Методические рекомендации МР 4.2.0015-10 "Микробиологический анализ парфюмерно-косметической продукции экспресс-методом биолюминесценции" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 1 декабря 2010 г.)

Методические рекомендации МР 4.2.0015-10
"Микробиологический анализ парфюмерно-косметической продукции экспресс-методом биолюминесценции"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 1 декабря 2010 г.)

Дата введения: с момента утверждения
Введены впервые

I. Область применения

1.1. Методические рекомендации могут использоваться при проведении исследований микробиологической загрязненности парфюмерно-косметической продукции с помощью альтернативного автоматизированного экспресс-метода биолюминесценции.

1.2. Методические рекомендации предназначены для специалистов аккредитованных бактериологических лабораторий и могут быть использованы в органах и организациях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, промышленных, испытательных лабораториях, а также иных организациях, занимающихся вопросами оценки безопасности парфюмерно-косметической продукции.

1.3. Методические рекомендации адаптированы к условиям работы лабораторий, осуществляющих контроль качества и безопасности парфюмерно-косметической продукции.

II. Общие положения

2.1. Классические методы микробиологических исследований парфюмерно-косметической продукции, используемые в практике бактериологических лабораторий, требуют больших затрат труда и времени, достаточно длительны и позволяют получать результаты в течение нескольких дней.

Предлагаемый ускоренный метод с использованием люминометра заключается в определении АТФ, синтезируемой микроорганизмами и определяемой по интенсивности возникающего свечения в ходе ферментативной реакции, позволяет получать быстрые (в течение нескольких часов) и надежные результаты для большого числа одновременно исследуемых образцов.

2.2. Биолюминесцентный метод определения АТФ является качественным методом определения микробиологической загрязненности парфюмерно-косметической продукции и может быть также использован для исследования некоторых видов сырья.

В настоящих методических рекомендациях представлено описание процедуры микробиологического анализа парфюмерно-косметической продукции экспресс-методом биолюминесценции с использованием люминометра Advance Coupe (Celsis International, Нидерланды).

2.3. Работы по подготовке реагентов, образцов продукции, проведению исследования на приборе, а также интерпретации результатов должны выполняться квалифицированными сотрудниками.

2.4. Технология использования метода.

Подготовленные образцы продукции в стерильном нейтрализующем летиновом бульоне (Letheen broth) инкубируются в течение 18 или 24 часов (в зависимости от типа продукта) и исследуются на приборе Люминометр Advance Coupe с использованием стандартной АТФ и набора реагентов UNI-1 + kit. По окончании анализа компьютерная программа выдает краткое описание полученных результатов, выраженных в относительных единицах света (RLU - RELATIVE LIGHT UNITS).

III. Метод отбора и подготовки проб для микробиологического анализа

3.1. Отбор проб

3.1.1. При отборе проб следует руководствоваться требованиями ГОСТ 29188.0-91 "Парфюмерно-косметические изделия. Правила приемки, отбор проб, методы органолептических испытаний" и ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических анализов".

3.1.2. Пробы парфюмерно-косметических изделий для микробиологического анализа отбирают до отбора проб для физико-химических, органолептических и других видов испытаний с соблюдением правил асептики, для того чтобы исключить вторичное микробное загрязнение продукта.

3.2. Подготовка проб к анализу

3.2.1. Подготовка проб для определения микробиологической чистоты

3.2.1.1. Перед вскрытием упаковки образец тщательно перемешивают, вращая или переворачивая его несколько раз. Место соединения крышки с тарой обрабатывают 70%-м раствором этилового спирта. Первую порцию (примерно 10%) содержимого упаковки отбрасывают, затем перемешивают стерильной петлей и отбирают пробу.

3.2.1.2. Используя стерильные приемы, отвешивают требуемое количество продукта в стерильный пластиковый контейнер и добавляют стерильный нейтрализующий летиновый бульон (п. 5.1.1), чтобы инактивировать действие консерванта в продукте.

Летиновый бульон рекомендуется как стандартная, обеспечивающая соответствующий начальный уровень АТФ, нейтрализующая среда для широкого спектра консервантов и определения различных видов заражения.

