Наставление по диагностике туберкулеза животных (утв. Департаментом ветеринарии 18 ноября 2002 г.)

Наставление по диагностике туберкулеза животных
(утв. Департаментом ветеринарии 18 ноября 2002 г.)

1. Общие положения

1.1. Туберкулез - инфекционная, хронически протекающая болезнь животных всех видов и человека, характеризующаяся поражением органов и тканей с образованием в них туберкулов.

Возбудитель - бактерии из рода Mycobacterium, в который входят более 38 самостоятельных видов. Болезнь у животных вызывают микобактерии туберкулеза бычьего (М. bovis), человеческого (М. tuberculosis) и птичьего (М. avium) видов. Каждый из них является патогенным для животных соответствующего вида или человека, возможно и перекрестное заражение.

Микобактерии туберкулеза бычьего вида патогенны для крупного рогатого скота. К ним также восприимчивы все млекопитающие животные и человек. К возбудителю туберкулеза человеческого вида восприимчивы, кроме человека, свиньи, козы, кошки, собаки. Этот вид, в основном, сенсибилизирует крупный рогатый скот к туберкулину и лишь иногда вызывает незначительные очаги в отдельных лимфатических узлах.

М. avium - возбудитель туберкулеза домашних и диких птиц. Он может вызывать патологические изменения у свиней. У крупного рогатого скота возбудитель туберкулеза птичьего вида вызывает кратковременную сенсибилизацию организма к туберкулину.

Отдельные виды атипичных микобактерий или их ассоциации могут вызывать сенсибилизацию крупного рогатого скота, свиней и птиц к туберкулинам, и в отдельных случаях патоморфологические изменения в лимфатических узлах у свиней, неотличимые от туберкулезных изменений.

1.2. При диагностике туберкулеза у животных используют эпизоотологический, клинический, патологоанатомический, гистологический, бактериологический, аллергический и молекулярно-генетический (полимеразная цепная реакция - ПЦР) методы исследования.

Основными, обязательными методами исследования на туберкулез являются внутрикожная (у овец, коз и пушных зверей: норок, песцов, лисиц - пальпебральная, у лошадей - глазная) туберкулиновая проба, патолого-анатомическое и бактериологическое исследование,

В благополучных по туберкулезу хозяйствах с целью отбора животных для диагностического убоя из числа реагирующих на туберкулин применяют одну из следующих проб: симультанную аллергическую пробу, офтальмопробу, пальпебральную и внутривенную туберкулиновую пробу.

1.3. Диагноз на туберкулез считается установленным в следующих случаях.

1.3.1. У млекопитающих животных (за исключением свиней):

- при обнаружении на вскрытии изменений, характерных для туберкулеза;

- при отсутствии видимых изменений или возникших затруднениях и определении характера изменений - при положительных результатах ПЦР и положительных результатах биологического исследования;

- при выявлении бактериологическим исследованием возбудителя бычьего или человеческого вида;

- при положительных результатах биологического исследования.

1.3.2. У свиней:

- при положительных результатах ПЦР и выявлении бактериологическим исследованием возбудителя туберкулеза бычьего или человеческого вида.

1.3.3. У птиц:

- при обнаружении на вскрытии характерных изменений, с подтверждением диагноза бактериоскопическим методом исследования;

- при отсутствии видимых изменений или возникших затруднениях в определении характера изменений - при положительных результатах ПЦР;

- при выделении культуры микобактерий птичьего вида (от попугаев - птичьего или человеческого видов).

1.4. Исследование животных на туберкулез проводят в порядке и сроки, предусмотренные Санитарными правилами СП 3.1.093-96 и Ветеринарными правилами ВП 13.3.1325-96, п. 10 "Туберкулез", утвержденными Госкомсанэпиднадзором и Минсельхозпродом России в 1996 г.

2. Эпизоотологические данные

2.1. Контроль за эпизоотическим состоянием хозяйств по туберкулезу животных осуществляют по результатам ветеринарно-санитарной экспертизы убойного скота на мясокомбинатах и в хозяйствах, патолого-анатомического вскрытия трупов павших животных, регуляторного клинического обследования поголовья и аллергических исследований, проводимых по эпизоотологическим и эпидемиологическим показаниям.

2.2. К туберкулезу восприимчивы животные всех видов и возрастов. Основным источником возбудителя туберкулеза являются больные животные, выделениями которых контаминируется среда обитания, являющаяся длительное время резервуаром инфекции.

2.3. Заражение туберкулезом животных происходит, в основном, через дыхательные пути или желудочно-кишечный тракт. Аэрогенное заражение чаще отмечают у взрослого скота в стойловый период. Телята, свиньи и птица заражаются чаще алиментарно при скармливании им необеззараженного молока, обрата и других кормов, контаминированных возбудителем туберкулеза.

2.4. Возникновению и распространению болезни способствуют высокая концентрация поголовья, неполноценное кормление, сырые, темные, плохо вентилируемые помещения, стойловое безвыгульное содержание, контаминированные микобактериями туберкулеза объекты внешней среды, нарушение правил карантинирования вновь поступивших животных, перегруппировка поголовья без учета эпизоотического состояния, отсутствие ветеринарно-санитарных пунктов на фермах и при летне-лагерном содержании животных.

2.5. При диагностике болезни в первую очередь учитывают эпизоотическое состояние и степень распространения туберкулеза в районе, области (крае), эпизоотическое состояние хозяйства в прошлые годы, метод оздоровления, ввод нового поголовья, контакты благополучных стад с неблагополучными, завоз кормов и другие связи с неблагополучными хозяйствами, использование для выпойки необеззараженного молока и обрата, обнаружение патолого-анатомических изменений, характерных для туберкулеза, у убитых или павших животных, выявление больных туберкулезом людей среди животноводов, наличие туберкулезных лечебно-профилактических учреждений на прилегающих территориях.

2.6. При появлении эпизоотологических или эпидемиологических показаний, дающих основание подозревать заражение животных туберкулезом, проводят комплекс исследований в соответствии с разделами настоящего Наставления.

3. Клинический осмотр

При клиническом осмотре у крупного рогатого скота определяют внешний вид и упитанность животного, прощупывают поверхностные лимфатические узлы - подчелюстные, предлопаточные, надколенные, у коров - вымя и надвыменные лимфатические узлы. Клинические признаки болезни проявляются только при длительном течении процесса.

При туберкулезном поражении лимфоузлов может наблюдаться их увеличение и болезненность. Туберкулез легких проявляется кашлем, особенно по утрам. Туберкулез вымени характеризуется образованием горячих болезненных припухлостей и поражением надвыменных лимфоузлов. При туберкулезе кишечника возможна диарея.

У телок, заразившихся в раннем возрасте, признаки болезни могут проявиться лишь после первого-второго отела.

У кошек туберкулез может проявляться в виде язв в области головы, у норок - в виде язвенных поражений кожи головы, шеи, грудной и брюшной области.

У больных туберкулезом животных периодически повышается температура тела, волосяной покров становится тусклым, взъерошенным. Снижается упитанность - до полного истощения, падает аппетит.

Довольно часто больные животные не имеют никаких внешних признаков заболевания.

#Аллергическое исследование

4.1. Сущность метода заключается в выявлении животных, инфицированных возбудителем туберкулеза или другими микобактериями, в аллергической пробе с туберкулином.

Основным методом исследования млекопитающих животных (за исключением лошадей, овец, коз и пушных зверей) и птиц является внутрикожная туберкулиновая проба. В качестве дополнительных методов исследования у крупного рогатого скота применяют офтальмопробу, пальпебральное и внутривенное введение туберкулина, симультанную пробу с ППД-туберкулином для млекопитающих и комплексным аллергеном из атипичных микобактерий (КАМ) или ППД-туберкулином для птиц.

Применение симультанной пробы основано на видовой специфичности аллергии, проявляющейся более выраженными реакциями на аллерген, родственный по антигенному составу микобактериям, вызвавшим состояние сенсибилизации животных. При оценке реакций на туберкулин у животных необходимо учитывать, что проявление и характер внутрикожных реакций зависит от общего физиологического состояния организма, чувствительности животных к туберкулину и вида микобактерий, обусловившего сенсибилизацию организма.

