Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции (основные положения) (утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 27 января 1997 г. N 13-7-2/840)

1. Область применения

1.1. Данные Правила предназначены для ветеринарных учреждений, использующих метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в целях диагностики инфекционных болезней.

1.2. Полимеразная цепная реакция является высоко чувствительным специфическим методом.

1.3. Высокая чувствительность ПЦР обуславливает проблему возможной контаминации.

Попадание в реакционную пробирку следовых количеств ДНК или кДНК возбудителя (специфических продуктов амплификации ДНК; ДНК-стандарта, используемой в качестве положительного контроля; ДНК или кДНК возбудителя клинического образца) приводит к амплификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, к появлению ложно-положительных результатов.

1.4. Различают следующие виды контаминации.

1.4.1. Контаминация продуктами амплификации (ампликонов) имеет наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР фрагменты ДНК накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации.

1.4.2. Перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложно-положительных результатов.

1.4.3. Контаминация посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или даже кожи сотрудников лаборатории следовыми количествами ампликонов приводит к появлению систематических ложно-положительных результатов.

Определить источник контаминации, как правило, бывает очень трудно и требует значительных затрат времени и средств.

1.5. В целях предотвращения ложно-положительных результатов при использовании метода ПЦР, кроме обычных требований, предъявляют дополнительные требования к расположению помещений и проведению самих анализов.

2. Требования к помещениям

2.1. Подразделение ПЦР-диагностики должно быть разделено на зоны (комнаты).

2.1.1. Пре-ПЦР-помещение, в котором проводят обработку клинических образцов, выделение ДНК или РНК, приготовление реакционной смеси для обратной транскрипции и ПЦР, постановку ПЦР. Пре-ПЦР-помещение должно быть оборудовано ламинарным боксом.

2.1.2. При наличии условии приготовление реакционной смеси для обратной транскрипции и ПЦР, постановку ПЦР рекомендуется проводить в отдельном помещении или специальных ламинарах.

ГАРАНТ:

Нумерация подпунктов приводится в соответствии с источником

2.1.5. Пост-ПЦР-помещение, где проводят детекцию продуктов амплификации.

2.2. Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) располагают как можно дальше от пре-ПЦР-помещения.

2.3. Необходимо исключить движение воздушного потока из пос-ПЦР и пре-ПЦР-помещение.

2.4. Работа в лаборатории должна быть организована в одном направлении: от пре-ПЦР-помещений к пост-ПЦР-помещению.

В пре- и пост-ПЦР-помещениях лаборатории должны работать разные сотрудники.

2.5. В пре-ПЦР-помещении запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты и т.д.), ПЦР-диагностику которых проводят в данной лаборатории.

2.6. В пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы исследований на инфекционные болезни, диагностика которых осуществляется в данной лаборатории.

2.7. В комнате обработки клинических образцов и в комнате приготовления реакционной смеси должны быть установлены настольные боксы с ультрафиолетовыми лампами или ламинары. 

2.8. Рабочие поверхности, оборудование и материалы облучают ультрафиолетовыми лучами с максимумом излучения в области 260 нм. Облучение проводят в течение 1 ч до начала работы и после ее окончания.

3. Требования к инструментам и организация работы

3.1. При исследовании материала, подозреваемого в заражении возбудителями инфекционных болезней I-II групп патогенности, работу необходимо проводить с соблюдением "Санитарных правил СП 1.2.011-94. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности".

3.2. Каждое помещение ПЦР-диагностической лаборатории должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате должны иметь соответствующую маркировку, выносить их в другие ПЦР-помещения запрещается.

Э.Э.# Каждый сотрудник ПЦР-лаборатории должен иметь персональный набор автоматических пипеток и реагентов.

3.4. Пробирки и наконечники для автоматических пипеток используют однократно. При переходе от одной пробы к другой обязательно меняют наконечники с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК, РКН или при раскапывании реакционной смеси.

