Приложение G (обязательное). Использование контрольных графиков для мониторинга количественных испытаний плотных питательных сред

Приложение G
(обязательное)

Использование контрольных графиков для мониторинга количественных испытаний плотных питательных сред

G.1 Общие положения

Настоящее приложение содержит описание применения контрольных графиков для мониторинга результатов, в частности тех, которые выражены в виде коэффициента производительности , как это описано в 7.2. при испытаниях селективных и неселективных агаровых сред по сравнению с подходящими неселективными эталонными агаровыми средами или предварительно принятыми партиями той же селективной агаровой среды.

Необходимо внимательно применять контрольные графики в случае испытаний различных партий одного и того же агара, так как любое ухудшение качества последовательных партий может быть незаметно до тех пор, пока испытуемые суспензии не будут тщательно контролироваться в плане получения требуемого количества микроорганизмов или не будут применяться эталонные среды (см. 3.4.6). Любая система QС среды, основанная на проверках от партии к партии, должна быть проверена на пригодность для цели предназначения перед ее использованием.

Каждый источник и партия испытуемого агара, вероятнее всего, продемонстрируют различные уровни производительности, и отдельные лаборатории могут использовать различные виды эталонного агара в сравнительных испытаниях с испытуемыми видами агара. Таким образом, отдельные лаборатории должны установить и обосновать свои собственные пределы и/или диапазоны приемлемых значений коэффициента производительности для каждого испытуемого агара при повседневном использовании в пределах значений коэффициента производительности, указанных в 7.2.2.1.2. Контрольные графики составляют на основе начальных данных валидации, пределы приемлемости устанавливают при использовании статистического анализа и затем графики используют для мониторинга последовательных партий агара. Пределы приемлемости пересматривают периодически (например, после прохождения каждых 30 испытаний) и при необходимости корректируют (соответствующая информация приведена в G.2.6).

Данные процедуры требуют использования микробной суспензии с известной концентрацией целевого штамма, установленного для питательной среды в приложении Е или F; это целевое значение для испытания. Испытуемой суспензией должна быть коммерческая эталонная среда (см. 3.4.6) или суспензия, приготовленная в лаборатории из тщательно стандартизованных рабочих культур эталонных штаммов. В течение периода использования концентрация микроорганизмов в лабораторной суспензии (целевое число) должна быть стабильной и суспензия должна быть гомогенной.

В целях оптимизации контроля данные суспензии должны содержать приблизительно 100 КОЕ (диапазон должен быть от 80 до 120 КОЕ) в объеме инокулята, который применяют к питательной среде в чашке, и испытание, как правило, проводят по меньшей мере дважды. В таблице 1 (см. 5.4.2.5.1) приведены значения прецизионности при различных уровнях инокулирования с тем, чтобы показать важность сохранения данного оптимального уровня инокулята.

Слои агара инокулируют методами распределения, добавления или мембранной фильтрации в соответствии с эталонным стандартным методом, в котором применяют агар, и инкубируют в условиях, установленных в конкретных стандартах.

Колонии, присутствующие на или в каждом слое, подсчитывают в соответствии с эталонными стандартными методами, а коэффициенты производительности рассчитывают согласно 7.2.1.1.

G.2 Применение контрольных графиков

G.2.1 Общие методики

Для составления нового контрольного графика необходимо провести не менее 10 испытаний на различных партиях одного и того же испытуемого агара, желательно в двух повторностях, проводя испытания в разные дни и с участием различных операторов (условия межлабораторной воспроизводимости). Проведение 20 испытаний (как это показано в методике в G.2.2) позволит получить более надежные значения пределов, и, таким образом, график, на котором обозначены 10 начальных испытаний (минимальное количество), необходимо пересчитать, когда станут доступны данные о 20 результатах. Индивидуальные графики используют на постоянной основе с не менее 30 испытаниями для каждой повторяющейся оценки текущего качества сред (см. G.2.6).