Крупный рогатый скот, свиньи и другие животные, зараженные возбудителем туберкулеза бычьего вида, реагируют на ППД-туберкулин для млекопитающих. При этом у животных старых, а также с низкой упитанностью или при генерализованном туберкулезном процессе реакции на туберкулин могут быть слабо выражены или даже отсутствовать (анергия).

В благополучных по туберкулезу стадах крупного рогатого скота у животных может наблюдаться повышенная чувствительность к туберкулину для млекопитающих, обусловленная сенсибилизацией организма животных микобактериями туберкулеза птичьего вида, возбудителем паратуберкулеза или атипичными микобактериями (парааллергические реакции). По характеру проявления внутрикожные парааллергические реакции не отличаются от реакций на туберкулин у животных, зараженных возбудителями туберкулеза бычьего или человеческого видов, но более выражены на КАМ или туберкулин для птиц, что выявляется при проведении симультанной пробы. При повторных исследованиях парааллергические реакции часто выпадают.

4.2. Для аллергических исследований у млекопитающих применяют ППД-туберкулин для млекопитающих, у птиц - ППД-туберкулин для птиц.

Каждый флакон с туберкулином и растворителем перед применением просматривают. При обнаружении в них каких-либо примесей, нарушении целостности стекла или укупорки, отсутствии надписей их выбраковывают. Препарат используют только в день вскрытия флаконов.

4.3. Для внутрикожного введения туберкулина используют безыгольные инъекторы или шприцы вместимостью 1-2 мл с бегунком и иглами для внутрикожных инъекций. Обезьянам, пушным зверям, кошкам и птицам туберкулин вводят только шприцем с иглой. Для нанесения туберкулина на конъюнктиву применяют глазные пипетки.

Шприцы, иглы и глазные пипетки стерилизуют кипячением без добавления дезинфицирующих веществ. Безыгольные инъекторы стерилизуют в соответствии с наставлением по их применению.

4.4. Туберкулинизации подвергают:

крупный рогатый скот, яков, лошадей и других представителей непарнокопытных, буйволов, свиней, овец, коз, собак, волков и других представителей хищных, кошек, обезьян, сумчатых - с двухмесячного возраста;

верблюдов, дельфинов, слонов, носорогов, бегемотов - с года;

маралов, оленей, антилоп, пушных зверей и птиц - с 6-месячного возраста.

Коров (нетелей), буйволиц, ячих, верблюдиц исследуют независимо от периода беременности; коз, овец, свиней, кобылиц, ослиц, сук, зебувидных и пушных зверей - не ранее 1-го месяца после родов.

Не разрешается исследовать туберкулинами животных в течение трех недель после вакцинации против инфекционных болезней и обработок против гельминтов.

4.5. Очищенный ППД - туберкулин для млекопитающих в стандартном растворе, приготовленном на биопредприятии, применяют для туберкулинизации млекопитающих животных.

Сухой очищенный ППД-туберкулин для птиц непосредственно перед применением растворяют в растворителе микобактериальных аллергенов, рассылаемом биопредприятием вместе с аллергеном.

4.6. Туберкулины применяют при исследовании на туберкулез млекопитающим (кроме обезьян, кошек и пушных зверей: норок, песцов, лисиц) в объеме 0,2 мл, обезьянам, кошкам, пушным зверям и птицам - 0,1 мл.

4.6.1. Для исследования обезьян стандартный раствор ППД-туберкулина для млекопитающих разводят в 10 раз (1 объем туберкулина в 9 объемах растворителя) стерильным физиологическим раствором рН или растворителем микобактериальных аллергенов.

4.6.2. При исследовании птиц содержимое одного флакона с ППД-туберкулином для птиц растворяют в одном флаконе растворителя объемом 20 мл.

4.7. Туберкулинизацию животных разрешается проводить ветеринарным врачам или ветеринарным фельдшерам йод контролем ветврача. Исследование проводят под контролем специалистов государственной ветеринарной службы.

4.8. Внутрикожный метод туберкулинизации

4.8.1. Туберкулин вводят:

крупному рогатому скоту (кроме быков), буйволам, зебувидным, якам, оленям, маралам, антилопам - в середине шеи (в этой области не разрешается вводить другие биологические препараты и лекарственные вещества);

быкам, слонам, носорогам, бегемотам - в подхвостовую складку;

верблюдам - в кожу брюшной стенки или области паха на уровне горизонтальной линии седалищного бугра;

свиньям - с наружной поверхности уха в 2-3 см от его основания; поросятам в возрасте 2-3 месяцев туберкулин допускается вводить в кожу поясничной области, отступая от позвоночника на 5-8 см, используя для этого только безыгольный инъектор;

овцам и козам - в нижнее веко под кожу, отступив от его края на 1,5-2 см;

собакам, волкам и другим представителям хищных - в области внутренней поверхности бедра или локтевой складки;

обезьянам, сумчатым, пушным зверям (норкам, песцам, лисицам) - интрадермопальпебрально в верхнее веко;

дельфинам - в кожу спины в области переднего ласта;

кошкам - в области внутренней поверхности уха;

курам - в кожу бородки;

индейкам - в подчелюстную сережку;

гусям, уткам - в межчелюстную складку или в складку кожи клоаки;

страусам, кузуарам - в складку кожи клозки;

фазанам (самкам), павлинам, попугаям, голубям, журавлям, цаплям, аистам, фламинго - в области наружной стороны голени на 1-2 см выше голеностопного сустава;

фазанам-самцам - в пещеристое тело на голове птиц позади наружного угла глаза.

4.8.2. Перед введением туберкулина шерсть (волос) в месте инъекции выстригают, кожу обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом. Вводить туберкулин в кожу, имеющую травматические повреждения, уплотнения и абсцессы, пораженную грибками, клещами или гельминтами, запрещается.

4.8.3. Учет и оценку реакции у крупного рогатого скота, буйволов, зебувидных, яков, верблюдов, слонов, носорогов, бегемотов, оленей, маралов, антилоп, обезьян, сумчатых, дельфинов проводят через 72 часа посте введения препарата; у коз, овец, свиней, собак, волков и других представителей хищных, кошек, пушных зверей - через 48 часов; у птиц - через 30-36 часов.

В неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота пунктах допускается применение двойной туберкулиновой пробы. С этой целью животным, не реагировавшим на первое введение туберкулина, препарат вводят повторно в день учета реакции в той же дозе и в то же место. Учет реакции на второе введение туберкулина проводят через 24 часа.

4.8.4. При учете реакции у каждого исследуемого животного пальпируют место введения туберкулина, у коз, овец, обезьян, сумчатых и пушных зверей сравнивают веки правого и левого глаза, у быков, слонов, носорогов, бегемотов - левую и правую подхвостовые складки.

При обнаружения изменений в месте введения туберкулина у крупного рогатого скота (кроме быков), буйволов, зебувидных, яков, верблюдов, оленей, маралов, антилоп измеряют кутиметром толщину складки в миллиметрах и определяют величину ее утолщения в сравнении с толщиной складки неизмененной кожи рядом с местом введения препарата.

4.8.5. Животных считают реагирующими на туберкулин:

крупный рогатый скот (кроме быков), буйволов, зебувидных, верблюдов, оленей, маралов, антилоп - при утолщении кожной складки - на 3 мм и более независимо от характера припухлости (отечности, болезненности, повышения местной температуры); быков, слонов, носорогов, бегемотов, свиней, собак, волков и других представителей хищных, дельфинов, кошек, и птиц - при образовании припухлости в месте введения туберкулина; обезьян, сумчатых, овец, коз и пушных зверей - при видимом различии правого и левого века.

4.9. Симультанная аллергическая проба с применением туберкулина и комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ).

