Приложение 2. Паразитологические методы лабораторной диагностики гельминтозов и протозоозов

Приложение 2

Паразитологические методы лабораторной диагностики гельминтозов и протозоозов

Отбор проб и доставка кала в паразитологическую или клинико-диагностическую лабораторию

1. Кал после дефекации отбирают из разных участков в количестве не менее 50 г (объем около столовой ложки).

2. Помещают в чистую сухую, стеклянную или пластиковую посуду с крышкой.

3. Кал для обнаружения личинок стронгилоидеса, карликового цепня должен быть исследован в день дефекации, поэтому доставляется утренний кал.

4. С целью обнаружения вегетативных форм лямблий в "жидком стуле" время от дефекации до исследования должно быть по возможности сокращено до минимума (30 мин - 1,5 часа).

5. Для обнаружения цистных форм простейших (в том числе лямблий), а также яиц печеночных и кишечных гельминтов допускается хранение кала при температуре холодильника в течение суток.

6. При взятии проб кала в консервант Турдыева возможно хранение до 1 месяца.

Консервант Турдыева

Состав: 0,2% раствор азотистокислого натрия (0,16 г + 80 мл дистиллированной воды); глицерин; формалин концентрированный (аптечный); раствор Люголя основной (10 г йодида калия растворить в 30 мл дистиллированной воды, добавить 5 г кристаллического йода, размешать до полного растворения и долить до 100 мл дистиллированной водой). Раствор Люголя хранить в посуде из темного стекла.

Приготовление: 80,0 мл 0,2% раствора + 2,0 мл глицерина + 10 мл формалина + 8,0 мл раствора Люголя.

Смешивать в соотношении: 1 часть кала + 3 части консерванта.

1. Исследование фекалий

1.1. Макроскопическое исследование фекалий

Макроскопическое исследование фекалий применяется перед микроскопическим исследованием для выявления зрелых паразитов или их фрагментов: бычьего или свиного цепней, широкого и чаечного лентецов, остриц.

Необходимые реактивы и оборудование: глицерин, физиологический раствор, дистиллированная вода, химические стаканы, чашки Петри, черная бумага, пинцет, препаровальные иглы, предметные стекла большие (6х10; 8х12 см), лотки эмалированные, микроскоп, лупа типа МБС.

Ход исследования

Фекалии сначала осматривают целиком, затем разводят дистиллированной водой до жидкой консистенции и небольшими порциями исследуют при хорошем освещении. Для лучшего просмотра применяют способ отстаивания:

1. Размешать фекалии в большом количестве воды в высоких стеклянных стаканах и поставить отстаивать.

2. Надосадочную жидкость слить, а осадок снова смешать с водой (так проделать несколько раз, пока надосадочный слой не станет прозрачным).

3. Отливать отдельные небольшие порции в чашки Петри и тщательно просматривать под стереоскопическим микроскопом МБС.

4. Извлекать пинцетом или препаровальной иглой все подозрительные частицы и крупные образования на отдельное предметное стекло или чашку Петри.

5. Образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, рассматривать под микроскопом МБС между двумя предметными стеклами.

6. Мелких гельминтов рассматривать в капле глицерина или физраствора под микроскопом при увеличении : окуляр х7 или х10, объектив х8 или х10.

Необходимо помнить, что микроскопия всех визуально обнаруженных в кале паразитов или фрагментов обязательна для уточнения морфологических особенностей и идентификации паразита.

Метод эффективен для дифференциальной диагностики половозрелых гельминтов кишечника (аскарид, остриц, члеников бычьего, свиного цепней, широкого и чаечного лентецов) от непереваренных частиц и других включений кала и идентификации найденных паразитов.

1.2. Микроскопические методы исследования фекалий

1.2.1. Метод нативного мазка с физраствором и раствором Люголя

Необходимые реактивы и оборудование: физиологический раствор, раствор Люголя 1%, предметные и покровные стекла, деревянные палочки, стеклянные пипетки, микроскоп.

Для обнаружения вегетативных форм лямблий (или других простейших) исследуют только неоформленные фекалии ("жидкий стул").

Фекалии исследуют сразу после дефекации (время можно увеличить до 1 часа, если сохранять фекалии при температуре 4-5°С).