Количество продукта, необходимое для приготовления пробы, определяется заранее по методике "Метод определения пригодности пробы" (Sample Effect Method) согласно прилож. 1 к настоящим методическим рекомендациям.

Соотношение продукта и питательного летинового бульона должно сохраняться равным 1:99.

В качестве наилучшей практики рекомендуется 1 г продукта поместить в 99 мл бульона. Однако не все лаборатории располагают необходимыми возможностями и площадью для таких размеров испытуемого образца. В таких случаях допускается уменьшать количество продукта до 0,1 г и помещать его в 9,9 мл бульона, сохраняя неизменным соотношение 1:99.

3.2.1.3. В асептических условиях (желательно в ламинарном боксе) добавить в пластиковый контейнер с отвешенным продуктом летиновый бульон и тщательно закрыть крышку контейнера. Перемешать на вихревом миксере, убедившись, что продукт полностью диспергирован в бульоне. Таким образом, получается разведение или 1:100.

3.2.1.4. Слегка ослабить крышку контейнера (на пол-оборота) и поместить его в шейкер-инкубатор на 24 часа при температуре . Рекомендуемая скорость вращения образцов в шейкер-инкубаторе 150-200 об./мин для полной уверенности, что продукт в течение всего времени остается полностью диспергированным в бульоне, не оседает на дно контейнера и не переливается через его край.

3.2.1.5. Определение собственной антимикробной активности парфюмерно-косметической продукции проводят в соответствии с МУК 4.2.801-99 "Методы микробиологического контроля парфюмерно-косметической продукции".

3.2.2. Подготовка отрицательного и положительного контроля

3.2.2.1. Отрицательный контроль используется в каждом тесте для определения уровня RLU, по сравнению с которым будут оцениваться пробы продукта. Летиновый бульон содержит небольшое количество АТФ и обеспечивает соответствующий начальный уровень АТФ.

В асептических условиях поместить в пластиковый стерильный контейнер 99 мл (либо 9,9 мл) летинового бульона. Для контроля следует использовать летиновый бульон той же партии, что и в подготовке тестируемых проб. В случае если при подготовке проб продукта использован бульон нескольких партий, следует подготовить контрольные образцы бульона из каждой партии. Инкубировать вместе с подготовленными пробами продукта в шейкер-инкубаторе.

3.2.2.2. Положительный контроль.

В асептических условиях поместить в пластиковый стерильный контейнер 99 мл (либо 9,9 мл) летинового бульона. С помощью стерильной пластиковой петли переместить криобусину, нагруженную свежей культурой (18-24 часов) Staphylococcus epidermidis, в летиновый бульон (п. 5.6). Для продуктов с pH < 5 используется криобусина, нагруженная свежей культурой Saccharomyces cerevisiae (п. 5.6).

Перемешать на вихревом миксере, убедившись, что культура полностью диспергирована в бульоне. Инкубировать вместе с подготовленными пробами продукта в шейкер-инкубаторе.

3.2.3. Дополнительное разведение образцов

3.2.3.1. После 24-часового инкубирования проб продукции вынуть образцы из шейкер-инкубатора и перемешать на вихревом миксере в течение 10-15 секунд каждый.

Подготовить следующее десятикратное разведение каждого образца в стерильной дистиллированной воде. Для этого 1 мл образца поместить в заранее подготовленный стерильный пластиковый контейнер, содержащий 9 мл стерильной дистиллированной воды, и тщательно перемешать на вихревом миксере. Полученное разведение - или (1:1 000).

Если на стадии определения количества продукта "Методом определения пригодности пробы" выявлено, что для данного продукта наиболее эффективно использовать разведение (1:100), то дополнительное разведение не требуется.

3.2.3.2. Если установлено, что пробы продукта тестируются в разведении 1:1 000, то и используемые для отрицательного контроля образцы стерильного летинового бульона, а также образец положительного контроля культуры Staphylococcus epidermidis после инкубирования должны быть разведены 1:10 в стерильной дистиллированной воде по п. 3.2.3.1.

3.2.3.3. Полученные разведения используют для тестирования на приборе. Время с момента окончания подготовки пробы до начала тестирования не должно превышать 30 мин.