4.9.1. Симультанную аллергическую пробу применяют для диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота при первичной постановке диагноза, а также для контроля за благополучием животных по туберкулезу в хозяйствах, где реакции на туберкулин обусловлены сенсибилизацией атипичными микобактериями.

Проба является групповой и дает возможность ориентироваться в ситуации по туберкулезу лишь в целом по стаду или группе (не менее 6 голов) исследуемых животных.

4.9.2. Симультанная проба заключается в одновременном (симультанном) введении животным двух аллергенов - ППД-туберкулина для млекопитающих в стандартном растворе и комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ) и определении достоверности различия в интенсивности (степени проявления) реакций на эти аллергены.

4.9.3. Под достоверностью различия понимают такое различие в величине показателей интенсивности реакций на туберкулин и КАМ, которое дает возможность с уверенностью не менее чем на 95% сделать заключение о состоянии по туберкулезу исследуемой группы животных.

4.9.4. Проведение симультанной пробы допускается не ранее, чем через 30 дней после последней туберкулинизации животных.

4.9.5. Туберкулин и КАМ вводят, соответственно, с левой и правой стороны тела животных строго симметрично в дозе по 0,2 мл: крупному рогатому скоту (кроме быков) - внутрикожно в середине шеи, быкам - также внутрикожно в левую и правую подхвостовую складки.

4.9.6. Учет и оценку реакций на туберкулин и КАМ проводят у крупного рогатого скота через 72 часа после инъекции аллергенов.

Реакцией считают припухлость в месте введения препарата, ощутимую при пальпации, независимо от ее характера (консистенции, температуры, болезненности и т.п.). При учете реакции у каждого исследуемого животного пальпируют место введения туберкулина. В случае обнаружения припухлости в месте его инъекции, у этого животного прощупывают место введения КАМа и проводят измерение утолщения кожной складки.

Более выраженную реакцию на туберкулин при менее выраженной или отсутствующей на КАМ обозначают знаком "+" (плюс), менее выраженную реакцию на туберкулин - знаком "-" (минус), при одинаковых реакциях - знаком "=" (равенство).

Животных, не реагирующих на туберкулин, не учитывают независимо от наличия или отсутствия у них реакций на КАМ.

4.9.7. Результаты оценки реакции на туберкулин в сравнении с реакцией на КАМ в знаках ("+", "-", "=") записывают в ведомость учета симультанной пробы (табл. 1) и с помощью табл. 2 определяют достоверность различия в интенсивности реакций у животных на туберкулин и КАМ в целом по группе. По ведомости подсчитывают общее количество животных, реагирующих на туберкулин с оценкой реакций "+" и "-" (животных, реагирующих на аллергены в равной степени, в расчет не берут), и таким образом определяют показатель А табл. 2 (например 14). Затем подсчитывают отдельно количество знаков "+" и знаков "-" и по табл. 2 сравнивают поочередно результаты с показателем Б, соответствующим установленному показателю А (в примере: соответствующий показатель Б равен 12).

4.9.8. Если количество знаков "+" равно или больше показателя Б, а также если при проведении пробы вообще не выявлено животных, реагирующих на КАМ, то это означает, что реакции на туберкулин выражены достоверно интенсивнее, чем на КАМ, и указывает на заражение животных возбудителем туберкулеза.

4.9.9. Если количество знаков "-" равно или больше показателя Б, значит у животных реакции достоверно более выражены на КАМ. Если при этом у всех реагирующих на туберкулин животных реакции интенсивнее выражены на КАМ и получены отрицательные результаты бактериологических исследований, группу скота считают благополучной по туберкулезу. Также благополучным по туберкулезу считают поголовье животных, среда которых при проведении симультанной пробы не выявлено реагирующих на туберкулин.

4.9.10. Могут быть случаи, когда при достоверно более интенсивной реакции на КАМ в целом по стаду (группе) у отдельных животных наблюдаются реакции на туберкулин при менее выраженной или совсем отсутствующей реакции на КАМ. Это может быть обусловлено парадоксальным проявлением реакций на аллергены или наличием туберкулезной инфекции на фоне сенсибилизации животных к туберкулину атипичными микобактериями. Для уточнения диагноза всех таких животных, а также реагирующих в равной степени на туберкулин и КАМ (при утолщении кожной складки на 3 мм и более), обязательно подвергают убою с патолого-анатомическим исследованием на туберкулез. При отсутствии характерных изменений проводят бактериологическое исследование и в случае получения отрицательного результата стадо (группу) животных считают благополучным по туберкулезу.

Таблица 1

Ведомость учета симультанной пробы (пример)

Номер (кличка) животных, реагировавших на туберкулин	Оценка реакции на туберкулин в сравнении с реакцией на КАМ: большая (+), меньшая (-), равная (=)
1	2
17	+
114	=
316	-
289	+
32	=
174	+
285	+
232	+
484	-
179	-
201	+
343	-
211	-
178	+
6	+
18	-
131	+
14	+
104	+
#6	-
903	-
40	-
139	+
28	-
77	+
Всего животных 25	Всего знаков "+" и "-" - 23 (показатель А табл. 2), в т.ч.: знаков "+" - 13 "-" - 10

В данном примере различие в интенсивности реакций на туберкулин и КАМ недостоверно, поэтому результаты симультанной пробы считают неопределенными.

Таблица 2

Определение достоверности различия реакций на туберкулин и КАМ

Показатель А	Показатель Б	Показатель А	Показатель Б
Общее количество животных, реагирующих на туберкулии с оценкой реакции "+" и "-"	Минимум животных с большей "+" или меньшей "-" интенсивностью реакции на туберкулии, при котором различие в реакции достоверно	Общее количество животных, реагирующих на туберкулии с оценкой реакции "+" и "-"	Минимум животных с большей "+" или меньшей "-" интенсивностью реакции на туберкулии, при котором различие в реакции достоверно
1	2	3	4
6	6	31	22
7	7	32	23
8	8	33	23
9	9	34	24
10	9	35	24
11	10	36	25
12	10	37	25
13	11	38	26
14	12	39	27
15	12	40	27
16	13	41	28
17	13	42	28
18	14	43	29
19	15	44	29
20	15	45	30
21	16	46	31
22	17	47	31
23	17	48	32
24	18	49	32
25	18	50	33
26	19	51	33
27	20	52	34
28	20	53	35
29	21	54	35
30	21	55	36
56	36	78	49
57	37	79	49
58	37	80	50
59	38	81	50
60	39	82	51
61	39	83	51
62	40	84	52
63	40	85	53
64	41	86	53
65	41	87	54
66	42	88	54
67	42	89	55
68	43	90	55
69	44	91	56
70	44	92	56
71	45	93	57
72	45	94	57
73	46	95	58
74	46	96	59
75	47	97	59
76	48	98	59
77	48	99	60
		100	61

4.9.11. Если количество "плюсов" и "минусов", взятых в отдельности, меньше показателя Б, то различие в интенсивности реакций на туберкулин и КАМ считают статистически недостоверным и результаты симультанной пробы неопределенными. В этом случае для установления диагноза животных, реагирующих в большей степени на туберкулин (с оценкой реакции "+") и в равной степени на туберкулин и КАМ (с оценкой реакции "="), подвергают убою с осмотром внутренних органов и тканей и направляют материал для бактериологического исследования на туберкулез. Заключение о состоянии стада или группы животных по туберкулезу делают по результатам всех проведенных исследований.

Так же поступают, когда на туберкулин реагируют менее 6 животных или у всех реагирующих на туберкулин реакции в равной степени выражены и на КАМ (отбирают для убоя животных с утолщением кожной складки на 3 мм и более). В этих случаях отбирают животных, реагировавших на туберкулин с оценкой "+" и "=" проводят их убой с последующим патолого-анатомическим исследованием (лабораторные исследования не проводят).

4.10. Симультанная аллергическая проба с применением туберкулинов для млекопитающих и для птиц.

