Межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14148-2015 "Продукция пищевая. Определение витамина K_1 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 мая 2016 г. N 312-ст)

Межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14148-2015
"Продукция пищевая. Определение витамина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 мая 2016 г. N 312-ст)

Foodstuffs. Determination of vitamin by high performance liquid chromatographic method

Дата введения - 1 июля 2017 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Научно-производственным республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации" (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии европейского стандарта, указанного в пункте 5

2 Внесен Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации по переписке (протокол от 27 февраля 2015 г. N 75-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Казахстан	KZ	Госстандарт Республики Казахстан
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Молдова	MD	Молдова-Стандарт
Россия	RU	Росстандарт
Таджикистан	TJ	Таджикстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 мая 2016 г. N 312-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14148-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 14148:2003 "Продукция пищевая. Определение витамина K1 с помощью ВЭЖХ" ("Foodstuffs. Determination of vitamin K1 by HPLC", IDT)

Европейский стандарт EN 14148:2003 разработан техническим комитетом CEN/TC 275 "Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы" Европейского комитета по стандартизации (CEN).

Официальный экземпляр европейского стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и европейского стандарта, на который дана ссылка, имеются в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им нормативные стандарты Российской Федерации, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина в пищевой продукции с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Определение витамина проводится путем измерения восстановленного филлохинона. Метод прошел валидацию для молока и детских смесей, однако известен опыт лабораторий, который показал, что метод также применим к другой пищевой продукции [10].

2 Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходим следующий ссылочный документ. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).

EN ISO 3696 Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

3 Сущность метода

Витамин отделяют в растворе пробы от сопутствующих веществ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и определяют флуориметрическим методом после восстановления в послеколоночном реакторе. Количественно определяют сумму изомеров витамина , которые на колонках с фазой выходят в виде единого неразрешенного пика [1] - [4].

4 Реактивы

4.1 Общие положения

Для проведения анализа, если не указано иное, используют только реактивы признанной аналитической чистоты и воду не ниже первой степени чистоты по EN ISO 3696 или дистиллированную воду.

4.2 Химические вещества и растворы

4.2.1 Метанол, массовая доля w()99,8%.

4.2.2 Этанол, объемная доля ()99,8%.

4.2.3 Смесь этанола и метанола, объемная доля () = 95%

Смешивают 950  этанола (4.2.2) с 50  метанола (4.2.1).

4.2.4 Дихлорметан, массовая доля w()99,5%.

4.2.5 Н-гексан, массовая доля w()97%.

4.2.6 Петролейный эфир, с диапазоном температуры кипения 35 - 60°С, ч.д.а.

4.2.7 Гидроксид калия, массовая доля w(KOH)85%.

4.2.8 Раствор гидроксида калия молярной концентрации с(KОН) = 10 .

4.2.9 Калий фосфорнокислый однозамещенный, массовая доля w()99,5%.

4.2.10 Карбонат калия, массовая доля w()99,9%.

4.2.11 Ацетат натрия, безводный, массовая доля w()99,5%.

4.2.12 Уксусная кислота, массовая доля w()99,8%.

4.2.13 Хлорид цинка, массовая доля w()98%.

4.2.14 Цинк, порошок, размер частиц < 63 мкм, массовая доля w(Zn)97%.

4.2.15 Фосфатный буфер с рН 7,9 - 8,0

Растворяют 54,0 г калия фосфорнокислого однозамещенного (4.2.9) примерно в 350  воды, регулируют рН до 7,9 - 8,0 раствором гидроксида калия (4.2.8) и разбавляют до 500  водой.

4.2.16 Раствор хлорида-ацетата цинка

Взвешивают 13,7 г хлорида цинка (4.2.13), 4,1 г безводного натрия ацетата (4.2.11) и 3,0 г уксусной кислоты (4.2.12) и переносят в мерную колбу вместимостью 50 , растворяют в метаноле (4.2.1) и объем содержимого колбы доводят до метки метанолом.

4.2.17 Липаза типа VII

Липаза из Candida rugosa с каталитической активностью 1000 Ед/мг или другой подходящий вариант*. Могут использоваться другие источники фермента из видов Pseudomonas и Rhizopus с учетом разницы в показателях активности.

4.2.18 Подвижная фаза для ВЭЖХ.

Смешивают 100  дихлорметана (4.2.4), 900  метанола (4.2.1) и 5  раствора хлорида-ацетата цинка (4.2.16). Фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм.

