Приложение С. Показатели эффективности мультиметодов для определения остатков (MRM) ветеринарных препаратов

Приложение С

Показатели
эффективности мультиметодов для определения остатков (MRM) ветеринарных препаратов

C1. Сфера применения

Целью настоящего Приложения является описание показателей/параметров эффективности, которыми должны обладать мультиметоды для определения остатков (MRM), чтобы давать признаваемую на международном уровне степень достоверности метода в целях получения результатов, пригодных для оценки остатков ветеринарных препаратов в рамках национальных программ или в международной торговле. Способы использования могут включать в себя скрининг, количественное определение и/или подтверждение. При этом каждый из них имеет различные требования к эффективности.

Настоящее Приложение применяется к MRM, используемым для анализа всех остатков ветеринарных препаратов и веществ, которые могут применяться в качестве ветеринарных препаратов. Такие MRM включают в себя определенные пестициды ветеринарного применения, которые могут присутствовать в качестве остатков в продуктах. Руководство по валидации мультиметодов для определения остатков применения пестицидов не в ветеринарных целях представлено в CAC/GL 40-1993: Руководство о надлежащей лабораторной практике при анализе остатков.

В настоящем Приложении MRM считаются методом, в сферу применения которого включаются три или более аналита одного и того же класса или нескольких классов ветеринарных препаратов. Такие MRM могут применяться для скрининга проб на предмет возможного наличия ветеринарных препаратов или для количественного и/или подтверждающего анализа. Настоящее руководство охватывает все три вида ситуации. Следует отметить, что утвержденные MRM могут включать в себя некоторые аналиты, в отношении которых показатели эффективности для количественного анализа в полном объеме утверждены, а также другие аналиты, в отношении которых критерии прецизионности и/или извлечения для количественного анализа или требования к информации в целях подтверждения остатков недоступны. Однако такие аналиты должны быть четко определены в рамках метода и не должны использоваться в указанных целях, пока они не будут утверждены и/или пока не будет продемонстрировано их соответствие целевому назначению.

C2. Определения

Совместимый или отрицательный результат: Результат, указывающий на то, что аналит отсутствует при самых низких выверенных концентрациях или выше таких концентраций (см. также Предел обнаружения в CAC/GL 72-2009).

Метод подтверждения: Метод, который дает полную или дополнительную информацию, позволяющую идентифицировать аналит с приемлемой степенью уверенности при исследуемой концентрации.

Предел принятия решений (CC): Предел, при котором может быть принято решение о том, что концентрация аналита, присутствующего в пробе, действительно превышает указанный предел с вероятностью ошибки (ложноположительный).

Способность к обнаружению (CC): Наименьшая истинная концентрация аналита, которая может быть обнаружена, идентифицирована и количественно определена в пробе с вероятностью ошибки (ложноотрицательная).

Исследуемый остаток: Остаток аналита в матрице, возникающий на маршруте, через который обычно рассчитывают следовую концентрацию при лечении или дозировании в соответствии с предполагаемым использованием, в отличие от остатков от лабораторного повышения концентрации образцов.

Матрица: Материал или компонент, отобранный для аналитических исследований, за исключением аналита.

Холостая матрица: Пробный материал, не содержащий поддающихся обнаружению концентраций исследуемого аналита.

Метод: Ряд процедур от получения пробы для анализа до получения окончательных результатов.

Мультиметод для определения остатков (MRM): Метод, который подходит для скрининга, подтверждения и количественного определения ряда аналитов, как правило, в нескольких различных матрицах и в сферу применения которого включаются три или более аналита одного и того же класса или нескольких классов ветеринарных препаратов.

Условно-положительный или подозрительный результат: Результат, предполагающий наличие аналита в концентрациях, равных или превышающих самые низкие выверенные концентрации.

Положительный результат: Результат, указывающий на подтверждение присутствия аналита в концентрациях, равных или превышающих самые низкие выверенные концентрации.

Количественный метод: Метод, способный давать результаты, выраженные в виде цифровых значений в соответствующих единицах, с точностью и прецизионностью, которые соответствуют целевому назначению. Степень прецизионности и правильности должна соответствовать критериям, указанным в Таблице 1 основного текста.