Фекалии для данного исследования забирают без консервантов!

Физиологический раствор подогреть до 36-37°С.

Приготовление 1% раствора Люголя: к 5 мл основного раствора Люголя добавить 20 мл физраствора. Хранить в темной склянке не более 14 дней.

Ход исследования

1. Нанести на предметное стекло 1 каплю теплого физраствора в левой половине и 1 каплю 1% раствора Люголя - в правой половине предметного стекла.

2. Немного фекалий перенести в каплю физраствора и растереть до получения равномерной негустой эмульсии, затем поместить немного фекалий в каплю раствора Люголя и также растереть.

3. Накрыть капли покровными стеклами и микроскопировать при увеличении: окуляр х10, объектив х40.

Метод позволяет выявлять вегетативные формы патогенных и непатогенных простейших и анализировать тип их движения (что имеет значение при видовой идентификации простейших).

Метод неинформативен для обнаружения яиц гельминтов!

1.2.2. Метод толстого мазка под целлофаном по Като

Необходимые реактивы и оборудование: 50% глицерин (100 мл глицерина + 100 мл дистиллированной воды), малахитовый зеленый - 3% раствор (2,5 г малахитовой зелени + 75 мл дистиллированной воды), целлофан гидрофильный, предметные стекла, палочки стеклянные или деревянные, специальный валик или резиновая пробка, микроскоп.

Подготовка рабочего раствора Като

1. 20 мл 50% глицерина + 1,2 мл 3% раствора малахитового зеленого. Раствор можно хранить длительное время в темной склянке с крышкой.

2. Из гидрофильного целлофана нарезать полоски по размеру предметного стекла (полиэтиленовая пленка непригодна для исследования).

3. Полоски поместить в рабочий раствор Като не менее, чем на 24 часа.

Ход исследования

1. На предметное стекло нанести фекалии (размером с небольшую горошину). Растереть индивидуальной палочкой.

2. Сверху накрыть целлофановой полоской, обработанной в растворе Като.

3. Притереть целлофан к стеклу с помощью специального валика или резиновой пробки до получения тонкого полупрозрачного слоя.

4. Препарат выдержать при комнатной температуре в течение 1 часа или в термостате при 37-40°С в течение 20-30 мин.

5. Микроскопировать при увеличении: объектив х8 или х10, окуляр х10 (для уточнения морфологического строения яиц гельминтов объектив х40).

Эффективность и информативность метода

Метод выявляет яйца печеночных и кишечных гельминтов при высокой и средней степени интенсивности инвазии, но малоинформативен при инвазиях низкой интенсивности. Не применяется для диагностики протозоозов.

1.2.3. Метод уксусно-эфирного осаждения

Необходимые реактивы и оборудование: водный раствор уксусной кислоты 5% (5 мл ледяной уксусной кислоты + 95 мл дистиллированной воды), этиловый эфир медицинский, раствор Люголя 1%, центрифужные градуированные пробирки, воронки стеклянные, металлические ситечки чайные или двухслойный бинт, предметные и покровные стекла, палочки деревянные или стеклянные, пипетки, резиновые пробки или специальный валик, центрифуга лабораторная, микроскоп.

Ход исследования

1. В центрифужные градуированные пробирки налить 5 мл 5% раствора уксусной кислоты.

2. Добавить 1 г фекалий (такое количество, чтобы раствор в пробирке поднялся до уровня 6 мл).

3. Фекалии тщательно смешать с уксусной кислотой при помощи индивидуальной палочки, закрыть пробирку пробкой, интенсивно встряхнуть до образования однородной смеси и дать постоять несколько минут.

4. Процедить через воронку с металлическим ситечком или двухслойным бинтом в другую центрифужную пробирку, так чтобы в новой пробирке 6 мл раствора# (сполоснуть воронку с бинтом через который процеживали фекалии 5% уксусной кислотой).

5. Добавить в пробирку 4 мл эфира (до метки 10 мл), закрыть пробкой и энергично встряхивать 30 сек., держа при этом пробирку в горизонтальном положении, придерживая пробку пальцем, до получения эмульгированной смеси.

6. Смесь центрифугировать при 1500 об/мин в течение 2 мин.

7. После центрифугирования в пробирке р