Национальный стандарт РФ ГОСТ Р ИСО 13720-2011 "Мясо и мясные продукты. Подсчет количества презумптивных Pseudomonas spp." (утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 943-ст)

Meat and meat products. Enumeration of presumptive Pseudomonas spp.

Дата введения - 1 января 2013 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова" Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ "ВНИИМП им. В.М. Горбатова" Россельхозакадемии) на основе собственного аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4

2 Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 226 "Мясо и мясная продукция"

3 Утвержден и введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 943-ст

4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 13720:2010 "Мясо и мясные продукты. Подсчет количества презумптивных Pseudomonas spp." (ISO 13720:2010 "Meat and meat products - Enumeration of presumptive Pseudomonas spp.").

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

5 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на мясо и мясные продукты, включая мясо птицы, и устанавливает метод подсчета количества презумптивных Pseudomonas spp.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ИСО 6887-1-1999 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Подготовка проб, исходной суспензии и десятикратных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила приготовления исходной суспензии и десятичных разведений (ISO 6887-1:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination - Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions)

ИСО 6887-2-2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Подготовка проб, исходной суспензии и десятикратных разведений для микробиологических исследований. Часть 2. Специальные правила для подготовки мяса и мясных продуктов (ISO 6887-2:2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination - Part 2: Specific rules for the preparation of meat and meat products)

ИСО 7218 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям (ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs - General requirements and guidance for microbiological examinations)

ИСО 11133-1 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Правила приготовления и производства питательных сред. Часть 1. Общие правила по обеспечению качества приготовления питательных сред в лаборатории (ISO/TS 11133-1 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory)

ИСО 11133-2 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Правила приготовления и производства питательных сред. Часть 2. Практическое руководство по определению эффективности питательных сред (ISO/TS 11133-2 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media)

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

презумптивные Pseudomonas spp. (presumptive Pseudomonas spp.): Бактерии, образующие колонии на цефалотин-фуцидин натрия-цетримидном агаре (CFC агар) при температуре культивирования 25°С и дающие положительную реакцию в тесте на наличие оксидазы при проведении исследования в соответствии с настоящим стандартом.

4 Сущность метода

Метод основан на высеве определенного количества исходной суспензии, ее десятикратных разведений на CFC агар и в последующем подсчете количества презумптивных Pseudomonas spp.

Посевы инкубируют при температуре 25°С в течение (444) ч.

Наличие на агаре колоний презумптивных Pseudomonas spp. подтверждается тестом на оксидазу (оксидазоположительные).

Количество презумптивных Pseudomonas spp. в 1 г () исследуемой пробы рассчитывается исходя из количества подтвержденных колоний на чашке с CFC агаром.

5 Приготовление разведений, питательных сред и реактивов

5.1 Общие требования

Общие правила проведения лабораторных исследований должны удовлетворять требованиям ИСО 7218; подготовка и тестирование питательных сред - ИСО 11133-1 и ИСО 11133-2.

5.2 Приготовление разведений

Десятикратные разведения готовят в соответствии с ИСО 6887-1 и ИСО 6887-2.

5.3 Цефалотин-фуцидин натрия-цетримидин агар (CFC агар) [1]

5.3.1 Основа среды

5.3.1.1 Состав:

     - желатин ферментативно гидролизованный ...............16,0 г;

     - казеин ферментативно гидролизованный ................10,0 г;

     - сульфат калия () ................................10,0 г;

     - хлорид магния () ...............................1,4 г;

     - агар* ................................................от 12,0 до 18,0 г;

     - дистиллированная вода ................................1000 .

5.3.1.2 Приготовление

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде при нагревании.

При необходимости устанавливают рН среды (см. 6.4) так, чтобы после стерилизации его значение составляло 7,20,2 при температуре 25°С. Разливают основу питательной среды в колбы или флаконы соответствующего объема (см. 6.6) и стерилизуют в автоклаве (см. 6.1) при температуре 121°С в течение 15 мин.

5.3.2 Растворы селективных добавок

Растворы хранят при температуре (53)°С не более 7 сут.

5.3.2.1 Раствор цефалотина

5.3.2.1.1 Состав:

     цефалотина натриевая соль ..................................0,1 г;

     дистиллированная вода ......................................100 .