Подготовка пробы: Процедура, применимая, при необходимости, для преобразования лабораторной пробы в аналитическую пробу путем удаления частей, которые не должны включаться в анализ.

Обработка пробы: Процедура(-ы) (например, разрезание, измельчение, перемешивание), применимая(-ые) для того, чтобы сделать аналитическую пробу приемлемо однородной с учетом распределения аналита до удаления аналитической части.

Метод скрининга: Метод, используемый для обнаружения присутствия аналита или класса аналитов в минимальной исследуемой концентрации или выше такой концентрации.

C3. Краткая информация о параметрах эффективности, которые должны быть охарактеризованы и определены для аналитических мультиметодов для определения остатков

Следующие параметры должны быть измерены для каждого исследуемого аналита и для каждой исследуемой матрицы, если применимо:

(a) Избирательность

(i) Отсутствие интерференций

(ii) Эффекты матрицы - охарактеризованные и контролируемые методов при их возникновении.

(iii) Установленные качественные, количественные и/или подтверждающие параметры отклика детектора (и для анализа скрининга, если это предусмотрено ниже для охвата пороговых значений или пределов)

(b) Калибровка

(i) Чувствительность

(ii) Диапазон калибровки

(iii) Функция калибровки

(iv) LOD и LOQ и/или и

(c) Надежность результатов

(i) Извлечение

(ii) Точность (правильность и прецизионность)

(iii) Неопределенность измерений

(iv) Испытания на устойчивость (стабильность), в том числе идентификация критических контрольных точек и возможных точек остановки

(d) Устойчивость аналитов

(i) Устойчивость в экстрактах проб и стандартных растворах;

(ii) Устойчивость при обработке и анализе пробы

(iii) Устойчивость при хранении в замороженном состоянии и в рамках цикла замораживания и оттаивания.

(e) Изучение исследуемых остатков (при наличии пригодных материалов)

(i) Проверка того, что исследуемые остатки экстрагированы столь же эффективно, как и аналит с повышенной концентрацией.

(ii) Проверка осуществления любых действий, составляющих часть метода, в целях высвобождения химически связанных остатков, при необходимости.

(iii) Проверка систематичности извлечения и прецизионности

C4. Показатели эффективности для MRM

Следует понимать, что показатели эффективности, перечисленные в параграфе 4, должны быть определены и измерены для каждого аналита, который входит в сферу применения полностью оптимизированного мультиметода для определения остатков. Лучше всего сделать это после того, как будет установлено, что разработка и/или модификация метода завершены и что аналитический метод не будет подвержен дополнительным изменениям или модификациям. В этой связи используемые понятия очень близки тем, что применяются для определения показателей эффективности аналита в рамках единичных аналитических методов, которые подробно описаны в основном тексте (см. Раздел 18). Во избежание повтора в настоящем Приложении будут описаны только отличия от единичных аналитических методов.

Можно ожидать, что требования к MRM по эффективному обнаружению остатков разнообразных ветеринарных препаратов в комплексной пищевой матрице приведут к повышенному риску интерференции со стороны иных материалов от матрицы проб в сравнении с единичными аналитическими методами. Если требуется, чтобы MRM подвергал анализу различные матрицы или матрицы различных видов животных, риск увеличивается. Это обуславливает необходимость обратить особое внимание на показатели эффективности, связанные со способностью к обнаружению и с избирательностью, при анализе эффективности MRM.

C5. Показатели эффективности MRM для анализа скрининга

MRM для анализа скрининга, как правило, имеют качественную природу и зачастую охватывают ряд аналитов, видов животных и матриц с целью разграничить пробы, которые не содержат поддающихся обнаружению остатков выше порогового или предельного значения ("отрицательные/совместимые"), и пробы, которые могут содержать остатки в превышение указанных значений ("положительные/условно-положительные/вызывающие подозрения положительные".