4.3 Витамин , образец сравнения (филлохинон, 3-фитилменадион), массовая доля w()99%

Витамин можно приобрести у различных поставщиков. Степень чистоты филлохинона может отличаться. Поэтому необходимо определить массовую концентрацию градуировочного раствора спектрофотометрическим методом в ультрафиолетовой области (см. 4.4.4).

4.4 Исходные растворы

4.4.1 Меры предосторожности

Витамин очень чувствителен к свету. Следует принять меры по защите образца сравнения и соответствующих растворов в процессе выполнения методики с использованием лабораторной посуды из коричневого стекла.

4.4.2 Исходный раствор I витамина , массовой концентрацией ()# = 1,0 

Взвешивают около 100 мг (точная навеска) образца сравнения витамина (4.3), переносят в мерную колбу вместимостью 100 , растворяют в метаноле (4.2.1) и объем содержимого колбы доводят до метки метанолом. Раствор можно хранить в среде азота в течение 3 мес при температуре минус 20°С в темном месте.

Примечание - При растворении указанных количеств витамина могут возникнуть затруднения.

4.4.3 Исходный раствор II витамина , массовой концентрацией () = 50,0 

Переносят пипеткой 5,0  исходного раствора I витамина (4.4.2) в мерную колбу вместимостью 100  и объем содержимого колбы доводят до метки метанолом (4.2.1). Раствор может храниться в среде азота в течение 1 мес при температуре минус 20°С в темном месте.

4.4.4 Определение массовой концентрации

Выпаривают 5,0  исходного раствора II витамина (4.4.3) с помощью ротационного испарителя в условиях частичного вакуума или под воздействием потока азота. Повторно растворяют осадок в 25,0  н-гексана (4.2.5) или петролейного эфира (4.2.6).

Измеряют на спектрофотометре (5.1) оптическую плотность раствора в кювете с оптической длиной пути 1 см относительно н-гексана или петролейного эфира в качестве образца сравнения в максимуме поглощения при длине волны около 248 нм. Рассчитывают массовую концентрацию витамина в исходном растворе II витамина (4.4.3) , , по формуле

,

(1)

где - величина оптической плотности раствора в максимуме поглощения при длине волны около 248 нм;

- коэффициент для перевода в микрограмм на миллилитр;

5 - коэффициент разбавления при замене растворителя метанола на н-гексан;

419 - величина витамина в н-гексане (4.2.5) или петролейном эфире (4.2.6) при 248 нм ([5]);

4.5 Стандартные растворы

4.5.1 Промежуточный стандартный раствор витамина , массовая концентрация () = 2,5 

Пипеткой переносят 5,0  исходного раствора II витамина (4.4.3) в мерную колбу вместимостью 100  и объем содержимого колбы доводят до метки метанолом (4.2.1).

4.5.2 Стандартный аналитический раствор витамина для ВЭЖХ, массовая концентрация () = 25,0

Пипеткой переносят 1  промежуточного стандартного раствора витамина (4.5.1) в мерную колбу из коричневого стекла вместимостью 100  и объем содержимого колбы доводят до метки метанолом (4.2.1). Данный раствор должен быть свежеприготовленным.

5 Оборудование

Используют стандартное лабораторное оборудование, в том числе перечисленное ниже.

5.1 Ультрафиолетовый спектрофотометр

УФ-спектрофотометр, способный измерять оптическую плотность при установленной длине волны, в кюветах с оптической длиной пути 1 см.

5.2 Система для ВЭЖХ

Система для ВЭЖХ, состоящая из насоса, устройства для инжекции проб, флуориметрического детектора, позволяющего выполнять измерения при заданных длинах волн (например, при длине волны возбуждения 243 нм и длине регистрации 430 нм), и системы для сбора и обработки данных (например, интегратора).

5.3 Колонка для ВЭЖХ

Аналитическая колонка с обращенной фазой, диаметром 3,0 - 4,6 мм, длиной 100 - 250 мм, заполненная частицами размером 3 - 10 мкм.

Допускается использовать колонки других размеров или с частицами другого размера. В этом случае параметры разделения должны быть адаптированы к таким материалам, чтобы обеспечить аналогичные результаты.

Могут использоваться и другие системы (см. приложение С), которые обеспечивают надлежащее разделение филлохинона от других совместно экстрагируемых компонентов пробы.

5.4 Система послеколоночной дериватизации

Колонка из нержавеющей стали или стекла, помещенная между аналитической колонкой и флуориметрическим детектором, диаметром 2,0 - 6,0 мм, длиной 10 - 150 мм, заполненная цинковым порошком (4.2.14).