G.2.2 Составление контрольных графиков

Данная методика основана на стандартном инокуляте, содержащем (10020) КОЕ в 0,1  инокулята, используемого для испытания, проводимого методом распределения по слою. Она также пригодна при использовании других объемов инокулята и при других методах посева, таких как глубинный посев или мембранная фильтрация, при условии, что инокулят содержит количество колониеобразующих единиц, лежащее в диапазоне приемлемости - (10020) КОЕ.

Среднее значение двух серий дублей при испытании i равно КОЕ/0,1  для испытуемой среды и КОЕ/0,1  для контрольной среды. Далее коэффициент производительности при испытании i равен / = . Для серии испытаний i = 1, 2, ....n, где i - минимум равно 10 и желательно, чтобы было равно 20, среднее значение коэффициента производительности вычисляют по формуле:

.

(G.1)

Средний диапазон значений коэффициента производительности вычисляют по формуле:

,

(G.2)

где i - номер испытания;

n - общее количество испытаний;

- значение при i-испытании.

Далее определяют стандартное отклонение s по формуле:

.

(G.3)

Примечание - Константа 0,8865 (или обратное ей число 1,128) - стандартизованное значение, рекомендуемое ASTM для определения стандартного отклонения из среднего диапазона дублированных значений результатов испытаний.

Рассчитывают 95% (2s) и 99% (3s) пределы распределения результатов.

На оси у контрольного графика отмечают общее среднее значение , , и каждый из двух верхних (+2s и +3s) и двух нижних (-2s и -3s) пределов; затем чертят линии, параллельные оси х. Результаты каждого индивидуального значения для испытаний, i = 1, 2, ..., n наносят на ось х (см. пример).

Каждый раз, когда готовят новую партию среды, проводят ее испытания с использованием стандартной суспензии инокулята, и величину рассчитывают как отношение количества колониеобразующих единиц, подсчитанных после инкубирования на испытуемой и эталонной средах, как это описано выше. Данное значение наносят на контрольный график и проверяют на соответствие установленным пределам.

G.2.3 Рабочий пример составления контрольного графика при наличии 20 результатов

В таблице G.1 приведены результаты 20 последовательных проверок коэффициента производительности на партиях одного и того же испытуемого неселективного агара при использовании стандартного инокулята с содержанием микроорганизмов 110 КОЕ/0,1 , подсчитанных на эталонной неселективной среде (фактические значения при подсчете на эталонной среде будут отличаться от данного значения на практике, однако эти данные используются для демонстрации принципа составления контрольных графиков только на основе рассчитанных коэффициентов производительности).

Таблица G.1 - Данные, касающиеся 20 последовательных проверок коэффициента производительности на неселективном агаре, используемые для составления контрольного графика (приведены фактические значения, полученные при подсчете только на испытуемом агаре; значения подсчета на эталонной среде, , во всех случаях равны 110 КОЕ)

Результаты испытаний
i	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
КОЕ (испытуемый агар),	95	102	94	97	105	68	98	105	103	116
	0,86	0,93	0,85	0,88	0,95	0,62	0,89	0,95	0,94	1,05
	-	0,07	0,08	0,03	0,07	-	0,06	0,06	0,01	0,11
Результаты испытаний
i	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
КОЕ (испытуемый агар),	95	90	89	116	114	110	114	98	88	102
	0,86	0,82	0,81	1,05	1,04	1,00	1,04	0,89	0,80	0,93
	0,19	0,04	0,01	0,24	0,01	0,04	0,04	0,15	0,09	0,13

Важно заметить, что нижний результат испытания 6 в данном примере для неселективного агара оказался ниже значения допустимого диапазона, установленного для допустимых значений от 0,70 до 1,40 для неселективного агара (см. 7.2.2.1.2), и все подобные результаты следует исключить как резко отклоняющиеся при определении среднего и стандартного отклонения для контрольного графика.

Причины, по которым результаты испытаний по определению выходят за допустимый диапазон, необходимо исследовать, поскольку они часто связаны с ненадлежащим проведением испытания, а не с тем, что качество питательной среды низкое. Это часто происходит, когда используемый инокулят содержит количество КОЕ, выпадающее из установленного диапазона от 80 до 120 КОЕ.

