Национальный стандарт РФ ГОСТ Р ИСО 9233-2-2011 "Сыры и плавленые сыры. Определение содержания натамицина. Часть 2. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 17 октября 2011 г. N 456-ст)

Cheese and processed cheese. Determination of natamycin content. Part 2. High-performance liquid chromatographic method

Дата введения - 1 января 2013 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") при участии Государственного научного учреждения "Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия" Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ "ВНИИМС") на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4

2 Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"

3 Утвержден и введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 17 октября 2011 г. N 456-ст

4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 9233-2:2007 "Сыры, сырные корки и плавленые сыры. Определение содержания натамицина. Часть 2. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для сыров, сырных корок и плавленых сыров" (ISO 9233-2:2007 "Cheese, cheese rind and processed cheese - Determination of natamycin content - Part 2: High-performance liquid chromatographic method for cheese, cheese rind and processed cheese").

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5-2004 (пункт 3.5)

5 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения массовой доли натамицина свыше 0,5 мг/кг в сырах, сырных корках и плавленых сырах и массы натамицина на единицу площади поверхности свыше 0,03  в сырных корках.

2 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1 содержание натамицина (natamycin content): Массовая доля вещества, определенного в соответствии с методикой, установленной в настоящем стандарте.

Примечание - Содержание натамицина выражают в миллиграммах на килограмм.

2.2 масса натамицина на единицу площади поверхности в сырной корке (surface-area-related natamycin mass in cheese rind): Масса натамицина на единицу площади поверхности, определенная в соответствии с методикой, установленной в настоящем стандарте.

Примечание - Массу натамицина на единицу площади поверхности выражают в миллиграммах натамицина на квадратный дециметр сырной корки.

2.3 сырная корка (cheese rind): Наружный слой сыра толщиной 5 мм, за исключением слоя покрытия, если оно присутствует.

3 Сущность метода

Экстрагируют метанолом известное количество пробы. Экстракт разбавляют водой с последующим охлаждением до температуры от минус 15°С до минус 20°С для осаждения большей части жира, а затем фильтруют. Определяют в фильтрате (при необходимости после концентрирования) содержание натамицина или массу натамицина на единицу площади поверхности с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).

4 Реактивы

Используют только реактивы признанного аналитического качества, если не оговорено иначе, а также только дистиллированную или деминерализованную воду или воду эквивалентной чистоты.

4.1 Метанол ().

4.2 Метанол, водный раствор.

Смешивают два объема метанола (4.1) и один объем воды.

4.3 Стандартные растворы натамицина

4.3.1 Стандартный основной раствор натамицина концентрацией 500 

Непосредственно перед использованием растворяют в метаноле (4.1) в мерной колбе с одной меткой вместимостью 100  (5.1) количество препарата с известным содержанием натамицина, соответствующее 50 мг чистого натамицина (). Доводят до метки водой и перемешивают.

4.3.2 Стандартный рабочий раствор натамицина концентрацией 5 

В мерную колбу с одной меткой вместимостью 50  (5.1) отбирают пипеткой 5,0  стандартного основного раствора натамицина (4.3.1). Разбавляют до метки водным раствором метанола (4.2) и перемешивают. Отбирают пипеткой 5,0  разбавленного таким образом раствора в другую мерную колбу с одной меткой вместимостью 50  (5.1). Разбавляют до метки водным раствором метанола (4.2) и перемешивают. Концентрация этого стандартного рабочего раствора натамицина составляет 5 . Концентрация должна быть близкой к концентрации испытуемого раствора, измеренной в 8.3.3. При необходимости регулируют концентрацию этого стандартного рабочего раствора путем отбора пипеткой и разбавления другого количества основного раствора.

4.4 Уксусная кислота (), ледяная.

5 Аппаратура

Обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.

5.1 Мерные колбы с одной меткой вместимостью 50 и 100 .

5.2 Ломтерезка или аналогичное устройство, способное нарезать ломтики сыра толщиной 5 мм и шириной примерно 30 мм (см. рисунок А.1).

5.3 Ломтерезка для тонкой нарезки, способная нарезать тонкие ломтики сыра максимальной толщиной 1 мм (см. рисунок А.2).

5.4 Измельчитель или смеситель.

5.5 Острый нож, способный разрезать ломтики сыра на небольшие кусочки.

5.6 Магнитная мешалка или аппарат для встряхивания.

5.7 Конические колбы вместимостью 100 и 200 , изготовленные из цветного стекла и снабженные притертыми стеклянными пробками.