5.5 Устройство для фильтрации

Подходит мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Примечание - Фильтрация подвижной фазы, так же как и раствора пробы, через мембранный фильтр до использования или инжектирования может увеличить срок службы колонок.

6 Методика проведения испытания

6.1 Меры предосторожности

Витамин очень чувствителен к свету. Во время проведения испытаний следует принимать меры для защиты пробы и соответствующих растворов с использованием лабораторной посуды из коричневого стекла.

6.2 Подготовка аналитической пробы

Гомогенизируют аналитическую пробу. Измельчают грубый материал при помощи соответствующего измельчителя и снова перемешивают, предварительно охлаждая, чтобы не допустить воздействия высокой температуры в течение длительного периода.

6.3 Приготовление раствора пробы

6.3.1 Экстракция из пробы

Взвешивают 1 г порошкообразной или 10 г жидкой пробы с точностью до 0,001 г в закрывающуюся аналитическую пробирку или коническую колбу. В порошкообразную пробу добавляют 15  воды с температурой 40°С и перемешивают на вортексе, в жидкую пробу добавляют 5  воды с температурой 40°С. Проводят холостой опыт, используя только реактивы без пробы (см. 6.5).

6.3.2 Обработка ферментом

Добавляют 5  фосфатного буфера с рН 7,9 - 8,0 (4.2.15) и перемешивают. Добавляют 1,0 г липазы (4.2.17), перемешивают на вортексе, закрывают пробкой и встряхивают в течение примерно 2 - 3 мин. Выдерживают смесь при температуре (372)°С в течение 2 ч. Через равные промежутки времени, например 20 мин, энергично встряхивают смесь вручную.

6.3.3 Экстракция

Смесь охлаждают до комнатной температуры, добавляют 10  смеси этанола и метанола (4.2.3) и 1,0 г карбоната калия (4.2.10) и хорошо перемешивают. Добавляют установленный объем (30 ) н-гексана (4.2.5) и энергично встряхивают. Затем оставляют в темном месте до разделения фаз или центрифугируют при 2000g в течение 10 мин. Н-гексановый экстракт можно хранить в течение ночи при температуре 4°С в среде азота в темном месте.

6.3.4 Перенос и разбавление фазы

Переносят в виалу пипеткой аликвотный объем фазы н-гексана (6.3.3): 0,5  для обогащенной пробы и 5,0  для необогащенной пробы. Удаляют растворитель в токе азота и снова растворяют осадок в установленном объеме V метанола (4.2.1) - 1,0 , получая раствор анализируемой пробы для анализа методом ВЭЖХ.

6.4 Идентификация

Идентифицируют витамин , сравнивая время удержания пика на хроматограммах, полученных при анализе раствора анализируемой пробы (6.3.4) и стандартного аналитического раствора (4.5.2). Идентификацию пика также можно выполнить, если добавлять соответствующие стандартные растворы в небольшом количестве в раствор анализируемой пробы.

Было доказано, что разделение и количественный анализ являются удовлетворительными при соблюдении указанных ниже экспериментальных условий (см. также рисунки А.1 - А.3). Альтернативные условия ВЭЖХ приведены в таблице С.1.

Неподвижная фаза и размеры колонки:	Resolve C18, 5 мкм, 150 х 3,9 мм.
Подвижная фаза:	Смешивают 100  дихлорметана (4.2.4), 900  метанола (4.2.1) и 5  раствора хлорида-ацетата цинка (4.2.16).
Скорость потока:	1,0 .
Инжектируемый объем:	20 .
Колонка для дериватизации:	Колонка из нержавеющей стали размером 20 x 4 мм, заполненная цинковым порошком (4.2.14).
Детектирование:	Флуориметрическое, длина волны возбуждения - 243 нм; длина волны регистрации - 430 нм.

Примечания

1 На неподвижных фазах С18 изомеры витамина (цис- и транс-) элюируются единым неразрешенным пиком ([6], [7]). Современные исследования показали, что разделение изомеров в пробах пищевой продукции может быть осуществлено на колонках с фазой С30 ([10]). В стандартных растворах и концентратах проб изомеры могут быть определены в условиях нормально-фазовой хроматографии с применением ультрафиолетового детектирования ([8], [9]).

2 В ходе экспериментальных исследований было установлено, что колонку для дериватизации можно нагреть до 40°С во время проведения анализов методом ВЭЖХ, для ускорения дериватизации.

