Приложение 1. Метод определения пригодности пробы готового продукта для микробиологического анализа с использованием биолюминесценции АТФ (Sample Effect Method)

Приложение 1

Метод определения пригодности пробы готового продукта для микробиологического анализа с использованием биолюминесценции АТФ (Sample Effect Method)

Эта методика может использоваться для подтверждения пригодности готовых продуктов для микробиологического анализа с использованием систем биолюминесценции АТФ и для определения степени разведения, при которой следует проводить анализ проб. Методика также может применяться для определения пригодности сырья для проведения микробиологического анализа с использованием систем биолюминесценции АТФ.

Не все виды сырья и готовых продуктов пригодны для тестирования с использованием биолюминесценции АТФ; в некоторых может содержаться повышенное количество природного АТФ (т.е. в продуктах, содержащих натуральные экстракты, например, алоэ вера), что может привести к получению "ложно-положительных" результатов. Другие материалы, такие как сложные полимеры, могут ингибировать реакцию биолюминесценции в системе АТФ, что может привести к получению "ложно-отрицательных" результатов. Поэтому важно знать, является ли сырье или продукт пригодным для тестирования с помощью микробиологического анализа с использованием систем биолюминесценции АТФ, а также знать необходимую степень разведения.

1. Принцип

Выбранная проба приготавливается в соответствующей нейтрализующей среде при разведении 1:10; затем приготавливаются два следующих разведения (1:100 и 1:1 000). Двойные аликвоты (100 мкл) всех разведений помещают в кюветы люминометра +10 мкл стандарта АТФ. Затем проводят измерения всех проб и соответствующих контролей на люминометре с использованием стандартного набора Uni 1+; полученные результаты сравнивают с контролями, используя таблицу Microsoft excel, которая автоматически определяет возможность проведения тестирования АТФ для каждого разведения индивидуальных проб.

2. Реакции

Высвобождающий АТФ агент (LuminEX) вводится в каждую пробу и облегчает экстракцию АТФ из клеток. Количество имеющегося АТФ затем измеряется с использованием каталитической реакции, запускаемой комплексом люциферин/люцифераза (LuminATE). Сила света, излучаемого в каждой пробе, выражается в относительных единицах силы света (RLU) и используется для определения наличия/отсутствия бактериального загрязнения пробы.

3. Приготовление проб

3.1. Перед взятием проб тщательно перемешайте тестируемый материал (готовый продукт или сырье), а перед взятием проб зубной пасты первую порцию продукта, выдавленную из тюбика, выбросьте.

3.1.1. Соблюдая стерильность, взвесьте 1,0 г ( г) пробы и поместите в стерильный контейнер.

3.1.2. Соблюдая стерильность, добавьте к пробе 9 мл нейтрализующего бульона и тщательно перемешайте; это будет разведение 1:10 или -1. Приготовьте последовательные разведения следующим образом: соблюдая стерильность, перенесите 1 мл разведения -1 в 9 мл нейтрализующего бульона, это будет разведение 1:100 или -2, тщательно перемешайте и, соблюдая стерильность, перенесите 1 мл разведения -2 в 9 мл нейтрализующего бульона, это будет разведение 1:1 000 или -3.

3.1.3. Укажите на каждом контейнере необходимые сведения о пробе.

3.2. Подготовка люминометра к работе.

3.2.1. Люминометр следует подготовить к работе в соответствии со специальными инструкциями производителя. Каждый инжектор люминометра, который предполагается использовать при тестировании, следует вымыть и ополоснуть с помощью набора для ежедневного мытья и ополаскивания компании-производителя люминометра перед заправкой реактивами из набора Uni 1+.

3.2.2. После начальной заправки реактивами следует провести измерения для получения серии "ежедневных контролей" (т.е. значений для пустых кювет, чистого реактива и АТФ-контроля), чтобы убедиться в нормальной работе люминометра и реактивов. После того как эти проверки будут проведены, и оператор убедится, что все системы работают нормально, можно проводить анализ проб.