5.8 Шприцы одноразовые вместимостью 10 .

5.9 Мембранные микрофильтры с размером пор от 0,20 до 0,45 мкм, стойкие к воздействию спиртовых растворов.

5.10 Складчатые бумажные фильтры, быстрофильтрующие, диаметром 150 мм (например, S и S, No. 595 1/2*).

5.11 Воронка диаметром приблизительно 70 мм.

5.12 Морозильная камера, способная замораживать при температуре от минус 15°С до минус 20°С.

5.13 Экстракционные гильзы для концентрирования, при необходимости, отфильтрованного экстракта.

5.14 Жидкостный хроматограф с УФ-детектором, способный проводить измерения при длине волны 303 нм и оборудованный регистрирующим устройством и/или интегратором.

5.15 Аналитическая колонка длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, типа С8, с размером частиц 5 мкм (например, Lichrosorb RP8*).

5.16 Защитная колонка длиной 100 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, типа С8, с размером частиц от 30 до 40 мкм.

5.17 Емкость для хранения пробы подходящей вместимости.

6 Отбор проб

В лабораторию следует поставлять представительную пробу. Она не должна быть подвержена порче или изменению во время транспортирования или хранения.

Отбор проб не рассматривается в методе, установленном в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора проб приводится в ИСО 707.

Лабораторная проба должна составлять целую головку сыра или ее сегмент, представляющий целую головку.

7 Приготовление пробы для испытания

7.1 Сырная корка

При необходимости разрезают пробу для испытания на сектора или более мелкие части так, чтобы ширина сырной корки была не более 30 мм. С помощью ломтерезки (5.2) отделяют всю корку от всех полученных секторов или частей, нарезая ломтиками максимальной толщиной 5 мм. Из полученной корки вырезают с помощью острого ножа (5.5) прямоугольный кусок площадью от 2 до 4 . Определяют площадь его поверхности в квадратных дециметрах и массу в килограммах. Тщательно измельчают (5.4) всю корку, включая взвешенный и измеренный кусок, и хорошо перемешивают. Сразу же переносят приготовленную таким образом пробу в емкость для хранения пробы (5.17). После приготовления каждой пробы для испытания очищают все инструменты, которые находились в контакте с пробой, горячей водой, а затем метанолом (4.1). Тщательно сушат все инструменты, например, струей сжатого воздуха.

7.2 Внутренняя часть сыра и плавленый сыр

После удаления корки (7.1) используют ломтерезку для тонкой нарезки (5.3) для получения ломтика максимальной толщиной 1 мм со всего наружного среза пробы для испытания. Нарезают все ломтики пробы на мелкие куски площадью приблизительно 50  и хорошо перемешивают. Сразу же переносят приготовленную таким образом пробу в емкость для хранения пробы (5.17). После приготовления каждой пробы для испытания очищают все инструменты, которые находились в контакте с пробой для испытания, горячей водой, а затем метанолом (4.1). Тщательно сушат все инструменты, например, струей сжатого воздуха.

8 Проведение испытания

8.1 Подготовка пробы для анализа

8.1.1 Сырная корка

В коническую колбу вместимостью 200  (5.7) взвешивают с точностью до 10 мг приблизительно 10,00 г пробы для испытания (7.1).

8.1.2 Внутренняя часть сыра и плавленый сыр

В коническую колбу вместимостью 100  (5.7) взвешивают с точностью до 10 мг приблизительно 5,00 г пробы для испытания (7.2).

8.2 Приготовление испытуемого раствора

8.2.1 Сырная корка

8.2.1.1 Первоначальная подготовка

В коническую колбу к пробе для анализа (8.1.1) добавляют 100  метанола (4.1). Перемешивают содержимое конической колбы в течение 90 мин на магнитной мешалке (5.6) или встряхивают в течение 90 мин в аппарате для встряхивания (5.6). Добавляют 50  воды. Сразу же переносят коническую колбу в морозильную камеру (5.12) приблизительно на 60 мин.

8.2.1.2 Фильтрование

Холодный экстракт фильтруют через складчатый бумажный фильтр (5.10), отбрасывая первые 5  фильтрата. Фильтрование следует проводить, пока суспензия остается еще холодной, чтобы избежать растворения жира и, следовательно, образования мутных фильтратов. Доводят фильтрат до комнатной температуры. С помощью шприца (5.8) отбирают порцию фильтрата. Фильтруют через мембранный микрофильтр с размером пор 0,45 мкм (5.9), а затем через мембранный микрофильтр с размером пор 0,20 мкм (5.9). Минимальное требуемое количество испытуемого раствора (фильтрата) составляет 20 мкл на ввод для прямого хроматографического измерения (8.3.4) и 25  или 50  для измерения при 5- или 10-кратной концентрации (8.3.5) соответственно.