6.5 Определение

Инжектируют 20  стандартного раствора анализируемой пробы (4.5.2) и аналитического раствора пробы (6.3.4) в хроматографическую систему.

При использовании метода внешнего стандарта находят интегрированием значения площадей пиков или определяют высоты пиков и сравнивают результаты с соответствующими значениями для образца сравнения.

Обычно концентрация витамина в растворе пробы очень мала. Поэтому, чтобы избежать загрязнений, все работы необходимо проводить с использованием чистой лабораторной посуды. Чтобы убедиться в отсутствии загрязнений, проводят холостую пробу с использованием тех же количеств реактивов, но без анализируемой пробы.

7 Обработка результатов измерений

Результат измерений рассчитывают при помощи градуировочной характеристики, либо используют соответствующие программы интегратора, либо применяют следующий упрощенный способ.

Рассчитывают массовую долю витамина w, мкг/100 г пробы, по формуле

,

(2)

где - площадь пика или высота пика витамина , полученная при использовании раствора анализируемой пробы (6.3.4), в единицах площади или высоты;

- массовая концентрация витамина в стандартном аналитическом растворе (4.5.2), ;

V - конечный объем аналитического раствора пробы (6.3.4), ;

- объем экстракта н-гексана (6.3.3), ;

100 - коэффициент для перевода массовой доли на 100 г пробы;

- площадь пика или высота пика витамина , полученная при использовании стандартного аналитического раствора (4.5.2), в единицах площади или высоты;

m - масса пробы, г;

- объем аликвоты экстракта, использованной для переноса фазы, ;

1000 - коэффициент для перевода нанограммов в микрограммы.

Результат измерений для витамина регистрируют в протоколе в микрограммах на 100 г пробы.

8 Прецизионность

8.1 Общие положения

Данные по прецизионности определения витамина были получены в 1998 году при межлабораторном испытании, проводимом в соответствии с Международным руководством АОАС на различных обогащенных и необогащенных пробах молочных продуктов [4]. Эти данные представлены в приложении В. Результаты, полученные в ходе совместного исследования, не обязательно могут быть применены к содержанию исследуемого вещества и матрицам пробы, отличным от представленных в приложении В.

8.2 Повторяемость

Абсолютное расхождение между двумя отдельными результатами испытаний, которые были получены при применении одного и того же метода на идентичном испытательном материале одним и тем же оператором на одном и том же оборудовании в течение короткого промежутка времени, не должно превышать предел повторяемости r более чем в 5% случаев.

	Значения для витамина :
	ультрапастеризованное цельное жидкое необогащенное молоко (1)	= 0,49 мкг/100 г	r = 0,12 мкг/100 г
	сухое молоко из цельного козьего молока (2)	= 6,63 мкг/100 г	r = 0,60 мкг/100 г
	детские смеси на основе молока с пониженной жирностью обогащенные (3)	= 118,07 мкг/100 г	r = 14,01 мкг/100 г
	детские смеси на основе сыворотки с пониженной жирностью обогащенные (4)	= 32,24 мкг/100 г	r = 4,31 мкг/100 г
	детские смеси на основе сои с повышенной жирностью, обогащенные (5)	= 78,69 мкг/100 г	r = 5,71 мкг/100 г
	детские смеси на основе сыворотки с повышенной жирностью, обогащенные (6)	= 49,64 мкг/100 г	r = 7,11 мкг/100 г
	детские смеси на основе сыворотки с пониженной жирностью обогащенные (7)	= 90,94 мкг/100 г	r = 11,32 мкг/100 г
	NIST SRM 1846** сухая детская смесь (8)	= 94,62 мкг/100 г	r = 15,05 мкг/100 г
	Число в скобках - номер пробы в таблице В.1 (см. приложение В).

8.3 Воспроизводимость

Абсолютное расхождение между двумя отдельными результатами испытаний, полученными при применении одного и того же метода на идентичном испытательном материале двумя лабораториями, не должно превышать предел воспроизводимости R более чем в 5% случаев.