Методы скрининга для утвержденных ветеринарных препаратов должны демонстрировать избирательность, равную 90%, с 95-процентной степенью достоверности и чувствительности при самых низких концентрациях, при которых исследуемый аналит может быть с достоверностью обнаружен в рамках установленных статистических пределов, обычно 95% доверительный интервал. В регулятивных целях указанные методы скрининга могут допускать небольшое количество "ложноположительных" результатов, так как любые отсортированные "положительные/ условно-положительные/ вызывающие подозрения положительные" пробы должны быть направлены на дополнительный подтверждающий и/или количественный анализ в целях идентификации, подтверждения и/или количественного определения наличия "подозрительного" остатка. Ко всем иным ветеринарным препаратам, которые НЕ утверждены для использования, настоящее Приложение может использоваться для принятия обоснованных решений о том, какие критерии эффективности необходимо разработать.

Критерии для идентификации пороговых или предельных значений для методов скрининга приведены в основном тексте (см. Раздел 18.1).

C6. Показатели эффективности MRM для количественного анализа

Требование извлекать ряд остатков различных ветеринарных препаратов в рамках одной экстракции увеличивает потенциал для сниженной избирательности MRM в сравнении с единичными аналитическими методами. Использование менее избирательной экстракции и процедур очистки может привести к наличию большего количества совместно извлеченных матричных материалов в окончательной выборке. Природа и количества таких совместно извлеченных материалов могут существенно различаться в зависимости от истории отдельной пробы. В этой связи необходима особая осмотрительность при установлении критериев для прецизионности и правильности MRM, чтобы гарантировать, что интерференция других компонентов, присутствующих в матрице пробы, не повлияет на количественное определение. Рекомендуется, чтобы MRM, используемые для подтверждения MRL Кодекса, отвечали стандартам эффективности для правильности и прецизионности, указанным в Таблице 1 основного текста. В целях обеспечения учета влияния различных проб при оценке эффективности с применением данных критериев рекомендуется следовать руководству основного текста (см. Раздел 18.2) при определении таких параметров. Промежуточная прецизионность, а не прецизионность повторяемости, для извлечения аналита с повышенной концентрацией в таких различных пробах, должна использоваться для сравнения с критериями, перечисленными в Таблице 1 основного текста.

Однако при отсутствии руководства для определения целевой концентрации конкретного аналита может рассматриваться значение, основанное на оценке рисков для здоровья населения, а не на пределах обнаружения доступной аналитической аппаратуры.

Аналитические методы для определения остатков ветеринарных препаратов в пищевых продуктах все чаще используют в качестве основы количественного определения стандартную кривую, образованную в результате добавления стандарта к известному холостому репрезентативному матричному материалу до извлечения аналита в диапазоне надлежащих концентраций, который охватывает целевую концентрацию. Использование такой стандартной кривой с согласованной матрицей для калибровки по своему характеру включает в полученные аналитические результаты корректировку извлечения, но может ввести новую погрешность, связанную с поведением конкретной холостой матрицы, используемой для построения стандартной кривой. Рекомендуется следовать руководству основного текста (см. Раздел 18.2) в части правильности метода, который использует кривую калибровки с согласованной матрицей.

Могут применяться альтернативные подходы к валидации метода, в рамках которых используются параметры Предел принятия решений и Способность к обнаружению . Указанные параметры предусматривают анализ неопределенности измерений.

C7. Показатели эффективности MRM для подтверждающих методов

Необходимые для положительной идентификации меры определяются на основании экспертного суждения аналитика, и особое внимание следует уделять выбору метода, который позволит минимизировать влияние интерферирующих аналитов. В конечном итоге, аналитик под свою ответственность должен сделать выбор, предоставить подтверждающие данные и интерпретировать результаты в соответствии с научными принципами и на основании квалифицированного суждения, как описано в основном тексте (см. Раздел 18.3).

Требования к эффективности методов подтверждения, основанные на газовой хроматографии-масс-спектрометрии с низким разрешением (GC-MS) и на жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS), которые представлены в Таблице 2 основного текста, были расширены в целях охвата ситуаций, когда относительная интенсивность ионов может быть менее 10%. В этих условиях приемлемой является 50-процентная относительная интенсивность ионов между стандартом и пробой.