8.2.2 Внутренняя часть сыра и плавленый сыр

8.2.2.1 Первоначальная подготовка

В коническую колбу к пробе для анализа (8.1.2) с помощью измерительного цилиндра добавляют 50  метанола (4.1). Перемешивают содержимое конической колбы в течение 90 мин на магнитной мешалке (5.6) или встряхивают в течение 90 мин в аппарате для встряхивания (5.6). С помощью измерительного цилиндра добавляют 25  воды. Сразу же переносят коническую колбу в морозильную камеру (5.12) приблизительно на 60 мин.

8.2.2.2 Фильтрование

Фильтруют раствор, как описано в 8.2.1.2.

8.3 Определение

8.3.1 Определение и пределы обнаружения

Лаборатория, которая применяет данный метод, должна установить пределы обнаружения и провести определение в собственных инструментальных условиях, используя признанные методы расчета, для верификации того, что натамицин может быть определен при концентрациях вплоть до 0,5 мг/кг и 0,03 .

8.3.2 Настройка жидкостного хроматографа (5.14)

Рекомендуется следующий хроматографический режим:

подвижная фаза: метанол (4.1) - вода - уксусная кислота (4.4) - 12:8:1 (объемных частей);

поток: 1 ;

установка детектора: 303 нм, 0,005 оптической единицы, вся шкала;

регистрирующее устройство: 10 мВ;

число теоретических (типичных) тарелок: минимум 1500.

При использовании другой колонки, отличной от приведенной в качестве примера (5.15), регулируют соотношение метанол:вода. Однако заданное относительное количество уксусной кислоты (4.4) к метанолу является существенным для сохранения максимальной оптической плотности при 303 нм. Для определения времени удерживания и проверки калибровочного графика (8.3.3) перед испытанием каждой серии проб в хроматограф должен вводиться стандарт с известным содержанием натамицина. Поскольку натамицин не устойчив в водном метаноле, выполняют измерение как можно быстрее.

8.3.3 Построение калибровочного графика

Отбирают пипеткой 1, 2, 4, 6 и 8  стандартного рабочего раствора натамицина (4.3.2) соответственно в серию мерных колб с одной меткой вместимостью 50 (5.1). Доводят до метки водным метанолом (4.2) и перемешивают. Полученные таким образом калибровочные растворы содержат 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 и 0,8  натамицина соответственно. Поочередно вводят в колонку по 20 мкл каждого калибровочного раствора. Определяют площадь или высоту полученных пиков. Наносят на график полученные площадь или высоту пика для каждого раствора по оси ординат относительно концентрации натамицина, в микрограммах на миллилитр, по оси абсцисс. HPL-хроматограмма образца приведена на рисунке А.3.

8.3.4 Испытуемый раствор

Вводят 20 мкл испытуемого раствора (8.2.1.2 или 8.2.2.2). Измеряют площадь или высоту пика с таким же временем удерживания, что и калибровочные растворы натамицина. Выполняют измерение по возможности быстрее. Если площадь или высота пика испытуемого раствора настолько мала, что интерполяция по калибровочному графику невозможна или почти невозможна, а определение тем не менее необходимо, следуют методике, указанной в 8.3.5. Примеры HPL-хроматограмм испытуемых растворов приведены на рисунке А.4.

Примечание - Присутствие в сыре специй, особенно перца, может мешать определению, поскольку на хроматограмме может образовываться пик с тем же временем удерживания, что и у пика, соответствующего натамицину. Разделение этих двух пиков может быть достигнуто путем градиентного элюирования или изократического использования альтернативной подвижной фазы метанол (4.1): фосфатный буфер, рН 4,5 с соотношением 11:9 объемных частей. Раствор фосфата для буферного раствора можно приготовить при растворении 3,026 г дигидроортофосфата калия в 1 воды.