	Значения для витамина :
	ультрапастеризованное, цельное, жидкое, необогащенное молоко (1)		= 0,49 мкг/100 г	R =	0,15 мкг/100 г
	сухое молоко из цельного козьего молока (2)		= 6,63 мкг/100 г	R =	1,08 мкг/100 г
	детские смеси на основе молока с пониженной жирностью обогащенные (3)		= 118,07 мкг/100 г	R =	18,19 мкг/100 г
	детские смеси на основе сыворотки с пониженной жирностью обогащенные (4)		= 32,24 мкг/100 г	R =	5,98 мкг/100 г
	детские смеси на основе сои, с повышенной жирностью, обогащенные (5)		= 78,69 мкг/100 г	R =	9,53 мкг/100 г
	детские смеси на основе сыворотки, с повышенной жирностью, обогащенные (6)		= 49,64 мкг/100 г	R =	10,65 мкг/100 г
	детские смеси на основе сыворотки, с пониженной жирностью, обогащенные (7)		= 90,94 мкг/100 г	R =	11,60 мкг/100 г
	NIST SRM 1846**, сухая детская смесь (8)		= 94,62 мкг/100 г	R =	17,95 мкг/100 г
	Число в скобках - номер пробы в таблице В.1 (см. приложение В).

9 Протокол испытаний

Протокол испытания должен содержать следующие сведения:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

b) ссылку на настоящий стандарт или примененный метод;

c) дату и тип методики отбора пробы (если они известны);

d) дату поступления пробы в лабораторию;

e) дату проведения испытания;

f) результаты испытания с указанием единиц выражения результатов;

g) все особенности, наблюдавшиеся при проведении испытания;

h) все операции, не оговоренные в методике или рассматриваемые как необязательные, которые могли повлиять на результаты испытания.

_______________________________

* Например, L-1754; Sigma Chemical Co, P.O. 14508, Saint Louis МО 63178, USA (США). Указанный продукт использовался в межлабораторном испытании. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанного продукта со стороны CEN. Могут быть использованы эквивалентные продукты, если было установлено, что они дают аналогичные результаты.

** Принято опорное значение при испытаниях (9410) мкг/100 г.

Библиография

[1]	Indyk, H.E., and Woollard, D.С.: Vitamin K in Milk and Infant Formulas: Determination of Phylloquinone and Menaquinone-4. Analyst 122, 1997, 465 - 469 (Витамин K в молоке и детских смесях. Определение содержания филлохинона и менахинона-4)
[2]	Indyk, H.E., Littlejohn, V.C., Lawrence, J.L., and Woollard, D.C.: Liquid Chromatographic Determination of Vitamin in Infant Formulas and Milk. J. AOAC intern. 78, 1995, 719 - 723. AOAC Official Methods of Analysis, 17th Ed, 2000, Method 999.15 - Determination of Vitamin by HPLC (Определение содержания витамина в детских смесях и молоке при помощи жидкостной хроматографии. Официальные методы анализа. Определение содержания витамина методом ВЭЖХ)
[3]	Haroon, Y., Bacon, D.S., and Sadowski, J.A.: Chemical reduction system for the detection of phylloquinone (vitamin ) and menaquinones (vitamin ). J. Chromatogr. 384, 1987, 382 - 389 (Системы химической дериватизации для обнаружения филлохинона (витамина ) и менахинонов (витамина ))
[4]	Indyk, H.E., and Woollard, D.C.: Vitamin K in Milk and Infant Formulas by Liquid Chromatography: Collaborative study. J. AOAC Intern. 83, 2000, 121 - 130 (Определение содержания витамина K в молоке и детских смесях методом жидкостной хроматографии: Совместное исследование)
[5]	The Merck Index: Vitamin . 12th Ed.: 7536, p. 1269 (1996) (Каталог Мерк. Витамин )
[6]	Ball, G. F. M, in G. F. M. Ball (Hrsg.): Fat-Soluble Vitamin Assays in Food Analysis: A Comprehensive Review. Else-vier Applied Science, London, 1988, 258 - 273 (Образцы жирорастворимых витаминов в анализе пищевых продуктов. Комплексный анализ)
[7]	Eitenmiller, R.R. and Landen, W.O.: Vitamin Analysis for the Health and Food Sciences. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C., 1999, 149 - 184 (Анализ витаминов для наук о здоровье и пище)
[8]	European Pharmacopoeia 1997: 1997: 1036; Phytomenadione. 1332 - 1334 (Европейская фармакопея 1997. Фитоменадион)
[9]	European Pharmacopoeia - Supplement 2000: 1999: 1036; Phytomenadione. 1060 - 1062 (Европейская фармакопея. Дополнение 2000. Фитоменадион)
[10]	Woolard, D.C., Indyk, Н.Е., Bertram, Y.F., and Cook, K.K.: Determination of Vitamin Isomers in Food by liquid Chromatography with С 30 Bonded-Phase Column, J. AOAC Intern. 85, 2002, 682 - 691 (Определение изомеров витамина в пищевых продукта методом жидкостной хроматографии на колонке с С 30 химически связанной фазой)