Среднее значение вычисляют по формуле:

.

(G.4)

(Оно показано на рисунке G.1 сплошной линией.)

Значения диапазона R = определяют абсолютную разницу последовательных значений, за исключением случая, когда значение исключают (например, в испытании 6 таблицы G.1), т.е. |0,93 - 0,86| = 0,07; |0,85 - 0,93| = 0,08; |0,88 - 0,85| = 0,03 и т.д.

Средний диапазон вычисляют по формуле:

.

(G.5)

Таким образом, стандартное отклонение .

95-процентные доверительные пределы (показаны на рисунке G.1 пунктирными линиями с короткими черточками) равны:

.

(G.6)

98-процентные доверительные пределы (показаны на рисунке G.1 пунктирными линиями с длинными черточками) равны:

.

(G.7)

Рисунок G.1 - Контрольный график, составленный на основе значений коэффициента производительности, полученных в результате первых 20 проверок, приведенных в таблице G.1 (результат испытания 6, являющийся резко отклоняющимся значением, исключен)

G.2.4 Оценка эксплуатационных характеристик и интерпретация результатов

Партию питательной среды принимают, если выполнены критерии общего (см. 6.2) и микробиологического качества.

Новую партию среды отклоняют, если в процессе проведения количественных испытаний, выполненных как это описано выше, получают любые из перечисленных ниже результатов, когда ситуация "выходит из-под контроля":

- выход за пределы 3s;

- результаты двух из трех наблюдений подряд превышают пределы 2s;

- шесть наблюдений подряд демонстрируют неуклонное увеличение или уменьшение:

- девять наблюдений подряд располагаются на одной и той же стороне от среднего значения.

Примечание - Критерий на основе четырех наблюдений подряд, когда уровень 1s превышен, может также быть важным, так как свидетельствует о существовании проблемы.

G.2.5 Альтернативные подходы к мониторингу эксплуатационных свойств сред

Методика использования контрольных графиков для мониторинга эксплуатационных свойств сред, приведенная выше, специально составлена для нанесения значений без трансформирования подсчета колоний в единицы .

Допустимо использование альтернативных подходов, основанных на непосредственном нанесении значений подсчета колоний или подсчета колоний в единицах , если они демонстрируют приемлемость. Методы проверки, соответствует ли распределение данных подсчета колоний нормальному или нет без трансформации , с использованием теста Колмогорова - Смирнова или теста хи-квадрат, а также соответствующие практические примеры приведены в [39].

Вместе с тем следует заметить, что если в подсчеты не включен коэффициент разбавления, то маловероятно, что будет уместной трансформация . Конвертирование непосредственного подсчета (например, 100 КОЕ на чашку) должно предполагать использование распределения Пуассона, для которого трансформация подсчета х равна . Более того, в любой ситуации, когда подсчеты колоний наносят непосредственно, важно гарантировать, чтобы уровень микроорганизмов в испытуемом инокуляте оставался постоянным в процессе проведения испытаний, иначе это приведет к получению недостоверных результатов.

G.2.6 Периодический пересмотр контрольных графиков

Первый и последующие контрольные графики для среды, проходящей отдельные испытания, должны периодически пересматриваться с целью гарантирования того, что установленные пределы остаются приемлемыми при составлении графиков в любое время. Первый график, содержащий минимум 20 значений данных, пересматривают с целью установления первоначальных пределов, и затем последующие графики можно пересматривать с определенной частотой при наличии каждых 30 значений данных по методике, приведенной ниже (в данном подпункте).

Как только контрольный график составлен полностью, снова рассчитывают среднее значение и стандартное отклонение s, исключая результаты, которые не попадают в установленный диапазон или пределы. При использовании трансформации все расчеты проводят, используя результаты, трансформированные в единицы .

Стандартное отклонение текущего графика сравнивают со стандартным отклонением всех предыдущих результатов, и проверяют на вариации, используя следующий критерий:

(0,975; n - 1, ),

(G.8)

где F (0,975; n-1, ) - значение F испытания при вероятности = 0,025 при количестве наблюдений n величины s, и количестве наблюдений величины .