4.10.1 Симультанную пробу с применением туберкулинов для млекопитающих и для птиц применяют у крупного рогатого скота и свиней для дифференциации специфических и параспецифических реакций при первичной постановке диагноза и для контроля за благополучием животных по туберкулезу в стадах, где реакции на туберкулин обусловлены сенсибилизацией микобактериями комплекса авиум-интрацеллюляре или атипичными микобактериями.

4.10.2. Туберкулины вводят в дозе 0,2 мл внутрикожно:

крупному рогатому скоту (кроме быков) в симметричные участки с правой и левой стороны шеи;

быкам - в правую и левую подхвостовые складки;

свиньям - с наружной поверхности уха - в 2-3 см от его основания, поросятам в возрасте 2-3 месяцев туберкулин допускается вводить в кожу поясничной области, отступая от позвоночника на 5-8 см, используя для этого только безыгольный инъектор.

Реакции учитывают у крупного рогатого скота через 72 часа и считают реагирующими животных при утолщении кожной складки на 3 мм и более, у свиней - через 48 часов при образовании припухлости в месте введении туберкулинов. Результаты исследований оценивают индивидуально или в целом по стаду.

4.10.3. Индивидуальную оценку интенсивности реакций проводят у животных, реагирующих на оба препарата. Реакция на один из туберкулинов у крупного рогатого скота считается более интенсивной, если при измерении кожной складки устанавливается разница не менее чем на 2 мм.

У свиней большую выраженность реакции на туберкулин для млекопитающих по величине припухлости при менее выраженной или полностью отсутствующей реакции на туберкулин для птиц обозначают знаком "+" (плюс), менее выраженную реакцию на туберкулин для млекопитающих - знаком "-" (минус), одинаковые по величине припухлости - знаком "=" (равенство).

4.10.4. Результаты оценки реакций на туберкулин записывают в ведомость учета симультанной пробы. Если реакция интенсивнее выражена на туберкулин для млекопитающих, то животное признают зараженным возбудителем туберкулеза бычьего или человеческого вида. При более интенсивной реакции на туберкулин для птиц животное считают зараженным микобактериями комплекса авиум-интрацеллюляре или атипичными микобактериями.

4.11. Глазной метод туберкулинизации (офтальмопроба)

4.11.1. Глазной метод туберкулинизации применяют для диагностики туберкулеза лошадей и других представителей непарнокопытных.

У крупного рогатого скота этот метод можно применять только одновременно с внутрикожной туберкулиновой пробой в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах для дополнительного выявления зараженных животных.

Офтальмопробу можно использовать также одновременно с внутрикожной пробой при отборе животных для диагностического убоя. Наиболее часто диагноз на вскрытии подтверждается у животных, реагирующих одновременно из внутрикожную пробу и офтальмопробу.

4.11.2. При каких-либо поражениях глаз исследование животных офтальмопробой запрещается.

4.11.3. Глазную туберкулинизацию проводят двукратно с интервалом 5-6 дней между введениями. Туберкулин в количестве 3-5 капель наносят пипеткой или шприцем с бегунком без иглы на конъюнктиву нижнего века или на поверхность роговицы при оттянутом нижнем веке. Массировать глаз после нанесения препарата запрещается.

Животным, реагировавшим на первое введение туберкулина, препарат повторно не вводят.

4.11.4. Учет результатов офтальмопробы проводят через 6, 9, 12 и 24 часа после первого и через 3, 6, 9 и 12 часов после повторного введения туберкулина. Положительная реакция характеризуется образованием слизисто-гнойного или гнойного секрета, накапливающегося в конъюнктивальном мешке или вытекающего в виде шнура из внутреннего угла глаза, гиперемией и отеком конъюнктивы. При учете реакции необходимо оттягивать нижнее веко и осматривать конъюнктивальный мешок, так как реакция может ограничиться кратковременным образованием гнойного секрета в виде зернышек.

При проявлении положительной реакции в ранние сроки (через 6-12 часов) позже учет реакции не проводят.

Кратковременная гиперемия и слезотечение с образованием небольшого количества слизистого секрета, а также отсутствие каких-либо изменений оценивается как отрицательная реакция.

4.12. Внутривенный метод туберкулинизации

4.12.1. Внутривенную туберкулиновую пробу применяют с целью отбора животных для диагностического убоя из числа реагирующих на туберкулин в благополучных по туберкулезу стадах.

4.12.2. Внутривенную пробу разрешается проводить только у взрослого крупного рогатого скота (не моложе 18 месяцев), за исключением коров (нетелей) в течение месяца до и после отела.

4.12.3. Внутривенную пробу проводят 50%-ным раствором ППД-туберкулина для млекопитающих (флакон туберкулина разводят равным количеством физиологического раствора или растворителя микобактериальных аллергенов). Каждому исследуемому животному внутривенно вводят по 1 мл препарата на 100 кг живой массы (примерно 4 мл 50% раствора).

4.12.4. Перед введением туберкулина у животного измеряют температуру тела. Животных с повышенной температурой (выше 39,5°С) не исследуют.

4.12.5. Реакцию учитывают через 3, 6 и 9 часов после введения туберкулина путем измерения температуры тела животного.

У больных туберкулезом животных реакция на внутривенное введение туберкулина характеризуется в большинстве случаев повышением температуры тела. Возможна общая реакция организма в виде судорожных явлений, сильного беспокойства, редко - потеря сознания и гибель от анафилактического шока.

Реагирующими на эту пробу признают животных с повышением температуры тела на один и более градусов выше максимальной нормальной, т.е. 40,5°С и выше.

4.13. Пальпебральный метод туберкулинизации крупного рогатого скота

4.13.1. Этот метод применяют одновременно с внутрикожной туберкулиновой пробой для дифференциации специфических и параспецифических реакций при первичной постановке диагноза. Крупному рогатому скоту туберкулин вводят пальпебрально (в толщу века) в дозе 0,2 мл в нижнее веко, отступив от его края на 1,5-2 см.

4.13.2. Учет и оценку реакция проводят через 72 часа после введения препарата. Оценку реакции проводят визуально, сравнивают века в месте введения туберкулина и без введения туберкулина.

4.13.3. Животных считают реагирующими на туберкулин при образовании ощутимой припухлости в месте введения препарата.

4.13.4. На пальпебральную пробу реагирует только крупный рогатый скот, зараженный возбудителем бычьего или человеческого видов. Животные, инфицированные атипичными микобактериями, на пальпебральную пробу не реагируют.

4.14. Оформление результатов аллергических исследований

По окончании аллергических исследования составляют акт, с приложением описи исследованных животных.

В акте указывают наименование хозяйства, фермы, вид животных, количество исследованного поголовья, наименование, номер и срок годности серий использованных препаратов, метод исследовании. В опись записывают инвентарные номера или клички животных, отмечают величину утолщения кожной складки.

В акте на исследование скота частного сектора и фермерских хозяйств указывают наименование населенного пункта, фамилию владельца, пол, масть и возраст исследованных животных, регистрируют результаты исследования.

5. Патолого-анатомическое исследование

5.1. Патолого-анатомические изменения при туберкулезе характеризуются образованием в органах и тканях гранулем (туберкулов). Туберкулы плотные, светло-серого или серовато-желтого цвета с творожистой массой в центре (казеозный некроз), частично или полностью обызвествленные, окруженные соединительнотканной капсулой.

5.2. При диагностике туберкулеза обязательному осмотру подвергают:

у млекопитающих - заглоточные, подчелюстные, предлопаточные, бронхиальные, средостенные, брыжеечные, портальные, надвыменные лимфатические узлы, легкие, печень, селезенку, молочную железу, плевру, брюшину, кишечник;

у птиц - печень, селезенку, кишечник в области илеоцекального соединения.

5.3. Туберкулезом могут поражаться любые органы и ткани (кроме роговых тканей) животных. Патолого-анатомические изменения весьма разнообразны и зависят от возраста и резистентности организма, условий кормления, содержания и эксплуатации животного, вирулентности и количества возбудителя, путей заражения и стадии процесса к моменту убоя животного.