8.3.5 Низкое содержание натамицина

8.3.5.1 Концентрирование

Решают вопрос о необходимости использования приблизительно 5- или 10-кратной концентрации. Основывают это решение на результате, полученном в 8.3.4, и на требуемом пределе определения. Затем в химический стакан отбирают пипеткой 25  или 50  (для 5- или 10-кратной концентрации соответственно) испытуемого раствора (8.2.1.2). В зависимости от требуемой концентрации добавляют 50 или 100  воды соответственно и перемешивают. Активируют экстракционную гильзу (5.13), используя от 3 до 5  метанола (4.1). Затем промывают 10  воды. Пропускают разбавленный испытуемый раствор через гильзу со скоростью от 3 до 5  с помощью шприца (5.8). Таким же образом промывают гильзу 10  воды и элюируют натамицин 3  метанола (4.1).

8.3.5.2 Измерение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

Разбавляют элюат (8.3.5.1) до 5  метанолом (4.1). Продолжают измерение, как указано в 8.3.4.

9 Расчет и выражение результатов

9.1 Расчет массовой доли натамицина

Массу натамицина во введенной аликвоте испытуемого раствора можно определить путем интерполяции по калибровочному графику (8.3.3).

Содержание натамицина в виде массовой доли w, мг/кг, в испытуемой пробе рассчитывают по формуле

,

(1)

где - концентрация натамицина в испытуемом растворе (8.2.1.2 или 8.2.2.2), ;

m - масса пробы для анализа (8.1.1 или 8.1.2), г;

V - общий объем испытуемого раствора (8.2.1.1 или 8.2.2.1), .

Примечание - В том случае, если испытуемый раствор приготовлен из сыра, отобранного из-под корки, w представляет собой содержание натамицина в результате миграции в сыр.

9.2 Расчет массы натамицина на единицу площади поверхности

Массу натамицина на единицу площади поверхности , , рассчитывают по формуле

,

(2)

где - массовая доля натамицина в пробе для испытания, взятой из сырной корки (7.1), мкг/кг;

m - масса взвешенного куска пробы для испытания, взятой из сырной корки (7.1), кг;

А - площадь взвешенного куска пробы для испытания, взятой из сырной корки (7.1), .

9.3 Поправка, вводимая в результат

В том случае, если отфильтрованный экстракт подвергался концентрированию, как указано в 8.3.5, вносят поправку в результаты испытания для w (9.1) и (9.2) следующим образом:

a) для приблизительно 5-кратной концентрации делят полученный результат на 5;

b) для приблизительно 10-кратной концентрации делят полученный результат на 10.

Если требуется параллельное определение при условии соблюдения требований к повторяемости, за конечный результат содержания натамицина в пробе для испытания принимают среднеарифметическое результатов двух определений, полученных в соответствии с разделом 10, округленное с точностью до первого десятичного знака.

9.4 Обработка результатов

Выражают результаты испытания с точностью до первого десятичного знака.

10 Прецизионность

10.1 Межлабораторные испытания

Значения повторяемости и воспроизводимости были получены по результатам межлабораторного испытания, проведенного в соответствии с ИСО 5725:1986 [2] (относительно результатов см. [4]).

10.2 Повторяемость

Абсолютное расхождение между результатами двух независимых единичных испытаний, полученными при использовании одного и того же метода на идентичном испытуемом материале в одной лаборатории одним оператором на одном и том же оборудовании в пределах короткого промежутка времени, будет не более чем в 5% случаев превышать значения, указанные в таблице В.1.

10.3 Воспроизводимость

Абсолютное расхождение между результатами двух единичных испытаний, полученными при использовании одного и того же метода на идентичном испытуемом материале в разных лабораториях разными операторами на различном оборудовании, будет не более чем в 5% случаев превышать значения, указанные в таблице В.1.

11 Протокол испытания

Протокол испытания должен содержать:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

b) используемый метод отбора проб, если известен;

c) используемый метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

d) все подробности, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, вместе с подробностями всех побочных обстоятельств, которые могут повлиять на результат(ы) испытания;

e) полученный(е) результат(ы) испытания и, в случае проверки повторяемости, конечный полученный результат.

_____________________________

* Пример подходящего продукта, имеющегося в продаже. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает одобрения этого продукта национальным органом по стандартизации.

Библиография

[1]	ISO 707/IDF 50 Milk and milk products - Guidance on sampling
[2]	ISO 5725:1986 Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests
[3]	DE RUIG W.G., VAN OOSTROM J.J., LEENHEER, K. Spectrometry and liquid chromatographic determination of natamycin in cheese and cheese rind. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1987, 70, pp. 944-8
[4]	DE RUIG, W.G. Determination of natamycin in cheese and cheese rind: Interlaboratory collaborative study. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1987, 70, pp. 949-54