Приложение N 2. Методы фиксации и окраски при гистологическом исследовании

Приложение N 2

Методы фиксации и окраски при гистологическом исследовании

Обычным методом фиксации гистологических объектов, подлежащих гистологическому исследованию, является 10% раствор формалина. Другие методы фиксации (спирт, спирт в смеси с эфиром, спирт-формалин, фиксаторы, в состав которых входят соли хромовой кислоты и др.) рекомендуются для специальных исследований.

В зависимости от целей исследования и характера присланного материала применяются различные методы его обработки в соответствии с общепринятой гистологической техникой: замораживание, заливка в целлоидин, целлоидин-парафин, парафин, желатину и т.д. Для быстрого получения высококачественных гистологических препаратов рекомендуются замораживание и ускоренная заливка в целлоидин.

При исследовании экстренных биопсий, вырезанные кусочки помещают в 10% раствор формалина, который в течение 2-3 минут подогревают не доводя до кипения, затем промывают в воде и готовят срезы на замораживающем микротоме. Замораживанию можно подвергнуть и нефиксированные кусочки ткани.

Все срезы должны быть окрашены гематоксилин-эозином. При необходимости, рекомендуется докраска срезов пикрофуксином по методу Ван Гизона, суданом III, IV и черным, шарлах-ротом. Импрегнацию аргирофильных волокон производят по методу Фута, Тибора-Папа или Гомори. Выявление амилоида, извести, гликогена, окраску в срезах туберкулезных палочек, других микроорганизмов и грибков производя в соответствии с общепринятыми методиками.

Биопсии, взятые при эзофагоскопии, гастроскопии бронхоскопии и цистоскопии рекомендуется обрабатывать методом ускоренной заливки в парафин. Очень мелкие пленчатые кусочки, с целью предотвращения их сморщивания, рекомендуется перед заливкой натягивать на кусочки свежей печени или яблока, что дает возможность получить ровный срез.

В последнее время большое диагностическое значение приобрело прижизненное морфологическое исследование ткани ряда паренхиматозных органов - печени, почек, селезенки, полученной посредством пункционной, аспирационной и трепанобиопсии.

Полученные таким путем, обычно очень мелкие кусочки ткани рекомендуется обрабатывать следующим методом:

1) поместить кусочки на марлю и зафиксировать в смечи, состоящей из 10 частей формалина и 9 частей 90 спирта. Время, фиксации кусочка зависит от его величины - от 3-4 часов до суток.

2) Поместить кусочки на несколько часов в касторовое масло.

3) Выдержать 30-40 минут в двух порциях хлороформа

4) Поместить на полтора часа в смесь хлороформа - парафином.

5) 30 минут-1 час в парафине

Кроме обычных гистологических методик рекомендуется использовать гистохимические методики

Материал для гистологического исследование костного мозга может быть получен методом пункционной биопсии грудины или трепанобиопсии подвздошной кости. Исследование этого материала рекомендуется проводить, по методике разработанной в патологоанатомической лаборатории ЦОЛИПК.

I. Пункционные биопсии - крупинки костного мозга содержащиеся в аспирированном при пункции материале.

1) Фиксация в жидкости Карнуа - 20-30 минут.

2) Абсолютный спирт 3-5 минут (сменяется дважды).

3) Хлороформ 3-5 минут (сменяется дважды).

Примечание: фиксация и смена указанных жидкостей производится в первоначально взятом флаконе путем смены растворов (во избежание возможного нарушения структуры костного мозга при сдавливании браншами пинцета) в условиях комнатного холодильника при температуре +4-6°С.

4) Парафин-хлороформ (в равных частях) 5-6 минут. В данной смеси объект находится в термостате при 37° или 56° в зависимости от температуры плавления парафина.

5) I - парафин 3-5 минут в термостате при 56°.

6) II - парафин 3-4 минуты в термостате при 56°.

Примечание: Из мерного парафина во второй парафин и на часовое стекло кусочек костного мозга переносится при помощи глазного пинцета, слегка разогретого над пламенем спиртовки.

7) Заливка в парафин производится на часовом стекле, предварительно смазанном вазелиновым маслом.

8) Приготовление срезов (толщина срезов 5 микрон).

9) Депарафинирование.

10) Окраска срезов гематоксилин-эозином. С целью дифференциации клеточных элементов костного мозга используется окраска азур-эозином и по методу Доминичи-Кедровского; для изучения состояния соединительной ткани рекомендуется окраска азокармином но методу Гайденгайна и по методу Ван Гизона. Аргирофильные волокна выявляются по методу Тибора-Папа, Фута или Гомори. Кроме того рекомендуется выявление железосодержащих пигментов по методу Перлса, гистохимические методики: ШИК-реакция, реакция Браше и прочие.

II. Трепанобиопсии.

1) Фиксация в жидкости Карнуа, 10-12% растворе нейтрального формалина, спирте, Цинкср-Формоле и др. Длительность фиксации в жидкости Карнуа 1,5 часа.

2) Абсолютный спирт 30 минут (сменяется дважды).

3) Декальцинация может осуществляться различными методами с применением азотной; трихлоруксусной, муравьиной кислот и др. Рекомендуется действенная и щадящая ткани декальцинация-смесь де Кастро:

состав	-	хлоралгидрат - 50 г
		абсолютный спирт - 300 мл
		концентрированная азотная кислота - 80 мл
		дистиллированная вода - 620 мл

Длительность декальцинации - 1 сутки.

4) Заливка в парафин, целлоидин-парафин и целлоидин.

При заливке в парафин используются спирты восходящей концентрации:

70° - 30 минут (сменяется дважды)

80°- 30 минут (сменяется дважды)

96°-30 минут (сменяется дважды)

абсолютный спирт - 30 минут (сменяется дважды)

хлороформ - 8 минут

парафин-хлороформ-8 минут в термостате при 37° или 56°.

парафин II - 10 минут

5) Заливка в парафин на часовом стекле, предварительно смазанном вазелиновым маслом.

6) Приготовление срезов - толщина срезов 3-5 микрон

7) Депарафинирование.

8) Окраска срезов теми же методами как и при пункционных биопсиях.

Примечание: Фиксация, декальцинация и проводка через спирт в пунктах 1, 2 и 3 осуществляется в комнатном холодильнике. Во избежание повреждения ткани костного мозга все операции до помещен и в парафин-хлороформ производятся в первоначально взятой посуде.