Инструкция по изготовлению и контролю мытного антивируса (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 12 октября 1956 г. взамен Наставления от 25 марта 1950 г.)

Штаммы и порядок работы с ними

1. Для производства мытного антивируса применяется возможно большее количество (10 и более) штаммов мытных стрептококков местного происхождения. Штаммы мытного стрептококка рекомендуется получать от больных мытом лошадей при появлении воспалительного процесса в подчелюстных лимфатических узлах и флюктуации, указывающей на образование гноя.

2. Штаммы мытного стрептококка должны быть типичными по своим морфологическим и культуральным свойствам и характеризуются следующими показателями:

а) в мазках стрептококки расположены в виде длинных грамположительных цепочек, отдельные кокки этих цепочек неодинаковой величины и несколько сплюснуты в поперечном направлении;

б) на сывороточном глюкозном МПА (3% пептона, 1% глюкозы и 10% лошадиной сыворотки) через 3 суток роста образуются сочные, сливающиеся между собой колонии без пигмента. На сывороточном МПБ в первые сутки роста дают сплошное помутнение среды с последующим ее просветлением и образованием слизистого осадка на дне пробирки без пленки и пристеночного кольца;

в) молоко не свертывают, вызывают незначительное покраснение лакмусового молока и незначительное обесцвечивание метиленового молока в период 1-3 суток роста с полным восстановлением его первоначального цвета после 12-15-суточного роста;

г) не разжижают желатины, не разлагают маннита, лактозы и сорбита. Разлагают глюкозу с образованием кислоты без газа;

д) обладают ясно выраженными гемолитическими свойствами при выращивании на кровяном агаре;

е) суточная культура (на сывороточном МПБ) мытного стрептококка, введенная белым мышам внутрибрюшинно в дозе 0,1 мл, вызывает в течение 1-5 суток заболевание и гибель их;

ж) для изготовления мытного антивируса применяют свежевыделенные штаммы мытного стрептококка, не пассированные через лабораторных животных, и сохраняют их на питательных средах путем пересева не реже одного раза в месяц.

3. Штаммы, сохраняемые в сухом виде в запаянных ампулах под вакуумом, годны для производства в течение одного года.

4. Свежевыделенные штаммы мытных стрептококков должны отвечать требованиям, указанным в пункте 2, для чего производятся соответствующие исследования, результаты которых заносятся в паспорт и книгу штаммов.

5. Производственные штаммы мытного стрептококка сохраняются в сухом виде в запаянных ампулах под вакуумом, а также на полужидком агар-агаре с добавлением 10% нормальной лошадиной сыворотки в запаянных пипетках.

Примечание. Сыворотку для указанных целей получают от здоровых лошадей из хозяйств, благополучных по инфекционным заболеваниям, и, в частности, по инфекционной анемии.

6. Штаммы мытного стрептококка проверяют на культурально-биохимические и патогенные свойства (на белых мышах) не реже 1 раза в 6 месяцев.

Питательные среды

7. Для изготовления мытного антивируса применяют МПБ с 2% пептона и 0,5% глюкозы, рН 7,6-7,8. Также можно готовить питательную среду из основного триптического перевара, приготовленного из конского или говяжьего мяса и разведенного дистиллированной водой (или водопроводной) до содержания 150-180 мг % аминного азота, добавляют 0,5% двузамещенного фосфорнокислого натра и 0,3% глюкозы, рН 7,6-7,8. Приготовление основного перевара Хоттингера производят по описанной ниже методике.

Приготовление основного перевара Хоттингера

8. На 1 кг мясного фарша добавляют 1,5 л дистиллированной воды, перемешивают, подщелачивают до рН 7,8-8,0 и кипятят 15-20 минут. Мясной отвар фильтруют, фарш отжимают и вторично пропускают через мясорубку. Мясной отвар разливают в 5-20-литровые бутыли, а отжатый мясной фарш распределяют пропорционально в каждую бутыль, при этом 1/3 бутыли после разлива мясного отвара и добавления фарша оставляют свободной. Полученную смесь мясного отвара с фаршем охлаждают до 40-45° (при более высокой температуре фермент трипсин инактивируется) и подщелачивают до рН 8,0.

В каждую бутыль из расчета на 1 л смеси добавляют 80-100 г измельченной поджелудочной железы или 12-14 г панкреатина и 20 мл хлороформа, закрывают резиновой пробкой и хорошо перемешивают. Открыв пробку, выпускают образовавшиеся пары хлороформа и опять закрывают. Бутыли помещают в термостат с температурой 45° на 5-8 дней, причем содержимое бутылей в первые 2-3 суток взбалтывают не реже 3-4 раз в сутки. В процессе переваривания выборочно в одной из бутылей определяют аминный азот и триптофан; рН определяют ежедневно и в случаях снижения подщелачивают до рН 7,8-8,0. Через 5-8 суток мясной фарш превращается в гомогенный сероватый осадок, над которым при правильном переваривании верхний слой жидкости имеет соломенно-желтоватый цвет. Химические показатели хорошего перевара Хоттингера: общего азота должно быть 900-1400 мг %, аминного азота 500-900 и триптофана 250-300 мг %.

При необходимости хранения основного перевара длительное время в бутыли по окончании переваривания к нему добавляют 10 мл хлороформа на 1 л перевара и помещают его в темное прохладное место.

Расплодка и выращивание культур

9. Производственные штаммы мытного стрептококка из пипеток или ампул засевают во флаконы с бульоном Хоттингера емкостью 100-150 мл или МПБ с 2% пептона, рН 7,6-7,8 и в пробирки с МПА.

Посевы выдерживают в термостате при температуре 36-37°. Суточную бульонную культуру каждого штамма подвергают макро- и микроскопической проверке. В мазках должны быть типичные удлиненные или короткие цепочки мытного стрептококка. После микроскопической проверки каждый производственный штамм пересевают в отдельные бутыли с питательной средой, приготовленной согласно прописи (см. пункт 7). Одновременно производят контрольные высевы на МПА, МПБ или бульон Хоттингера.

10. Засеянные бутыли выдерживают в термостате в продолжение 20 суток при температуре 7°. В первые 6-7 суток роста культур в термостате посевы ежедневно просматривают макроскопически и слегка взбалтывают. На 6-8-й день роста берут пробу бульона из засеянных колб, определяют рН и (в соответствии с установленным рН среды) подщелачивают стерильным насыщенным раствором соды или 4%-ным нормальным раствором едкого натра до первоначального рН и тщательно взбалтывают. В последующие дни производят только макроскопический просмотр.

Обработка культур

11. По истечении 20 суток роста в термостате содержимое каждой бутыли просматривают макроскопически и микроскопически. Бутыли с культурами, в которых обнаружена посторонняя микрофлора, выбраковывают.

12. Проверенные на чистоту культуры мытного стрептококка из отдельных бутылей смешивают вместе, берут пробу на испытание наличия антивирусных веществ, затем всю смесь консервируют 0,5%-ным раствором фенола.

13. Бутыли с культурой после консервирования ставят на 5-6 суток в темное, прохладное, сухое помещение для выпадения осадка и просветления бульона.

14. После отстаивания прозрачный слой бульона сливают при помощи сифона в стерильную посуду с соблюдением всех правил стерильности.

15. Хорошо отстоявшийся, с полным просветлением антивирус допускают к расфасовке без фильтрации.

Примечание. При просветлении бульона после 2-3-дневного отстоя и наличии фильтров с большой пропускной способностью допускают фильтрацию без отстоя. После слива серии антивирус фильтруют через простерилизованные пластинки в фильтре Зейтца.

16. Фильтрат стерильно с помощью сифона разливают по флаконам емкостью от 100 до 500 мл, которые закрывают ватными пробками.

17. Расфасованный антивирус прогревают в автоклаве при температуре 100° в течение 15 минут, после чего ватные пробки во флаконах заменяют резиновыми или корковыми, которые заливают сургучом, опечатывают печатью учреждения, изготовляющего антивирус.

Контроль

18. Контроль специфичности производят путем проверки накопления антивирусных веществ.

19. Пробы смеси культуры, взятые до консервирования (как это указывается в пункте 12), фильтруют через фильтр Зейтца или свечи Беркефельда, Шамберлана и разливают по пробиркам.

20. В указанные пробирки засевают 10 штаммов мытного стрептококка и два штамма гнойного, причем каждый штамм высевают на 3 пробирки неразведенной испытуемой среды (антивируса).

21. Мытный антивирус признают специфически активным при замедленном и скудном росте культур мытного стрептококка в неразведенном антивирусе в течение 3 суток и при наличии хорошего роста культур гнойного стрептококка.

22. Для проверки стерильности и безвредности, госконтролер отбирает по 5 флаконов от каждой серии расфасованного мытного антивируса.

23. На стерильность проверяют путем высева из каждого флакона на две пробирки МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, а также на пять пробирок МП сывороточного бульона и среду Китт-Тароцци. Посевы в термостате выдерживают 10 суток, причем они должны оставаться стерильными.

24. Безвредность антивируса проверяют путем введения его трем белым мышам весом не менее 15 г подкожно в дозе 0,5 мл, двум кроликам в дозе 10 мл подкожно и двум морским свинкам в дозе 10 мл подкожно. Наблюдения за подопытными животными ведут в течение 10 суток.

25. Антивирус считают безвредным, если белые мыши, морские свинки и кролики остаются живыми.

26. Результаты контроля каждой серии антивируса фиксируют в прошнурованной, пронумерованной, скрепленной печатью книге контроля. Под записью контроля каждой серии должна быть подпись госконтролера. Для практического употребления выпускают антивирус стерильный, безвредный и специфичный.

Кондиции антивируса

27. Мытный антивирус представляет собой фильтрат или отстой стерилизованной бульонной культуры стрептококка, консервированный 0,5%-ным раствором фенола. По внешнему виду - прозрачная соломенно-желтого цвета жидкость.

28. На каждом флаконе должна быть этикетка с указанием учреждения, изготовившего антивирус, номера серии, количества содержимого во флаконе, даты изготовления, срока годности, дозы и номера контроля.

29. Мытный антивирус выпускают только для подкожного и местного применения, о чем делают указание на этикетке.

30. Антивирус хранят в темном, сухом помещении при температуре 2-15°.

31. Срок пользования антивирусом один год с момента его изготовления.

32. От каждой серии антивируса оставляют в архиве производственного учреждения не менее пяти флаконов, которые с отметкой на этикетке "Архив" хранят в течение двух лет.

Учет производственных процессов

33. В производственную книгу записывают номера штаммов мытного стрептококка, взятых для изготовления данной серии антивируса, среды, дату посева, фильтрацию и другие процессы.

34. Данные о проведении очередных пересевов, результатах проверки патогенных и культурально-биохимических свойств штаммов записывают в книгу штаммов.

35. Все производственные книги должны быть пронумерованы, прошнурованы и скреплены сургучной печатью учреждения, изготовляющего антивирус.