3.2.3. Для каждой тестируемой пробы необходимо в сумме 12 кювет, как указано ниже:

2 х 100 мкл 1:10 (-1) разведение пробы в бульоне

2 х 100 мкл 1:10 (-1) разведение пробы в бульоне + 10 мкл АТФ

2 х 100 мкл 1:100 (-2) разведение пробы в бульоне

2 х 100 мкл 1:100 (-2) разведение пробы в бульоне + 10 мкл АТФ

2 х 100 мкл 1:1000 (-3) разведение пробы в бульоне

2 х 100 мкл 1:1000 (-3) разведение пробы в бульоне + 10 мкл АТФ

Кроме того, для каждого измерения необходимо:

2 х 100 мкл контроля для бульона

2 х 100 мкл контроля для бульона + 10 мкл АТФ

1 х 50 мкл стандарта АТФ

1 положительный контроль

NB: Для каждой пробы следует использовать чистые и стерильные наконечники пипеток. Рекомендуется располагать кюветы в соответствующем держателе в логическом порядке (рис. 1).

4. Расчеты и представление результатов

4.1. Вычисление результатов

При каждом анализе, проводимом с помощью люминометра, следует записывать следующие значения (в относительных единицах силы света - RLU):

- среднее значение для контрольного бульона;

- два результата для контрольного бульона + АТФ;

- два значения для каждой пробы в бульоне;

- два значения для каждой пробы в бульоне + АТФ.

Например, при условии, что пробы 1 и 2 тестировались в люминометре одновременно, средние значения для контрольного бульона и значения для контрольного бульона + АТФ одинаковы, получаем результаты, приведенные в табл. 1.

Таблица 1

Среднее значение для контрольного бульона: 312 Бульон + АТФ : 311310289205 Проба 1: 1:10 3941 1:10 + АТФ 6438 1:100 196188 1:100 + АТФ 183525189788 1:1000 316294 1:1000 + АТФ 325553276517

Проба 2: 1:10 266264 1:10 + АТФ 292550275292 1:100 349314 1:100 + АТФ 266468252126 1:1000 346334 1:1000 + АТФ 319980305035

4.2. Обработка данных

Для получения результатов исследования пробы, полученные первичные данные следует ввести в специально подготовленную таблицу MS Excel. Эта таблица состоит из трех отдельных листов, каждый из которых предназначен для одного разведения, т.е. 1:10 (-1), 1:100 (-2) или 1:1 000 (-3), и обработки данных для одной пробы (продукта или сырья).

При необходимости тестирования нескольких проб следует заполнять новую таблицу для каждой пробы.

4.2.1. Ввод сведений.

Используя таблицу, следует ввести все сведения в предназначенные для них ячейки (рис. 2).

Необходимо заполнить как можно больше сведений, чтобы было ясно, что тестировалось, когда и с использованием каких реактивов/приборов.

4.2.2. Ввод данных.

4.2.2.1. Данные о бульоне.

Нужно ввести все необходимые результаты для проб с разбавлением 1:10 в соответствующие ячейки таблицы (рис. 3).

Средние и пороговые значения вычисляются автоматически благодаря заведенным в ячейки формулам, и эти значения будут одинаковы для каждого листа. Эти данные должны быть скопированы в соответствующие места других рабочих листов; если это не произойдет автоматически, то необходимо ввести данные вручную.

NB: Если разность значений составляет >20% среднего значения, то полученное число будет красного цвета. Эту часть теста следует повторить.

4.2.2.2. Данные о пробе.

Необходимо ввести все остальные необходимые сведения/результаты, касающиеся пробы, в соответствующие ячейки таблицы (см. рис. 4, приведенный ниже). Следует повторить эту операцию для каждого разведения пробы, т.е. 1:10 (-1), 1:100 (-2) и 1:1 000 (-3).

NB: Если разность значений составляет >20% среднего значения, то полученное число будет красного цвета.

5. Исходные и конечные данные

5.1. Содержит ли проба АТФ небактериального происхождения?

Данные, введенные в таблицу, изменяют ячейки, содержащие уравнения (рис. 5).

Значение, помеченное знаком i на приведенном выше рис. 5, - это концентрация АТФ в контрольном бульоне (пМ), а значение, помеченное знаком ii, - это концентрация АТФ в пробе, находящейся в контрольном бульоне.