5.3.2.1.2 Приготовление

Натриевую соль цефалотина растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.

5.3.2.2 Раствор фуцидина натрия

5.3.2.2.1 Состав:

    фуцидин натрия .................................0,1 г;

    дистиллированная вода .........................100 .

5.3.2.2.2 Приготовление

Фуцидин натрия растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.

5.3.2.3 Раствор цетримида .

5.3.2.3.1 Состав:

     цетримид** ..................................................0,1 г;

     дистиллированная вода ......................................100 .

5.3.2.3.2 Приготовление

Цетримид растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.

5.3.3 Готовая среда

5.3.3.1 Состав среды

                                        Объем,      Концентрация, 

     Основа питательной среды (см. 5.3.1) ..100 ..................-;

     Раствор цефалотина (см. 5.3.2.1) .......5 ..................50;

     Раствор фуцидина натрия (см. 5.3.2.2) ..1 ..................10;

     Раствор цетримида (см. 5.3.2.3) ........1 ..................10.

5.3.3.2 Приготовление

В основу питательной среды, охлажденную на водяной бане (см. 6.3) до температуры (472)°С, добавляют растворы ингибиторов и тщательно перемешивают.

5.3.4 Приготовление чашек с CFC агаром

В стерильные чашки Петри (см. 6.8) разливают готовую среду примерно по 15  и дают агару затвердеть.

Непосредственно перед применением среду в чашках подсушивают в соответствии с ИСО 11133-1.

Среду в чашках Петри хранят не более четырех недель при температуре (53)°С.

5.3.5 Определение эффективности питательной среды

Определение продуктивности и селективности среды проводят в соответствии с ИСО 11133-1. Эффективность CFC агара должна быть проверена по методам и критериям ИСО 11133-2.

5.3.5.1 Определение продуктивности

Инкубация: при температуре 25°С в течение (444) ч.

Штаммы: Pseudomonas fluorescens WDCM 00115*** или Pseudomonas flagi WDCM 00116***.

Эталонная среда: трипказо-соевый агар (TSA).

Метод контроля: количественный.

Критерий: коэффициент продуктивности > 0,5.

5.3.5.2 Определение селективности

Инкубация: при температуре 25°С в течение (444) ч. 

Штаммы: Escherichia coli WDCM 00013***.

Метод контроля: количественный.

Критерий: полное ингибирование роста.

5.4 Реактив для определения оксидазы

5.4.1 Состав:

     N, N, N', N' - тетраметил-р-фенилендиамин дигидрохлорид - 1,0 г;

     дистиллированная вода                                   - 100 .

5.4.2 Приготовление

Реактив растворяют в дистиллированной воде непосредственно перед применением. Могут быть использованы готовые (имеющиеся в продаже) диски или пластинки. В этом случае следуют рекомендациям изготовителя.

6 Оборудование

Используют следующее лабораторное оборудование для микробиологических исследований в соответствии с ИСО 7218, в частности:

6.1 Термостат для сухой стерилизации или автоклав для влажной стерилизации.

6.2 Термостат, поддерживающий температуру (251)°С.

6.3 Баня водяная, поддерживающая температуру (472)°С.

6.4 рН-метр с точностью измерения 0,05 единиц.

6.5 Петли, изготовленные из платиново-иридиевого сплава или эквивалентные стерильные одноразовые петли.

6.6 Пробирки, бутылки или колбы необходимого объема.

6.7 Пипетки градуированные, стерильные, вместимостью 1 , с ценой деления 0,1  по [2] класса А или автоматические пипетки по [3], с использованием стерильных наконечников.

6.8 Чашки Петри стеклянные или полимерные диаметром от 90 до 100 мм.

6.9 Шпатели стеклянные или пластиковые, например шпатель стеклянный в форме хоккейной клюшки, диаметром 3,5 мм, длиной 200 мм, имеющий изгиб под прямым углом приблизительно 30 мм от одного конца, с оплавленными концами.

7 Отбор проб

Метод отбора проб не входит в настоящий стандарт. При отсутствии стандарта, описывающего отбор проб исследуемого продукта, пробы отбирают по специальному соглашению между заинтересованными сторонами.