IV. Метод анализа

При работе люминометра в процессе инжекции реагентов, АТФ - высвобождающий реагент (Lumex EX), поступающий в каждый образец продукта, способствует экстракции АТФ из клеток микроорганизмов, находящихся в пробе продукта. Количество присутствующей в пробе АТФ измеряется по количеству света в ходе каталитической реакции с комплексом люциферин/люцифераза (LUMEN АТЕ), оценивается в относительных единицах света (RLU) и используется для заключения о присутствии или отсутствии микробиологического заражения продукта.

4.1. Подготовка кювет для люминометра

4.1.1. По 100 мкл (0,001 мл) исследуемого материала из разведений, приготовленных по п. 3.2.3.1 поместить на дно индивидуальной кюветы для люминометра. Убедиться в отсутствии материала на стенках кюветы.

4.1.2. Подготовить все пробы продуктов, а также контрольные образцы (два отрицательных и один положительный) по п. 4.1.1.

4.1.3. Поместить в индивидуальную кювету 100 мкл (0,001 мл) стандартного АТФ (ATP standard), поставляемого в наборе реагентов UNI 1 + kit (п. 5.2.1).

4.2. Проведение анализа на люминометре

После начальной заправки реактивами следует провести измерения для получения серии "ежедневных контролей" (т.е. значений для пустых кювет, чистого реактива и АТФ-контроля), чтобы убедиться в нормальной работе люминометра и реактивов. После того как эти проверки будут проведены, и оператор убедится, что все системы работают нормально, можно проводить анализ проб.

4.2.1. Загрузить кюветы в люминометр в порядке, указанном в Руководстве по работе с прибором.

4.2.2. Работа люминометра и инжекция реагентов Lumex EX и LUMEN АТЕ (п. 5.2.1) в присутствии которых протекает каталитическая реакция биолюминесценции, происходит в автоматическом режиме, управляемом компьютерной программой.

4.2.3. Количество света на выходе каждого образца измеряется и оценивается по отношению к контрольным стерильным бульонам.

Образцы, показания которых RLU не превышают среднее показание контрольных стерильных нейтрализующих бульонов более чем в 1,4 раза, считаются соответствующими стандарту микробиологического качества (PASS). Все неудачные образцы отмечаются в списке с положительным результатом (Positive) и должны быть исследованы повторно.

4.3. Обработка результатов

4.3.1. Отрицательные результаты.

Образец, который по результатам проведенного теста на люминометре оценивается как PASS, указывает, что продукт отвечает микробиологической чистоте (<300 КОЕ/г) и может быть выпущен на реализацию.

4.3.2. Положительные результаты.

Образец, который по результатам проведенного теста на люминометре оценивается как (Positive), указывает, что продукт может быть заражен микроорганизмами и, необходимо провести дополнительное повторное испытание этого продукта на люминометре и классическим методом в соответствии МУК 4.2.801-99 "Методы микробиологического контроля парфюмерно-косметической продукции".

4.3.3. Оценка положительных результатов.

Положительные результаты теста указывают, что продукт может быть заражен, так как результат RLU образца превышает в 1,4 раза результат стерильного летинового бульона. В этом случае следует немедленно перепроверить этот продукт двойным количеством образцов.

Если по результатам "Метода определения пригодности пробы" продукт тестируется в разведении , то должны быть приготовлены свежие разведения в стерильной дистиллированной воде из образца продукта, инкубированного в течение 24-х часов.

В случае если результаты RLU двух свежеприготовленных образцов отрицательные, не превышают в 1,4 раза результат стерильного летинового бульона и выражаются как PASS, то продукт может выпущен на реализацию.

В случае если один или оба свежеприготовленных образца показывают положительный результат, т.е. превышают в 1,4 раза результат стерильного летинового бульона и выражаются как (Positive), должны быть срочно приняты меры в соответствии с установленными в организации требованиями в области качества.

4.4. Диаграмма испытания образцов при получении положительных результатов

V. Аппаратура, реагенты, питательные среды, расходные материалы

5.1. Питательные среды

5.1.1. Летиновый бульон (Letheen Broth), используется для продуктов с любым pH. Состав летинового бульона: белковый пептон - 10,0 г; мясопептонный агар - 5,0 г; лецитин - 0,7 г; полисорбат 80 (Твин-80) - 5,0 г; натрия хлорид - 5,0 г, pH -

5.1.2. Жидкая среда Сабуро (Sabouraud Liquid Medium) для продуктов с низким pH (<5).