В начальных стадиях процесса туберкулы представляют собой серые полупрозрачные узелки размером от булавочной головки до чечевичного зерна. Затем они мутнеют и становятся бело-желтого цвета, заполняющая их некротизированная сухая крошковатая масса напоминает творог.

5.4. У взрослого крупного рогатого скота чаще всего поражаются легкие, лимфатические узлы головы и легких, а у молодняка - брыжеечные лимфатические узлы.

В легких очаги поражения обычно выделяются над легочной плеврой, чаще по тупому краю. Очаги бывают различной величины, плотные с творожистым некрозом и перифокальным воспалением.

Печень, почки, селезенка и молочная железа поражаются обычно при генерализации туберкулезного процесса.

Туберкулезные поражения серозных покровов (жемчужница) встречаются с одновременным поражением паренхиматозных органов и региональных лимфатических узлов.

При милиарном туберкулезе (наблюдается, в основном, у молодых и истощенных животных) в различных органах и лимфатических узлах обнаруживают многочисленные плотные узелки величиной с просяное зерно.

Мелкие туберкулезные узелки следует отличать от гранулем паразитарного, микотического и иного происхождения. Микотические гранулемы макроскопически трудно отличить от туберкулезных, узелки паразитарного происхождения содержат некротическую массу, легко выдавливающуюся, внутренняя поверхность капсулы таких узелков блестящая, гладкая.

5.5. При заражении крупного рогатого скота микобактериями туберкулеза человеческого и птичьего видов патолого-анатомические изменения обнаруживают редко.

5.6. Изменения при туберкулезе у животных других видов имеют некоторые особенности. У свиней чаще находят обызвествленные инкапсулированные единичные или конгломерирующие некрозы в лимфатических узлах головы и брыжейки, редко в легких и печени. У маралов и пушных зверей регистрируют генерализованный процесс с образованием множественных туберкулов. У птиц чаще всего обнаруживают поражение печени, селезенки и кишечника.

5.7. В случае отсутствия у крупного рогатого скота видимых изменений или возникших затруднениях в определении характера патологических изменений послеубойный материал направляют для лабораторного исследования. От свиней и птиц материал отбирают независимо от характера патологических изменений, обнаруженных в органах и тканях.

5.8. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности. Для бактериологического исследования направляют от млекопитающих - лимфатические узлы: заглоточные, подчелюстные, бронхиальные, средостенные, брыжеечные; лимфатические узлы, взятые в области илеоцекального соединения и подвздошной кишки, упаковывают отдельно от остальных лимфатических узлов. Портальные, предлопаточные, надвыменные, поверхностные паховые лимфатические узлы и внутренние органы (легкие, печень, почки) направляют только при наличии туберкулезных изменений.

Парные лимфатические узлы отбирают оба, указав их название на этикетке, которую помещают вместе с пробой.

Трупы (тушки) птиц в лабораторию направляют целиком.

5.9. Пробы патологического материала, отобранные для бактериоскопического, культурального и биологического исследований, доставляют в лабораторию в свежем или замороженном виде. Для гистологического исследования отбирают кусочки патологически измененных органов и фиксируют их в 10%-ном нейтральном водном растворе формалина. Пробы хранят до окончания лабораторного исследования.

5.10. На отправляемый в лабораторию материал составляют сопроводительный документ установленной формы с указанием результатов аллергических и патолого-анатомических исследований.

6. Бактериологическое исследование

6.1. Сущность метода заключается в выявлении и выделении культур микобактерий, определении вида возбудителя туберкулеза.

Бактериологическое исследование биоматериала включает бактериоскопический, культуральный и биологический способы исследования.

Бактериоскопически и культурально исследуют биоматериал от каждого животного в отдельности. Для биологической пробы допускается составлять общую пробу не более чем от двух животных одного стада.

Исследование проводят в следующем порядке:

- микроскопия мазков, изготовленных из биоматериала и окрашенных по методу Циля-Нильсена;

- культуральное исследование (посев биоматериала на питательные среды);

- биологическое исследование (биопроба).

6.2. Бактериоскопическое исследование

6.2.1. Бактериоскопию проводят в целях определения наличия и степени обсемененности материала кислотоустойчивыми микобактериями. Сущность метода заключается в способности микобактерий, окрашенных фуксином, удерживать краситель после длительного обесцвечивания в солянокислом спирте.

Способ световой микроскопии обычно дает положительные результаты при содержании 100 000 и более бактериальных клеток в 1 мл материала. Результаты (положительные или отрицательные) микроскопии не дают основания для постановки диагноза на туберкулез у животных (кроме птиц) и обязательно должны быть подтверждены культуральным или биологическим методами исследований. При обнаружении микобактерий в мазках из материала от птиц, в органах которых отмечены патологические изменения, диагноз на туберкулез считают установленным и дальнейшие исследования не проводят. В случае отрицательных результатов микроскопии мазков проводят культуральное исследование материала.

6.2.2. Для микроскопии из каждого органа и лимфатического узла готовят по 2 мазка путем тщательного растирания материала между двумя стеклами. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем, окрашивают по Цилю-Нильсену (см. приложение N 1) и просматривают под микроскопом.

Для микобактерий туберкулеза характерны тонкие, прямые или изогнутые красные палочки различной длины, часто зернистые. Они располагаются небольшими скоплениями или одиночно.

Атипичные микобактерии морфологически трудноотличимы от возбудителя туберкулеза, однако чаще это грубые, толстые, как правило, незернистые палочки, различные по длине.

6.3. Культуральное исследование

6.3.1 Культуральное исследование дает положительные результаты при наличии 20-100 микобактерий в 1 мл исследуемого материала.

6.3.2. Для получения чистых культур микобактерий материал подвергают предварительной обработке.

Из каждого доставленного в лабораторию лимфатического узла и участка ткани вырезают кусочки размером 0,5 см на границе здоровой и измененной ткани. Общая масса отобранного материала для исследования составляет около 6-10 г.

Брыжеечные лимфатические узлы, лимфоузлы, взятые в области илеоцекального соединения и подвздошной кишки, обрабатывают и высевают отдельно от другого материала (нельзя смешивать с легкими, печенью и средостенными лимфоузлами). Отобранный материал обрабатывают по одному из следующих методов.

Метод Гона-Левенштейна-Сумиоши. Кусочки материала измельчают ножницами в ступке, тщательно растирают пестиком со стерильным песком или стеклом и заливают в зависимости от свежести материала 3-6%-ным раствором серной кислоты или 5-10%-ным раствором щавелевой кислоты в соотношении: на 1 объем материала - 4 объема кислоты. Затем центрифугируют в течение 10-15 мин при 3000 об/мин. Общая экспозиция воздействия кислотой не должна превышать 30 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок отмывают 2-3 раза физиологическим раствором центрифугированием при том же режиме и используют для посевов, нанося и растирая его шпателем на поверхности яичной среды.

Метод А.П. Аликаевой. Кусочки материала помещают в ступку и заливают 3-6%-ным раствором серной кислоты на 10-20 мин, ступку накрывают листом стерильной пергаментной бумаги. Затем кислоту сливают, материал промывают 3 раза в течение 5-10 мин физиологическим раствором, после чего раствор удаляют, и кусочки ткани тщательно растирают со стерильным песком или стеклом и незначительным объемом физиологического раствора (1-1,5 мл). Из полученной взвеси делают посевы и мазки, а к оставшейся доливают физиологический раствор в количестве, необходимом для заражения животных (1-2 мл на одно животное).

Метод флотации. Применяют для концентрации микобактерий в исследуемом материале. Кусочки материала растирают в ступке с физиологическим раствором до консистенции сметаны, 10 мл суспензии помещают в узкогорлую колбу вместимостью 250 мл и добавляют 10 мл 1%-ного раствора едкого натра. Смесь в течение 10 мин (не более) тщательно встряхивают в шуттель-аппарате до получения однородной взвеси. Затем гомогенизированный материал разбавляют в соотношении 1:9 физиологическим раствором и прибавляют 1-2 мл ксилола или авиационного бензина. Смесь снова встряхивают 5-10 мин, добавляют физиологический раствор до горлышка колбы и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Микобактерии туберкулеза концентрируются во флотационном кольце у горлышка колбы.