Следует обеспечить условия, чтобы лаборатория получила пробы, которые были бы представительными и не были бы повреждены или изменены при транспортировании или хранении (см. ИСО 7218).

8 Подготовка проб

Подготовку проб к исследованию проводят в соответствии с ИСО 6887-1 и ИСО 6887-2 и/или по определенным стандартам, разработанным для рассматриваемых групп продукции, или по специальному соглашению между заинтересованными сторонами.

9 Порядок проведения испытаний

9.1 Навеска, исходная суспензия и разведения

Приготовление исходной суспензии и ее десятикратных разведений проводят в соответствии с ИСО 6887-2.

9.2 Посев и инкубация

9.2.1 Для посева каждого разведения используют одну чашку с агаром и не менее двух последовательных разведений в соответствии с ИСО 7218.

При посеве только одного разведения используют не менее двух чашек Петри с агаром.

9.2.2 0,1  исходной суспензии вносят в чашку с CFC агаром (см. 5.3.4). В другую чашку с CFC агаром вносят 0,1  из первого десятикратного разведения.

Эту процедуру повторяют с каждым из последующих десятикратных разведений, используя каждый раз чистую стерильную пипетку.

9.2.3 Посевной материал растирают по поверхности агара шпателем (см. 6.9) до тех пор, пока его поверхность не станет сухой.

9.2.4 Чашки с посевами инкубируют вверх дном в термостате (см. 6.2) при температуре 25°С в течение (444) ч.

9.3 Подсчет и отбор колоний

После инкубирования отбирают чашки, содержащие не более 150 колоний.

С каждой такой чашки произвольно отбирают не менее пяти колоний различных типов.

9.4 Идентификация

9.4.1 Оксидазный тест

Часть фильтровальной бумаги увлажняют оксидазным реактивом (см. 5.4.2). Затем на фильтровальную бумагу с помощью пластмассовой петли или петли из платиново-иридиевого сплава по 6.5 (никель-хромовая петля дает ложноположительные результаты) наносят отобранную колонию.

Если через 5 - 10 с фильтровальная бумага окрашивается в фиолетовый цвет, тест на оксидазу считается положительным.

Если в течение 30 с цвет фильтровальной бумаги не изменился, тест на оксидазу считается отрицательным.

Результаты подтверждают, используя положительные и отрицательные контрольные штаммы микроорганизмов. Примерами контрольных штаммов могут быть Pseudomonas aeruginosa WDCM 00025 (положительный контроль), Escherichia соli WDCM 00013 (отрицательный контроль).

9.4.2 Оценка результатов

Оксидазоположительные микроорганизмы оценивают как презумптивные Pseudomonas spp.

10 Обработка результатов

Обработку результатов проводят в соответствии с ИСО 7218.

11 Оформление протокола испытаний

Протокол испытаний должен содержать:

a) информацию, необходимую для полной идентификации образца;

b) метод исследования со ссылкой на настоящий стандарт;

c) полученные результаты;

d) все подробности проведения испытаний, не предусмотренные настоящим стандартом или считающиеся необязательными, но которые могут повлиять на результат.

_____________________________

* Используемая масса зависит от прочности агарового геля.

** Смесь состоит в основном из тетрадецилтриметиламмония бромида с небольшим количеством додецилтриметиламмония бромида и цетримония (гексадецилтриметиламмония) бромида

*** Справочный каталог штаммов, доступный на http://www.wfcc.nig.ac.jp/WDCM Reference Strain Catalogue, для информации о коллекции культур ряда штаммов и детали контактов.

Допускаются к использованию и другие штаммы указанных в настоящем стандарте видов микроорганизмов с аналогичными свойствами.

Библиография

[1]	MEAD, G.C., ADAMS, B.W. A selective medium for the rapid isolation of pseudomonads associated with poultry meat spoilage. Br. Poult. Sci. 1977, 18, pp. 661 - 670
[2]	ИСО 835	Посуда лабораторная стеклянная. Мерные градуированные пипетки (ISO 835 Laboratory glassware - Graduated pipettes)
[3]	ИСО 8655-2	Устройства мерные, приводимые в действие поршнем. Часть 2. Пипетки, приводимые в действие поршнем (ISO 8655-2 Piston-operated volumetric apparatus - Part 2: Piston pipettes)