3.5. При обработке клинических образцов и внесении выделенной ДНК или РНК в реакционную пробирку используют наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером или наконечники с ватным фильтрами, приготовленными в помещении, в котором не ведутся работы с ДНК.

3.6. Работы в комнате обработки клинических образцов и в комнате приготовления реакционной смеси и постановки ПЦР проводят в перчатках, которые используют однократно.

3.7. Обработку рабочей одежды из пре- и пост-ПЦР-помещений должны проводить раздельно.

3.8. В работе следует использовать суховоздушные термостаты, использование водяных бань запрещено, так как заполняющая их вода может стать источником контаминации.

3.9. Санитарные требования:

- каждое помещение должно иметь отдельный набор инвентаря для обработки и уборки рабочего места (ватно-марлевые тампоны, пинцет, 70%-ный этанол, дезинфицирующий раствор и т.д.) и источники, ультрафиолетового излучения;

- при манипуляции с клиническим материалом рабочую поверхность столов до и после проведения исследований обрабатывают дезинфицирующим раствором, применяемым при данной болезни, затем 70%-ным эталоном;

- в комнате изготовления реакционной смеси рабочую поверхность перед работой обрабатывают 70%-ным эталоном.

3.10. К работе в ПЦР-диагностической лаборатории допускается персонал, прошедший соответствующее обучение.

4. Требования к проведению ПЦР-анализа

4.1. Обработка клинических образцов.

4.1.1. Отбор клинических образцов необходимо проводить только в одноразовые пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение 1 ч хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные.

4.1.2. Клинические образцы хранят отдельно от реагентов.

4.1.3. Работают с клиническими образцами только в одноразовых перчатках.

4.1.4. Используют одноразовые наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером.

4.2. Постановка ПЦР.

4.2.1. Смесь реактивов для ПЦР готовят сразу на все пробы, включая контрольные, и затем раскапывают ее по пробиркам.

4.2.2. Одновременно работают только с одной пробиркой.

4.2.3. При постановке ПЦР обязательно применяют отрицательный и положительный контроли в соответствии с наставлениями по применению диагностических наборов.

4.2.4. Подготовленные к ПЦР исследуемые образцы добавляют в реакционные смеси в последнюю очередь одноразовыми наконечниками с аэрозольным барьером. Использованные наконечники сбрасывают в емкость с 1N-ным раствором HCI.

4.3. Детекция продуктов амплификации.

4.3.1. Анализ продуктов ПЦР проводят в изолированной комнате.

4.3.2. Оборудование, реактивы, халаты, перчатки, а также уборочный инвентарь, используемые в комнате детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение), должны находиться только в этой комнате и не попадать в пре-ПЦР-помещения.

4.3.Э.# В дополнение к общим требованиям в комнате детекции продуктов амплификации необходимо работать в сменной обуви.

4.3.4. Детекцию продуктов амплификации должен проводить сотрудник лаборатории, не занятый обработкой клинических образцов и операциями с реакционной смесью.

4.3.5. Использованные наконечники для автоматических пипеток, разной цепной реакцией, но и другими методами диагностики данной инпробирки и другие загрязненные ДНК материалы обрабатывают реагентами, фекции, вызывающими деградацию ДНК (1 N-ый раствор HCI, 10%-ый раствор гипохлорида натрия 10%-ый раствор хлорной извести).

4.4. Для оценки качества работы ПЦР-диагностической лаборатории периодически применяют внутрилабораторные контрольные положительные и отрицательные образцы, охарактеризованные не только с помощью полимеразной цепной реакции, но и другими методами диагностики данной инфекции.

Правила разработаны Всероссийским государственным научно-исследовательским институтом контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и Всероссийским научно-исследовательским институтом защиты животных.

Начальник отдела ветсанэкспертизы и лабораторной диагностики

Б.И. Антонов

Начальник Департамента ветеринарии

В.М. Авилов