5.1.3. Триптонсоя бульон (TryptoneSoya Broth).

5.2. Реагенты

5.2.1. Набор реагентов UNI-1 + kit на 1 000 тестов.

Хранение при температуре 0-4°С.

Каждый набор включает: 6 фл. х 18,8 биолюминесцентного реагента (Lumine EX)

6 фл. х АТФ высвобождающего реагента (Lumine АТЕ)

6 фл. х 12 мл восстанавливающего буфера (Lumen ATE buffer)

1 фл. х АТФ стандарт (ATP standards)

1 фл. х 15 мл АТФ буфер (ATP buffers)

5.2.2. Набор реагентов Daily Wash & Rinse kit для ежедневной промывки и ополаскивания люминометра.

Каждый набор включает: 14 фл. х Раствор для промывки инжекторов

14 фл. х Раствор для ополаскивания инжекторов

5.2.3. Набор реагентов Monthly Maintenance & Cleaning kit для ежемесячного ухода и очистки люминометра.

Каждый набор включает:

6 фл. х 12 мл реагент 1 (Reagent 1) - водный раствор для очистки инжекторов

6 фл. х 22 мл реагент 2 (Reagent 2) - водный раствор для дезинфекции инжекторов

6 фл. х 22 мл реагент 3 (Reagent 3) - водный раствор для промывки инжекторов.

5.3. Приборы

5.3.1. Люминометр.

5.3.2. Компьютер с операционной системой Windows ХР.

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

5.3.2. Весы электронные по 1 классу точности, дискретность отсчета 0,001 г.

5.3.3. Шейкер инкубатор 28°С, 150-200 об./мин.

5.3.4. Автоклав.

5.3.5. Вихревой миксер.

5.3.6. Автоматический дозатор 100 мкл (0,1 мл).

5.3.7. Криоблок PL 155, металлический штатив для хранения криовиал, нагруженных культурой микроорганизмов в замороженном состоянии.

5.4. Расходные материалы

5.4.1. Контейнеры пластиковые стерильные одноразовые с завинчивающейся крышкой 30 или 150 мл.

5.4.2. Пипетки пластиковые стерильные одноразовые в индивидуальной упаковке 1 и 10 мл.

5.4.3. Петли пластиковые стерильные одноразовые 1 мкл.

5.4.4. Наконечники для дозатора Fintip стерильные, упаковка: 10 штативов по 96 штук.

5.4.5. Кюветы для люминометра пластиковые Advance Cuvettes.

5.4.6. Microbank PL 160 - набор криовиал с цветными бусинами для хранения культуры Staphyloccocus epidermidis и Saccharomyces cerevisiae.

5.4.7. Петли CULTI-LOOPS, нагруженные лиофилизированной культурой St. epidermidis и Saccharomyces cerevisiae.

5.5. Приготовление стерильного нейтрализующего бульона и стерильной дистиллированной воды

5.5.1. Приготовление стерильного нейтрализующего бульона

5.5.1.1. Отвесить дегидратированную сухую среду, как указано в инструкции производителя.

5.5.1.2. Тщательно перемешать с требуемым количеством дистиллированной воды.

5.5.1.3. Нагревать до полного растворения порошка в воде.

5.5.1.4. Как только порошок полностью растворится, снять с плитки и остудить. Разлить в стерильные колбы с завинчивающейся крышкой.

5.5.1.5. Маркировать колбы, указав название бульона, дату приготовления и срок годности.

5.5.1.6. Автоклавировать в течение 15 минут при температуре 121°С. При каждом цикле стерилизации проводить контроль температуры и времени с помощью индикаторов стерилизации (полосок или химических).

5.5.1.7. Стерильный бульон может храниться при комнатной температуре в сухом месте в течение 3-х месяцев. По истечении этого срока остатки бульона следует утилизировать.