Вариации значительно увеличиваются, когда s не удовлетворяет данному критерию, в таком случае необходимо выяснить возможную причину данного факта.

В случае, когда стандартное отклонение составленного контрольного графика соответствует данному критерию, для составления следующего контрольного графика эти данные объединяют с результатами предыдущих наблюдений [в качестве примера для вычислений см. формулу (G.9)].

Кроме того, сравнивают среднее значение текущего графика со средним значением всех предыдущих наблюдений и проверяют, выполняется ли следующий критерий:

,

(G.9)

где - среднее значение текущего контрольного графика;

- среднее значение всех предыдущих контрольных графиков;

s - стандартное отклонение контрольного графика;

- стандартное отклонение всех предыдущих контрольных графиков:

n - общее количество наблюдений текущего контрольного графика;

- общее количество наблюдений всех предыдущих контрольных графиков.

Если среднее значение текущего контрольного графика соответствует данному критерию, эти данные объединяют с данными предыдущих наблюдений для составления следующего контрольного графика.

В случае, когда данный критерий не выполняется, выясняют возможную причину этого. Если причину установить не удается, составляют новый контрольный график и устанавливают новые пределы, основанные на предыдущих наблюдениях, путем пересчета пределов для среднего значения и стандартного отклонения для всех наблюдений.

Пример вычислений:

Примеры данных приведены в таблице G.2, они касаются трех контрольных графиков, каждый из которых содержит 30 результатов наблюдений. Значения , и относятся к обобщенным данным из графиков 1 и 2.

Значение одного наблюдения во втором графике (номер 22, выделено курсивом) превышает предел приемлемости, установленный лабораторией на основе ее собственных данных. Таким образом, данное значение не используют в расчетах.

Таблица G.2 - Значения результатов испытаний в рамках трех контрольных графиков для оценки и сравнения с пределами, установленными лабораторией (см. [39])

Результаты испытаний
Измерения	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
График 1	100	77	108	75	83	92	70	81	90	88
График 2	74	81	60	66	109	83	73	82	74	89
График 3	89	75	67	63	90	77	90	75	53	91
Результаты испытаний
Измерения	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
График 1	78	82	90	95	75	86	100	98	75	92
График 2	80	83	95	71	98	74	76	92	84	88
График 3	99	74	88	68	100	81	97	89	80	71
Результаты испытаний
Измерения	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30
График 1	74	80	98	79	82	91	78	90	65	60
График 2	67	130	97	98	64	85	101	73	67	82
График 3	63	84	82	84	99	79	86	70	72	98
Расчеты значений для каждого графика
		s							Расчеты значений на основе обобщения значений, относящихся к графикам 1 и 2
График 1	84,4	11,1	122,7			83,0	11,7	136,1
График 2	81,6	12,3	150,8			-	-	-
График 3	81,1	12,1	147,5			-	-	-

В результате проверки вариаций значений стандартного отклонения путем сравнения значения стандартного отклонения s графика 3 со значениями стандартных отклонений первых двух графиков () был получен следующий результат:

.

(G.10)

Критическое значение F (0,975: 29,58) = 1,83. Наблюдаемое значение меньше критического, и, таким образом, не существует значительной разницы между стандартным отклонением графика 3 и графиков 1 и 2.

В результате последующей проверки того, было ли среднее значение изменено, как это описано выше для этих данных, были получены следующие результаты.

На основе данных, касающихся графика 3, было получено значение 1,9 (по формуле ), а критическое значение равно

.

(G.11)

Рассчитанное для графика 3 значение меньше критического и, таким образом, не имеется существенной разницы между средним значением для графика 3 и для графиков 1 и 2.

Поскольку проверка вариаций была достоверной, данные для графика 3 объединяют с данными графиков 1 и 2 для расчета значений новых пределов. Таким образом, новый контрольный график составляют на основе среднего значения, равного 82,4 и стандартного отклонения, равного 11,80.