Для приготовления мазков содержимое образовавшегося кольца осторожно отсасывают пипеткой и наносят по мере подсыхания несколько раз на предметное стекло. Дня посевов на питательные среды пенистую часть флотационного кольца переносят пастеровской пипеткой на стерильные пробирки, добавляя приблизительно равное количество 3-6%-ного раствора серной кислоты. Пробирки тщательно встряхивают в течение 3-5 мни и оставляют на 10 мин. Содержимое вновь образовавшегося компактного кольца засевают петлей-ракеткой в пробирки с питательной средой.

6.3.3. Для выращивания микобактерий используют плотные яичные среды Левенштейна-Йенсена, ФАСТ-ЗЛ, Финн-2, Гельберга, Петраньяни (см. приложение N 2).

6.3.4. Подготовленный для исследования материал высевают в 5-10 пробирок с питательной средой Левенштейна-Йенсена и одну из следующих сред: Гельберга, Петраньяни, Фини-2, ФАСТ-3Л. Посев проводят пастеровской пипеткой или платиновой петлей, осторожно растирая материал по всей поверхности питательной среды. Засеянные пробирки укладывают в наклонном положении и помещают в термостат с температурой 37-38°С. Через 2 суток посевы просматривают и определяют восстановление цвета среды. Если цвет среды не восстановился, обработку и посев повторяют. Пробирки, в которых появился рост посторонней микрофлоры, удаляют. В остальных ватно-марлевые пробки парафинируют.

6.3.5. Посевы инкубируют в течение 3 месяцев. Для выявления начального роста микобактерий пробирки с посевами просматривают не реже одного раза в неделю. Рост микобактерий туберкулеза бычьего вида чаще обнаруживают на 20-60 сутки, человеческого на 20-30, птичьего - на 10-20, атипичных микобактерий - на 3-30 сутки.

6.3.6. У выделенных первичных культур изучают и описывают свойства по следующей схеме:

а) сроки обнаружения первичного роста;

б) характер роста - отдельные колонии, скопления их, сплошной рост;

в) характеристика колоний;

величина - мелкие, крупные;

форма - круглая, звездчатая, с неровными краями;

поверхность - гладкие, влажные, шероховатые, сухие, складчатые;

рельеф - плоские, выпуклые, шаровидные;

консистенция - крошковатые, вязкие, слизистые;

пигментообразование - непигментированные, пигментные (цвет);

эмульсируемость в физиологическом растворе - отсутствует, слабая, хорошая;

г) тинкториальные свойства при окраске по Цилю-Нильсену;

д) морфология микобактерий:

длина - длинные, короткие, коккоподобные;

толщина - тонкие, толстые;

форма - прямые, изогнутые, ветвящиеся, расположенные под углом;

количество - единичные клетки, небольшие скопления, кучки.

6.3.7. Микобактерии туберкулеза бычьего вида в первых генерациях растут скудно, через 20-60 суток, в виде мелких, гладких, шаровидных, цвета слоновой кости колоний. Реже встречаются культуры, образующие шероховатые колонии.

Для микобактерий туберкулеза человеческого вида характерен интенсивный узелковоподобный, шероховатый, сухой рост (через 20-30 суток) культуры цвета слоновой кости. Это R-формы (шероховатые) колоний. Иногда встречаются S-формы (гладкие) колоний.

Культуры микобактерий туберкулеза птичьего вида растут быстрее (10-15 суток), чем микобактерии туберкулеза бычьего и человеческого видов. Колонии мягкие, слизистые, серовато-белые, реже слегка желтоватые, иногда с пуговицеобразным возвышением и кратеровидным углублением (форма "тюрбана"),

6.3.8. Для дальнейшего изучения культуральных свойств микобактерий накапливают бактериальную массу выросшее колоний на яичной среде. Для пересева отбирают колонии, наиболее характерные по внешнему виду для микобактерий туберкулеза.

Для дифференциации культур возбудителей туберкулеза бычьего, человеческого, птичьего видов и атипичных микобактерий, накопленную бакмассу пересевают на различные питательные среды (яичные, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (MПA) и яичную среду с салицилатом натрия) и культивируют их при разных температурных режимах: 20-22°, 37-38° и 45°С.

Для пересева платиновой петлей (диаметр 2-3 мм) снимают 1-2 петли культуры и переносят в стерильную пробирку или пенициллиновый флакон. Бактериальную массу тщательно растирают в 1-1,5 мл физиологического раствора, который добавляют небольшими порциями в пробирку (флакон).

Приготовленную взвесь вносят пастеровской пипеткой по 2-3 капли в девять пробирок со средой Левенштейна-Йенсена (по 3 пробирки на каждый температурный режим), в три пробирки яичной среды с салицилатом натрия, в три пробирки с МПА и МПБ. На пробирках делают надписи с указанием номера экспертизы, даты пересева и температурного режима культивирования. Пробки парафинируют и пробирки устанавливают в термостат при заданных температурах. Пробирки с посевами на мясопептонный бульон, мясопептонный агар и на яичную среду с салицилатом натрия инкубируют в термостате при 37°С.

При пересевах учет появления роста в первые 10 суток культивирования проводят каждые двое-трое суток и каждые пять дней в последующие три недели.

Характер роста на яичных средах к МПА определяют и описывают по той же схеме, что и первичные культуры, а на МПБ - в следующем порядке:

пленка - наличие, отсутствие;

интенсивность развития пленки - тонкая, умеренно развитая, толстая;

поверхность пленки - гладкая, зернистая, морщинистая;

цвет пленки;

нити (наличие и характер): тонкие, толстые, короткие, длинные;

осадок - плотный, рыхлый, хлопьевидный, цвет;

изменение среды культивирования - помутнение, цвет.

Помутнение среды указывает на загрязнение культуры. Микобактерии туберкулеза всех трех видов не образуют пигмент и растут на яичных средах без салицилата натрия, M. tuberculosis и M. bovis растут при температуре - 37-38°С, M. avium при температурах - 22°С, 37-38°С и 45°С, микобактерии туберкулеза птичьего вида также растут на яичной среде с салицилатом натрия. M. tuberculosis и M. bovis не растут на МПБ и МПА, на этих средах допускается слабый рост микобактерий птичьего вида.

Атипичные микобактерии растут в первые 3-7 дней после посева при разных температурах на яичных средах, а некоторые - на яичной среде с салицилатом натрия, МПБ и МПА.

На основании характера роста культур на питательных средах можно ориентировочно дифференцировать возбудителей туберкулеза бычьего и человеческого видов от других микобактерий (возбудитель туберкулеза птичьего вида и атипичные микобактерии). Основные культуральные свойства микобактерий приведены в приложении N 3.

Видовую принадлежность выделенных микобактерий туберкулеза можно определять на основании результатов полимеразной цепной реакции (ПЦР).

6.4. Биологическое исследование.

6.4.1. Метод биологической пробы применяют для обнаружения микобактерий туберкулеза в исследуемом материале и определения видовой принадлежности культур возбудителя по патогенным свойствам для лабораторных животных.

6.4.2. Выявление возбудителя туберкулеза в биологическом материале проводят параллельно с культуральным исследованием путем введения посевной суспензии трем морским свинкам. Определение видовой принадлежности микобактерий проводят путем введения первичных культур трем морским свинкам, трем кроликам и при необходимости - трем курам.

6.4.3. Лабораторных животных (морских свинок, кроликов, кур), используемых для исследования проверяют аллергически туберкулином. Морских свинок и кроликов исследуют ППД-туберкулином для млекопитающих, кур - ППД-туберкулином для птиц.