5.5.2. Подготовка стерильной дистиллированной воды

5.5.2.1. Стерильные колбы с дистиллированной водой (250 мл) маркировать, указав дату стерилизации, и поместить в автоклав для стерилизации в течение 15 минут при температуре 121°С. При каждом цикле стерилизации проводить контроль температуры и времени с помощью индикаторов стерилизации (полосок или химических).

5.5.2.2. Стерильная дистиллированная вода может храниться при комнатной температуре в сухом месте в течение 3-х месяцев. По истечении этого срока остатки воды следует утилизировать.

5.6. Подготовка криобусины для положительного контроля

5.6.1. Для подготовки свежей культуры (18-24 ч) Staphylococcus epidermidis или Saccharomyces cerevisiae используются петли CULTI-LOOPS (п. 5.4.7), нагруженные стабилизированными жизнеспособными микроорганизмами.

К работе с использованием петель должен допускаться обученный в соответствии с инструкцией поставщика персонал.

Удалив упаковку и наконечник с петли, поместить ее в пробирку с жидкой средой, используя для этой цели:

а) триптонсоя бульон (TryptoneSoya Broth) (п. 5.1.3) для петель, нагруженных культурой Staphylococcus epidermidis;

б) стерильный солевой раствор для петель, нагруженных культурой Saccharomyces cerevisiae.

Культуры Staphylococcus epidermidis и Saccharomyces cerevisiae выращивают в жидкой среде в условиях инкубирования при температуре 37°С до полного растворения пленки, покрывающей петлю, и образования взвеси микроорганизмов.

Используя стерильную пастеровскую петлю, пересевают культуру по поверхности хорошо подсушенной среды штрихами для получения изолированных колоний.

Инкубируют чашки с посевами при 30°С в течение 24-48 часов.

5.6.2. Для хранения чистой культуры Staphylococcus epidermidis или Saccharomyces cerevisiae используются криовиалы, содержащие 25 цветных бусин, и криоконсервант (п. 5.4.6). Бусины имеют пористую структуру, что позволяет микроорганизмам задерживаться на их поверхности.

5.6.3. В стерильных условиях изолированные колонии микроорганизмов с чашки Петри (п. 5.6.1) пересевают в криовиалу с криоконсервантом до достижения 3-4 McFarland стандарта.

Тщательно завинчивают крышку криовиалы и вращают ее 4-5 раз для распределения культуры микроорганизмов. Избыточное количество криоконсерванта удаляют из криовиалы.

Плотно закрытую криовиалу с культурой устанавливают в криоблок (п. 5.3.7) и хранят при температуре не выше -32°С в морозильной камере.

5.6.4. Перед подготовкой положительного контроля (п. 3.2.2.2) криовиалу с культурой микроорганизмов выдерживают несколько минут при комнатной температуре, оставляя криоблок в морозильной камере. После перемещения одной бусины из криовиалы в контейнер с летиновым бульоном, криовиалу устанавливают в криоблок и хранят для последующих тестов.

Библиографические данные

1. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

2. СанПиН 1.2.681-97 "Гигиенические требования к производству и безопасности парфюмерно-косметической продукции".

3. МУК 4.2.801-99 "Методы микробиологического контроля парфюмерно-косметической продукции".

4. ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических анализов".

5. ГОСТ 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов".

6. ГОСТ 10444.1-84 "Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе".

7. Ефременко Е.Н., Азизов Р.Э., Махлис Т.А., Аббасов В.М., Варфоломеев С.Д. Определение биолюминесцентным методом минимальных ингибирующих концентраций веществ по отношению к бактериям, участвующим в биокоррозии. М.: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Химический факультет, 2005. 119992.

8. Сведения о приборах, расходных материалах, средах на сайтах в интернете:

http://www.lumtek.ru/bioluminescence/

http://lux.ibp.ru/applications/biotests.htm

http://www.celsis.com

http://www.bd.com

http://www.fisherscientific.com

http://www.oxoid.com

http://www.sarstedt.com

9. Сеземин И.А. Применение экспресс-метода АТФ люминометрии при санитарно-гигиенических исследованиях в пищевой промышленности//Пищевая промышленность. 2007. N 3.

10. Константинова С. Люцифераза помогает считать бактерии. ИР 12(684), 2006.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко