуды - по 5.3.1.

7.3.2 Подготовка проб - по 5.3.2.

7.3.3 Подготовка прибора к измерениям - по ДВ.2.2; градуировка прибора - по ДВ.2.3 - ДВ.2.6 (приложение ДВ) для метода А.

7.3.4 Подготовка тест-объектов (тест-организмов) - по ДБ.1.3.1 (приложение ДБ) с учетом требований 7.3.5 и 7.3.6.

7.3.5 Определение объема суспензии водорослей, необходимого для тестирования

7.3.5.1 Непосредственно перед тестированием колбу с подготовленными по ДБ.1.3.1 (приложение ДБ) водорослями закрывают ватно-марлевой пробкой, встряхивают вручную, выдерживают 30 мин при температуре и освещенности по 5.4.3.4, затем снова перемешивают, после чего из колбы автоматической пипеткой переносят в кварцевую кювету прибора объем аликвоты суспензии водорослей, равный объему кварцевой кюветы, затем кювету с аликвотой суспензии водорослей помещают в камеру прибора для измерения интенсивности флуоресценции водорослей.

Порядок проведения измерений - по ДВ.2.7.4 (приложение ДВ).

7.3.5.2 За значение интенсивности флуоресценции суспензии водорослей принимают среднеарифметическое из измеренных значений (за вычетом среднеарифметического из измеренных значений холостой пробы), если абсолютная величина разности между ними не превышает 5% от среднего значения.

7.3.5.3 На основании полученного среднеарифметического значения интенсивности флуоресценции суспензии водорослей (см. 7.3.5.2) рассчитывают необходимый объем суспензии водорослей для внесения в заданный объем каждой колбы (100 ) анализируемых разбавлений (концентраций), в том числе и для контрольной пробы, для проведения тестирования.

При этом значение интенсивности флуоресценции клеток водорослей в начале тестирования должно находиться в пределах 0,20 - 0,25, что соответствует плотности (численности) клеток - (при коэффициенте пересчета ).

Примечание - Коэффициент пересчета, принимают равным , если значение углового коэффициента (наклона) градуировочной характеристики составляет 0,99 [см. ДВ.2.3, ДВ.2.5 (приложение ДВ)].

7.3.6 Проверка физиологической чувствительности тест-объектов (тест-организмов)

Приготовление растворов модельного токсиканта (двухромовокислого калия) - по 5.3.5.1, 5.3.5.2.

Тестирование анализируемых растворов модельного токсиканта проводят по 5.4.3.4 в течение 48 ч, после чего измеряют по ДВ.2.7.4 (приложение ДВ) интенсивность флуоресценции каждого раствора модельного токсиканта. При этом измерения интенсивности флуоресценции каждой аликвоты (из каждой колбы) каждой концентрации раствора модельного токсиканта проводят не менее трех раз.

Обработка результатов измерений - по 7.5.4 с учетом требований 5.3.5.4. Пример приведен в приложении ДГ (см. таблицу ДГ.2).

Если по результатам тестирования не удалось получить конкретное значение 48 ч , то для определения 48 ч модельного токсиканта используют пробит-анализ. Аналогичный пример приведен в приложении ДД.

7.3.7 Приготовление холостой пробы

Холостую пробу готовят следующим образом: в конические колбы вместимостью 250  вносят 100  питательной среды Прата, приготовленной в соответствии с требованиями ДА.1.2 (приложение ДА).

7.3.8 Приготовление пробы контроля фона - по 5.3.3.

Примечание - При тестировании окрашенных или мутных проб может возникнуть мешающее влияние, обусловленное ослаблением светового потока, необходимого для роста клеток водорослей в анализируемой пробе. В таком случае измеряют интенсивность флуоресценции пробы без водорослей (фоновые растворы) и полученное значение вычитают из значения интенсивности флуоресценции, полученного при измерении пробы с водорослями.

7.3.9 Подготовка контрольной пробы

Для каждой пробы анализируемых разбавлений (концентраций) подготавливают контрольную пробу следующим способом: в конические колбы вместимостью 250  вносят по 100  питательной среды Прата [см. ДА.1.2 (приложение ДА)], добавляют по 1,0  суспензии водорослей в экспоненциальной фазе роста (см. 5.3.4), перемешивают, выдерживают 30 мин при температуре и освещенности по 5.4.3.4, затем снова перемешивают, после чего из колбы автоматической пипеткой переносят в кварцевую кювету прибора объем аликвоты контрольной пробы, равный объему кварцевой кюветы, кювету с аликвотой контрольной пробы помещают в камеру прибора для измерения интенсивности флуоресценции водорослей.

Порядок проведения измерений - по ДВ. 2.7.4 (приложение ДВ).

Обработка результатов измерений аналогична процедуре, приведенной в 7.3.5.2 (с учетом числа колб, использованных для приготовления контрольных проб для предварительного или окончательного тестирования).

Значение интенсивности флуоресценции клеток водорослей в контрольной пробе в начале тестирования должно находиться в пределах 0,20 - 0,25, что соответствует плотности (численности) клеток - (коэффициент пересчета равен ).

Примечания

1 С целью получения в начале тестирования плотности (численности) клеток водорослей в пределах от до , достаточно в каждую колбу на 100 мл питательной среды внести 1,0  суспензии водорослей из культуры, плотность (численность) которой находится в пределах от до , что соответствует интенсивности флуоресценции клеток водорослей в пределах 0,20 - 0,25.

2 При проведении тестирования контрольные пробы готовят в двух колбах - для предварительного тестирования; в трех колбах - для окончательного тестирования.

7.4 Проведение измерений

Тестирование подготовленных проб (см. 7.3.2, 7.3.7 - 7.3.9) проводят аналогично требованиям, установленным в 5.4, при этом через каждые 24 ч проводят измерение интенсивности флуоресценции аликвот анализируемых проб, отобранных из каждой колбы, включая контрольные, холостые пробы и, если использовались пробы контроля фона, как указано в ДВ.2.7.4 (приложение ДВ).

Примечание - При необходимости определения токсичности исследуемого объекта, содержащего легколетучие вещества, или если исследуемые вещества быстро распадаются, то допускается оценивать токсичность исследуемых объектов в динамике, проводя измерения интенсивности флуоресценции аликвот анализируемых проб, например, через каждые 15 мин после начала тестирования проб.

Примеры предварительного и окончательного тестирования и определения эффективной концентрации вещества по изменению интенсивности быстрой флуоресценции клеток водорослей приведены в приложении ДК.

7.5 Обработка результатов

7.5.1 При наличии компьютерной системы сбора и обработки информации порядок обработки результатов измерений устанавливают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации прибора.

7.5.2 При отсутствии компьютерной системы сбора и обработки информации обработку результатов проводят следующим образом.

7.5.2.1 Рассчитывают значение интенсивности флуоресценции анализируемой пробы для каждой заданной кратности разбавлений (концентраций), в том числе и контрольной пробы, по формуле

,

(5)

где - среднеарифметическое значение измеренных значений интенсивности флуоресценции аликвоты анализируемой пробы заданной кратности разбавления (концентрации), отн. ед;

- среднеарифметическое значение измеренных значений интенсивности флуоресценции холостой пробы, отн. ед.

При необходимости из среднеарифметических значений интенсивности флуоресценции каждого заданного разбавления (концентрации), за исключением контрольной пробы, вычитают среднеарифметическое значение интенсивности флуоресценции пробы контроля фона.

За результат измерений интенсивности флуоресценции анализируемой пробы заданной кратности разбавления (концентрации), в том числе и контрольной пробы, принимают среднеарифметическое результатов измерений (для аликвот из двух колб - при предварительном тестировании; из трех колб - при окончательном тестировании), если абсолютная величина разности между ними не превышает 5% от среднего значения.

7.5.2.2 Токсический эффект А, %, оцениваемый по снижению интенсивности флуоресценции для каждого заданного разбавления (концентрации) анализируемой пробы относительно контрольной пробы, в процентах, рассчитывают по формуле

,

(6)

где - среднеарифметическое значение интенсивности флуоресценции контрольной пробы, рассчитанное с использованием формулы (5), отн. ед;

В - среднеарифметическое значение интенсивности флуоресценции анализируемой пробы, рассчитанное по формуле (5), отн. ед.

7.5.3 Оценка токсичности - аналогична установленной в 5.5.4 с учетом расчета токсического эффекта по формуле (6).

7.5.4 Определение эффективной кратности разбавления (концентрации) - аналогично 5.5.3 с использованием формулы (6). Пример приведен в приложении ДК.

Если в результате тестирования не удается установить точное значение (), то для его определения применяют пробит-анализ, аналогичный пример приведен в приложении ДД.

7.6 Результаты считают достоверными, если соблюдаются следующие условия:

a) значение интенсивности флуоресценции водорослей в контрольной пробе в конце тестирования увеличилось не менее чем в три раза по сравнению со значением интенсивности флуоресценции водорослей, измеренным в начале тестирования;

b) коэффициент колебаний значений интенсивности флуоресценции водорослей в контрольных пробах в каждой из трех колб в серии анализируемых проб в течение тестирования должен быть не более 5% относительно их среднеарифметического значения;

c) уровень рН в контрольной пробе изменился не более чем на 1,5 ед рН в конце тестирования;

d) токсичность модельного токсиканта находится в пределах, указанных в 5.3.5.4.

Если условия перечислений а) - d) не соблюдаются, то находят причины неудовлетворительных результатов, устраняют их и для тестирования используют новую культуру водорослей.

7.7 Оформление результатов - аналогично 5.6.

Библиография

[1]	ИСО 8692:2004	Качество воды. Испытание на торможение роста водорослей в пресной воде с применением одноклеточных зеленых водорослей
	(ISO 8692:2004)	(Water quality - Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green algae)
[2]	ПНД Ф 12.1:2:2.2:2.3.2-03*	Отбор проб почв, грунтов, осадков биологических очистных сооружений, шламов промышленных сточных вод, донных отложений искусственно созданных водоемов, прудов-накопителей и гидротехнических сооружений. Экологический Центр аналитического контроля, М., 2003
[3]	ПНД Ф 12.15.1-08*	Методические указания по отбору проб для анализа сточных вод. Утверждены ФГУ "Федеральный центр анализа и оценки техногенного воздействия" Ростехнадзора, от 18 апреля 2008 г.
[4]	НВН 33-5.3.01-85*	Инструкция по отбору проб для анализа сточных вод. Утверждена приказом Минводхоза СССР от 13 июля 1985 г.

_____________________________

* Действует до утверждения аналогичного национального стандарта.