Накануне исследования у свинок на боку выщипывают или выбривают шерсть. ППД-туберкулин для млекопитающих вводят внутрикожно в дозе 25 ME (международных единиц) в объеме 0,1 мл растворителя или стерильного физиологического раствора. Реакцию на туберкулин учитывают через 24 часа. Положительная реакция проявляется гиперемией кожи в месте введения туберкулина и образованием уплотненной припухлости диаметром 5 мм и более, иногда с некрозом в центре. Кроликам туберкулин в дозе 50 МЕ/0,1 мл вводят в кожу наружной поверхности уха. Реакцию учитывают через 24 и 48 часов. Положительная реакция проявляется гиперемией кожи диаметром от 5 мм и более и образованием припухлости в месте введения туберкулина.

Курам вводят 0,1 мл ППД-туберкулина для птиц внутрикожно в бородку, реакцию учитывают через 30-36 ч. Положительная реакция характеризуется опуханием бородки.

Биопробу проводят на животных, не реагирующих на введение туберкулина.

6.4.4. Постановка биопробы для обнаружения возбудителя туберкулеза в исследуемом биоматериале

6.4.4.1. Биопробу ставят с материалом от каждого животного в отдельности, иногда допускается составлять общую пробу не более, чем от двух животных одного стада. Этот метод даст положительные результаты при наличии в инъецируемом материале единичных клеток микобактерий туберкулеза.

6.4.4.2. Дня постановки биопробы берут трех морских свинок массой 300-500 г (желательно светлой масти). Взвесь материала, использованного для посевов на питательные среды и нейтрализованного 10%-ным раствором аммиака или 10%-ным стерильным водным раствором двууглекислой соды до получения рН 7,0-7,2, отстаивают до оседания крупных частиц к образовавшуюся надосадочную суспензию в дозе 1-2 мл вводят морским свинкам подкожно в области паха.

6.4.4.3. При развитии туберкулезного процесса у морских свинок через 14-28 сут в месте инъекции материала наблюдают увеличение и уплотнение регионального лимфатического узла и уплотнение кожи, затем образование язвы. Свинки прогрессивно худеют. Туберкулез у морских свинок может протекать без проявления клинических симптомов.

6.4.4.4. За животными ведут наблюдение в течение трех месяцев. При гибели морских свинок в течение срока наблюдения проводят вскрытие трупов и патолого-анатомическое исследование. При отсутствии падежа свинок убивают через 3 месяца после заражения, также проводят патологоанатомическое исследование.

Из участков органов и лимфатических узлов готовят мазки и окрашивают по Цилю-Нильсену. При положительном результате бактериоскопии материала дают положительное заключение на туберкулез.

6.4.5. Постановка биопробы для определения видовой принадлежности культур возбудителя туберкулеза.

6.4.5.1. Для определения вида возбудителя туберкулеза, выделенного при культуральном исследовании, заражают трех морских свинок, трех кроликов и при необходимости трех кур. Биопробу ставят отдельно с каждой культурой.

Для постановки биопробы берут кроликов массой не менее 2 кг, морских свинок массой 300-500 г и кур не моложе 5 месяцев.

6.4.5.2. Заражение животных проводят 3-4-недельной культурой: морских свинок - подкожно, кроликов - внутривенно в краевую вену уха, кур - внутривенно в подкрыльцовую вену или внутримышечно в область грудины в дозах по 1 мг микобактерий, суспендированных в 1 мл физиологического раствора.

Для приготовления суспензии бактериальную массу в количестве 8-10 мг снимают шпателем с поверхности плотной питательной среды и, соблюдая меры предосторожности, переносят в стерильный, предварительно взвешенный пенициллиновый флакон. Флакон с бакмассой взвешивают на аналитических весах. Разница между вторым и первым взвешиванием показывает вес взятой культуры. Для приготовления суспензии физиологический раствор берут из расчета 1 мл на 1 мг бактериальной массы. Если бактериальная масса трудно гомогенизируется (суспензия должна быть однородной), её сначала тщательно растирают с несколькими каплями физиологического раствора пестиком в ступке или стеклянной палочкой в пробирке, а затем к суспензии частями добавляют необходимый объем физиологического раствора.

6.4.5.3. За животными ведут наблюдение в течение трех месяцев. При гибели животных в течение срока наблюдения проводят вскрытие трупов. При отсутствии падежа животных убивают через 3 месяца после заражения.

6.4.5.4. Определение вида микобактерий туберкулеза проводят на основании результатов патолого-анатомических исследований зараженных животных.

Возбудитель туберкулеза бычьего вида вызывает у морских свинок и кроликов генерализованный процесс в период от 20 до 90 суток после введения культуры. У морских свинок в регионарных к месту введения паховых лимфатических узлах на разрезе обнаруживают казеозные очаги. Аналогично поражены и другие лимфатические узлы. Селезенка и печень увеличены, плотные, с серо-белыми или серо-желтыми мелкими сливающимися узелками, в легких множество серо-белых очажков.

У кроликов резко увеличены легкие, а них множество очажков, часто с наличием некрозов. В печени и селезенке поражения наблюдаются чаще в виде отдельных небольших узелков. В почках могут развиваться очаговые поражения.

Микобактерии человеческого вида вызывают у морских свинок генерализованный туберкулез, а у кроликов не вызывают прогрессирующего процесса. Единичные очажки можно обнаружить в легких и редко в почках, чаще поражения отсутствуют.

Микобактерии туберкулеза птичьего вида у морских свинок, как правило, вызывают только абсцесс в месте введения культуры и увеличение регионарного пахового лимфатического узла, а у кроликов - сепсис, характеризующийся резким увеличением селезенки и гибелью животных в течение 10-30 суток.

Микобактерии туберкулеза птичьего вида вызывают гибель кур в течение 30 суток. Иногда куры выживают до 2-3 месяцев. У кур, павших в ранние сроки, на вскрытии находят резкое увеличение селезенки и печени, при микроскопии обнаруживают обилие кислотоустойчивых микобактерий. У кур, убитых через 3 месяца после заражения, на вскрытии находят множественные серо-желтые бугорки в печени и селезенке, а в окрашенных по Цилю-Нильсену мазках из органов, - микобактерии туберкулеза.

Микобактерии туберкулеза человеческого и бычьего видов при внутривенном заражении кур не вызывают у них заболевания и каких-либо изменений в органах.

Принадлежность микобактерии туберкулеза к тому или иному виду определяют по следующим данным:

при генерализованном процессе у морских свинок и кроликов - бычий вид;

при отсутствии поражений или наличии единичных типичных очажков в легких у кроликов и генерализованном процессе у морских свинок - человеческий вид;

при наличии поражений у кур и септического процесса у кроликов - птичий вид.

6.4.5.5. Дифференциацию культур атипичных микобактерий и определение их сенсибилизирующей роли можно проводить в порядке, изложенном в приложении 4.

7. Молекулярно-генетический метод исследования (ПЦР)

7.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является молекулярно-генетическим экспресс-методом исследования, основанным на обнаружении в исследуемом материале специфического фрагмента ДНК, характерного только для определенного вида возбудителя. Принцип ПЦР заключается в выделении и многократном повторении циклов амплификации (копирования) специфического фрагмента ДНК возбудителя в исследуемой пробе а выявлении его с помощью электрофореза в агарозном геле или другим способом.

7.2. ПЦР применяют при постановке диагноза на туберкулез:

у крупного рогатого скота - при отсутствии видимых изменений или возникших затруднениях, в определении характера патолого-анатомических изменений;

у других видов млекопитающих животных - независимо от характера патолого-анатомических изменений;

у птиц - при отсутствии видимых изменений или возникших затруднениях при определении характера изменений.

ПЦР применяют также для определения видовой принадлежности выделенных микобактерий.

7.3. Отбор и доставка материала в ветеринарную лабораторию

7.3.1. Материал отбирают от каждого животного в отдельности. Для исследования направляют в обязательном порядке лимфатические узлы: подчелюстные, заглоточные, бронхиальные, средостенные, портальные, брыжеечные и лимфоузлы илеоцекального соединения и подвздошной кишки; кусочки паренхиматозных органов: легких и печени.

Парные лимфоузлы берут с обеих сторон туши (трупа) животного.