При проведении этого теста предполагается, что проба не загрязнена, поэтому любая разница между i и ii приписывается концентрации АТФ, содержащегося в пробе.

Если значение ii значительно больше значения i (т.е. >1.4х), и обнаружено, что проба не ингибирует реакцию биолюминесценции (см. раздел 5.2), то предполагается, что АТФ небактериального происхождения составляет значительную часть АТФ (и значит, загрязнение отсутствует), и поэтому проба не пригодна для проведения тестирования АТФ.

Ячейка, содержащая значение, помеченное знаком ii, автоматически изменяет цвет, указывая, не содержит ли проба слишком большое количество натурального АТФ.

5.2. Ингибирует ли проба реакцию биолюминесценции?

Наличие АТФ определяется по свету, испускаемому при гидролизе АТФ до АМФ, который отдает энергию в виде зеленого света (ферментом, катализирующим эту реакцию, является люцифераза). Некоторые пробы могут изменять эту реакцию или эмиссию света в результате этой реакции.

В конечной части рабочего листа определяется, оказывает ли проба какое-либо влияние на реакцию биолюминесценции. Это определяется по способности пробы в бульоне испускать свет в результате гидролиза АТФ, выраженной в процентах к аналогичной способности самого бульона.

Желаемый результат должен быть как можно более близким к 100%. Падение ниже 100% означает, что сырье/продукт каким-то образом тормозит реакцию, и света излучается меньше, чем в чистом бульоне.

Эго может препятствовать определению загрязнения при обычном тестировании АТФ.

Если полученное значение превышает 100%, это означает, что проба усиливает испускание света. Слишком большое усиление может привести к ложным положительным результатам при обычном тестировании АТФ.

Практически невозможно найти материал, для которого бы значение составляло 100%. В большинстве случаев получается значение больше или меньше 100%. Поэтому была создана шкала диапазонов процентных значений, используя которую можно определить, оказывает ли проба значительное влияние.

Значения рассчитываются с помощью табл. 2 и появляются в окрашенной ячейке. Цвет ячейки зависит от процентного значения (табл. 2).

Таблица 2

5.3. Интерпретация результатов

После введения всех данных тестирования в таблицу результаты для трех разведений отображаются в нижней части таблицы (рис. 6).

Эта сводная таблица (рис. 6) составлена для того, чтобы пользователь быстро определил наилучшие условия тестирования, как представлено ниже в таблице 3.

Таблица 3

Чем ближе это значение к 100%, тем меньше проба влияет на течение реакции биолюминесценции.

Если результат на этом этапе окрашен в желтый цвет, то его приемлемость или неприемлемость определяется микробиологом, являющимся специалистом по методике определения АТФ. Однако в общем случае, если приемлемость результата является неопределенной (т.е. цвет желтый), а результат определения концентрации АТФ для пробы в бульоне окрашен в зеленый цвет, то проба считается приемлемой.

Если ни одна из концентраций (1:10, 1:100 или 1:100) не дает приемлемого значения, и/или концентрация АТФ для пробы в бульоне является высокой, то проба не пригодна для тестирования с использованием метода определения АТФ. Для такой пробы следует применять классический метод определения общего количества жизнеспособных микроорганизмов.

6. Удаление отходов

Сбор, обезвреживание, хранение и уничтожение (утилизация) должны осуществляться способами, безопасными для здоровья и среды обитания в соответствии с требованиями законодательства Российской Федерации в области обращения с отходами производства и потребления. Вывоз отходов осуществляется специализированными организациями, имеющими лицензию на данный вид деятельности.

7. Безопасность

Во всех живых клетках имеется АТФ, поэтому очень важно, чтобы все операторы принимали меры предосторожности для защиты от загрязнения проб из внешних источников АТФ. Для получения правильных результатов при использовании этих методик необходимо проводить микробиологические тренинги, особенно тренинги по методикам обеспечения стерильности. При проведении тестов, описанных в этом документе, необходимо соблюдать правила общей безопасности. При работе согласно описанным методикам следует использовать медицинский халат, защитные очки и перчатки. До и после работы согласно методикам рабочее место следует дезинфицировать, а, покидая рабочее место, следует тщательно вымыть руки.