Таблица 1 настоящего Приложения содержит количество идентификационных точек (IP), полученных в отношении сочетания аналитических методов на основе масс-спектрометрии, и дает необходимые и достаточные критерии для подтверждающего анализа. Как правило, минимум четыре идентификационные точки требуются для соответствия принятым критериям эффективности для регулятивных методов. Таким образом, сочетание родительского иона и двух продуктов иона даст четыре необходимые IP при использовании инструментов MS/MS с низким разрешением в рамках метода подтверждения. Примеры методов обнаружения, которые не основаны на MS, перечислены в Таблице 3 основного текста.

Независимо от разрешения масс-спектрометра, как минимум одно ионное соотношение должно быть измерено, чтобы исключить возможность образования осколков одной и той же массы веществ, возникающих из изобарных соединений аналогичной структуры. Время удерживания, точнее, относительное время удерживания, должно быть определено в целях исключения возможностей для ложных идентификаций при использовании масс-спектрометров для обнаружения.

Немагнитные секторные масс-спектрометры высокого разрешения (HRMS) становятся все более доступными и широко применяются. При применении указанного оборудования предлагается использовать в качестве основы подтверждения соединения высокую точность массы и разрешающую способность масс-спектрометра.

C8. Валидация полностью охарактеризованных MRM

Определение параметров в параграфе 4 для всех аналитов и матриц, входящих в сферу применения MRM, позволит провести объективную оценку пригодности аналитического метода к использованию в программах регулятивного контроля. Что касается методов скрининга, аналиты, измеренные параметры эффективности которых в ряде экспериментов по валидации достигаются в 90% всех измерений, взятых при каждом сочетании аналита/матрицы/концентрации, могут считаться приемлемыми для включения в метод.

Раздел 19.1 рекомендует, насколько это возможно, использовать исследуемый материал, образующийся в естественных условиях, при характеристике и валидации аналитических методов. Однако цена получения такого исследуемого материала для валидации каждого аналита в рамках MRM может быть чрезмерно высокой. Если введение нескольких разных ветеринарных препаратов сельскохозяйственным животным экономически целесообразно и возможно, исследуемый материал может быть получен в отношении нескольких тщательно отобранных аналитов, представляющих классы и/или группы ветеринарных препаратов на основе распространенности их использования и потенциала по формированию остатков в превышение установленных MRL. Целевая исследуемая концентрация должна быть приближенной к MRL или ожидаемой концентрации.

Для валидации MRM могут быть использованы альтернативные протоколы, при необходимости, модифицированные с учетом отдельных обстоятельств.

Таблица 1: Примеры количества идентификационных точек (IP), полученных в отношении ряда методов обнаружения на основе масс-спектрометрии и их сочетаний (n = целое число)

Метод	Источник идентификации	Количество идентификационных точек (IP)
GC-MS (EIa или CIb)	n характеристических ионов	N
GC-MS (EI + CI)	2 (EI) + 2 (CI)	4
GC-EIMS или GC-CIMS (2 деривата)	2 (Дериват A) + 2 (Дериват B)	4
LC-MS	n характеристических ионов	N
GC-MS/MSc	1 родительский ион + 2 продукта иона	4
LC-MS/MSd	1 родительский ион + 2 продукта иона	4
GC-MS/MS	2 родительских иона, каждый с 1 продуктом иона	5
LC-MS/MS	2 родительских иона, каждый с 1 продуктом иона	5
LC-MS/MS/MS	1 родительский ион, 1 продукт иона и 2 продукта иона второго поколения	5,5
HRMS	N	2n
GC-MS и LC-MS	2 + 2	4
GC-MS и HRMS	2 + 1	4
LC-HRMS/MS и GC-HRMS/MS	1 родительский ион + 2 продукта иона	6
a Электронная ионизация (EI) b Химическая ионизация (CI) c Газовая хроматография - тандемная масс-спектрометрия (GC-MS/MS) d Жидкостная хроматография - тандемная масс-спектрометрия (LC-MS/MS)