Лимфатические узлы, не имеющие при прощупывании очагов уплотнения, направляют в лабораторию целиком, без надрезов.

7.3.2. Отобранный от каждого животного материал группируют и упаковывают по пробам:

1 - лимфоузлы подчелюстные, заглоточные, бронхиальные, средостенные и кусочки легких;

2 - лимфоузлы портальные, области илеоцекального соединения и подвздошной кишки, брыжеечные и кусочки печени.

7.3.3. Пробы материала направляют в ветеринарную лабораторию в свежем, замороженном виде или законсервированными 30%-ным раствором глицерина.

7.4. Подготовка материала в ветеринарной лаборатории

7.4.1. При подготовке материала для исследования в ПЦР необходимо соблюдение условий, исключающих возможность механической контаминации его возбудителем туберкулеза и его фрагментами и получения по этой причине ложноположительных результатов реакции.

Инструментарий, лабораторная посуда, вода, растворы, соприкасающиеся с обследуемым материалом, должны быть свободны от клеток возбудителя туберкулеза - живых и убитых, и фрагментов его ДНК. При этом следует учитывать, что обычно применяемые методы стерилизации (кипячение, автоклавирование и т.п.) недостаточны для разрушения ДНК.

Лабораторную посуду выдерживают в течение 2-х часов в сухожаровом шкафу при температуре не ниже 180°С или обрабатывают 1 М раствором соляной кислоты, 10%-ным раствором гипохлорита натрия, 10%-ным раствором хлорной извести или смесью концентрированной серной кислоты с двухромовокислым калием (хромпик) и затем промывают дистиллированной водой.

Инструментарий (ножницы, пинцеты и т.п.) фламбируют над пламенем горелки. Ступки, пестики после стерилизации кипячением или автоклавированием фламбируют с помощью подожженного ватного тампона, смоченного 96°-ным спиртом.

7.4.2. Размороженные или отмытые от консервирующей жидкости лимфатические узлы и кусочки паренхиматозных органов освобождают от жировой ткани и просушивают фильтровальной бумагой. Затем с помощью пинцета погружают по одному в 96°-ный спирт и сразу поджигают. После угасания пламени фламбирование повторяют.

Фламбирование каждого лимфоузла или кусочка паренхиматозного органа проводят не менее 4-х раз. При фламбировании биоматериала соблюдают меры противопожарной безопасности.

7.4.3. Материал, освобожденный таким способом с поверхности от возможной контаминации возбудителем туберкулеза и фрагментами его ДНК, помещают по отобранным пробам в профламбированные ступки и измельчают ножницами. Затем материал в ступках растирают с прокаленным битым стеклом, добавляют 10-15 мл дистиллированной воды и перемешивают. Образовавшуюся смесь по 0,4-0,5 мл переносят пастеровской пипеткой в пробирки с крышками для ПЦР вместимостью 1,5 мл направляют в лабораторию ПЦР-диагностики.

Оставшийся в ветеринарной лаборатории исходный материал в виде суспензии ткани хранят в замороженном виде до окончания исследования.

7.5. Для определения видовой принадлежности микобактерий бактериальную массу, полученную при культуральном исследовании, направляют в лабораторию ПЦР-диагностики. При подготовке и отправке культуры в лабораторию ПЦР-диагностики необходимо исключить возможность механической контаминации ее возбудителем туберкулеза и фрагментами его ДНК. При соблюдении таких условий отсутствуют ложноположительные результаты реакции.

Для этого с поверхности яичной среды шпателем снимают 1-3 колонии микобактерий и переносят их в 2-3 одноразовые пробирки для ПЦР вместимостью 0,5-1,5 мл (не менее 2-х поверхностей).

Оставшиеся в ветеринарной лаборатории первичные культуры хранят до окончания исследования.

7.6. Пробы материала или культуры в пробирках для ПЦР, с указанием на них номера животного (экспертизы), направляют с сопроводительным документом в лабораторию ПЦР-диагностики в свежем или замороженном виде.

7.7. Работу проводят в аккредитованной в установленном порядке лаборатории ПЦР-диагностики в соответствии с "Правилами проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции", утвержденными Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 27.01.1997 г., N 13-7-2/840.

В лаборатории ПЦР-диагностики анализ проводят в соответствии с действующими наставлениями по применению тест-систем для обнаружения и дифференциации М. bovis и М. tuberculosis, а также тест-системы дня обнаружения М. avium, утвержденными Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ.

7.8. Заключение по результатам ПЦР

7.8.1. Положительный результат ПЦР свидетельствует о наличии в организме животного ДНК определенного вида возбудителя туберкулеза (M. bovis, М. tuberculosis или М. avium).

7.8.2. Отрицательный результат анализа указывает на отсутствие ДНК возбудителя туберкулеза (М. bovis, М. tuberculosis или M. avium) в исследуемых образцах материала от животных или выделенной культуры.

8. Гистологическое исследование

8.1. Гистологическое исследование проводят для дифференциации патолого-анатомических изменений, типичных для туберкулеза, и сходных изменений, наблюдаемых при других болезнях.

8.2. Присланным для гистологического исследования патологический материал осматривают, подозрительные участки тканей вырезают вместе с прилегающей нормальной тканью и помещают для фиксации в 10%-ный раствор формалина при комнатной температуре на 3-5 суток. Из фиксированного материала вырезают небольшие кусочки, отмывают их в течение 2-3 часов в проточной воде, подвергают целлоидиновой или парафиновой проводке, наклеивают на блоки и готовят срезы толщиной 10-15 микрон. Для ускорения гистологического исследования можно готовить срезы из отмытых от формалина кусочков на замораживающем микротоме. Срезы окрашивают гематоксилин - эозином и при необходимости по Цилю-Нильсену.

В положительных случаях при гистологическом исследовании в тканях находят гранулемы с некротизированным центром, окруженные зоной эпителиоидных, отдельных гигантских и лимфоидных клеток и соединительнотканной капсулой. В специфической капсуле, как правило, формируются дочерние резорбтивные узелки.

8.3. При дифференциальной диагностике следует учитывать гранулемы, образующиеся при актиномикозе, нокардиозе, коринебактериозе, паразитарных поражениях, паратуберкулезе.

В гранулемах микотического происхождения находят в некрозе мицелий гриба, при паразитарных - тело паразита и эозинофильноклеточную пролиферацию в капсуле.

При паратуберкулезе наблюдают в брыжеечных лимфатических узлах и кишечной стенке эпителиоидно-клеточную пролиферацию без образования некрозов.

9. Установление лабораторного диагноза на туберкулез

9.1. Лабораторные исследования на туберкулез проводятся в срок до 6 месяцев.

9.2. Лабораторный диагноз на туберкулез у млекопитающих животных считается установленным в следующих случаях:

- получен положительный результат полимеразной цепной реакции (ПЦР) и из исследуемого материала выделена культура микобактерий туберкулеза бычьего, человеческого или птичьего вида со свойствами, характерными для этих возбудителей болезни;

- получен положительный результат биологического исследования на туберкулез.

9.3. Лабораторный диагноз на туберкулез у птиц считается установленным в следующих случаях:

- при обнаружении микобактерий в мазках из патологического материала при бактериоскопическом исследовании или положительных результатах ПЦР;

- из исследуемого материала выделена культура микобактерий птичьего вида (от попугаев - птичьего или человеческого видов).

9.4. О результатах лабораторного исследования ветеринарные лаборатории обязаны сообщить специалистам хозяйств, руководству предприятий и организаций, приславшим материал, и одновременно главному ветврачу района (города) по местонахождению хозяйства. Ответ дается по утвержденной форме, в нем должны быть подробно и понятно указаны результаты проведенных исследований и конкретное заключение лаборатории о наличии или отсутствии туберкулеза.

С утверждением настоящего Наставления утрачивает силу "Наставление по диагностике туберкулеза животных", утвержденное Главным управлением ветеринарии Государственного агропромышленного комитета СССР 25.02.86 г.